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Single-molecule spectroscopy allows the direct observation of conformational dynamics in individual biomolecules. Here, we describe how single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) reveals heterogeneous kinetics in the EBS1*/IBS1* interaction, two RNA sequences that play an important role in group II intron mediated self-cleavage. Further examples of dynamic heterogeneity in functional nucleic acids are provided and the possible origins of this phenomenon are discussed.

Extrazelluläre Ribonukleinsäuren (RNA), vor allem freigesetzt als Folge von Gewebsverletzungen, wurden von unserer Arbeitsgruppe als prokoagulatorischer und proinflammatorischer Faktor im vaskulären System identifiziert. Hierbei dient RNA einerseits über die Bindung an Proteine des intrinsischen Gerinnungsweges (Faktor XI, Faktor XII, Präkallikrein, hochmolekulares Kininogen) als effizienter Kofaktor für deren Autoaktivierung und führt zur Ausbildung eines stabilen Thrombus. Andererseits induziert extrazelluläre RNA über die Aktivierung des vaskulär-endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (VEGF-R2) den Anstieg des intrazellulären Kalzium-Spiegels. Dies resultiert in einer Hyperpermeabilität des Endothels und der Ausbildung zerebraler Ödeme in vivo. Diese Effekte wurden in vivo durch die Applikation von Ribonuklease 1 (RNase 1), aber nicht mit Desoxyribonuklease (DNase), in entsprechenden Tiermodellen signifikant blockiert.Bislang gab es keine Hinweise, ob spezifische Strukturmerkmale für die physiologischen Effekte extrazellulärer Nukleinsäuren verantwortlich sind. Daher wurde in der hier vorliegenden Arbeit die prokoagulatorische Aktivität und die Stabilität verschiedener synthetischer Desoxyribonukleinsäure- (DNA) und RNA-Oligonukleotide in humanem Plasma sowie in isolierten Systemen in Abhängigkeit zu strukturellen Charakteristika untersucht. Hierbei waren Oligonukleotide mit stabiler Haarnadelsekundärstruktur (1) stärker vor der Degradierung durch Nukleasen geschützt, (2) effiziente Kofaktoren bei der Auto-Aktivierung von Präkallikrein im isolierten System und (3) prokoagulatorisch in humanem Plasma. Über Bindungsexperimente mit verschiedenen DNA-Oligonukleotiden wurden die stärksten Wechselwirkungen zwischen prokoagulatorisch aktiven Haarnadelstrukturen und hochmolekularem Kininogen (KD=1,82 µM), einem nicht-enzymatischen Kofaktor bei der Aktivierung von Präkallikrein und Faktor XI, charakterisiert. Ebenso zeigten synthetische, therapeutisch verwendete Nukleinsäuren (Aptamere) deutliche prokoagulatorische Eigenschaften. Die systemische Applikation von Aptameren könnte somit von thrombotischen und inflammatorischen Komplikationen begleitet werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass kurze Haarnadel-enthaltende Nukleinsäurestrukturen über die spezifische Bindung an Kininogen die Aktivierung des intrinsischen Gerinnungsweges vermitteln können. Dies erweitert unsere Kenntnisse bezüglich der Interaktion zwischen Gerinnungsproteinen und Nukleinsäuren, die bisher lediglich auf deren Größe und negative Ladung zurückgeführt wurden. In diesem Zusammenhang wurde Plättchenfaktor 4 (PF4), ein basisches Chemokin, das bei der Aktivierung von Thrombozyten aus den alpha-Granula freigesetzt wird, als neues Nukleinsäure-bindendes Protein identifiziert. Aufgrund seiner starken Bindung an zelluläre und synthetische Nukleinsäuren neutralisiert PF4 deren prokoagulatorische Aktivität und beeinflusst somit als neuer Regulator das Ausmaß der intrinsischen Blutgerinnung.Zirkulierende RNasen erfüllen als effiziente Gegenspieler der verschiedenen durch extrazelluläre RNA initiierten Prozesse im Gefäßsystem protektive Aufgaben. Hierbei ist insbesondere die Regulation der in Endothelzellen exprimierten RNase 1 unter inflammatorischen und prokoagulatorischen Bedingungen von Bedeutung. Eine signifikante Verminderung der RNase 1-Expression im Endothel wurde nach Stimulation mit Tumornekrosefaktor alpha (TNF-alpha) oder Thrombin detektiert, während Lipopolysaccharide keinen Effekt hatten. Der Einfluss der Agonisten war dabei reversibel, sodass die Expression von RNase 1 nach Entfernen des Stimulus wiederhergestellt wurde.Die Herunterregulation von RNase 1 durch TNF-alpha oder RNase 1-siRNA bewirkte eine Zunahme der endothelialen Permeabilität, da das unter Kontrollbedingungen in den adherens junctions exprimierte VE-Cadherin eine veränderte, teilweise cytosolische Lokalisierung zeigte. Die Analyse der beteiligten Signalwege, die zur Erniedrigung der RNase 1 Expression nach TNF-alpha-Behandlung in Endothelzellen führte, schloss einen NFkappaB-abhängigen Regulationsmechanismus aus. Vielmehr implizierte die Wiederherstellung der RNase 1-Expression durch Inhibierung der Histondeacetylasen mit Trichostatin A, dass die TNF-alpha-bedingte erniedrigte Expression von RNase 1 über Veränderungen im Acetylierungsstatus beteiligter Proteine reguliert wird.Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine genaue Regulation des RNA/RNase 1-Gleichgewichtes auf mRNA wie auch auf Proteinebene eine wichtige Rolle bei der Homöostase des vaskulären Systems spielt., Extracellular ribonucleic acid (RNA), released particularly after tissue or vessel damage, was identified by our group as new procoagulant and proinflammatory mediator in the vascular system. RNA serves as an efficient cofactor for the auto-activation of the proteins of the intrinsic coagulation pathway (factor XI, XII, prekallikrein, high molecular weight kininogen), thereby promoting stable clot formation. Furthermore, extracellular RNA increases endothelial permeability in a vascular endothelial growth factor (VEGF)-dependent manner, resulting in enhanced cerebral edema formation in vivo. Both effects were significantly inhibited in vivo by the application of ribonuclease 1 (RNase 1) but not deoxyribonuclease (DNase) in respective pathogenic animal models.In the present study the structure-function relations of extracellular nucleic acids were characterized particularly with respect to their coagulant activities. Therefore, different deoxyribonucleic acid (DNA)- and RNA-oligonucleotides, representing diverse secondary structures, were indcluded in the analysis. The results implicate that oligonucleotides forming a stable hairpin structure (1) are better protected against the degradation by nucleases, (2) serve as effecient cofactors for the auto-activation of prekallikrein in isolated systems and (3) act as potent procoagulant cofactors in human plasma. Binding experiments with different DNA-oligonucleotides revealed specific interactions between procoagulant hairpin forming structures and high molecular weight kininogen (KD=1,82 µM), a non-enzymatic cofactor for the activation of prekallikrein and factor XI. Prominent procoagulant activities were also seen for therepeutically used nucleic acids, so called aptamers. Thus, a systemic application of these compounds could be acompanied by thrombotic or inflammatory side effects.These results implicate that nucleic acids, forming stable hairpin structures, promote the activation of the intrinsic coagulation pathway via specific binding to kininogen. This extends our knowledge of the interaction between coagulation proteins and nucleic acids, which was thought so far to depend solely on their size and negative charge.Platelet factor 4 (PF4), a basic chemokine, which is released from the a-granules of activated platelets, was identified as new nucleic acid binding protein. Based on this interaction, PF4 neutralises the procoagulant activity of cellular as well as artificial nucleic acids in a dose-dependent manner, thereby representing a new regulator of the procoagulant functions of extracellular nucleic acids.Circulating RNases, expressed in endothelial cells, represent the natural counterpart of extracellular RNA in the vascular system. In this context, the regulation of the vascular RNase 1 under inflammatory and coagulant conditions was of particular interest. A long-term treatment of human endothelial cells with tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) or thrombin revealed a significant down-regulation of RNase 1 mRNA and activity. Stimulation with lipopolysaccharids had no effect. Analysis of the endothelial barrier function revealed that the down-regulation of RNase 1 by TNF-alpha as well as the application of RNase 1-siRNA increased the permeability of the endothelial monolayer as demonstrated by rearrangement of the VE-cadherin distribution and disintegration of cellular contacts in the adherence junctions. Mechanistically, the TNF-alpha-induced decrease of RNase 1 expression was independent of the activation of NFkappaB. Yet, inhibition of histone deacetylases by trichostatin A recovered RNase 1 expression and secretion, indicating an acetylation-dependent regulation process. Furthermore, a depletion of the TNF-alpha-stimulus induced a recovery of RNase 1 expression and release in a time-dependent manner, indicative for a reversible process. These results demonstrate a down-regulation of RNase 1 on mRNA and protein level by several inflammatory stimuli including TNF-alpha, which is mediated by changes of the acetylation status. Consequently, an exact regulation of the RNA/RNase 1 balance on mRNA as well as on protein level plays an important role in the homeostasis of the vascular system.

Modified nucleoside triphosphates (dNTPs) are a versatile platform for the generation of high-density functionalized nucleic acids. The enzymatic polymerization of dNTPs allows the introduction of sensible functionalities that might not be compatible with the standard automated synthesis of oligonucleotides. Their application to in vitro selections, an elegant chemical approach to Darwinian evolution, delivers modified aptamers and catalytic nucleic acids with potentially enhanced properties. This review article highlights some recent synthetic examples of dNTPs bearing functionalities that are either found in the active site of protein enzymes or have been employed in organocatalysis and further underscores their usefulness in the development of some modified catalytic nucleic acids with special emphasis on M2+-independent RNA-cleaving DNAzymes.

Chemically modified nucleic acids find widespread use as tools in research, as diagnostic reagents and even as pharmaceutical compounds. On the background of antisense research and development, the synthesis and evaluation of modified oligonucleotides was intensively pursued in the early to mid nineties in corporate research of former Ciba. Most of these efforts concentrated on the development of sugar and/or backbone-modified derivatives for pharmaceutical applications. Additionally, oligonucleotide metal conjugates were investigated with the goal to develop artificial ribonucleases. Since the turn of the millennium also the potential of non-nucleosidic and non-hydrogen bonding building blocks has increasingly been recognized. Such derivatives possess unique properties that may have an impact in the fields of materials and genetic research. In this brief account, we take a personal look back on some past as well as some recent results.

Hochaufgelöste Strukturen von Nukleinsäuren geben Aufschluss über die Konformation, Hydratation und Ligandenbindung der Moleküle. Als Modellsysteme für natürliche Nukleinsäuren wurden zwei tRNA-Akzeptorstämme und zum Vergleich eine davon abgeleitete modifizierte „locked“ Nukleinsäure untersucht. Um eine maximale Auflösung der Strukturen zu erzielen, wurden Kristallisationsansätze unter Mikrogravitationsbedingungen durchgeführt und gleichzeitig die Länge der untersuchten Moleküle auf sieben Basenpaare begrenzt. Anhand der Struktur des tRNAArg-Akzeptorstammes konnte beispielhaft die Bindung von kleinen Molekülen an einfache Nukleinsäurefaltungsmotive gezeigt werden. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen zur basen-spezifischen Bindung von kleinen Molekülen an Aptamere und Riboswitches. Die Struktur des tRNASer- Akzeptorstammes weist durch ihre hohe Auflösung von 1,2 Å eine nahezu vollständige Hydratation aller Basenpaare auf. Da der Akzeptorstamm von tRNAs wesentliche Identitätsmerkmale für die Erkennung durch die korrespondierenden Aminoacyl-tRNA-Synthetasen trägt, konnte durch einen Vergleich mit einem Isoakzeptor der Einfluss des Wassernetzwerkes auf die Interaktion mit natürlichen Bindungspartnern untersucht werden. Dies wurde durch eine Superpositionierung der beiden Isoakzeptoren mit der Seryl-tRNA-Synthetase bestätigt und ausgeweitet. Die Sequenz und Struktur des tRNASer- Akzeptorstammes stellten die Grundlage für die Untersuchung der davon abgeleiteten Struktur einer „locked“ Nukleinsäure hinsichtlich Konformation, Hydratation und Ligandenbindung dar. Dies ermöglichte einen sequenzunabhängigen Vergleich der LNA mit der korrespondierenden RNA. Dabei zeigte sich, dass die LNA eine vorher nicht beschriebene Doppelhelixstruktur einnimmt, aus der heraus Gründe für die hohe thermische Stabilität dieser Nukleinsäureklasse abgeleitet werden konnten. Die Duplex ist im Vergleich zur RNA durch eine Streckung bei gleichzeitiger Öffnung charakterisiert, was konformationell eher anderen modifizierten als der natürlichen Nukleinsäure ähnelt. Trotz der strukturellen Unterschiede gleichen das Hydratationsmuster und das Ligandenbindungsverhalten in weiten Bereichen dem der natürlichen Nukleinsäure., High-resolution X-ray crystallography of nucleic acids is a powerful method to investigate conformation, hydration and ligand-binding of these molecules. Two tRNA-acceptorstem-microhelices where employed as model systems for natural nucleic acids and compared to a modified “locked” nucleic acid, which sequence was derived from one of those acceptorstems. Oligonucleotides were restricted to a length of seven base pairs and crystallization was even performed under microgravity conditions to maximize resolution of the structures. The structure of the tRNAArg acceptorstem can be seen as a model for the binding of small molecules to simple structural motifs of nucleic acids. The results are consistent with investigations on base-specific interactions of small molecules with aptamers and riboswitches. Due to its high resolution of 1.2 Å, the structure of the tRNASer acceptorstem reveals a nearly complete hydration of all base pairs. Since tRNA acceptorstems carry important identity elements for the interaction with the cognate aminoacyl-tRNA-synthetase, a comparison with an isoacceptor yielded insight into the impact of the hydration network for the interaction of tRNAs with other molecules. These findings were confirmed and extended by a superposition of the two isoacceptors with the seryl-tRNA-synthetase. The highly-resolved structure of the tRNASer acceptorstem was the fundament for the investigation of a “locked” nucleic acid. The sequence of the LNA was derived from the acceptorstem. This allowed a sequence independent comparison of the modified nucleic acid with its corresponding natural counterpart. The structure was investigated with focus on conformation, hydration and ligand-binding. It could be demonstrated, that the LNA shows a double helix geometry, which differs significantly from natural nucleic acids and can be rather brought in vicinity to other modified nucleic acids. The structure of the LNA duplex can be described as a stretched helix with an enlarged helical pitch. Despite these structural differences the hydration and ligand-binding ability of the modified nucleic acid are similar to those observed in RNA.

At the beginning, the two fundamental papers by Watson and Crick published in 1953 are presented. Subsequently, the main phases of protein and nucleic acids research, starting in the middle of the 19th century, are shortly reviewed. It is outlined, how the 'protein-paradigm' was gradually developed and ultimately became widely accepted. It is then described how Caspersson in 1936 newly raised the question what the chemical nature of genes was: proteins or nucleic acids ? In the main part of this report six lines of research are reviewed, the results of which led to the demise of the 'protein paradigm', the creation of the Watson-Crick model of the DNA and the elaboration of the mechanism of DNA replication: (a) mutation experiments with UV and determination of the UV action spectrum, (b) determination of the chemical identity of the transforming agent in bacteria, (c) detailed chemical analysis of the DNA of different organisms, (d) molecular investigation of the infection of bacteria by bacteriophages, (e) X-ray analysis of DNA fibers, (f) model building and theoretical treatment of all data obtained. In this article, the factors promoting and inhibiting scientific progress in this field are described (and, above all, the relations between scientists with fixated concepts). The results from these lines of research led to the recognition of the decisive role of nucleic acids as the carriers of genetic information and, in this way, formally established the 'nucleic acid paradigm'. Finally the question is discussed why Watson and Crick found the right solution for the DNA structure (and not one of their competitors).

Im Zuge der Promotionsarbeit wird das Verfahren zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren in Abwasser mit Hilfe der paramagnetischen Polystyrolkugeln der Sorte Dynabeads untersucht und optimiert. Betrachtet werden die untersuchten Standartbedingungen am Beispiel des Enterovirus Poliovirus Sabin 1 in Bezug auf die Effizienz des direkten bzw. indirekten Einfangs, des Lysevermögens der intakten Viren, sowie den Bedingungen für das Abkoppeln der isolierten Nukleinsäure von der Trägersubstanz für die 5' nicht codierende Region (5'NCR). Ferner wird geprüft, ob diese Standartbedingungen auch für andere Genomabschnitte ihre Gültigkeit besitzen und wie gegebenenfalls Variationen von Reaktionszeit, Temperatur u.ä. innerhalb der Versuchsvorschriften zu den gewünschten Ergebnissen führen. Anschließend erfolgt eine Prüfung der PCR Bedingungen, um mögliche Störfaktoren wie sie z.B. durch Inhibitoren auftreten können, auszuschließen. Durch eine Untersuchung von fünf Abwasserproben auf Enteroviren mit Hilfe Dynabeads bzw. mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit wird die Nachweisgenauigkeit zweier unterschiedlicher Isolierungssysteme verglichen und das Erfolg versprechende zur Isolierung von enteralen Viren aus Umweltwasser aus dem Raum Leipzig herangezogen. Während des Untersuchungszeitraumes vom Oktober 2002 bis Dezember 2004 werden 327 Proben (100 an der Stelle A, 96 an der Stelle B, 92 an der Stelle C und 39 an der Stelle X) auf das Vorkommen von gastroenteralen Viren (Adenoviren AdV, Astroviren AstV, Enteroviren EntV, Hepatitis A HAV, Noroviren NoV und Rotaviren A RoV) mittels PCR untersucht. Ein repräsentativer Teil der in der PCR positiven Proben wird mittels Sequenzierung untersucht, bei ca. 90% der NoV, EntV und AstV positiven Proben zusätzlich durch real-time PCR die Viruslast der Proben bestimmt. Die mögliche Infektiösität der nachgewiesenen Viren erfolgt durch eine Anzucht von Enteroviren auf Zellen. Bei einer Hybridisierungsbedingung mit 1000 mM LiCl bei 65°C für drei Stunden können Virionen erfolgreich lysiert und an einen Primer aus der 5'NCR gekoppelt werden [50]. Es kann außerdem gezeigt werden, daß dabei der indirekte Einfang gegenüber dem direkten Einfang deutlich bevorzugt wird (i.d.R. 65% zu 11%). Werden andere Genomabschnitte für eine Detektion herangezogen, so kann es Variationen der Reaktionszeit und/oder der Reaktionstemperatur zur Folge haben. Eine erfolgreiche Abkopplung der RNA von den Dynabeads erfolgt in 1x PCR Puffer bei 90°C für 5 min. Die dabei beobachteten Degradationserscheinungen der RNA haben jedoch keinen Einfluß auf das Ergebnis einer späteren Vervielfältigung mittels PCR. Es kann gezeigt werden, daß RNA, die noch an die Dynabeads gekoppelt ist, schlechter amplifiziert wird als solche, die vorher abgekoppelt wird. Durch die Zugabe von RNase-Inhibitor und durch die Behandlung mit Ultraschall wird die virale RNA im Abwasser stabilisiert und somit ein störungsfreier Nachweis mittels PCR erst ermöglicht. Jedoch ist die Effizienz dieser Methode bezüglich der Möglichkeit, in einem Reaktionsschritte alle im Abwasser befindlichen Viren zu isolieren, deutlich ungeeigneter als mit der QIAGEN-Methode. Ferner wird Ab- und Oberflächenwasser mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden auf das Vorkommen von enterale Viren (AdV, AstV, EntV, HAV, NoV und RoV) untersucht. Je weiter dabei die Untersuchungsstelle vom Klärwerk entfernt ist, desto niedriger ist die Zahl der Viren, die detektiert werden. Eine Analyse der PCR Produkte zeigt, daß die gefundenen Genotypen mit den nachgewiesenen Genotypen in der Patientendiagnostik übereinstimmen und demnach in einem saisonalen Zusammenhang zueinander stehen. EntV kann in drei von 26 Proben erfolgreich angezüchtet werden und läßt somit Aussagen über eine mögliche Infektiösität der Erreger zu [49]. Zusammenfassend kann der Beweis erbracht werden, daß Ab- und Oberflächenwasser ein mögliches Reservoir für Infektionen mit enterale Viren ist [18], auch wenn eine Analyse des Gewässers durch die bakteriologischen Indikatorgruppenvon einer mikrobiologischen Unbedenklichkeit ausgeht., In this study, a method to isolate virale nucleic acids in waste water samples with paramagnetical polystyrene beads (Dynabeads) was examined and optimated. Standart conditions for the efficiency of the indirect and direct capture, the lysis conditions for poliovirus sabin 1 but also the detachment of bound RNA from Dynabeads were considered. It was also neccessary to consider, if these standart conditions for the 5'NCR were identical with those of other genome sections. If possible, changes for temperatures, reaction time and other agents should be assimilated. At the next step, PCR conditions were examined to reduce the presence of compounds that inhibited RT or PCR. Fife waste water samples were detected for EntV with Dynabeads and QIAamp Viral RNA MiniKit. The system which included the highest efficience to detect enteroviruses, were used to analyse enteric viruses in waste and surface water samples from the river Neue Luppe and Lake Werbelin. From September 2002 to December 2004 327 water samples (100 at site A, 96 at B, 92 at C and 39 at side X) were drawn at weekly intervals and were also examined for enteric viruses such as adenovirus, astrovirus, enterovirus, hepatitis A virus, norovirus and rotavirus A by specific nested PCR systems. A selection of nested PCR products of each virus type were sequenced. 90% of all samples containing NoV, EntV and AstV underwent quantitative PCR analysis to determine the genome load as calculated per liter water before the concentration step. For further evaluation of infectivity selectetd PCR positive water specismens werde examined for EntV by cell culture. Hybridization conditions, including 1000 mM LiCl buffer and temperatures of 65°C for three hours, warranted the lysis of enterovirus and a high efficiency of capturing 5'NCR primers to the virale nucleic acid [50]. However, indirect capture was much more efficient than direct capture (mostly 65% to 11%). To catch other genome domains of Human Poliovirus Sabin 1, changes of reaction temperatures and time were neccessary. Detachment of bound RNA from Dynabeads was tested at different conditions. Best results were obtained when the samples were treated with 1x PCR buffer at 90°C for 5 min. The radioblot showed that at 90°C visible RNA breakdown had occured but it had no influence on the amplification rate of the PCR. RNA, which was not detached at Dynabeads, was amplificated with a higher rate than bound RNA. With special methods and compounds like RNase-inhibitation, inhibitations of RT or PCR were dramatically reduced. Unfortunately, this isolation method was not as efficient as the QIAGEN kit, which allowed the isolation of all virale nucleic acids in a sample using a one-step-reaction. Waste water and surface water samples were examined for AdV, AstV, EntV, HAV, NoV and RoV using by different and specifical molecularbiological methods. As demonstrated, in most cases detection rates were significantly lower at the lakeshore (site C) than at the sewage plant (site X and A). The genotype distribution and the seasonal patterns observed reflected the clinical epidemiologies of the agents. EntV were successfully cultivated from three of 26 samples and it demonstrated so the infectivity of enteric viruses although inactivation and elimination mechanisms during the sewage plant and the following concentration steps [49]. In summary, the data of this study corroborate recent evidence that surface waters are a potential reservoir for enteric viral infections [18]. This may be the case even if the classic bacteriological parameters indicatetd an accepteble waterquality.

Our group is working on the development of reliable access to biologically relevant, long, and modified RNA sequences. Here, we briefly present the chemical synthesis of such sequences with 2?-O-triisopropylsilyloxymethyl (= 2?-O-tom) protected ribonucleoside phosphoramidites, their template-directed enzymatic ligation, and some examples of modified nucleotides, designed to promote structural and biological studies.

The goal of molecular diagnostics in oncology is the early diagnosis of malignant disease processes during initial work-up or as part of follow-up. Body fluids serve as the primary material for non-invasive diagnostic methods. Besides actual tumor cells, the examination of urine can yield evidence of secreted proteins or even free nucleic acids. In principle, all of the methods available for the detection of tumor markers in tissue or blood samples can be successfully applied to the examination of urine samples. However, molecular biological examination of urine samples is associated with important problems because the cells in such samples are exposed to significant degradation and regression effects and because certain components of the urine act to inhibit the polymerase chain reaction. The present overview discusses the respective strengths and weakness of the available technology as applied to the diagnosis of urologic malignancies. Experimental studies conducted to date have reported high sensitivities and specificities for molecular diagnostics using urine samples. It is important to note that not only carcinomas of the urinary bladder can be diagnosed from material obtained in urine samples: in fact, the method can be used to diagnose entities such as renal cell and prostate carcinomas and, due to renal filtration of DNA, even non-urologic malignancies. The diagnostic application of these methods, however, remains in an experimental stage and must still clear several hurdles before becoming available for routine clinical use.