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Im Rahmen der angeborenen Immunreaktion kommt es zum Austritt aktivierter Leukozyten aus dem Blutstrom in entzündetes Gewebe. Bei der Auswanderung (Extravasation) werden Leukozyten zuerst eingefangen und verlangsamt (initialer Kontakt), um anschließend auf dem Gewebeendothel zu rollen, fest zu adhärieren und schließlich durch das Endothel hindurch zu wandern, um den Entzündungsherd zu erreichen. Diese gezielte Auswanderung ist ein physiologischer Prozess. Da es durch Persistenz des Antigens bei chronischen Erkrankungen zu einem unkontrollierten Auswandern der Leukozyten mit der Folge eines sekundären Gewebeschadens kommt, ist die Möglichkeit der gezielten Hemmung der Extravasation von großem medizinischen Interesse. Ein möglicher Ansatzpunkt ist dabei die Modulierung der L-Selektin–Ligand-Interaktion, da L-Selektin, das konstitutiv auf Leukozyten exprimiert wird, eine entscheidende Rolle während des initialen Kontaktes der Leukozyten mit dem Endothel spielt. Diese Interaktion wird durch Bindung der Lektindomäne des L-Selektins an sLex- Motive und Sulfatgruppen endothelialer Liganden vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde die L-Selektin–Ligand-Interaktion auf zwei verschiedenen Wegen moduliert, wobei für die Interaktionsstudien initial ein Flusskammer-Assay etabliert wurde, mit dem erfolgreich die Zell / Ligand- Interaktion quantifiziert werden konnte. Erstens wurden in intakten Zellen die Neuraminsäurereste der zellulären Glykoproteine durch Behandlung der Zellen sowohl mit dem natürlichen Mannosamin-Vorläuferderivat peracMNAc, als auch mit den artifiziellen Derivaten peracMNProp und peracMNCycloProp verändert. In diesen modifizierten Zellen wurde untersucht, ob die veränderte Sialylierung zu einer veränderten Interaktion zwischen Selektinen und dem Liganden PSGL-1 kommt. Die Untersuchungen zeigten, dass es bei allen Behandlungen zu einer Hypersialylierung der Zellen kam, wobei die Behandlung mit peracMNProp bzw. peracMNCycloProp zum Einbau der strukturell veränderten Neuraminsäure N-Propanoylneuraminsäure bzw. N-Cyclopropyl-carbonyl-Neuraminsäure führte. Weiterhin konnte eine verstärkte Adhäsion der PSGL-1-exprimierenden Zellen an den Liganden P-Selektin nach Supplementierung gemessen werden, die durch den Einbau der artifiziellen Sialinsäuren noch verstärkt wurde. Dahingegen zeigten die entsprechend behandelten L-Selektin-exprimierenden Zellen aufgrund der Hypersialylierung eine verminderte Interaktion mit dem Liganden PSGL-1. Durch die Behandlung mit den artifiziellen Derivaten kam es dabei zu einer weiteren Verminderung der Interaktion mit PSGL-1. Zweitens wurden unterschiedliche potentielle L-Selektin-Inhibitoren zur Modulation der Interaktion verwendet: zwei L-Selektin-Aptamere, welche sich in der Anzahl der Bindungs-domäne unterschieden (Monomer und Dimer) und drei Vertreter aus der Gruppe der dendritischen Polyglycerolsulfate (dPG2 kDaS23, dPG6 kDaS67 und dPG480 kDaS5185), die sich in der Größe des Polyglycerolgerüstes und in der Anzahl der funktionalisierten Sulfate unterschieden. Die dendritischen Polyglycerolsulfate zeigten eine inhibitorische Wirkung auf die L-Selektin –Ligand-Interaktion, wobei sich die gewünschte inhibitorische Wirkung in Abhängigkeit der Anzahl bindungsrelevanter Sulfate einstellte. So konnte eine eindrucksvolle Verbesserung der Inhibition bei Verwendung von dPG480 kDaS5185 um das 1000fache gegenüber dPG6 kDaS67 erzielt werden. Damit konnte gezeigt werden, dass eine multivalente Präsentation der Bindungs-epitope eine entscheidende Rolle für die Bindung an L-Selektin spielt. Die Bindungsstudien an den DNA-Aptameren konnten dieses Ergebnis untermauern, da die dimere Präsentation des Bindungsepitops zu einer 50fachen besseren inhibitorischen Wirkung gegenüber dem monomeren Aptamer führt. Diese Resultate zeigen eindeutig, dass eine gezielte Modulation der L-Selektin–Ligand-Interaktion möglich ist und dass mit den dendritschen Polyglycerolsulfaten und den DNA- Aptamer-Varianten neuartige Inhibitoren charakterisiert wurden, die das Potential für eine therapeutische Anwendung besitzen., During inflammation leukocytes exit the bloodstream into the site of inflammation (extravasation). Therefore, free floating cells are captured by endothelial ligands, slowed down by transient interactions (initial contact) and start rolling on the vascular endothelium and attach firmly to pass through the endothelium and to finally access the center of inflammation. This is a desired process during the innate immune response, but in chronic diseases extravasation of leukocytes is misregulated and leads to tissue damage. Therefore, it is desirable to regulate the uncontrolled leukocyte migration, e.g. by modulation of the L-selectin–ligand interaction. L-selectin, which is constitutively expressed on leukocytes, plays an important role for the initial contact of leukocytes to the endothelium. The binding of L-selectin depends on the interaction of its lectin domain to the endothel ligands containing the sLex-motif and sulfate groups. In the present study, the modulation of the L-selectin–ligand interaction was studied in two different ways. Initially a flow chamber assay was established to quantify the cell / ligand interaction under defined conditions. In a first step the neuraminic acids of glycoproteins of intact cells were modified by incorporation of the natural mannosamine derivative peracMNAc and the unnatural derivatives peracMNProp and peracMNCycloProp. These modified cells were examined concerning the changes in the interaction between selectins and their ligand PSGL-1. Analyses confirmed the successful incorporation of the sialic acid derivatives and therefore the hypersialylation of the cells. The treatment with the unnatural derivatives peracMNProp and peracMNCycloProp lead to the integration of the artificial neuraminic acids N-propanoyl neuraminic acid and N-cyclopropylcarbonyl neuraminic acid into the glycan structures. The modifications lead to improved adhesion of PSGL-1 expressing cells to P-selectin due to a higher incorporation of sialic acids and its derivatives in glycan structures. In contrast, the modification of the L-selectin glycans with the sialic acid derivatives leads to a reduced interaction of L-selectin expressing cells with the ligand PSGL-1. The second way to modulate L-selectin interactions relied on different potential inhibitors: three different dendritic polyglycerol sulfates (dPG2 kDaS23, dPG6 kDaS67 and dPG480 kDaS5185), which differed in the size of the polyglycerol core and in the amount of sulfate groups, and two L-selectin-aptamers, which differed in the presentation of the L-selectin specific binding epitop (monomer and dimer). The application of the polyglycerol sulfates showed significant inhibition dependent on the amount of the binding sulfates on the L-selectin-ligand interaction. This work demonstrates thus an impressive 1000-fold stronger inhibition by dPG480 kDaS5185 compared to dPG6 kDaS67. This reflects the important role of multivalent presentation of the binding epitopes for the L-selectin–ligand interaction. The interaction studies with the DNA-aptamers confirmed this observation. Compared to the monomeric aptamer, the dimeric epitope presentation shows a 50-fold (dimer-flex) better inhibition. These results clearly demonstrate the possibility to modulate the L-selectin-ligand interaction specifically and present the dendritic polyglycerol sulfates and DNA-aptamer variants as novel inhibitors with the potential for a successful therapeutic application.

Im Rahmen der Immunüberwachung oder bei Entzündungen müssen Leukozyten aus dem Blutstrom in umliegendes Gewebe gelangen, um dort Pathogene aufzuspüren und zu eliminieren. Dazu werden die Leukozyten in einer so genannten Adhäsionskaskade aus dem Blutstrom abgefangen und beginnen, auf den Endothelzellen zu rollen, bis sie schließlich nach Aktivierung fest adhärieren und auswandern. Dabei kann es zu sekundärer Gewebeschädigung kommen, wenn die Infiltration der Leukozyten ungebremst abläuft, wie es bei entzündlichen Krankheiten der Fall ist. Um die Entzündungsreaktion therapeutisch einzudämmen, werden gegenwärtig Medikamente eingesetzt, die häufig starke Nebenwirkungen zeigen. Für eine alternative Therapiestrategie, die gezielt das Auswandern der Leukozyten adressiert, bietet sich der erste Schritt der Adhäsionskaskade als Ansatzpunkt an. Dieser wird von dem leukozytären Adhäsionsrezeptor L-Selektin im Zusammenspiel mit seinen endothelialen Liganden vermittelt. L-Selektin ist ein Transmembranrezeptor auf der Oberfläche der Leukozyten. Mit seiner C-Typ- Lektindomäne bindet er an muzinähnliche, sulfatierte, sialylierte und fucosylierte Glykane. Die detaillierte Struktur von L-Selektin im Komplex mit seinen Bindungspartnern ist unbekannt und sollte in der vorliegenden Arbeit aufgeklärt werden. Die Kenntnis der Kristallstruktur sollte es ermöglichen, in Zukunft modellgestützt Ligandenanaloga und Inhibitoren zu entwickeln, die zur antiinflammatorischen Therapie eingesetzt werden können. L-Selektin ist ein hochglykosyliertes Glykoprotein. In einem zweiten Teil der Arbeit sollte die Struktur und die Funktion der N-Glykane von L-Selektin untersucht werden. Um L-Selektin zu kristallisieren, mußte zunächst ein Expressionssystem gefunden werden, mit dem es möglich war, L-Selektin in einer geeigneten, funktionellen Form in ausreichender Menge herzustellen. Dazu wurden verschiedene Formen eines verkürzten L-Selektins (LE) kloniert und in verschiedenen Expressionssystemen exprimiert. LE umfasste dabei die N-terminale C-Typ Lektindomäne und die angrenzende EGF-Domäne, welche zusammen die Ligandbindung vermitteln. LE, das in der Hefe Pichia pastoris, in Sf9-Insektenzellen und in CHO-Zellen exprimiert wurde, stellte sich aus verschiedenen Gründen als nicht für die Kristallisation geeignet heraus. Im HEK293Freestyle-Expressionssystem konnten schließlich ausreichende Mengen LE hergestellt werden. Da L-Selektin ein Glykoprotein ist, das als heterogene Mischung aus verschiedenen Glykoformen exprimiert wurde, wurden anschließend verschiedene Strategien zur Reduktion der Glykan-Heterogenität untersucht. Nach systematischer Mutagenese wurde eine funktionelle LE-Variante gefunden, die eine weitaus höhere Homogenität als der Wildtyp aufwies. Es konnte ein Protokoll etabliert werden, mit dem dieses Protein mithilfe eines Aptamers hochrein aus dem Kulturüberstand gewonnen werden konnte. Dieses Protein konnte schließlich erfolgreich kristallisiert werden. Die Auflösung des Diffraktionsmusters konnte von anfänglichen ~14 Å auf ~7 Å verbessert werden, jedoch konnte die Röntgenstruktur bei dieser Auflösung nicht bestimmt werden. Um die Bindungsaffinität rekombinanten L-Selektins zu erhöhen, wurden neben der monomeren Form auch eine dimerisierte Form, sowie ein Pentamer und ein Decamer konstruiert. Das etablierte HEK293F-Expressionssystem wurde genutzt, um diese Konstrukte rekombinant zu exprimieren. Die Expression, Aufreinigung und Funktion der L-Selektin-Multimere konnte erfolgreich demonstriert werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Ligandbindung durch Multimerisierung überproportional verstärkt wurde. Zur Untersuchung der N-Glykosylierung von rekombinantem L-Selektin wurden Glykosylierungsmutanten konstruiert, in HEK293F-Zellen exprimiert und aufgereinigt. Alle Proteine zeigten Bindungsaktivität, wobei die Stärke der Bindung mit steigender Anzahl von N-Glykanen tendenziell geringer wurde. Das nichtglykosylierte LE zeigte dabei die stärkste Bindung. Weiterhin konnte ein positiver Einfluß der Glykane auf die Sekretion der LE-Varianten festgestellt werden. Drei der Mutanten trugen jeweils nur ein N-Glykan an jeweils unterschiedlicher Position. Mit diesen war es möglich, die Struktur der N-Glykane von LE aus HEK293F-Zellen an jeder einzelnen Position zu bestimmen. Bei der Glykananalytik wurden unerwartete Glykanstrukturen gefunden, deren Grundstrukturen hauptsächlich biantennär und zumeist stark fucosyliert waren. An den Antennen der N-Glykane waren zum Großteil N-Acetyl-Galactosamin-Reste statt der üblicheren Galactose-Reste verknüpft. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass diese N-Glykane mit Sulfaten modifiziert waren. Bei einem Kontrollprotein aus demselben Expressionssystem waren vergleichbare Strukturen nicht nachzuweisen. Dies ließ darauf schließen, dass die Aminosäuresequenz von L-Selektin Informationen enthält, welche eine proteinspezifische N-Glykosylierung herbeiführen. Die sulfatierten Glykanstrukturen sind in der Literatur nur für einige wenige Proteine beschrieben, darunter als klassisches Beispiel die Glykoproteinhormone. Zusätzlich wurden bei der LE-Mutante, die nur ein N-Glykan in der ersten Position enthielt, bislang nicht beschriebene Glykanstrukturen identifiziert. Es handelte sich dabei um biantennäre Glykane, die jeweils an beiden antennären N-Acetyl-Glucosaminresten terminal zwei aufeinander folgende N-Acetyl-Galactosaminreste besaßen. Diese Strukturen lagen sowohl sulfatiert als auch nicht sulfatiert vor. Zukünftige Untersuchungen werden zeigen, welche Funktion diese ungewöhnlichen Glykane haben und ob das native, lösliche L-Selektin im Blutserum oder auf Leukozyten ebenfalls mit solchen Strukturen ausgestattet ist. Die Untersuchungen legen die Grundlage für eine Strukturaufklärung der Bindungsdomäne von humanem L-Selektin mittels Kristallisation und Röntgendiffraktion. Sie zeigen weiterhin, daß die Bindungsaffinität von L-Selektin durch Oligomerisierung erhöht wird. Durch Aufklärung der Struktur der N-Glykane von rekombinantem L-Selektin konnte eine ungewöhnliche N-Glykosylierung von L-Selektin nachgewiesen werden. Die N-Glykane haben, wie die Bindungsstudien und die Untersuchungen der Sekretion zeigen, einen Einfluß auf Biosynthese und Funktion von L-Selektin., Leucocytes have to leave the blood stream and enter surrounding tissues in order to detect and eliminate pathogens during immune surveillance and in inflammation. This process of extravasation is organized in a so-called adhesion cascade, where leucocytes are captured from the blood stream and start rolling on endothelial cells. After activation, leucocytes adhere firmly and subsequently migrate out of the blood vessel. In inflammatory diseases this leucocyte infiltration is often not dampened, and severe secondary tissue damage might occur. The currently applied drugs for a general anti- inflammatory therapy often show adverse effects. An alternative therapeutic approach is to specifically address the leucocyte extravasation process by intervening at the initial contact of the leucocytic adhesion receptor L-selectin with its endothelial ligands. L-selectin is a transmembrane receptor on the surface of leucocytes. It binds to mucin-like sialylated, sulphated and fucosylated glycans via its C-type lectin domain. Since the detailed structure of L-selectin in complex with its binding partners is unknown, it was the aim of this study to solve the crystal structure. Prospectively, on the basis of these data it will be possible to model ligand- analogs and to design synthetic inhibitors as drugs for anti-inflammatory therapy. L-selectin is a highly glycosylated glycoprotein. So the second part of the present study aimed at investigating the structure and function of the N-glycans of L-selectin. In order to crystallize L-selectin, it was at first necessary to establish an expression system to produce L-selectin in a suitable, biologically active form and in sufficient amounts. For this purpose different truncated soluble variants of L-selectin (LE) were cloned and expressed in several expression systems. LE consisted of the N-terminal C-type lectin domain and the adjacent EGF-like domain, which mediate the ligand binding. Recombinant protein expressed in the yeast Pichia pastoris, in Sf9 insect cells and CHO-cells was not suitable for crystallization trials for various reasons. However, expression in the HEK293Freestyle expression system was successful. Because L-selectin is a glycoprotein and was expressed as a mixture of glycoforms, various strategies to reduce glycan-based heterogeneity were investigated. After systematic mutagenesis of the glycosylation sites, a variant of LE was identified, which was much more homogeneous than the wildtype protein. A protocol to highly purify this protein from the cell culture supernatant with the aid of an aptamer was established. The LE variant successfully crystallized and we could improve the diffraction resolution from ~14 Å to ~7 Å. However, with this resolution it was not possible to solve the crystal structure. To improve the binding affinity of recombinant L-selectin, a dimeric as well as a pentameric and decameric form was constructed in addition to the monomeric form. The established HEK293F expression system was used to produce these recombinant proteins and their successful expression, purification and functionality were demonstrated. It was shown, that the ligand binding affinity of these L-selectin variants was disproportionally increased by multimerization. To study the N-glycosylation of L-selectin, glycosylation-mutants were constructed, expressed in HEK293F cells and purified. All of these mutant proteins showed binding activity, while by trend the affinity was lower by increasing number of N-glycans. The nonglycosylated variant of LE showed the highest binding affinity. In contrast, protein glycosylation had a positive influence on the secretion rate. Three of the glycosylation mutants had only one N-glycan attached to a different position each. With these mutants it was possible to analyze the site specific glycan structures. In the glycan analysis, unexpected structures were identified. It was shown, that the glycans were mostly biantennary and highly fucosylated. A large part of the antennae was modified with N-acetyl-galactosamine residues instead of the more common galactose residues. In addition, the N-glycans were modified with sulphate-residues. Interestingly, a control protein from the same expression system did no show these modifications. Thus, one can conclude that the amino acid sequence of L-selectin has intrinsic information for this specific glycosylation pattern. The sulphated glycan structures identified are described only for a few proteins in the literature, with the glycoprotein hormones as the classical example. Furthermore, on the LE variant which had only one glycan at the first position, uncommon structures were found, which to our knowledge had not been described previously. These glycans had a biantennary structure and two consecutive N-acetyl-galactosamine residues were attached to each antenna. Parts of these structures were further modified with a sulphate residue. Future studies are necessary to elucidate the function of these glycans and to demonstrate if they are also present on L-selectin originated from physiological sources. The results of the present study provide a basis for the elucidation of the L-selectin structure by crystallization and X-ray diffraction. Furthermore, it was shown that multimerization enhances the binding affinity of L-selectin. In the analysis of the N-glycans of recombinant L-selectin, uncommon N-glycans were detected. Binding studies and secretion analysis showed, that the N-glycans have an influence on the biosynthesis and function of L-selectin.

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang, L-Selektin vermittelt zusammen mit seinen endothelialen Liganden das Rollen von Leukozyten auf dem Gefäßendothel und leitet hiermit den ersten Schritt einer Adhäsionskaskade ein, die zum Auswandern der Leukozyten in das perivaskuläre Gewebe führt. L-Selektin ist daher einerseits essentiell für die physiologische Immunabwehr. Andererseits ist L-Selektin an pathologischen Entzündungsreaktionen, beispielsweise an der Transplantatabstoßung oder an Autoimmunkrankheiten beteiligt. Es stellt somit eine Zielstruktur für antiinflammatorische Wirkstoffe dar, die durch Blockade von L-Selektin die Rekrutierung von Leukozyten in entzündetes Gewebe hemmen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Hemmung der Bindung von L-Selektin an seine Liganden durch synthetische multivalente Liganden auf der Basis von Sialyl Lewis x, Glykomimetika und rekombinanten Glykoproteinen zu untersuchen. Diese Untersuchungen sollten auf der Ebene einzelner Moleküle und auf der Ebene intakter Zellen unter Flussbedingungen erfolgen und somit der Scherstressabhängigkeit der Bindungsfunktion von L-Selektin Rechnung tragen. Für die Untersuchung unterschiedlicher Inhibitoren wurde ein standardisiertes Testsystem entwickelt, bei dem die Bindung von rekombinantem divalenten L -Selektin-IgG an den synthetischen Liganden SiaLex-PAA-sTyr mittels Oberflächenplasmonenresonanz gemessen wurde. Weiterhin wurde ein Flusskammer- Assay für die Untersuchungen von Inhibitoren adaptiert, bei dem das Rollen und die Adhäsion transfizierter NALM-6-Zellen, die L-Selektin auf ihrer Oberfläche exprimieren, an aktivierte HUVECs gemessen wurde. Mit beiden Verfahren wurde die inhibitorische Aktivität von multivalenten Formen von Sialyl Lewis x, Sialyl Lewis a und Tyrosinsulfat kovalent gebunden an den Träger Polyacrylamid im Vergleich zu den monovalenten Formen dieser Liganden gemessen. Die Untersuchungen zeigten, dass Multivalenz zu einer außerordentlichen Steigerung der inhibitorischen Aktivität führt und die Hemmwirkung der multivalenten Inhibitoren mit zunehmendem Scherstress zunimmt. Mit Polyglycerolsulfat-Dendrimeren wurde eine zweite Klasse multivalenter Inhibitoren untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine außerordentlich starke Hemmwirkung dieser multivalenten Inhibitoren. Polyglycerolsulfat-Dendrimere hemmten spezifisch L- und P-Selektin, dagegen nicht die Funktion von E-Selektin. Mit dem Makrolid Efomycin M wurde drittens ein Glykomimetikum auf seine inhibitorische Aktivität untersucht. Efomycin M hemmte selektiv die Bindungsfunktion von L-Selektin, jedoch nicht die von E- und P-Selektin. Diese Untersuchungen zeigten, dass auch monovalente Inhibitoren starke Hemmwirkung besitzen können. Auf der Basis des physiologischen Liganden PSGL-1 und von Hsc70, von dem kürzlich eine Zelloberflächenform, die L-Selektin bindet, beschrieben wurde, wurden zwei potentielle inhibitorische Glykoproteine als Fusionsproteine konstruiert: PSGL-1-IgG als Fusionsprotein des N-Terminus von PSGL-1 mit drei Tyrosinresten und einem O-Glykan, welche das L-Selektin- Bindungsmotiv von PSGL-1 darstellen, und Hsc70-IgG als Fusionsprotein des Sequenzabschnitts 279-299 von Hsc70, welcher Ähnlichkeit zum PSGL-1-Bindungsmotiv aufweist. Die Expression erfolgte in der für Glykosylierung und Sulfatierung geeigneten humanen Zelllinie KG1a. Untersuchungen mittels Oberflächenplasmonenresonanz zeigten eine vergleichbar starke Bindung von PSGL-1-IgG und Hsc70-IgG an L-Selektin. Dieses Ergebnis wies darauf hin, dass die rekombinanten Glykoproteine PSGL-1-IgG und Hsc70-IgG zumindest in ihrer divalenten Form potente Inhibitoren der L-Selektin-Funktion sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass für die Hemmung der Bindungsfunktion von L-Selektin multi- und monovalente Inhibitoren zur Verfügung stehen, die die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien der medikamentösen antiinflammatorischen Therapie eröffnen., Together with its endothelial ligands, L-selectin mediates leukocyte rolling on vascular endothelium, thereby initiating the first step of an adhesion cascade that leads to transmigration of leukocytes into the perivascular tissue. On the one hand, L-selectin is thus essential for physiological immune defense; on the other hand, it is involved in pathological inflammatory reactions, e.g. transplant rejection or autoimmune diseases. It is therefore a target structure for antiinflammatory agents that inhibit leukocyte recruitment into inflamed tissue by L-selectin blockade. The aim of this study was to examine the inhibition of L-selectin binding to its ligands by synthetic multivalent ligands on the basis of Sialyl Lewis x, glycomimetics and recombinant glycoproteins. These examinations were performed on the level of individual molecules and that of intact cells under flow conditions in order to take into account the shear stress dependence of L-selectin binding. Different inhibitors were examined by developing a standardized test system that measured the binding of recombinant divalent L-selectin-IgG to the synthetic ligand SiaLex-PAA-sTyr by means of surface plasmon resonance. In addition, inhibitors were examined by adapting a flow chamber assay to measure the rolling and adhesion of transfected L-selectin-expressing NALM-6 cells on activated HUVECs. Both procedures were used to measure the inhibitory activity of multivalent forms of Sialyl Lewis x, Sialyl Lewis a and tyrosine sulfate covalently bound to the carrier polyacrylamide in comparison to the monovalent forms of these ligands. The examinations showed that multivalence markedly enhances the inhibitory activity, and increasing shear stress intensifies the inhibitory effect of multivalent inhibitors. Polyglycerol sulfate dendrimers were used to examine a second class of multivalent inhibitors. The results showed a remarkably strong inhibitory effect of these multivalent inhibitors. Polyglycerol sulfate dendrimers were specific for L- and P-selectin but did not inhibit the function of E-selectin. Third, the macrolide efomycine M was used to examine the inhibitory activity of a glycomimetic. Efomycine M was specific for L-selectin but did not inhibit E- or P-selectin binding. These examinations showed that even monovalent inhibitors exert a strong inhibitory effect. Two potential inhibitory glycoproteins were constructed as fusion proteins on the basis of the physiological ligand PSGL-1 and Hsc70, for which an L-selectin-binding cell surface form was recently described: PSGL-1-IgG as the fusion protein of the N-terminus of PSGL-1 with three tyrosine residues and one O-glycan, which represent the L-selectin binding motive of PSGL-1, and Hsc70-IgG as the fusion protein of a sequence segment of Hsc70 of the position 279-299, which shows similarity to the PSGL-1 binding motive. The expression took place in the human cell line KG1a, which is suitable for glycosylation and sulfatation. Examinations utilizing surface plasmon resonance showed a comparably strong binding of PSGL-1-IgG and Hsc70-IgG to L-selectin. This result indicated that the recombinant glycoproteins PSGL-1-IgG and Hsc70-IgG are potent inhibitors of L-selectin function, at least in their divalent form. The results of this study document the availability of multi- and monovalent inhibitors of L-selectin binding that open up prospects for the development of new anti- inflammatory drug strategies.

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rollgeschwindigkeiten von Leukozyten auf humanen kardialen mikrovaskulären Endothelzellen (HCMEC) und humanen umbilikalen venösen Endothelzellen (HUVEC). Die Endothelzellen wurden aus explantierten humanen Herzen sowie aus menschlichen Nabelschnüren unmittelbar postpartal gewonnen. Unter definierten Bedingungen wurden die in einer Flusskammer gemessenen Geschwindigkeiten von L-Selektin exprimierenden Nalm6-IF4 Zellen auf unstimulierten Endothelzellen mit denen auf stimulierten Endothelzellen verglichen. Die langsamere Geschwindigkeit der Leukozyten auf stimulierten Endothelzellen weist darauf hin, dass L-Selektin Liganden auf humanen kardialen mikrovaskulären Endothelzellen erst nach Stimulation exprimiert werden. Die beobachtete Geschwindigkeitsreduktion der Leukozyten ist jedoch von dem in der Literatur beschriebenen Selektin vermittelten Rollen zu unterscheiden. In den Versuchen mit Tunicamycin wurde gezeigt, dass N-glykosidisch gebundene Zucker kritische Bestandteile der Liganden für ihre Interaktion mit L-Selektin sind. Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch der Einfluss E-Selektin vermittelter Interaktionen auf die Geschwindigkeit der HL60 Zellen untersucht. Neben dem typischen Rollen wurde hier ebenfalls eine Selektin abhängige Geschwindigkeitsreduktion gesehen., The aim of the present study was to investigate selectin mediated rolling velocities of leucocytes on human cardiac microvascular endothelial cells (HCMEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). HCMEC were gained from explanted human hearts and HUVEC from umbilical cords immediately postpartum. Flow velocities of L-Selectin expressing Nalm6-IF4 cells on quiesent endothelial cells were compared to those on stimulated endothelial cells. Stimulation of endothelial cells with TNF led to significantly slower velocities of Nalm6-IF4 cells indicating that HCMEC express L-Selectin ligands only after stimulation. The observed reduction of flow velocities differs from rolling of leucocytes described in the literature. Experiments with tunicamycin showed that N-glycosylated carbohydtrate moieties are needed for proper function of L-Selectin ligands. E-Selectin mediated interactions between HL60 cells and endothelial cells were studied under the same conditions. Besides the typical rolling, a selectin mediated reduction of flow velocity was observed.

Circulating polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are known to contribute to the pathophysiology of myocardial ischemia and reperfusion injury. The present study was designed to examine whether the duration of ischemia in myocardial infarction, the type of coronary intervention (angioplasty vs. angioplasty plus stenting) and duration of the procedure itself modulate the inflammatory responses of PMNs.In patients with acute myocardial infarction (AMI; n = 20) neutrophil beta-2-integrin Mac-1 (CD11b/CD18) and L-selectin (CD62L) were determined at different time points before and after PTCA or PTCA plus stenting. After PTCA alone but not after PTCA plus stenting a significant rise in Mac-1 (136 +/- 43%) was demonstrated. This elevation decreased after 60 minutes if the duration of the recanalization procedure was shorter than 30 minutes but remained elevated after longer interventions. After delayed intervention a significant and more pronounced increase of Mac-1 (142 +/- 37%) was observed, while early intervention prevented this increase. After PTCA alone or delayed intervention a significant shedding of L-selectin (77 +/- 20%; 77 +/- 23%) was demonstrated. Early intervention or PTCA plus stenting caused no significant changes in L-selectin.It is concluded that PMN activation is attenuated by early and short intervention as well as by stenting. Induction of PMN activation might contribute to the superior outcome following stenting and early intervention compared to conventional PTCA in particular when performed delayed.

In the pulmonary circulation, endotoxemia induces leukocyte/endothelium interaction in pulmonary arterioles and venules. Thus, leukocytes may contribute to the pathogenesis of acute lung injury. In order to investigate, whether this interaction can be inhibited by early blockade of the adhesion cascade, we studied the effect of the humanized anti-L-selectin antibody HuDreg 200 on leukocyte kinetics in pulmonary arterioles and venules following i.v.-infusion of endotoxin. In endotoxemia HuDreg 200 reduces sticking of leukocytes in both pulmonary arterioles and venules. Thus, we were able to demonstrate that early blockade of the adhesion cascade effectively prevents leukocyte accumulation in pulmonary microvessels in endotoxemia. Therefore, HuDreg 200 may exhibit protective effects on the manifestation of leukocyte-mediated acute lung injury.

This work presents initial experimental results obtained with co-incubation of human neutrophilic granulocytes from patients with various diseases (5 patients each group) and collagen- or silver-coated polyester grafts (25 patients each graft).After two-hour co-cultivation of the graft with human granulocytes of different patients (normal controls; peripheral occlusive vascular disease; diabetes mellitus; carcinoma/chemotherapy; sepsis), the following parameters were determined by flow cytometry: CD11b, CD62L, fMLP, CXCR2.The change in the receptor expression was taken as a measure of responsiveness, with statistically significant differences seen within and between the groups. For the silver-coated graft, such differences were mainly noted for the fMLP receptor (p=0.01). For the two-hour incubation with collagen coating, the receptors CD62L and CXCR2 were indicative of differences between the various diseases (CD62L p=0.01; CXCR2 p=0.01). Comparison between the grafts revealed statistically significant differences for the CXCR2 and the fMLP receptors (CXCR2 p=0.00; fMLP p=0.03).The differences noted between the grafts and between the patients groups are suggestive of an altered responsiveness of the granulocytes to the grafts. This enables new aspects with respect to the genesis of accompanying clinical symptoms.

In der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen vorgestellt, die sich mit Wirkungen und Interaktionen von zwei ubiquitär im menschlichen Körper vorkommenden Gasen befassen, i.e. Sauerstoff und Stickstoffmonoxid. Im Falle beider Substanzen ermöglicht die geringe Größe der Moleküle eine freie Diffusion über Membranen hinweg, eine Eigenschaft, die für die Funktion der Signaltransduktion geradezu prädestiniert. Aus den vorgelegten Untersuchungen lassen sich die folgenden Folgerungen ableiten: * Stickstoffmonoxid wirkt in-vitro selektiv bakteriostatisch auf Bakterien, die üblicherweise Früh- und Neugeborene besiedeln. Dabei hängt die Selektivität von den jeweiligen bakteriellen Verteidigungsmechanismen ab, die bakteriostatische Wirkung liegt in einem Konzentrationsbereich, der außerhalb desjenigen liegt, der derzeit klinisch angewendet wird. * Hyperoxie führt im Ganztiermodell der unreifen Ratte zu einer zerebralen Hochregulation von iNOS und damit zur Synthese von NO. Soweit dies anhand der Synthese von Peroxynitrit als definitivem Schädigungsmechanismus beurteilbar ist, wird trotz entsprechender iNOS-Expression wenig bis gar kein Peroxynitrit gebildet. Da das Zusammentreffen von NO und Sauerstoff sonst regelhaft zur Entstehung von Peroxynitrit führt, müssen im Gehirn der unreifen Ratte ausreichende antioxidative Schutzmechanismen präsent sein, die diese Reaktion verhindern. * Im in-vitro-Modell der Gasäquilibrierung von Nabelschnur-PMN zeigte sich unter Hyperoxie das ausgeprägteste Aktivierungsmuster aller verglichenen Sauerstoffkonzentrationen. Dies stand im Gegensatz zur Exposition adulter Zellen, hier fand sich eine größere Hyperoxietoleranz bei gleichzeitig stärkster Aktivierung unter Hypoxiebedingungen. Welche Bedeutung diesen Ergebnissen im klinischen Umgang mit Neugeborenen zukommt muß derzeit noch offen bleiben. Allerdings häufen sich Hinweise aus experimentellen Studien, die darauf hindeuten, daß ein restriktiver Umgang mit hohen Sauerstoffkonzentrationen auch im klinischen Umfeld gerechtfertigt sein könnte. The present investigations deal with the effects and interactions of gases, which are ubiquitous in the human body i.e. oxygen and nitric oxide. Both substances are small enough to freely diffuse across biological membranes. This ability predestines both molecules for the function of signal transduction. The results of our investigations lead to conclusions as follows: * Nitric oxide has selective bacteriostatic effects in-vitro on some bacterial strains typically isolated from preterm and term newborn infants. Selectivity depends on the presence of bacterial defense mechanisms. The bacteriostatic effect takes place at concentrations above those currently used in clinical practice. * Hyperoxia leads to upregulation of iNOS and subsequent NO production in an animal model of the immature rat. Despite this upregulation of iNOS synthesis there is no increased production of peroxynitrite which is known to cause cellular and DNA damage. Since the combination of NO and high concentrations of oxygen lead to peroxynitrite formation on a regular basis, effective antioxidant mechanisms appear to prevent peroxynitrite formation in the brain of the immature rat. * The most pronounced activation of cord blood polymorphonuclear cells (PMN) during conditions of hyperoxia, normoxia, and hypoxia was found for exposure towards high oxygen concentrations in an in-vitro model of gas equilibration. As opposed to that, hypoxia was the most potent trigger for adult PMN. It remains to be determined which clinical implications must be derived from these results. However, increasing experimental evidence indicates that exposure towards high oxygen concentrations should be restricted also in clinical practice and not only in preterm infants, but also in term newborns.

Während die zellulären Mechanismen der Pathogenese der Arteriosklerose intensiv untersucht worden sind, ist über die Mechanismen, die zu einer bevorzugten Lokalisation arteriosklerotischer Läsionen in bestimmten Gefäßarealen führen, weniger bekannt. Zur Untersuchung dieser Mechanismen wurden Endothelzellen aus menschlichen Koronararterien, einem Gefäßbereich, in dem häufig arteriosklerotische Läsionen beobachtete werden, isoliert und kultiviert. Endothelzellen der Mikrozirkulation menschlicher Herzen wurden unter gleichen Bedingungen kultiviert und die Reaktionen beider Zellarten verglichen. Inkubation der Zellen mit den in Bezug auf die Bildung arteriosklerotischer Plaques besonders pathogenen oxidierten LDL induzierte in makrovaskulären koronaren Endothelzellen eine stärkere Zunahme der PAI-1 Aktivität (182%, p, While the cellular mechanisms of atherosclerosis have been intensively studied, the mechanisms leading to preferential localization of atherosclerotic lesions are less well understood. To further define these mechanisms, endothelial cells from coronary arteries, i.e. vessels with frequent atherosclerotic lesions, were isolated and grown in vitro. In order to compare the reactions of both cell types, endothelial cells derived from microvessels of human hearts were isolated and cultured under identical conditions. Incubation of endothelial cells with oxidized LDL (75 µg/ml protein) induced a significant increase in PAI-1 activity (182 %, p

Ischemia followed by reperfusion, as happens in myocardial infarction, or the development of acute respiratory distress syndrome, are associated with a exaggerated extravasation of leukocytes into the surrounding tissue , which may cause severe bystander damage. In animal models of these diseases, pharmacological blockage of the leukocyte adhesion molecule, L-selectin (CD62L), has been shown to be partially protective by reduction or inhibition of leukocyte-mediated secondary tissue damage. The aim of this project was the development of an in vitro assay to investigate the relative effectiveness of potential L-selectin antagonists. Ideally, the assay should require low sample volumes and allow for measurements of larger series of reagents. The assay system investigated was based on the homotypic granulocyte aggregation under shear stress, which mimicks the L-selectin-dependent adhesion of leukocytes to previously arrested neutrophils on vascular endothelium. After optimizing numerous variables of the aggregation assay, the requirement of L-selectin for the homotypic granulocyte aggregation induced was demonstrated by inhibition experiments using soluble L-selectin or monoclonal antibodies directed against the lectin domain of L-selectin. Several carbohydrate polymers with L-selectin binding properties, such as the seaweed-derived fucose polymer fucoidin, high-molecular-weight dextran sulfate or heparin, also inhibited neutrophil aggregation in a dose-dependent fashion. However, despite employing a flow cytometry-based read-out technique, the assay remained extremely labor intensive, precluding investigations of extended series. Therefore, the homotypic aggregation experiments with freshly isolated human granulocytes remains a useful tool to further evaluate specific questions of L-selectin dependent adhesion processes, but it is not apt for transfer into routine laboratories.

While the cellular mechanisms of atherosclerosis have been intensively studied, the mechanisms leading to preferential localization of atherosclerotic lesions are less well understood. To further define these mechanisms, endothelial cells from coronary arteries, i.e., vessels with frequent atherosclerotic lesions, were isolated and grown in vitro. In order to compare the reactions of both cell types, endothelial cells derived from microvessels of human hearts were isolated and cultured under identical conditions. Incubation of endothelial cells with oxidized LDL (75 microg/ml protein) induced a significant increase in PAI-1 activity (182%, p0.05) in coronary macrovascular endothelial cells. This stimulatory effect of ox-LDL was less significant in microvascular endothelial cells (144%, p0.05). n-LDL did not influence secreted PAI-1 activity. Stimulation with angiotensin II induced expression of E-selectin more effectively in coronary macrovascular than in microvascular endothelial cells. In addition, angiotensin II-induced E-selectin expression led to increased E-selectin-dependent adhesion of HL60 cells to coronary macrovascular endothelial cells under flow conditions, while only little effect was observed with cardiac microvascular endothelial cells. In contrast, L-selectin-dependent adhesion, which has been shown to play an important role in inflammatory reactions, was preferentially observed in cardiac microvascular endothelial cells and could only be stimulated with TNFalpha, not by angiotensin II. Therefore, these cellular differences may in part explain specific properties of cardiac endothelial cells: Such that atherosclerotic lesions are localized in macrovascular vessel segments, whereas inflammatory responses are predominantly found in the microvasculature.