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Die Fragen, die sich vor Beginn der Arbeit stellten (s. Teil B. Herleitung der Aufgabenstellung), konnten anhand der Versuche zu dieser Arbeit weitgehend beantwortet werden. Die Hauptfrage war, inwieweit Klf4 Monozyten beeinflusst, sowohl in ihrer Anzahl als auch in ihrem Expressionsmuster. Eine weitergehende Frage beschäftigte sich mit den Aufgaben der einzelnen Domänen des Klf4-Gens, indem untersucht wurde, inwieweit das Klf4-Gen, dem eine entscheidende Sequenz fehlte, in der Lage war, Einfluss auf die Expression weiterer Gene zu nehmen. Zunächst sollten die Hinweise unserer Arbeitsgruppe auf Auswirkung der Deletion von Klf4 auf Monozyten, insbesondere Ly6Chigh, bestätigt werden. Bekannt war bereist der Einfluss von Klf4 als myeloidzellspezifischer Transkriptionsfaktor und dessen verstärkte Expression in myeloiden Vorläuferzellen und humanen Monozyten und die Aufgabe in der proinflammatorischen Signalübertragung in humanen Makrophagen. Es zeigte sich im peripheren Blut von Klf4-deletierten Mäusen (Cre-Rekombinase tragend, LoxP- flankiert) eine sehr starke Reduktion der Ly6Chigh-Subpopulation der Monozyten, während die zweite große Subpopulation, Ly6Cneg., nicht beeinträchtigt war. Auch die Reduktion im Knochenmark dieser Tiere um ca. 55 % lässt auf einen Defekt durch die Deletion von Klf4 bereits in der Entwicklung der Zellen schließen. Nachdem nun eine signifikante Einflussnahme von Klf4 auf die Entwicklung von Ly6Chigh-Monozyten gezeigt worden war, sollte als nächstes ein weiterer Parameter analysiert werden: die Expression von Klf4-Zielgenen. Es zeigte sich ein unterschiedliches Expressionsmuster bei 260 Transkripten, die sich in thematische Gruppen einteilen lassen. Dies lässt Vermutungen über die weit gestreuten Aufgaben von Klf4 aufstellen. In erster Linie fällt die große Gruppe der Transkripte der Entzündungs- und Immunantwort auf, die auf offenbar komplexe Weise durch Klf4 beeinflusst wurden, teils durch Klf4 induziert, teils reprimiert. Dies spricht summa summarum eher für eine negativregulierende Rolle von Klf4, was aber auch durch nicht wenige Beispiele widerlegt wurde. Eine weitere große Gruppe stellten Transkripte des Zellmechanismus im weiteren Sinne dar, wie u.a. Wachstumsfaktoren, (Proto-) Onkogene und Transkriptionsfaktoren. Dies bestätigten in der Literatur beschriebene Beobachtungen: Klf4 wirkt in erster Linie wachstumshemmend, kann aber sowohl als Tumorsuppressor, als auch als Onkogen wirken, abhängig vom zellulären Kontext und vom Zielgen selbst. Weitere Einflussgebiete zeigten sich auf den Gebieten Zytoskelett, Zellkern, Zelladhäsion-/Interaktion, Oberflächenrezeptoren, extrazelluläre Matrix, Koagulation und Nervensystem. Die genannten Versuche wurden mit dem Deletionstypen der Cre-Rekombinase tragenden LoxP-flankierten Mäuse durchgeführt. Um die Schlussfolgerungen aus den Versuchen zu untermauern und um mögliche Einflussnahmen anderer Faktoren, als die Deletion von Klf4 selbst, auszuschließen, wurde ein weiterer Deletionstyp untersucht. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion von ca. 52 % der Ly6Chigh-Monozyten im Knochenmark sowie eine Reduktion von ca. 82 % in der Milz. Der zweite Abschnitt der Arbeit beschäftigte sich mit der Auswirkung der Klf4-Deletion auf die Expression mutmaßlicher Zielgene, die in der Genexpressionsanalyse bereits gezeigt wurde. Der Einfluss der Klf4-Deletion war deutlich geworden. Aber war er direkt durch Klf4 zustande gekommen? Auch die Frage, ob die Einflussnahme von Klf4 auch im Umkehrschluss, bei verstärkter Expression von Klf4 anstelle der Deletion, stattfand, wurde hier beantwortet. Dafür wurde in myeloide Vorläuferzellen ein Virusvektor mit der Klf4-Sequenz eingebracht, so dass die Zellen Klf4 überexprimierten. In der PCR-Analyse zeigte sich, dass Adora2b, bei Klf4-Deletion schwächer exprimiert, nun in Klf4-überexprimierenden Zellen stärker induziert wurde als in nativen Zellen. Dies wies auf die direkte Einflussnahme von Klf4 auf dieses Zielgen hin. Ein weiterer Unterpunkt, die Frage nach der Wichtigkeit der einzelnen Domänen der Klf4-Sequenz, konnte in dieser Arbeit beantwortet werden: Neben dem vollständigen Klf4-Vektor wurden auch Vektormutanten, denen jeweils eine Domäne fehlte, in myeloide Zellen eingebracht und die Transkriptmengen von Adora2b per PCR gemessen. Unter den Domänen war die SH3-bindende Domäne (die als proteinbindende Domäne für Signalwege eine Rolle spielen soll), eine transkriptionsaktivierende Domäne sowie die DNA-bindende Zinkfingerdomäne. Es zeigte sich erstaunlicherweise, dass keine der hier untersuchten Domänen für die Expression des Zielgens Adora2b unerlässlich war. Diese Arbeit zeigt die Wichtigkeit des Transkriptionsfaktors Klf4 für die terminale Differenzierung von Ly6Chigh-Monozyten im Knochenmark., The questions posed prior to the start of this work have been mostly answered following the completion of the experimental process. The main objective was to investigate the extent by which Klf4 influenced monocytes, both in numbers and in their expression patterns. Further investigation consisted of identifying the effect of the main domains of the Klf4 gene on the expression of target genes by removing their sequence in the Klf4 gene. First, the hypothesis posed by our research group regarding the impact of the deletion of the Klf4 gene in monocytes, especially Ly6Chigh, should be confirmed. In mice subjected to Klf4 deletion (Cre recombinase-carrying, LoxP-flanked), the peripheral blood was found to show a very strong reduction of Ly6Chigh subpopulation of monocytes, while the second major subpopulation Ly6Cneg. was not affected. The average 55% reduction of Ly6Chigh in the bone marrow can be attributed to the deletion of the Klf4 gene during the early development of the cells. Next we studied the influence of the Klf4 gene on target genes expression. By comparing the expression pattern of the Klf4 deleted cell with wild type there were 260 differently expressed transcripts which can be divided into thematic groups indicating the wide-spread functions of Klf4. First and foremost, there is a significant group of transcripts of inflammatory and immune response which seems to be influenced in complex ways, some being induced, others repressed by Klf4. The results indicate a predominantly inhibitive regulatory role for Klf4, although there were many cases where there was evidence to the contrary. Another large group contained transcripts of cellular mechanism, such as including growth factors (proto-) oncogenes and transcription factors. This was confirmed by observations described in literature: Klf4 has potent inhibitory capacity and can act both as a tumor suppressor as well as an oncogene depending on the cellular context and the target gene itself. Other areas of influence include the areas of cytoskeleton, cell nucleus, cell adhesion/interaction, surface receptors, extracellular matrix, coagulation and the nervous system. In order to corroborate the conclusions of this study and to exclude possible influence from other factors, as the deletion of Klf4 itself, an alternate deletion type was investigated. Here also, there was a significant reduction of approximately 52% of Ly6Chigh monocytes in the bone marrow and a reduction of approximately 82% in the spleen. The second part of the work deals with the effect of Klf4 deletion in the putative target gene expression, which was demonstrated in an analysis of gene expression. The effect of Klf4 deletion was clear. Had this effect originated from Klf4? Furthermore, we needed to investigate whether an increased expression of Klf4 had an impact on the target genes own expression. To do so, myeloid progenitor cells were infected with a viral vector carrying the Klf4 sequence in order to overexpress Klf4. The PCR analysis showed that in contrast to Klf4 deleted cells, Adora2b was now stronger induced in Klf4 overexpressed cells compared to native cells. This indicates a direct influence of Klf4 on this target gene. Additionally, the importance of the individual Klf4 domains could be answered in this thesis: Besides the full Klf4 vector, mutant vectors, each of which lacked a domain, were introduced into myeloid cells and the transcript of Adora2b measured by PCR. Among the domains were the SH3-binding domain (which is thought to play a role as a protein-binding domain of signaling pathways), a transcription activating domain and the DNA-binding zinc finger domain. It was found, surprisingly, that none of the studied domains was essential for the expression of the target gene Adora2b. These results suggest a significant influence of the transcription factor Klf4 in the terminal differentiation of monocytes in the bone marrow Ly6Chigh.

Ein gutes Tiermodell ist Voraussetzung, um relevante und verwertbare Ergebnisse bei der Erforschung immunologischer Zusammenhänge in der Sepsis zu bekommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei operative Sepsismodelle in der Maus, die „Cecal Ligation and Puncture“ (CLP) und die „Colon Ascendens Stent Peritonitis“ (CASP), miteinander verglichen. Bei der CLP wird das Zökum der Maus ligiert und anschließend punktiert. Im Modell der CASP implantiert man einen Stent in das Colon Ascendens der Maus, der eine Verbindung zwischen Darmlumen und Peritoneum schafft. Zunächst wurden innerhalb des jeweiligen Modells Überlebenskinetiken angefertigt. Die CLP wurde als CLP mit einfacher 18G-Punktion (CLP[1]) sowie mit zweifacher 18G-Punktion (CLP[2]) operiert. Für die CASP wurden drei verschiedene Stentgrößen verwendet, nämlich 14G, 16G und 18G. Das Ergebnis zeigte im Falle der CASP eine feine Abstufung der Letalität nach 48 Stunden, abhängig von der verwendeten Stentgröße. Bei der CLP ergab die Kinetik keinen Unterschied im Überleben zwischen CLP[1] und CLP[2]. In den folgenden Ex-Vivo-Experimenten wurden CLP[1], CLP[2], 14G-CASP, 16G-CASP und eine Sham-OP miteinander verglichen. Die Entwicklung einer Peritonitis wurde zunächst makroskopisch mittels Fotodokumentation des Situs 24 Stunden nach entsprechender OP überprüft. Bei CLP[1] und CLP[2] imponierte ein völlig avitales Zökum nebst lokaler Entzündung, während bei CASP das gesamte Peritoneum deutlich entzündet war. Zur mikroskopischen Beurteilung wurde proximales Jejunum 6, 12 und 18 Stunden nach OP HE- und immunhistochemisch gefärbt. Dabei ergab sich für die CASP ein kontinuierlich zunehmendes Bild von Destruktion und Infiltration, Sham und CLP[1] zeigten praktisch keine Veränderungen im Jejunum, CLP[2] präsentierte sich uneinheitlich. Bakteriologische Untersuchungen veranschaulichten die Tatsache, dass ein massiver Bakterienbefall des gesamten Organismus nur nach CASP gewährleistet ist, nicht aber nach CLP. Mittels ELISA wurde die Entwicklung der Serumspiegel von TNF-α, IL-1β und IL-10 bis 18 Stunden nach CASP bzw. bis 24 Stunden nach CLP beobachtet. Es zeigte sich bei CASP in allen drei Fällen ein starker, kontinuierlicher Anstieg der Werte, während nach CLP[2] nur der 24-Stunden Wert von IL-10 sehr hoch war. Alle übrigen Werte nach CLP[1] und CLP[2] bewegten sich auf konstant niedrigem Niveau. Die Ergebnisse zeigen, dass sich binnen 48 Stunden nach CASP kontinuierlich eine den gesamten Organismus erfassende, fulminante Sepsis entwickelt. Desweiteren ist die Letalität nach CASP durch Variation der Stentgröße exakt abstufbar, auch die Wiederholbarkeit der CASP ist gewährleistet. Im Gegensatz dazu bescheinigen die Versuche der CLP vor allem eine diskontinuierliche Entwicklung. Vom Modell her praktisch schon als Abszess zu sehen, erfüllt die CLP auch klinische Kriterien eines schwelenden Abszessherdes. Während die CASP als echtes Sepsismodell anzusehen ist, sollte die CLP künftig eher als Abszessmodell bezeichnet und unter diesem Gesichtspunkt auch verwendet werden. Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP), and Cecal Ligation and Puncture (CLP), two animal models designed to closely mimic the clinical course of intraabdominal sepsis, were compared. In the past, immunomodulatory therapies developped in animal studies failed to be successful in human. As a consequence, the established animal sepsis models were criticized. It has been proposed that present models had to be reevaluated and new, clinically more relevant models should be evolved. CLP procedure was performed puncturing once (CLP[1]) or twice (CLP[2]) the ligated cecum of C57BL/6 mice. In the CASP model, a stent with defined diameter was surgically inserted into the ascending colon. Survival, bacterial load, immuno-histochemistry, and serum cytokine levels were analyzed in the groups. Survival following CASP procedure correlated strongly with the stent diameter, whereas the number of punctures in CLP did not significantly change survival rate. Bacterial loads of peritoneal lavage, liver, and lung, as well as serum cytokine levels (Tumor-Necrosis-Factor, Interleukin-1β, Interleukin-10) steadily increased from 6h to 24h after CASP procedure. In contrast, continuously low amounts of bacteria and cytokines were found in CLP mice at any point of time except IL-10 24h after CLP[2]. Twenty-four hours after CLP surgery, the ligated cecum was covered by adhesive small bowel loops, whereas in CASP mice the intestinal leakage was then still present. Taken togehter, the CASP model closely mimics the clinical course of diffuse peritonitis with early and steadily increasing systemic infection and inflammation (SIRS). In contrast, CLP rather reveals to be a model of intraabdominal abscess formation with sustained and minor signs of systemic inflammation.