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Objectives: Cyclic nucleotide phosphodiesterase 2A (PDE2A), an enzyme which hydrolyzes the second messengers cAMP and cGMP, is highly enriched in distinct areas of the brain. Accordingly, PDE2A is involved in important signaling pathways related to normal brain function but also to neurodegeneration and neuro-oncology [1]. To enable the visualization of this protein in the brainwith PET, we developed a novel fluorine-18 radioligand for PDE2A. Methods: Based on the benzoimidazotriazine (BIT) tricyclic scaffold, several fluorine-containing derivatives were synthesized via a multi-step synthesis route, and their inhibitory profiles were assessed by PDE isoenzyme-specific activity assays. The most potent and selective PDE2A ligand BIT1 was radiolabeled via nucleophilic aromatic substitution of the corresponding 2-nitro pyridine precursor by [18F]fluoride in DMSO with thermal heating (Figure 1). [18F]BIT1 was isolated using semi-preparative HPLC (Reprosil-Pur C18-AQ column, 250 x 10 mm, 46% ACN/aqu. 20 mM NH4OAc, flow 5.5 mL/min) followed by final purification with solid-phase extraction and formulation in isotonic saline containing 10% ethanol. Preliminary in vitro autoradiography and in vivo PET studies (60 min dynamic PET imaging, nanoScan® PET/MRI, MEDISO, Budapest, Hungary) of [18F]BIT1 were performed using pig brain slices and female CD-1 mice, respectively. The in vivo metabolism of [18F]BIT1 was investigated by radio-HPLC analysis of mouse plasma and brain samples at 30 min p.i. Results: From the series of BIT derivatives, BIT1 was selected as candidate for PET imaging of PDE2A based on the most suitable inhibitory potential and profile (IC50 PDE2A3 = 3.3 nM;16-fold selectivity over PDE10A). [18F]BIT1 was successfully synthesized with a radiochemical yield of 54 ± 2% (n = 3, EOB), molar activities of 155 – 175 GBq/μmol (EOS) and radiochemical purities of ≥99%. [18F]BIT1 was stable in saline, pig plasma, and n-octanol up to 60 min at 37 °C. The distribution pattern of [ 18F]BIT1 in pig brain cryosections corresponds to the spatial distribution of PDE2A with accumulation in the striatal regions caudate nucleus and nucleus accumbens. Additionally, the displacement of [18F]BIT1 with BIT1 as well as TA1 (a potent PDE2A ligand) indicated saturability and selectivity of these binding sites. Uptake of [18F]BIT1 in the brain was shown by subsequent imaging studies in mice (SUVwhole brain = 0.7 at 5 min p.i.); however, more detailed analyses revealed nonspecific distribution of the tracer in the brain (78% parent compound at 30 min p.i.). Conclusions: The potent and selective PDE2A inhibitor [18F]BIT1 binds in vitro in brain regions known to express PDE2A. Further structural modifications will be performed to develop radiotracers with improved brain uptake and target-selective accumulation in vivo. Acknowledgement 1. Deutsche Forschungsgemeinschaft (German Research Foundation, SCHE 1825/3-1). 2. Scholarship Program for Research and Innovation in Science and Technology Project (RISET-PRO)-Indonesia Ministry of Research, Technology and Higher Education (World Bank Loan No: 8245-ID) References [1] S. Schröder, B. Wenzel, W. Deuther-Conrad, M. Scheunemann, P. Brust, Novel Radioligands for Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase Imaging with Positron Emission Tomography: An Update on Developments Since 2012, Molecules 21 (2016) 650–685.

In plants, nitric oxide (NO)-mediated 3′, 5′-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) synthesis plays an important role during pathogenic stress response, stomata closure upon osmotic stress, the development of adventitious roots and transcript regulation. The NO-cGMP dependent pathway is well characterized in mammals. The binding of NO to soluble guanylate cyclase enzymes (GCs) initiates the synthesis of cGMP from guanosine triphosphate. The produced cGMP alters various cellular responses, such as the function of protein kinase activity, cyclic nucleotide gated ion channels and cGMP-regulated phosphodiesterases. The signal generated by the second messenger is terminated by 3′, 5′-cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDEs) enzymes that hydrolyze cGMP to a non-cyclic 5′-guanosine monophosphate. To date, no homologues of mammalian cGMP-synthesizing and degrading enzymes have been found in higher plants. In the last decade, six receptor proteins from Arabidopsis thaliana have been reported to have guanylate cyclase activity in vitro. Of the six receptors, one was shown to be a NO dependent guanylate cyclase enzyme (NOGC1). However, the role of these proteins in planta remains to be elucidated. Enzymes involved in the degradation of cGMP remain elusive, albeit, PDE activity has been detected in crude protein extracts from various plants. Additionally, several research groups have partially purified and characterized PDE enzymatic activity from crude protein extracts. In this review, we focus on presenting advances toward the identification of enzymes involved in the cGMP metabolism pathway in higher plants.

Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine chronische potentiell reversible Lungenerkrankung Frühgeborener, die hauptsächlich durch mechanische Ventilation und die hohe Sauerstoffkonzentration während der Behandlung des Atemnotsyndroms (ARDS) verursacht wird. Die Anzeichen der neuen Form der BPD, welche durch ein gestörtes alveoläres Wachstum sowie durch eine verminderte Vaskularisierung der Lunge charakterisiert wird, können auch an Lungen neonataler Hyperoxie-exponierter Mäuse beobachtet werden. Während der normalen Lungenentwicklung spielt die Regulation der second messenger cAMP und cGMP eine wichtige Rolle. Daher nehmen Phosphodiesterasen (PDEs), die für die Hydrolyse von cAMP und cGMP verantwortlich sind, eine bedeutsame Stellung ein. Da es möglich ist, dass die Entwicklung einer BPD durch eine veränderte Expression und Regulation von PDEs gefördert oder beeinflusst wird, sollte diese in der vorliegenden Arbeit anhand eines neonatalen hyperoxischen Mausmodells und anhand von Hyperoxie-exponierten pulmonalen Epithelzellen untersucht werden. PDE-Expressionsanalysen hyperoxischer Mauslungen ergaben eine erhöhte Gen- und Protein-expression der cAMP-spezifischen PDEs und speziell der PDE4. Durch immunhistochemische Färbungen konnte die PDE4 sowohl in pulmonalen Epithelzellen, als auch in Entzündungszellen detektiert werden. Die Behandlung Hyperoxie-exponierter Mäuse mit dem PDE4-spezifischen Inhibitor Cilomilast führte neben einem verbesserten Allgemeinbefinden der Tiere auch zu leichten Verbesserungen im Körpergewicht, teilweise zu einer signifikant verbesserten Lungenstruktur und zu einer gesteigerten Lungenfunktion. Bei der Untersuchung Hyperoxie-exponierter pulmonaler Epithelzellen konnte ebenfalls eine erhöhte PDE4A-Proteinexpression festgestellt werden, die jedoch mit einer geringeren PDE4-Phosphorylierung, einer geringeren PDE4-Aktivität und einer gesteigerten intrazellulären cAMP-Konzentration und IL 6-Freisetzung unter Hyperoxie einher ging. Bei der Stimulation pulmonaler Epithelzellen mit rekombinanten IL-6 zeigte sich neben der Aktivierung des MAPK und JAK/STAT-Signalwegs auch eine erhöhte PDE4A-Phosphorylierung, die mit einer gesteigerten PDE4-Aktivität einher ging. Um den Mechanismen der durch Cilomilast bewirkten Verbesserungen der Lungenstruktur und funktion näher auf den Grund zu gehen, wurde die Proliferation pulmonaler Epithelzellen unter Hyperoxie mit verschiedenen Cilomilast-Konzentrationen untersucht. Es wurde jedoch deutlich, dass Cilomilast in Konzentrationen ab 10µM hemmend auf das Zellwachstum pulmonaler Epithelzellen wirkt. Bei Untersuchungen des pro-proliferativen Transkriptionsfaktors Stat3, der unter Hyperoxie eine herabgesetzte Tyr705-Phosphorylierung aufwies, konnte durch Cilomilast eine leichte Wiederherstellung der Tyr705-Phosphorylierung und wahrscheinlich damit verbunden, eine erhöhte Expression von SP-B, nicht aber von SP-C, bewirkt werden. Zusammenfassend machen diese Ergebnisse deutlich, dass die PDEs unter hyperoxischen Bedingungen eine veränderte Expression und Aktivität aufweisen, und dass die Hemmung der cAMP-spezifischen PDE4 im hyperoxischen Mausmodell, hauptsächlich durch eine Abschwächung der Entzündungsreaktion in der Lunge, zu einer Verbesserung der Lungenstruktur und funktion führt. In pulmonalen Epithelzellen scheint die Aktivität der PDE4 jedoch durch einen unbekannten Faktor beeinträchtigt zu werden, der den intrazellulären cAMP-Spiegel ansteigen lässt und somit vermutlich die Apoptose der Zellen unter Hyperoxie fördert. Da SP-B für die postnatale Lungenfunktion unverzichtbar ist und Cilomilast die SP B-Expression in pulmonalen Epithelzellen steigert, könnte eine Therapie mit Cilomilast eine Behandlungsmöglichkeit der BPD darstellen., Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a chronic lung disease seen in premature infants exposed to high oxygen levels and mechanical ventilation and is characterized by an arrest in alveolar development. The disease can be mimicked by prolonged exposure of newborn mice to hyperoxia which results in a disruption of distal lung growth with large, simplified alveolar structures and an increased septal wall thickness. During normal lung development the second messengers cAMP and cGMP play important roles in cellular signalling. Therefore Phosphodiesterases (PDEs), the cyclic nucleotide degrading enzymes, are of particular importance as they can show an altered expression and regulation during the development of BPD. In this work the role of phosphodiesterases in hyperoxia induced lung injury in newborn mice was investigated. Further the expression and activity of PDEs in alveolar epithelial cells (AECs) exposed to hyperoxia has been analysed. PDE expression analysis of hyperoxic mice lungs showed increased gene and protein expression of the cAMP specific PDEs, especially of PDE4. By immunohistochemical staining of mouse lung tissue PDE4 has been localized in the pulmonary epithelium as well as in inflammatory cells. Treatment of hyperoxia exposed mice with the PDE4 specific inhibitor Cilomilast resulted beside a better well-being of the animals in an improved body weight and an enhanced lung function. Investigation of hyperoxia exposed AECs also revealed increased PDE4A protein expression but accompanied by a lowered PKA-phosphorylation of PDE4, less PDE4 activity and elevated intracellular cAMP concentrations and IL 6 release. In order to clarify the mechanisms of the beneficial effects of Cilomilast on structure and function of the lung, the proliferation of AECs with different Cilomilast concentrations during hyperoxic exposure was investigated. Cilomilast was not able to improve growth of AEC under hyperoxic conditions and inhibited cell growth of AECs in concentrations higher than 10µM. In contrast Cilomilast increased phosphorylation of the proproliferative transcription factor Stat3 on tyrosine residue 705 which was decreased in hyperoxia. This led most probably to the increased expression of SP-B but not SP-C. All together these results demonstrate that PDEs show a different expression and activity in mice lungs after hyperoxic exposure. Inhibition of PDE4 leads to a lowered inflammation and therefore to an improvement in alveolarisation and lung function. In AECs activity of PDE4 seems to be affected by an unknown factor which leads to increased cAMP concentrations and therefore probably to higher apoptosis of cells during hyperoxic exposure. As hydrophobic SP-B is indispensable for postnatal lung function and survival the treatment with Cilomilast could offer a new therapeutic modality in the clinical management of BPD.

Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine chronische potentiell reversible Lungenerkrankung Frühgeborener, die hauptsächlich durch mechanische Ventilation und die hohe Sauerstoffkonzentration während der Behandlung des Atemnotsyndroms (ARDS) verursacht wird. Die Anzeichen der neuen Form der BPD, welche durch ein gestörtes alveoläres Wachstum sowie durch eine verminderte Vaskularisierung der Lunge charakterisiert wird, können auch an Lungen neonataler Hyperoxie-exponierter Mäuse beobachtet werden. Während der normalen Lungenentwicklung spielt die Regulation der second messenger cAMP und cGMP eine wichtige Rolle. Daher nehmen Phosphodiesterasen (PDEs), die für die Hydrolyse von cAMP und cGMP verantwortlich sind, eine bedeutsame Stellung ein. Da es möglich ist, dass die Entwicklung einer BPD durch eine veränderte Expression und Regulation von PDEs gefördert oder beeinflusst wird, sollte diese in der vorliegenden Arbeit anhand eines neonatalen hyperoxischen Mausmodells und anhand von Hyperoxie-exponierten pulmonalen Epithelzellen untersucht werden. PDE-Expressionsanalysen hyperoxischer Mauslungen ergaben eine erhöhte Gen- und Protein-expression der cAMP-spezifischen PDEs und speziell der PDE4. Durch immunhistochemische Färbungen konnte die PDE4 sowohl in pulmonalen Epithelzellen, als auch in Entzündungszellen detektiert werden. Die Behandlung Hyperoxie-exponierter Mäuse mit dem PDE4-spezifischen Inhibitor Cilomilast führte neben einem verbesserten Allgemeinbefinden der Tiere auch zu leichten Verbesserungen im Körpergewicht, teilweise zu einer signifikant verbesserten Lungenstruktur und zu einer gesteigerten Lungenfunktion. Bei der Untersuchung Hyperoxie-exponierter pulmonaler Epithelzellen konnte ebenfalls eine erhöhte PDE4A-Proteinexpression festgestellt werden, die jedoch mit einer geringeren PDE4-Phosphorylierung, einer geringeren PDE4-Aktivität und einer gesteigerten intrazellulären cAMP-Konzentration und IL 6-Freisetzung unter Hyperoxie einher ging. Bei der Stimulation pulmonaler Epithelzellen mit rekombinanten IL-6 zeigte sich neben der Aktivierung des MAPK und JAK/STAT-Signalwegs auch eine erhöhte PDE4A-Phosphorylierung, die mit einer gesteigerten PDE4-Aktivität einher ging. Um den Mechanismen der durch Cilomilast bewirkten Verbesserungen der Lungenstruktur und – funktion näher auf den Grund zu gehen, wurde die Proliferation pulmonaler Epithelzellen unter Hyperoxie mit verschiedenen Cilomilast-Konzentrationen untersucht. Es wurde jedoch deutlich, dass Cilomilast in Konzentrationen ab 10µM hemmend auf das Zellwachstum pulmonaler Epithelzellen wirkt. Bei Untersuchungen des pro-proliferativen Transkriptionsfaktors Stat3, der unter Hyperoxie eine herabgesetzte Tyr705-Phosphorylierung aufwies, konnte durch Cilomilast eine leichte Wiederherstellung der Tyr705-Phosphorylierung und wahrscheinlich damit verbunden, eine erhöhte Expression von SP-B, nicht aber von SP-C, bewirkt werden. Zusammenfassend machen diese Ergebnisse deutlich, dass die PDEs unter hyperoxischen Bedingungen eine veränderte Expression und Aktivität aufweisen, und dass die Hemmung der cAMP-spezifischen PDE4 im hyperoxischen Mausmodell, hauptsächlich durch eine Abschwächung der Entzündungsreaktion in der Lunge, zu einer Verbesserung der Lungenstruktur und – funktion führt. In pulmonalen Epithelzellen scheint die Aktivität der PDE4 jedoch durch einen unbekannten Faktor beeinträchtigt zu werden, der den intrazellulären cAMP-Spiegel ansteigen lässt und somit vermutlich die Apoptose der Zellen unter Hyperoxie fördert. Da SP-B für die postnatale Lungenfunktion unverzichtbar ist und Cilomilast die SP B-Expression in pulmonalen Epithelzellen steigert, könnte eine Therapie mit Cilomilast eine Behandlungsmöglichkeit der BPD darstellen. Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a chronic lung disease seen in premature infants exposed to high oxygen levels and mechanical ventilation and is characterized by an arrest in alveolar development. The disease can be mimicked by prolonged exposure of newborn mice to hyperoxia which results in a disruption of distal lung growth with large, simplified alveolar structures and an increased septal wall thickness. During normal lung development the second messengers cAMP and cGMP play important roles in cellular signalling. Therefore Phosphodiesterases (PDEs), the cyclic nucleotide degrading enzymes, are of particular importance as they can show an altered expression and regulation during the development of BPD. In this work the role of phosphodiesterases in hyperoxia induced lung injury in newborn mice was investigated. Further the expression and activity of PDEs in alveolar epithelial cells (AECs) exposed to hyperoxia has been analysed. PDE expression analysis of hyperoxic mice lungs showed increased gene and protein expression of the cAMP specific PDEs, especially of PDE4. By immunohistochemical staining of mouse lung tissue PDE4 has been localized in the pulmonary epithelium as well as in inflammatory cells. Treatment of hyperoxia exposed mice with the PDE4 specific inhibitor Cilomilast resulted beside a better well-being of the animals in an improved body weight and an enhanced lung function. Investigation of hyperoxia exposed AECs also revealed increased PDE4A protein expression but accompanied by a lowered PKA-phosphorylation of PDE4, less PDE4 activity and elevated intracellular cAMP concentrations and IL 6 release. In order to clarify the mechanisms of the beneficial effects of Cilomilast on structure and function of the lung, the proliferation of AECs with different Cilomilast concentrations during hyperoxic exposure was investigated. Cilomilast was not able to improve growth of AEC under hyperoxic conditions and inhibited cell growth of AECs in concentrations higher than 10µM. In contrast Cilomilast increased phosphorylation of the proproliferative transcription factor Stat3 on tyrosine residue 705 which was decreased in hyperoxia. This led most probably to the increased expression of SP-B but not SP-C. All together these results demonstrate that PDEs show a different expression and activity in mice lungs after hyperoxic exposure. Inhibition of PDE4 leads to a lowered inflammation and therefore to an improvement in alveolarisation and lung function. In AECs activity of PDE4 seems to be affected by an unknown factor which leads to increased cAMP concentrations and therefore probably to higher apoptosis of cells during hyperoxic exposure. As hydrophobic SP-B is indispensable for postnatal lung function and survival the treatment with Cilomilast could offer a new therapeutic modality in the clinical management of BPD.

Die schwere pulmonale Hypertonie stellt ein bedrohliches Krankheitsbild mit eingeschränkter Prognose dar. Sie entsteht entweder auf dem Boden von Lungenerkrankungen oder liegt als primäre Form vor. Erfolgversprechende neue Therapieansätze, mit Inhalation vasodilatierender Agenzien werden augenblicklich in klinischen Studien getestet. Im Vordergrund stehen hier die Arachidonsäuremetaboliten Prostazyklin und sein stabiles Analogon Iloprost. Über deren Aktivierung der Adenylatzyklase erfolgt eine vermehrte Bildung von zyklischem Adenosinmonophosphat, das eine zentrale Rolle bei der Vasodilatation spielt. Durch Anwendung des transbronchialen Appliaktionsweges (Aerosolierung) dieser Substanzen kann eine auf das Lungengefäßbett begrenzte Blutdrucksenkung erzielt werden ohne eine systemische Hypotonie zu provozieren (pulmonale Selektivität). Außerdem besteht durch diese Applikationsform auch eine intrapulmonale Selektivität durch das Erreichen von Lungenarealen, die an der Ventilation teilnehmen. Auf diese Weise wird eine Zunahme bestehender Gasaustauschstörungen vermieden oder sogar, durch Umverteilung der Perfusion, eine Besserung derselben erzielt. Eingeschränkt wird diese Therapiemöglichkeit allerdings durch die nur kurz anhaltenden positiven hämodynamischen und den Gasaustausch betreffenden Wirkungen. Dies verhindert eine kontinuierliche pulmonalarterielle Drucksenkung und macht häufige Inhalationen nötig. Ziel der vorgelegten Arbeit war es, mögliche neue Ansatzpunkte für eine Therapie der akuten und chronischen pulmonalen Hypertonie zu finden. Dies galt insbesondere in Bezug auf die maximal erreichbare pulmonalarterielle Drucksenkung und auch auf die Zeitdauer der erzielbaren Effekte. Es galt die Hypothese zu prüfen, dass durch kombinierte Verabreichung eines Adenylatzyklasestimulus und eines Phosphodiesterase-Inhibitors eine Verbesserung der hämodynamischen Antwort zu erzielen ist. Dies geschah unter der Vorstellung, das Phoshodiesterasen das Abbausystem des vasodilatierenden zyklischen Adenosinmonophoshat bilden . Die Studien wurden an einer experimentell erzeugten akuten pulmonalen Hypertonie am etablierten Modell der isoliert ventilierten und blutfrei perfundierten Kaninchenlunge durchgeführt. Die gemessenen Parameter waren der pulmonalarterielle Druck, das relative Organgewicht als Maß der Ödementwicklung sowie Ventilations-/ Perfusionsverhältnisse zur Quantifizierung von Gasaustauschstörungen, die anhand der MIGET bestimmt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde die vasodilative Eigenschaft des dualen Phosphodiesterase-Inhibitors Zardaverin gezeigt. Inhalative Verabreichung von Prostazyklin und seinem stabilen Analogon Iloprost erbrachte eine intrapulmonal selektive Vasodilatation. Zur Kombinationstherapie wurde eine Dosis des Phosphodiesterase-Inhibitors etabliert, die per se keine Auswirkung auf die geprüften Parameter hatte. Durch die kombinierte Applikation des inhalativen Prostazyklin oder Iloprost mit Zardaverin konnte ein Synergismus hinsichtlich der Auswirkung auf die Hämodynamik, Ventilations-/ Perfusionsverteilung und die Ödementwicklung erzielt werden. Die zeitgleiche Verabreichung von Zardaverin und Iloprost stellte die wirksamste Therapiegruppe in unseren Versuchen dar. Diese Arbeit zeigt den Synergismus zwischen inhalativen Prostanoiden und dem gleichzeitig verabreichten dualselectiven Phosphodiesterase-Inhibitor Zardaverin in Bezug auf die pulmonalarterielle Drucksenkung, die Lungenödementstehung und den Gasaustausch in einem Modell der pulmonalen Hypertonie, Severe pulmonary hypertension is a life threatening disease with poor prognosis. Pulmonary hypertension develops from underlying lung disease or exists as a primary form. Promising new therapies, which include inhalation of vasodilators are under clinical investigation. The major substances, that are tested in this respect are prostacylin (epoprostenol) and its analogue iloprost. Both induce activation of adenylatcyclase, that in turn leads to production of cyclic adenosin monophosphat, which plays a central role in vasodilation. When these substances are applicated via the bronchial route (aerosolisation), vasodilation results that is restricted to the pulmonary vascular bed and does not cause systemic hypotension (pulmonary selectivity). Also, via aerosolisation intrapulmonary selectivity is given as lung areas are targeted that participate in ventilation. This can avoid an increase - or even lead to improvement - of existing gas exchange disturbances, via redistribution of perfusion. This new therapeutic option is limited through the short effects on hemodynamic and gas exchange. As a result, a continuous relief of pulmonary hypertension is not reached and makes repetitive inhalations necessary. Aim of these studies was to find starting points for new therapeutic options in the treatment of acute and chronic pulmonary hypertension. This included to increase the maximal decline of pulmonary artery pressure as well as prolongation of times of these effects. Hypothesis was, that combined application of a stimulus of adenylatecyclase and a phosphodiesterase-inhibitor leads to an improvement of the hemodynamic response. Basically, phosphodiesterases metabolise the vasodilatory cyclic adenosin monophoshat. The studies were performed in a model of artificial acute pulmonary hypertension in isolated ventilated and blood free perfused rabbit lungs. Main parameters included pulmonary artery pressure and lung weight gain as a parameter for formation of lung edema. The multiple inert gas elimination technique (MIGET) was used to measure of ventilation-/ perfusion distribution, to quantify gas exchange disturbances. As a result, the vasodilatory properties of the dualselective phosphodiesterase-inhibitor zardaverine were shown. Inhalative application of prostacyclin and iloprost led to intrapulmonary selective vasodilation. A dose of zardaverine was established, that per se did influence the measured parameters. As inhalative prostacyclin or iloprost were co-applicated with zardaverin a clear synergism with respect on hemodynamics, ventilation-/ perfusion distribution and lung edema formation was shown. The most effective combination was inhaled iloprost with zardaverin. These investigations demonstrate the synergistic effect of inhaled prostanoids and the dualselective phosphodiesterase-inhibitor zardaverin regarding relief of pulmonary artery pressure, lung edema formation and gas exchange in a model of pulmonary hypertension.