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Scrapie eradication efforts cost 18 million dollars annually in the United States and rely heavily upon PRNP genotyping of sheep. Genetic resistance might reduce goat scrapie and limit the risk of goats serving as a scrapie reservoir, so PRNP coding sequences were examined from 446 goats of 10 breeds, 8 of which had not been previously examined at PRNP. The 10 observed alleles were all related to one of two central haplotypes by a single amino acid substitution. At least five of these alleles (M142, R143, S146, H154, and K222) have been associated with increased incubation time or decreased odds of scrapie. To the best of our knowledge, neither S146 nor K222 has been found in any goats with scrapie, though further evaluation will be required to demonstrate true resistance. S146 was more common, present in several breeds at widely varying frequencies, while K222 was observed only in two dairy breeds at low frequency. Overall, this study provides frequency data on PRNP alleles in US goats, shows the pattern of relationships between haplotypes, and demonstrates segregation of multiple scrapieassociated alleles in several breeds not examined before at PRNP.

Selection programmes based on prion protein (PrP) genotypes are being implemented for increasing resistance to scrapie. Commercial meat sheep populations participating in sire-referencing schemes were simulated to investigate the effect of selection on PrP genotypes on ARR and VRQ allele frequencies, inbreeding and genetic gain in a performance trait under selection. PrP selection strategies modelled included selection against the VRQ allele and in favour of the ARR allele. Assuming realistic initial PrP frequencies, selection against the VRQ allele had a minimal impact on performance and inbreeding. However, when selection was also in favour of the ARR allele and the frequency of this allele was relatively low, there was a loss of up to three to four years of genetic gain over the 15 years of selection. Most loss in gain occurred during the first five years. In general, the rate of inbreeding was reduced when applying PrP selection. Since animals were first selected on their PrP genotype before being selected on the performance trait, the intensity of selection on performance was weaker under PrP selection (compared with no PrP selection). Eradication of the VRQ allele or fixation of the ARR allele within 15 years of selection was possible only with PrP selection targeting all breeding animals.

Trotz der Globalisierung der Pharmaindustrie und einigen tragischen Vorfällen aufgrund verunreinigter Ausgangsstoffe und Kontaminationen von pharmazeutischen Hilfsstoffen gibt es im Gegensatz zu Wirkstoffen bislang keine eindeutigen Qualitätsanforderungen an Hilfsstoffe. Durch die Umsetzung der Fälschungsrichtlinie 2011/62/EU und das neue österreichische Arzneimittelgesetz (AMG) werden höhere Anforderungen an Hilfsstoffe in den Bereichen der Guten Herstellungs- und Vertriebspraxis angeführt. Der Arzneimittelhersteller hat sicherzustellen, dass die verwendeten Hilfsstoffe geeignet sind. Eine Verifizierung der für die Hilfsstoffherstellung angemessenen Guten Herstellungspraxis muss erfolgen, welche durch den Hilfsstoffhersteller gelebt und eingehalten werden muss. Die Europäische Kommission hat hierzu im Februar 2013 einen Leitlinienentwurf herausgegeben, welcher das Ziel einer formalisierten Risikobewertung im Hinblick auf die Ermittlung der einschlägigen Guten Herstellungspraxis für Arzneiträgerstoffe (Hilfsstoffe) verfolgt. Zur Risikobewertung und Identifizierung kritischer Parameter ist hierbei eine Reihe von Faktoren zu berücksichtigen, die in dieser Diplomarbeit näher betrachtet werden. Die Problematik bei Hilfsstoffen besteht darin, dass diese meist eine komplexe Zusammensetzung besitzen. Hierbei ist es besonders wichtig, dass eine entsprechende Charakterisierung des Hilfsstoffes durchgeführt wird und eine Spezifikation, unter Berücksichtigung aller Hilfsstoffkomponenten und Verunreinigungen, festgelegt wird. Eine Kontrolle und Gewährleistung der gleichbleibenden Zusammensetzung innerhalb der definierten Spezifikation und die Reduzierung anderer Bestandteile (z.B. Lösemittel) auf eine minimale akzeptierte und festgelegte Menge sind unumgänglich, um die Patientensicherheit gewährleisten zu können. In diesem Sinne sind entsprechende Kontrollen und / oder ein laufendes Monitoring des Herstellungsprozesses für Hilfsstoffe erforderlich, sodass die notwendige Chargenidentität und -konsistenz erreicht wird. Weiters sind Hilfsstoffe anhand ihres Ursprungs für die Verwendung in Arzneimitteln angemessen zu testen, sodass entsprechende Qualitätsmerkmale und spezifische Anforderungen erfüllt werden. Eine laufende Überprüfung des Hilfsstoff- und Hersteller-Risikoprofils kann durch eine entsprechende Lieferantenqualifizierung erfolgen. Hierzu sind einige Möglichkeiten in dieser Diplomarbeit angeführt. Aufgrund der neuen regulatorischen Entwicklungen besteht weiterhin die Notwendigkeit einer engeren Zusammenarbeit zwischen dem Hilfsstoff- und Arzneimittelhersteller. In Zukunft könnte allerdings die Identifizierung kritischer Faktoren zu Diskussionen führen, da dies auf Basis individueller Sichtweisen stattfindet. Despite the globalization of the pharmaceutical industry and some tragic incidents due to contaminated raw materials and contaminations of pharmaceutical excipients, there are – contrary to API’s – no clear quality requirements for excipients. By the implementation of the Directive 2011/62/EU and the new Austrian Law on pharmaceutical products (AMG) more stringent requirements on excipients in the fields of GMP and GDP are laid down. The drug manufacturer has to ensure that the excipients used are suitable. A verification of the appropriate good manufacturing practice for the manufacturing of excipients must take place, which must be lived and maintained by the excipient manufacturer. Concerning this, the European Commission has issued draft guidelines on the formalised risk assessment for ascertaining the appropriate good manufacturing practice for excipients of medicinal products for human use in February 2013. A number of factors need to be taken into account for the risk assessment and identification of critical parameters, which are discussed in detail in this thesis. The problem is that excipients usually have a complex composition. Here it is particularly important that an appropriate characterization of the excipient is performed and a specification taking into account all components and impurities of the excipient is defined. In order to ensure patient safety a monitoring and ensuring of consistency in composition within a defined specification and reducing of other components (f.e. solvents) to a minimum accepted and fixed amount are essential. In this sense, appropriate controls and / or an ongoing monitoring of the manufacturing process for excipients is required in order to achieve the required batch consistency. Furthermore excipients should be tested appropriately by their origin for use in medicines, so that specific requirements and related quality characteristics are fulfilled. An ongoing review of the excipient and manufacturer risk profile can be performed by supplier qualification. Concerning this some possibilities are mentioned in this thesis. Due to the new developments in the regulatory environment, there is furthermore the need for closer cooperation between the excipient- and drug manufacturer. In the future, however, the identification of critical factors could lead to discussions, as this takes place based on individual perceptions. vorgelegt von: Christoph Fassl Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2014

Prionerkrankungen sind bislang nicht therapierbare, grundsätzlich tödlich verlaufende Krankheiten, die infektiösen Charakter besitzen. Dabei kommt es zur Fehlfaltung eines physiologisch vorkommenden Proteins, des zellulär exprimierten Prion Proteins PrPC. PrPC wird in eine stabile, unlösliche Form PrPSc gefaltet, welches Aggregate bilden und sich im Gehirn in Form von Prionplaques ablagern kann. Dadurch kommt es zu einem pro¬gressiven Neuronenverlust begleitet von einer profunden Mikrogliaaktivierung und ei¬ner Vakuolisierung der Hirnmasse. Studien in Zellkulturen und im Mausmodell haben ge¬zeigt, dass Immunisierungsstrategien als potentielle Therapien bei Prionerkrankun¬gen in Betracht gezogen werden können. Natürlich vorkommende Autoantikörper (nAbs) wurden schon bei der Alzheimer- und Parkinson-Erkrankung nachge¬wie¬sen und auf ihre Wirksamkeit untersucht. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Wirkweise von Prion-spezifischen nAbs (nAbs-PrP) in vitro bei Prion¬erkran¬kungen. Wir konnten erstmalig nAbs-PrP gegen das Prionproteinfragment PrP106-126 A117V im Serum und CSF gesunder Probanden detektieren. Darüber hinaus konnten nAbs-PrP aus ei¬nem kommerziell erwerblichen Pool intravenöser Immunglobuline (IVIg) mit-tels Affini¬täts¬chromatographie isoliert werden. Der Nachweis von nAbs-PrP in huma-nem Serum und CSF von gesunden Spendern impliziert eine physiologische Rolle von nAbs-PrP bei der Kon¬ver¬¬sion von PrPC zu PrPSc. Tatsächlich konnte in der vor¬lie-genden Arbeit ge¬zeigt werden, dass nAbs-PrP die Fibrillenbildung des Peptids PrP106-126 A117V konzen¬tra¬tions¬abhängig inhibieren. Auch die toxische Wirkung des Peptides auf Neu¬rone konnte durch nAbs-PrP gehemmt werden, was vermutlich mit dem hemmen¬den Einfluss auf die Fibrillenbildung einhergeht. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass nAbs-PrP ver¬¬mutlich eine bedeutende Rolle bei der Mikroglia-vermittelten Prion-„Clearance“ spielen. Eine Behandlung der Mikrogliazellen mit nAbs-PrP führte zu einer ver¬¬stärkten Pha¬gozytose von PrP106-126 A117V, die weder in einer Induktion pro-in¬flamma¬tori¬scher Zytokine noch in einer Einschränkung der Zellvitalität resultierte. Durch den Ein¬satz verschiedener Phagozytose-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass wahr¬schein¬lich zwei unterschiedliche Mechanismen für die Phagozytose von fi-brilliertem Prion¬pep¬tid einerseits und für die nAbs-PrP-vermittelte Prionaufnahme anderer¬seits ver¬ant¬wort¬lich sind. Zusammenfassend konnte in vitro gezeigt werden, dass nAbs-PrP in die patholo¬gi¬schen Prozesse der Prionkonversion und -toxizität eingreifen können. nAbs-PrP lösten dabei keine inflammatorische Reaktion in Mikrogliazellen aus, sondern wirkten fördernd auf die „Clearance“ von fibrillierten Prionpeptiden. Diese Ergebnisse legen nahe, den Effekt von nAbs-PrP auf den Krankheitsverlauf in vivo zu untersuchen.

Kimguard One-Step sterilisation wrap has regulatory approval as a Class I medical device suitable for packaging terminally sterilised medical items. In this study, we evaluated the performance of five different grades of Kimguard One-Step sterilisation wrap after prion sterilisation cycle (134 °C for 18 minutes) using the final pack test method. Kimguard One-Step grades KC100, KC200, KC300, KC400 and KC500 were used to wrap a 1/1 DIN steel wire instrument tray (internal volume of 7.2 L) and each wrapped test pack was challenged with 100,000 1 μm latex particles delivered at an air flow rate of 250 mL/min during a 25-minute test period. For each grade of wrap, particle filtration efficiency measurements were carried out sixfold after sterilisation and repeated after test pack storage for three months. At both time points, particle counts within the wrapped test packs were negligible and yielded mean particle retention rates for all five grades of sterilisation wrap of ≥ 99.99%. From these results, we conclude that the microbial barrier effectiveness of Kimguard One-Step sterilisation wraps KC100, KC200, KC300, KC400 and KC500 remains unaffected by prevacuum steam sterilisation at 134 °C for 18 minutes, or by subsequent storage for three months with regular movement of packs during storage.

Kimguard One-Step sterilisation wrap has regulatory approval as a Class I medical device suitable for packaging terminally sterilised medical items. In this study, we evaluated the performance of five different grades of Kimguard One-Step sterilisation wrap after prion sterilisation cycle (134 °C for 18 minutes) using the final pack test method. Kimguard One-Step grades KC100, KC200, KC300, KC400 and KC500 were used to wrap a 1/1 DIN steel wire instrument tray (internal volume of 7.2 L) and each wrapped test pack was challenged with 100,000 1 μm latex particles delivered at an air flow rate of 250 mL/min during a 25-minute test period. For each grade of wrap, particle filtration efficiency measurements were carried out sixfold after sterilisation and repeated after test pack storage for three months. At both time points, particle counts within the wrapped test packs were negligible and yielded mean particle retention rates for all five grades of sterilisation wrap of ≥ 99.99%. From these results, we conclude that the microbial barrier effectiveness of Kimguard One-Step sterilisation wraps KC100, KC200, KC300, KC400 and KC500 remains unaffected by prevacuum steam sterilisation at 134 °C for 18 minutes, or by subsequent storage for three months with regular movement of packs during storage.

Die Möglichkeit der Übertragung von vCJD durch Bluttransfusionen stellt ein großes Risiko für das Blutspendewesen dar. Dieses Risiko könnte durch die Einführung eines Screening-Tests zum Nachweis von vCJD in präklinischen Stadien minimiert werden. Auf der Suche nach einer geeigneten Plattform zur Entwicklung eines Screening-Test im Blut wurde die PrPC-Spaltung durch mittels Streptokinase (SK) aktiviertes Plasminogen und/oder Aufdecken von Kryptepitopen in PrPSc nach Denaturierung untersucht. In einem speziell konzipierten ELISA-Test mit zwei monoklonalen Antikörpern wurde die PrPC- Spaltung durch endogenes Plasmin nachgewiesen. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37°C mit 44 kU/ml SK wurden nur 20 % der PrPC-Ausgangskonzentration im Plasma detektiert. Humane Plasmaproben, aufgestockt mit Hirnhomogenisaten aus gesunden und an Scrapie erkrankten Hamstern, wurden nach vier verschiedene Vorbehandlungen im ELISA ausgetestet: native Proben, Proben nach Plasminspaltung, denaturierte Proben und Proben nach Plasminspaltung und Denaturierung. Unter diesen Testbedingungen konnte keine PrPSc-Spaltung durch SK-aktiviertes Plasminogen festgestellt werden. Die Denaturierung der pathologischen Proben konnte eine Scrapie-Hirnhomogenisat-Verdünnung in Humanplasma von 10-3,5 signifikant von den normalen Proben unterscheiden. Die Einführung der Plasminspaltung vor der Denaturierung erzeugte einen signifikanten Unterschied der pathologischen Proben von den normalen Proben bis zu einer Hirnhomogenisat-Verdünnung in Humanplasma von 10-3,6. Der entwickelte ELISA-Test ist ein neues und relativ einfaches Verfahren zum Nachweis von PrPSc in humanem Plasma. Nach Optimierung der Nachweisgrenze könnte er zum Blutspender-Screening-Test weiterentwickelt werden., The possibility of vCJD-transmission by blood transfusion represents a high risk for blood supply. The implementation of a screening test for detection of vCJD in preclinical stages could minimize that risk. In search of appropriate platform for the development of a blood screening test the PrPC cleavage by streptokinase (SK) activated plasminogen and/or exposure of a cryptepitopes in PrPSc after denaturation was investigated. In a special designed ELISA test with two monoclonal antibodies the PrPC cleavage by endogenous plasminogen was demonstrated. After 60 minutes incubation at 37°C with 44 kU/ml SK only 20% of the PrPC initial concentration were detected. Human plasma samples, spiked with brain homogenates from normal and scrapie-infected hamsters, were investigated in ELISA after four different pretreatments: native samples, samples after plasmin cleavage, denaturated samples and samples after plasmin cleavage and denaturation. Under the test conditions PrPSc cleavage by SK- activated plasminogen couldn’t be detected. The denaturation of the samples significantly differentiated between normal and pathological samples up to 10-3,5 dilution of scrapie-infected brain homogenate in human plasma. The implementation of plasmin cleavage before the denaturation produced a significant difference between the pathological and normal samples up to 10-3,6 homogenate dilution in plasma. The represented ELISA test is new and relative simple procedure for detection of PrPSc in human plasma. After further optimization of the detection limit it could be used as blood donors screening test.

Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod führen. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infektiöse Agens „Prion“ teilweise oder vollständig aus dem zellulären Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine mögliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Homöostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrPΔ32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Domäne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20% erhöhte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Veränderungen führte, wurde die Lebensspanne um 8% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizität der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion übergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabhängigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anfälligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizität der Deletionsmutante übergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bezüglich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Domäne, durch die möglicherweise Fenton-ähnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden könnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung über einen bislang unaufgeklärten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die Möglichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner ermöglicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzuklären., Transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal progressive neurodegenerative disorders. The protein only hypothesis proposes that the infectious agent designated prion consists partly or entirely of the host cellular prion protein (PrPC) and, when the prion is introduced into the organism, causes the conversion of PrPC into the pathogenic isoform PrPSc. However, the disease underlying neuropathogenic mechanisms and the physiological function of PrPC still remain unknown, although a neuroprotective function or a role in oxidative stress homeostasis has been postulated previously. In this work transgenic Drosophila melanogaster lines were evaluated as a model for studying the function of PrPC. By using the bipartite expression system UAS/GAL4 either wild-type PrP (wt-PrP) or a truncated disease associated variant PrPΔ32-134 (tr-PrP) lacking the putative neuroprotective octarepeat domain were utilized. Wt-PrP transgenic flies displayed an approximately 20% increase in average lifespan compared to controls. Although expression of tr-PrP in Drosophila did not induce any obvious neuropathology, it significantly reduced the lifespan by 8%. Co-expression of wt-PrP and tr-PrP did not complement this phenotype, indicating a chronic toxicity of the truncated PrP that is overriding the neuroprotection. Since extended lifespan and stress resistance are closely associated, flies were exposed to the reactive oxygen species (ROS) hydrogen peroxide, oxygen and Paraquat as three independent treatments to provoke oxidative stress. Interestingly, wt-PrP confered resistance to ROS-induced stress, whereas tr-PrP transgenic flies showed normal susceptibility, which was partly rescued by co-expression of wt-PrP. In this regard PrP presence in its physiological compartment, the central nervous system, is sufficient to maintain the described beneficial effects. These findings suggest that PrP is involved in oxidative stress homeostasis by a mechanism that requires the copper binding octarepeat domain. This function might be responsible for the inhibition of Fenton-like reactions which are known to play an important role in oxygen radical synthesis. Consistent with this theory is the observation that ectopic expression of the octarepeat deletion mutant tr-PrP reduces both acquired stress resistance and lifespan by an unrelated, yet unknown mechanism. The Drosophila PrP model provides the possibility to investigate the physiological function of PrP in more detail. It is likewise considerable to identify unknown ligands of PrP in order to uncover PrP signal transduction pathways or neuropathogenic mechanisms.

Es gilt als gesichert, dass Prionen Auslöser einer Reihe neurodegenerativer Krankheiten beim Menschen (Creutzfeldt-Jakob-Krankheit) und Tieren (BSE) sind. Die Krankheitserreger, Prionen, entstehen aus dem nativen, membrangebundenen Prion-Protein (PrPc) durch eine Änderung der Sekundär- und Tertiärstruktur. Prion-Proteine binden spezifisch Kupfer. Paramagnetisches Cu behindert den Einsatz etablierter Methoden zur Strukturaufklärung auf Basis der NMR-Spektroskopie. Lediglich die Struktur des C-terminalen Teils (Residuen 121-231) wurde mittels NMR-Spektroskopie gelöst. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Untersuchung des Kupferbindungsplatzes in der N-terminalen Domäne des Proteins mittels einer neuentwickelten Methode zur Strukturbestimmung. Die Domäne besteht aus vier Wiederholungen einer Sequenz aus acht Aminosäuren, der Octarepeat-Sequenz. Untersuchungen wurden sowohl an synthetisierten Peptidfragmenten als auch an vollständigen humanen Prion-Proteinen durchgeführt. Aus der EXAFS-Spektroskopie lagen Informationen über den Abstand der ersten Liganden zum Cu-Zentrum vor. Er beträgt etwa 1.95Å. Außerdem wurde das Ligandieren eines His-Imidazolrings nachgewiesen. Der Bindungswinkel des His-Nδ wurde auf Cu-Nδ-Cγ=133° bestimmt. Die Vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf EPR- und ENDOR-Spektroskopie. Mit EPR wurde die axiale Symmetrie des Komplexes und die ligandierenden Atomarten, 3 Stickstoffatome und 1 Sauerstoffatom, bestimmt. Der Abstand von Protonen und deren Lage bezüglich der Molekül-Symmetrieachse ist durch ENDOR-Spektroskopie bestimmbar. Charakteristische Linien zeigen beispielsweise His-Hε1 und die Hα-Protonen der Glycine. Die Lage von weit entfernten Stickstoffatomen wurde mit ESEEM-Spektroskopie bestimmt. Die Koordination eines Imidazolrings, aufgrund charakteristischer EXAFS-Spektren bereits vermutet, konnte so bestätigt werden. Außerdem stehen für die Peptidkette stereochemische Informationen wie Bindungswinkel, Bindungslängen oder die Planarität der Peptidbindung zur Verfügung. Die unterschiedliche Natur der Abstandsinformationen verglichen mit der NMR-Spektroskopie machte eine neuartige Strategie für die Simulated-Annealing-Computeroptimierung nötig. Sie wurde in Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für BioMolekulare Optik, LMU München, entwickelt. Bei diesem Rechenverfahren wurden Computermodelle von insgesamt 189 verschiedenen Komplexkonfigurationen generiert, von jeder dieser Konfigurationen wurden 1200 Peptidkonformationen errechnet. Nach einer Plausibilitätsprüfung dieser insgesamt 226800 Konformationen und nach Überprüfung ihrer Kompatibilität mit allen gemessenen Daten ergibt sich eine Struktur, bei der das Nδ des Imidazolrings, die Rückgratstickstoffe von Gly3 und Gly4, und der Carbonylsauerstoff des Gly4 in einer Ebene ligandieren. In der axialen Position koordiniert ein Wassermolekül. Die Ergebnisse aus den Untersuchungen der Octarepeat-Cu-Komplexe sind nicht ohne weiteres auf kupferbeladene Prion-Proteine übertragbar. Da sich die EPR-Spektren der Prion-Proteine von denen der Peptide unterscheiden, kann die Komplexierung des Cu mit vier Stickstoffatomen nicht ausgeschlossen werden. Die ähnliche Lage der ENDOR-Resonanzen belegt eine ähnliche planare Koordination der Stickstoffe wie bei den Octapeptiden. Die Untersuchungen an vollständigen humanen Prion-Proteinen ergeben außerdem eine starke Abhängigkeit der gebildeten Komplexe vom pH-Wert. Während bei Octapeptid/Cu-Komplexen die Bildung von Doppelkomplexstrukturen zuverlässig ausgeschlossen werden kann, ist das bei vollständigen Prion-Protein-Proben wesentlich aufwendiger. Die notwendigen EPR-Titrationsexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Prion-proteins are to be considered as the cause of neurodegenerative diseases in humans (Creutzfeldt-Jakob-disease) and animals (BSE). The infectious agent, “prion”, is formed out of the native, membrane-bound protein (PrPc) through a change in the secondary and tertiary protein structure. Prion-proteins bind copper specifically and with high affinity. Paramagnetic copper hampers the use of established methods of structural refinement basing upon NMR-spectroscopy. Only the structure of the C-terminal domain of the protein (residues 121-231) was solved using NMR-spectroscopy. This work concentrates on the characterisation of the copper binding site in the N-terminal domain of the protein by utilising a newly developed method for structural refinement. The domain consists of four repeats of a peptide-sequence that is eight amino-acids long, the so-called octarepeat-sequence. The work was done on both, synthesised peptide fragments and complete human prion-proteins. From EXAFS-spectroscopy information on the distance between the copper centre and the first ligands were available. This distance is about 1.95Å. Moreover the ligation of a His-imidazole-ring was proven. The binding-angle of the His-Nδ could be determined, Cu-Nδ-Cγ=133°. This work concentrates on EPR and ENDOR spectroscopy. With EPR the axial symmetry of the complex and the types of the first ligands, 3 nitrogen and 1 oxygen atoms, could be assigned. The distance of the protons and their position relative to the symmetry-axis were determined with ENDOR-spectroscopy. Characteristic lines are caused by the His-Hε1 and the Hα-protons of the glycin residues. The position of the nitrogen-atoms can be fixed with ESEEM-spectroscopy. The coordination of a histidine-imidazole ring, which was suspected because of characteristic EXAFS-spectra, could be confirmed. For the peptide-chain moreover, there exist stereochemical information like bond lengths, angles and the planarity of the peptide-bond. The different of distance information yielded by the experiments compared with NMR required a new strategy for the simulated-annealing computer optimisation. This optimisation was developed in cooperation with the Lehrstuhl für BioMolekulare Optik, LMU München. In this calculation method computer-models of 189 different complex configurations were generated, for each of these configurations 1200 conformations were calculated. After testing the plausibility of each of these 226800 conformations and after a check for the compatibility with our measurements the method yielded a structure, in which the Nδ of the His imidazolering, the backbone nitrogen atoms of Gly3 and Gly4 and the carbonyl-oxygen of the Gly4 coordinate the copper in a planar way. One axial position is ligated by a water molecule. The results of the research on the octapeptide-Cu-complexes can not be transferred easily to copper-complexed prion-proteins. The EPR-spectra of prion-proteins and peptides are different, so the ligation of the copper by four nitrogen-ligands cannot be excluded. The similar position of the ENDOR resonance-lines proves the same planar position of the nitrogen atoms as in the octarepeat-fragments. The measurements on complete human prion-proteins also yield a strong dependence of the complex structure on the pH-value of the solution. Whereas the formation of Cu-Cu-double complex-structures can be excluded in the octarepeat-fragments, this is much more difficult in the samples containing complete human prion-proteins. The required EPR-titration-experiments are not finished yet.

Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie für Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantikörpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zelluläre Prion-Protein beschrieben und die zellulären und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten Mäusen spezifische Antikörper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erhöhte Zytokinspiegel von TNF und IFN induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antikörperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypmäusen nachgewiesen werden. Die induzierten Antikörper in Wildtypmäusen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgeführt. Hierfür wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zusätzlich zum PrP für das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in früheren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen körpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antikörperantwort in Prnp0/0-Mäusen induziert werden konnte. In Wildtypmäusen wurden allerdings nur geringe Antikörpertiter nachgewiesen. Die Antikörper aus den Prnp0/0-Mäusen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 stärker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypmäusen eine unspezifische Erhöhung der Zytokinantwort mit erhöhten TNF- und IFN-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgeführt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypmäuse mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle Mäuse aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und für Prionenerkrankungen typische histopathologische Veränderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren., The prion protein (PrPC) plays a pivotal role in transmissible spongiform encephalopathies (TSE). Recent studies have shown that strategies aimed to elicit antibodies against PrP should be considered as a promising therapeutic approach for prion diseases. In this study active immunisation strategies against PrPC were described, humoral and cellular immune responses as well as the influence of the onset of the prion disease were analyzed. Here we demonstrate that immunisation with recombinant murine prion-protein (mPrP) results in activation and proliferation of PrP-specific T cells and induction of PrP-specific antibodies in PrP-deficient mice (Prnp0/0). These antibodies are able to detect and reduce PrPSc levels in cell culture. Immunisation with rek. mPrP and CpG-1826 results in increased levels of TNF and IFNin Prnp0/0 mice. In contrast no T cell response and only low antibody titers against PrP were found in individual wild-type mice. The low level of antibodies in wildtype mice were not able to reduce the PrPSc level in cell culture. In a second approach, we investigated a new immunisation strategy against PrPC with two vaccine DNA vectors (pCG-PrP and pCG-PrP-P30). The pCG-PrP vector system contains murine PrP sequence, whereas the pCG-PrP-P30 vector also contains an immune stimulatory peptide of the tetanus toxin, which has been shown to break tolerance against self proteins. Results indicate that this improved vaccine evokes a sustained antibody response in Prnp0/0 mice, but only low antibody titers were found in wild-type mice. The antibodies from Prnp0/0 mice were able to detect PrPSc and to reduce PrPSc levels in cell culture. DNA immunisation induced activation and proliferation of PrP-specific T cells in Prnp0/0-mice which was even stronger after immunisation with pCG-PrP-P30 than after pCG-PrP treatment. DNA vaccination induced an unspecific T cell response with increased levels of IFN and TNF in wild-type mice. Furthermore we combined DNA and protein immunisation to break tolerance against PrP. The results obtained were similar then those after DNA vaccination alone. Inoculation of the immunised wildtype mice with mouse adapted scrapie prions showed that these animals were not protected against the development of the prion disease. All mice in the vaccinated and control groups succumbed to scrapie with similar incubation times, deposition of PrPSc in brain and spleen and typical histopathological changes in the brain. Nevertheless based on these findings additional strategies of immunisiation should be envisaged to develop immunotherapeutic approaches to break tolerance against PrP and to protect against the prion disease.

The conversion of the cellular prion protein (PrPc) into pathologic PrPSc and the accumulation of aggregated PrPSc are hallmarks of prion diseases. A variety of experimental approaches to interfere with prion conversion have been reported. The aim of this work was to investigate whether interference with intracellular signalling events has an impact on this conversion process. Therefore, about 50 inhibitors of specific signalling pathways were screened in prion-infected cells for their capacity to affect prion conversion. The tyrosine kinase inhibitor STI571 was highly effective against PrPSc propagation, with an IC50 of less than 1 µM. STI571 cleared prion-infected cells time- and dose-dependently from PrPSc without influencing biogenesis, localization or biochemical features of PrPc. Interestingly, this compound did not interfere with the de novo formation of PrPSc but mainly activated the lysosomal degradation of pre-existing PrPSc, lowering the half-life time of PrPSc from >24 hours to, Prionkrankheiten sind stets tödliche, neurodegenerative, infektiöse Erkrankungen, die unterteilt werden können in sporadische, genetisch-familiäre oder erworbene Formen. Sie sind auch bekannt unter dem Namen transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSEs). Zu ihnen gehören die Creutzfeldt-Jakob Erkrankung (CJD), das Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS), Kuru, die fatale (letale) familiäre Insomnie (FFI) und die Variante der CJD (vCJD) im Menschen, Scrapie bei Schafen und Ziegen sowie die bovine spongiforme Enzephalopathie bei Rindern (BSE). Prion-Erkrankungen werden durch die Akkumulierung einer abnormal gefalteten Isoform des zellulären Prion Proteins PrPc verursacht, die PrPSc genannt wird und den Hauptbestandteil von infektiösen Prionen darstellt. Die Konversion des zellulären Prion Proteins PrPc in seine pathogene Isoform PrPSc und die Akkumulierung von aggregiertem PrPSc sind demnach wesentliche Merkmale von Prion-Erkrankungen. Auf der Suche nach Wegen für eine mögliche Therapie und/oder Prophylaxe wurde bisher eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen durchgeführt, mit dem Ziel in die Prion-Konversion einzugreifen. In dieser Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob durch einen Eingriff in zelluläre Signaltransduktionsprozesse ein Effekt auf die Konversion von PrPc in PrPSc ausgeübt werden kann. Dafür wurde von etwa 50 verschiedenen Substanzen, die spezifische Signalwege der Zelle inhibieren, der Effekt auf die Prion-Konversion in Prion-infizierten Zellen untersucht. Der Tyrosin-Kinasen Inhibitor STI571 zeigte in diesem Screening als einzige Substanz eine sehr starke Reduktion von PrPSc. Die Konzentration, mit der eine 50 %ige Reduktion von PrPSc in Prion-infizierten Zellen erreicht werden kann (IC50), liegt bei ≤1 µM. Weitere Untersuchungen ergaben, dass der durch STI571 ausgelöste anti-Prion Effekt zeit- und dosisabhängig ist und keinen Effekt auf die Biogenese, die Lokalisierung oder die biochemischen Eigenschaften der zellulären Isoform PrPc hat. Experimente zum molekularen Wirkungsmechanismus zeigten, dass STI571 nicht die Neusynthese von PrPSc inhibiert, sondern vielmehr den lysosomalen Abbau von bereits in der Zelle vorhandenem PrPSc aktiviert. Hierbei wird die zelluläre Halbwertszeit von PrPSc, die unter normalen Umständen sehr hoch ist und bei mehr als 24 Stunden liegt, auf unter 9 Stunden reduziert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass durch STI571 nicht die allgemeine lysosomale Aktivität der Zellen erhöht wird, sondern dass es spezifisch den physiologischen Abbau von PrPSc aktiviert und dadurch die zelluläre Clearance von PrPSc erhöht. Schließlich konnte das molekulare Ziel von STI571, das spezifisch die drei Tyrosin-Kinasen c-Kit, den PDGF(platelet derived growth factor)-Rezeptor und c-Abl inhibiert, bestimmt werden. Den verschiedenen durchgeführten Untersuchungen zufolge wird die Degradierung von PrPSc durch die Inhibition der Kinase c-Abl ausgelöst. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Eingriffe in die zelluläre Signaltransduktion auf den Prozess der Prion-Konversion Einfluss genommen und die zelluläre Clearance von PrPSc aktiviert werden kann. Demnach stellen Signaltransduktionswege generell potentielle Ziele für Ansätze zur Prophylaxe und Therapie von Prion-Erkrankungen dar. Substanzen, die spezifisch in Signaltransduktionsprozesse der Zelle eingreifen, sind somit eine neue Klasse von Substanzen mit anti-Prion Wirkung.

Titel und Inhaltsverzeichnis Einleitung Geschichtlicher Überblick Das Prion-Modell Histopathologie von TSE-Erkrankungen Ausbreitung des Erregers im infizierten Wirt Diagnose von TSE-Erkrankungen Das IL-1-System Problemstellung der Arbeit Material und Methoden Material Methoden Tierversuche Immunhistochemische Methoden Molekularbiologische Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Literaturverzeichnis Danksagung Selbstständigkeitserklärung, In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Interleukin-1 auf die Scrapie-Pathogenese im ZNS untersucht. Dazu wurden IL-1R1-defiziente-Mäuse und entsprechende Wildtypkontrollmäuse mit Scrapie infiziert und eingehend in verschiedenen Stadien der Erkrankung analysiert. Untersuchte Parameter waren die Überlebenszeiten der Tiere, die Astrozyten- und Mikroglia-Aktivierung, die Akkumulation von fehlgefaltetem PrPSc und die spongiformen Veränderungen im infizierten Hirngewebe. Verschiedene Infektionsexperimente ergaben ein statistisch hochsignifikant verlängertes Überleben der Knockout-Tiere von im Durchschnitt 25 Tagen. Bezüglich der pathologischen Veränderungen war bei den IL-1R1-defizienten Mäusen in der asymptomatischen Phase eine drastisch verminderte Astrozyten-Aktivierung sowohl immunhistochemisch als auch im Northern-Blot im Vergleich zur Kontrollgruppe festzustellen. In Übereinstimmung mit diesen Befunden konnte zudem in den IL-1R1-/--Tieren eine verringerte Expression der Chemokine CXCL9 und CXCL10, die von aktivierten Astrozyten exprimiert werden und direkt durch IL-1 induzierbar sind, nachgewiesen werden. Die verminderte Astrogliose korrelierte mit einer deutlich geringeren Ablagerung von PrPSc in den Knockout-Mäusen, die mittels Immunhistochemie und dem PET-Blot untersucht wurde. Weiterhin wiesen die IL- 1R1-/--Tieren im Vergleich zu den Kontrollen eine etwas ausgeprägtere Expression des Mikroglia-Aktivierungsmarkers CD11b auf. Bezüglich der Vakuolisierung im erkrankten Gewebe konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Die Befunde deuten darauf hin, dass die Aktivierung von Astrozyten eine der wichtigsten Funktionen von IL-1 während der Scrapie-Infektion des Gehirns ist. Die verringerte PrPSc-Akkumulation in den IL-1R1-defizienten Mäusen kann direkt auf die abgeschwächte Astrozytose zurückgeführt werden, da Astrozyten in vivo eine relevante Wirtszelle für die Prion-Replikation darstellen (Raeber et al., 1997, Diedrich et al., 1991, Ye et al., 1998). Die verlängerten Überlebenszeiten der IL-1R1-/--Mäuse könnten sowohl auf eine verminderte astrozytäre Produktion neurotoxischer Faktoren wie z. B. möglicherweise Chemokine, als auch auf die geringere PrPSc-Belastung zurückgeführt werden (Brown et al.,1999 b). Zusammengefasst ist in der vorliegenden Arbeit mit IL-1 erstmals ein Zytokin identifiziert worden, dass die Gliose während einer Scrapie-Infektion des ZNS und die Akkumulation von fehlgefaltetem Prion-Protein beeinflusst., The influence of interleukin-1 on the scrapie pathogenesis in the CNS was studied. The scrapie infection of IL-1RI-deficient mice and appropiate wild- type control mice was compared and studied in detail at various time points. Analysed parameter were the survival times of the animals, the activation of astrocytes and microglia, the accumulation of misfolded PrPSc and the degree of spongiform changes in the infected brain. Several infection experiments revealed a statistically significant prolonged survival of the IL-1RI- deficient mice of in average 25 days. The IL-1RI-deficient mice showed a strongly reduced astrocytosis in comparison to the wild-type controls in the asymptomatic stage. These results were obtained by immunohistochemistry and by Northern-blotting. In agreement with these results the expression levels of the chemokines CXCL9 and CXCL10, which are produced by activated astrocytes and can be induced directly by IL-1, were reduced in the IL-1RI-deficient mice compared to the wild-type controls. The reduced astrogliosis correlated with a significantly reduced accumulation of PrPSc in the knockout-mice, which was shown by immunohistochemistry and by PET-blotting. Furthermore, microglia from the IL-1R1-deficient mice showed a slight increase in the expression of the activation-marker CD11b. No differences were seen for the degree of spongiform changes in the scrapie-infected brain tissue between the KO-mice and the controls. The results point towards an important role of IL-1 in the activation of astrocytes during the scrapie-infection of the CNS. The reduced accumulation of PrPSc in the IL-1R1-deficient mice could be linked to the reduced astrogliosis, because astrocytes are a relevant host cell for the replication of prions in vivo (Raeber et al., 1997, Diedrich et al., 1991, Ye et al., 1998). The prolonged survival of the IL-1R1-deficient mice may be a consequence of a lowered astrocytic production of neurotoxic factors, among them possibly chemokines, and of the reduced PrPSc burden. Taken together, the present study shows for the first time that IL-1 modifies the gliosis and the accumulation of PrPSc during a scrapie infection of the CNS.

Diese Arbeit befasst sich mit der Kinetik der Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen. Anhand dreier Beispiele, der Phosphoglyceratkinase (PGK) aus Hefe, einer Variante von Barstar und des Prion-Proteins des Syrischen Hamsters (SHaPrP(90-232)) wurde insbesondere die Kinetik der Bildung von Amyloidfibrillen und deren kinetischer Vorläuferstrukturen mittels dynamischer und statischer Lichtstreuung, Circulardichroismus, Infrarotspektroskopie, Elektronenmikroskopie und teilweise analytischer Chromatographie untersucht. Die Kinetiken wurden mit Konzepten der Aggregationstheorie von Kolloiden und der chemischen Kinetik beschrieben. Die Modellierung der Kinetiken weist ausgehend von der monomeren PGK bei pH 2 und 190 mM NaCl auf eine zweistufige Reaktionskaskade, bestehend aus irreversiblen, bimolekularen Elementarschritten hin. Während der ersten Stufe wird ein engverteiltes Ensemble von Oligomeren mit einer mittleren Masse von 10 Monomeren und wesentlichen Anteilen an beta-Faltblattstrukturen gebildet. Die Protofibrillen entstehen durch die Vereinigung der strukturell polaren Oligomere, die durch die erste Reaktionsstufe bereitgestellt werden und als kritische Oligomere bezeichnet werden. Die gefundene Kopplung des Wachstums der intermediären Zustände und die Zunahme der beta-Faltblattstruktur kann innerhalb eines verallgemeinerten Diffusions-Kollisions-Modells interpretiert werden, bei dem die beta-Stränge durch intermolekulare Wechselwirkungen stabilisiert werden. Die Fehlfaltung und Aggregation des SHaPrP(90-232) bei pH 4.2 und 1 M GuHCl und geeigneten Zusätzen an Salz zeigt einen augenscheinlichen Zweizustandsübergang mit hoher Reaktionsordnung ( >2.5) zwischen dem monomeren, alpha-helikalen Ausgangszustand und einem beta-faltblattreichen, ringförmigen Oktamer. Die Progresskurven der Umwandlung der Sekundärstruktur lassen sich mit dem Zeitverlauf einer bimolekularen Reaktion anpassen. Das Oktamer bildet bei hohen eingesetzten Proteinkonzentrationen Multimere. Auf sehr langen Zeitskalen setzt die Bildung von Protofibrillen ein. Das kritische Oktamer stellt die Vorstufe der nachgeschalteten Wachstumsphänomene dar. Unter geeigneten Umgebungsbedingungen kann der nicht-nativ, partiell gefaltete Zustand von Barstar bei niedrigem pH (A-Zustand) in einem zweistufigen Prozess erst in Protofibrillen und anschlie"send in reife Amyloidfibrillen konvertiert werden. Zur Aktivierung der Konversion des oligomeren A-Zustandes (mittlere Masse von 16 Monomeren) sind moderate Ionenstärken ([NaCl]>0) und erhöhte Temperaturen (T>50°C) notwendig. Die Bildung der Protofibrillen ist unabhängig von der eingesetzten Proteinkonzentration. Bei Raumtemperatur und entsprechender Ionenstärke bilden sich amorphe Aggregate. Dagegen führt die Erhöhung der Temperatur in Abwesenheit von Salz zur Dissoziation des oligomeren A-Zustandes. Alle drei Proteine müssen zur Ausbildung protofibrillärer Strukturen und gegebenenfalls reifer Fibrillen oligomere Zustände mit partiell gefalteter Konformation einnehmen. Diese kritischen Oligomere sind langlebige Intermediate, die den Dreh- und Angelpunkt für die Bildung nachgeordneter Strukturen darstellen. Die Bildung von Amyloidfibrillen ist somit ein mehrstufiger hierarchischer Strukturbildungsprozess. Die in der Literatur bekannten Modelle der nukleierten Polymerisierung und der nukleierten Konformationskonversion werden dem höchstens in gewissen Teilaspekten gerecht. Die Annahme einer universellen Kinetik der Amyloidbildung kann im Lichte der Ergebnisse dieser Arbeit nicht aufrechterhalten werden. Dagegen scheinen die Zustände des kritischen Oligomers und der Protofibrille als Hierarchiestufen der Amyloidbildung generische Bestandteile des Prozesses zu sein. Die Kinetik der Bildung der verschiedenen Hierarchiestufen weist keine nennenswerten Gemeinsamkeiten zwischen den drei untersuchten Proteinen auf., This thesis deals with the kinetics of misfolding and aggregation of proteins. The kinetics of amyloid formation and precursors of three proteins, phosphoglcerate kinase (PGK), a barstar variante and the Syrian hamster Prion protein (SHaPrP(90-232)) were investigated by the use of dynamic and static light scattering, infrared spectroscopy, circular dichroism, electron microscopy and in part by analytical chromatography. The kinetics were described with concepts from the theory of colloidal aggregation and chemical kinetics. The modelling of the kinetics starting from the monomeric PGK at pH 2 and 190 mM NaCl points to a two stage reaction cascade built up by irreversible, bimolecuar elementary reaction steps. During the first stage a narrow distributed ensemble of oligomeric states with an average mass of ten monomers and essentially ordered amounts of beta-sheet structure is built up. Protofibrils are formed by coalescence of the structural polar oligomers provided by the first stage which are termed critical oligomers. The found coupling between growth and acquisition of beta-sheet structure is interpreted in terms of a generalized diffusion-collision model, where stabilization takes place by intermolecular interactions. The misfolding and aggregation of SHaPrP(90-232) shows an apparent two-state transition between the initial monomeric, alpha-helical state and an beta-sheet rich, annular octamer with high reaction order (>2.5) at pH 4.2 and 1 M GuHCl with appropriate amounts of salt added. Progress curves monitoring the secondary structure transition can be fitted by the time-course of bimolecular reactions. The octamer forms multimers at high protein concentrations. Formation of protofibrils sets up on very long time-scales. The critical octamer is a precursor for all subsequent growth processes. The non-native, partially folded state of barstar at low pH (A-state) can be converted in a two-stage process first to protofibrils and then to mature amyloid fibrils under appropriate environmental conditions. Conversion of the oligomeric A-state (average mass of 16 monomers) can be activated by elevated temperatures (T>50°C) in the presence of moderate amounts of salt ([NaCl]>0). Formation of protofibrils is independent of protein concentration. Amorphous aggregates are formed at room temperature with sufficient amounts of salt added. In contrast elevated temperatures in absence of salt lead to dissociation of the oligomeric A-state. All three proteins have to populate an oligomeric, partially folded state to form protofibrils and eventually mature fibrils. These critical oligomers are long-lived intermediates which are the pivotal point from which all other structures arise. Formation of amyloid fibrils is a hierarchical assembly process where structures are built up by several stages. Models known from the literature, in particular nucleation polymerization and nucleated conformational conversion, only master partial aspects of amyloid formation. The wide-spread assumption of a universal kinetics of amyloid formation turns out to be unjustified. In contrast, the states of critical oligomer and protofibril seem to be generic parts of the hierarchical assembly process. Comparison of the kinetics of each hierarchical level amoung the three investigated proteins shows no considerable similarities.

Ziel der Arbeit war es, die Bedeutung der Glykosylierung des Prionproteins für die Pathogenese der Scrapie-Erkrankung zu untersuchen. Obwohl nach dem derzeitigen Wissensstand ein fehlgefaltetes Protein (PrPSc) die Krankheit verursacht, können bei der Scrapie-Erkrankung verschiedene Stämme unterschieden werden. Zuckerseitenketten des Prionproteins werden als eine mögliche Ursache dieser Stammvielfalt diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollten deshalb verschiedene transgene Mäuse hergestellt werden, die un- bzw. monoglykosyliertes Mausprionprotein exprimieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Deletion der ersten Erkennungssequenz für N-Glykosylierung durch den Austausch von Threonin zu Alanin an Kodon 182 des Maus-Prionproteins zu einer gestörten PrPsen-Synthese mit behinderter Oberflächenexpression führt. Ebenso waren transgene Mäuse mit dieser Mutation resistent gegenüber einer Scrapie-Infektion mit zwei verschiedenen Stämmen. Die Zerstörung der zweiten Glykosylierungsstelle beeinträchtigte indes weder Trafficking noch die grundsätzliche Scrapie-Infizierbarkeit. Da es in der Literatur Hinweise gab, dass PrPsen auf der Zelloberfläche exprimiert werden muss, damit PrPres Zellen infizieren kann, stellte sich die Aufgabe transgene Tiere herzustellen, deren glykosylierungsmutiertes PrP möglichst authentisch prozessiert wird, um so eine wichtige Grundvoraussetzung für die Infizierbarkeit der Mäuse zu schaffen. Aus diesem Grund wurden verschiedene Erkennungssequenz-mutierte PrP-Moleküle in Zellkultur charakterisiert. Dazu wurden über 20 verschiedene PrPsen-Mutanten kloniert, sequenziert und anschließend in verschiedenen Zelllinien mit immunologischen und biochemischen Methoden untersucht. Mittels Oberflächenbiotinylierung, Immunfluoreszenz, Endo H-Verdau und Durchflusszytometrie wurde die Zell-Topologie der PrP-Mutanten ermittelt. Im Westernblotverfahren in Verbindung mit PNGase F-Verdau wurde der Glykosylierungszustand der Moleküle untersucht. Die Verankerungsform der Moleküle wurde mittels PIPLC-Verdau, das Vorhandensein von Schwefelbrücken in einem weiteren proteinbiochemischen Verfahren untersucht. Über Ultrazentrifugation wurde die Löslichkeit der Moleküle bestimmt. Nach der Charakterisierung von PrPsen wurden verschiedene ausgewählte Mutanten in scrapieinfizierten Zellen (ScN2a) auf Umfaltbarkeit in ihre Proteinase K-resistente Isoform PrPres untersucht. Zu diesem Zweck wurden ScN2a Zellen mittels eines retroviralen Systems transduziert und Zellhomogenate direkt bzw. nach Proteinase K-Verdau und Ultrazentrifugation im Westernblot untersucht. Dabei zeigte sich, dass prinzipiell jede der sechs untersuchten Mutanten (Wt3F4, T182A, T182N, T198A, T182A/T198A, T182N/T198A) konvertierbar war. Die unglykosylierte Mutante T182N/T198A zeigte jedoch einen dominant-negativen Effekt, d.h. eine Umfaltung war nur möglich, wenn dieses Konstrukt in geringen Mengen in der Zelle exprimiert wurde. In Anwesenheit von vielen mutierten PrPsen-Molekülen konnte keine Konversion dieser Mutante detektiert werden, während gleichzeitig die nachweisbare Menge an endogenem Maus- PrPres abnahm. Dieser Effekt wurde bis dato noch nicht im Zusammenhang mit Mutationen in diesem Bereich des Prionproteins beschrieben. Bei dem Versuch Maus-Neuroblastomzellen (N2a), welche mutiertes PrPsen exprimieren, mit drei verschiedenen TSE-Stämmen (Me7, Chandler und 79A) zu infizieren, war nur der Stamm Me7 in der Lage 3F4-getaggtes Prionprotein umzufalten. Unter den gewählten Versuchsbedingungen wurden nur die Mutanten umgefaltet, die vergleichbar mit Wildtyp 3F4 auf der Zelloberfläche detektiert werden konnten (T182N, T198A, T182N/T198A). Demnach bestätigte sich, dass für eine de novo Scrapie-Infektion einer Zelle das umzufaltende PrPsen-Molekül in ausreichender Menge auf der Zelloberfläche vorhanden sein muss. PrP-Mutanten (T182N, T198A, T182N/T198A) mit wildtypähnlichem Verhalten wurden anschließend zur Herstellung transgener Mäuse verwendet. Zu diesem Zweck wurden PrP% -Mäuse, welche kein Prionprotein besitzen, mit dem jeweiligen Konstrukt mikroinjiziert. Das Genom der Nachkommen wurde mittels verschiedener PCR-Reaktionen auf das Vorliegen und die Kopienzahl eingebauter, transgener DNA untersucht. Die Prionprotein-Expression wurde sowohl qualitativ als auch quantitativ analysiert. Diese Mäuse überexprimierten bis zu vierfach im Vergleich zur Wildtypmaus Maus-Prionprotein und stellen so eine Infizierbarkeit versprechende Verbesserung der bisher von DeArmond et al. (DeArmond et al., 1997) publizierten Mäuse T182A, T182A/T198A dar, die bei geringer PrPsen-Expressionsrate nicht mit Scrapie infizierbar waren. In Infektionsexperimenten kann nun mittels der hier vorgestellten Mäuse ermittelt werden, wie Prionproteine in der Lage sind, allein auf der Basis einer Polypeptidkette Stammeigenschaften zu vermitteln. The aim of this work was to elucidate the role of the glycosylation of the prion protein for the pathogenesis of the scrapie disease. The infectious agent of this disease is postulated to be only one missfolded protein (PrPSc). Therefore, it is an intriguing question, how one protein can encipher different scrapie strains. In this context oligosaccharide-chains are discussed as a possible reason for this variety of strains. Therefore, a set of different transgenic mice was generated, which of them express mono- or diglycosylated prion protein. Earlier work (Rogers et al. 1990; Lehmann and Harris 1997) showed that the deletion of the first consensus-site for N-glycosylation leads to an aberrant synthesis of PrPsen characterized by missing surface expression. This was achieved by the substitution of threonine by alanine at codon 182. Transgenic mice carrying this mutation were resistant to scrapie infection with two different scrapie strains (DeArmond et al. 1997). On the other hand, the deletion of the second glycosylation site did neither change the trafficking of the prion protein nor the fundamental susceptibility. There was evidence in literature, that the surface expression of PrPsen is preponderance for a de novo scrapie infection of cells. Therefore, the aim was to generate transgenic mice, which express surface expressed glycosylation mutants of PrP. The first step was to generate 20 different glycosylation mutants. All mutants were verified by sequencing, expressed in different cell-lines, and investigated by immunological and biochemical methods. Thereafter, the topology of PrP-mutants in the cell was determined by surface-biotinylation, immunocytochemical staining, digestion by Endo H and FACS-analysis. The state of glycosylation was validated by PNGaseF-digestion and westernblotting. The attachment of PrP to the cell membrane was elucidated by PIPLC-release. Last, the solubility of the mutant proteins was defined by ultracentrifugation and the existence of S-S-bridges was elucidated by biochemical methods. After the characterization of PrPsen particular mutants were selected and investigated for their convertibility into the proteinase K-resistant isoform PrPres. For this purpose, scrapie infected cells (ScN2a-cells) were transduced using a retroviral system and cell homogenates were treated with proteinase K, ultracentrifugated, and analyzed by westernblotting. It became apparent that all of the investigated mutants (Wt3F4, T182A, T182N, T198A, T182A/T198A, T182N/T198A) were convertible. However, the unglycosylated mutant T182N/T198A showed a dominant-negative inhibition. In other words, conversion was only possible if this construct was expressed in small amounts. In the presence of many mutated proteins no conversion was found and the detectable amount of endogenous mouse-PrP was reduced. This effect has never been described before in context with mutations in this region of the protein. The next step was to challenge Maus-Neuroblastoma cells (N2a), which express mutated PrPsen, with three different scrapie strains (Me7, Chandler and 79A). Only the challenge by scrapie strain Me7 lead to conversion of 3F4-tagged prion protein. At the chosen experimental conditions only mutants were convertible, which showed wildtype-like surface expression in tissue culture (T182N, T198A, T182N/T198A). Therefore, it was demonstrated that for a de novo infection of cells the target protein (PrP[sen]textsuperscript{sen}) must be present on the cell surface in sufficient amount. PrP-mutants (T182N, T198A, T182N/T198A) with wildtype-like behavior were used for the generation of transgenic mice. For this reason, PrP%-mice, missing any PrP, were microinjected with the corresponding construct. The genome of the offspring was screened by different PCR-reactions and analyzed for the existence and the copy-number of the transgene. The protein expression was analyzed in a qualitative and quantitative manner. The transgenic mice overexpressed prion protein of up to four times as much as the wildtyp-mice and promise therefore to be infectible. This result represents an improvement to the earlier published work by DeArmond et al. (T182A, T182A/T198A), whos mice showed low expression rates and low susceptibility to scrapie infection (DeArmond et al., 1997). In addition, further infection experiments with the presented transgenic mice could help to clarify the principle how prion proteins are capable to encipher strain variety on the basis of only one single polypeptide chain.

In neuster Zeit wurde in der Tagespresse und i n der Fachliteratur viel uber die Erschleinung einer neuen Ruinderkrankheit geschrieben, wodurch die Offentlichkeit sehr besorgt wurde. Es handelt sich um eine schwere infektiose und meist todlich endende Erkrankung, die wegen ihrer Symptome Rinderwahnsinn gennant wird. Nach den bisherigen Untersuchungen scheint sie auf den Menschen ubertragbar zu sein und ruft dann eine besondere Form der todlichen Creutzfeld-Jacob-Krankheit hervor.