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Diese Dissertation befasst sich mit der Dynamik von Lipidtropfen (LDs), die der Speicherung von Lipiden (hauptsächlich Triacylglycerol, TAG) dienen. Das epidemische Auftreten von Adipositas und der sogenannten Fettleber (Steatose) hat das wissenschaftliche Interesse an der Regulation der zellulären Speicherung in LDs stark beflügelt. Es gibt inzwischen zahlreiche Publikationen zu einzelnen Aspekten der Bildung, des Wachstums und des Abbaus von Lipidtropfen. Ein detailliertes mathematisches Modell, das diese Einzelergebnisse in ein konsistentes Bild zusammenfügt, gibt es allerdings nicht. Die Aufstellung, Validierung und Anwendung eines umfassenden mathematischen Modells der Dynamik von LDs steht daher im Mittelpunkt dieser Arbeit. Dieses Modell umfasst unter anderem die Aufnahme von freien Fettsäuren aus dem Blutplasma, die Veresterung zu TAG, die Bildung, das Wachstum und die Lipolyse von Lipidtropfen, die durch etliche regulatorische Oberflächenproteine (ROPs) gesteuert werden. Eine wesentliche Frage im Zusammenhang mit der Entstehung einer Fettleber gilt den Mechanismen, die den heterogenen Fetteinlagerungen in der Leber zugrunde liegen. Eigene Experimente mit humanen Hepatomzellen (PLC) zeigten, dass eine Heterogenität in der TAG-Speicherung auch in isolierten Zellen existiert, wenn man sie einer Fettsäurebelastung unterwirft. Modellsimulationen zeigen, dass Schwankungen in der Expression zentraler regulatorischer Proteine bereits eine Heterogenität bis zu 50% erklären können. Unter der Annahme, dass eine solche Variabilität der Genexpression auch im intakten Organ vorliegt, prognostiziert das Modell eine Variation im TAG-Gehalt einzelner Zellen um einen Faktor drei bis sechs. Zusammenfassend ist zu sagen, dass der Modellansatz zahlreiche experimentelle Ergebnisse von einzelnen Prozessen im zellulären TAG-Metabolismus und im Metabolismus der LD-Dynamik in ein konsistentes, neuartiges und dynamisches Modell eines metabolischen Netzwerks integriert. This dissertation occupies with the dynamics of lipid droplets (LDs) serving as lipid deposit transporting, mainly triacylglycerol (TAG). The epidemic occurrence of obesity and steatosis has inspired strongly the scientific interest in regulation of hepatic TAG accumulation. There are now numerous publications regarding individual aspects of formation, maturation and lipolysis of LDs. However, a detailed computational model putting together this fractional knowledge is lacking so far. I focus on development, validation and implementation a kinetic model encompassing the pathways of the fatty acids (FFA) and TAG metabolism and the main molecular processes governing the dynamics of LDs. Experiments with primary human hepatocytes incubated with an excess of FFA show a large heterogeneity of TAG content and LD size distribution. Intriguingly, a large cell-to-cell heterogeneity with respect to the number and size of LDs has been found in various cell types. These findings suggest that the extent of cellular lipid accumulation is not only determined by the imbalance between lipid supply and utilization but also by variations in the expression of regulatory surface proteins and metabolic enzymes. To better understand the relative regulatory impact of individual processes involved in the cellular TAG turnover we varied randomly the expression of RSPs and metabolic enzymes. A random fold change by a factor of about 2 in the activity of RSPs was sufficient to reproduce the large diversity of droplet size distributions. Under the premise that the same extent of variability of RSPs holds for the intact organ, our model predicts variations in the TAG content of individual hepatocytes by a factor of about three to six depending on the nutritional regime. Taken together, our modeling approach integrates numerous experimental findings on individual processes in the cellular TAG metabolism and LD dynamics metabolism to a consistent state-of-the-art dynamic network model.

Der Stoffwechsel der Zelle besteht aus chemischen Reaktionen und Transportprozessen, deren Umsatzraten (Stoffflüsse) das Ergebnis genetischer, translationaler und metabolischer Kontrolle sind. Stoffflüsse erlauben daher wertvolle Einblicke in das interne Zellgeschehen, sind jedoch -- wenn überhaupt -- nur unter großem Aufwand experimentell bestimmbar. Ihre Vorhersage mittels mathematischer Modelle ist ebenfalls komplex; vereinfachend wird angenommen, der Stoffwechsel unterliege einer optimalen Regulation, wobei Optimalität vielfältig interpretiert wird. Die in dieser Arbeit entwickelte Methode zur Flussvorhersage basiert auf der Annahme, dass sich die Synthesewege wichtiger Metabolite im Laufe der Evolution optimiert haben und unabhängig voneinander reguliert werden. Dies ermöglicht den Organismen: 1. sich einer variierenden Umgebung schnell anzupassen und 2. Störungen und Schäden auf kleinere Teilsysteme (Module) zu begrenzen. Kern der Methode ist die Vorhersage optimaler Synthese-Module: stationärer Flusszustände, die jeweils nur einen Metaboliten synthetisieren und dabei eine vorgegebene Zielfunktion minimieren oder maximieren. Diese minimalen Flussmoden (\textit{MinModen}) sind schnell und ohne Kenntnis enzymspezifischer Parameter zu berechnen, womit sie sich auch zur systematischen Überprüfung der Synthesekapazität großer Netzwerke eignen. Durch lineare Kombination der MinModen kann das Flussgeschehen komplexer Stoffwechselleistungen abgebildet werden. Hinsichtlich verfügbarer experimenteller Daten ist die Qualität der so gewonnenen Flussvorhersagen vergleichbar mit bisherigen Konzepten, und das, obwohl die Kombination optimaler Synthesen ein suboptimales Gesamtflussgeschehen ergibt. Vorteil der MinModen-Methode ist die flexible Integration zusätzlich verfügbarer Daten. So können beispielsweise durch Berücksichtigung Freier Gibbs-Energien und recherchierter Metabolitkonzentrationsbereiche thermodynamisch zulässige Flusszustände vorhergesagt werden., The metabolism of a cell consists of chemical transformations and transport processes. Their rates (fluxes) are the result of genetic, translational and metabolic control and therefore carry valuable information about the internal state of a cell. However, metabolic fluxes are hard to determine by experiment and are therefore subject of mathematical prediction methods. In this work, a conceptually new method for the prediction of fluxes in large scale metabolic networks is developed. The method is based on the assumption of optimally evolved synthesis pathways that are regulated independently of each other. This enables organisms: (i) to quickly adapt to a varying and complex environment and (ii) to modularly organize its metabolism in order to restrict internal disturbances and damage to smaller subsystems. The core of this method is the prediction of optimal ``synthesis-modules'''': stationary flux modes, each of which synthesizes a single metabolite while minimizing or maximizing a so-called objective function. These so-called minimal flux modes (MinModes) are rapidly calculable without knowledge of enzyme kinetics. As such they are suited for the determination of the synthesis capacity and the set of blocked reactions of large networks. Linearly combined, they allow for the representation of complex metabolic tasks. In contrast to previous approaches that optimize for the concerted accomplishment of complex metabolic tasks (e.g. biomass formation), optimizing single syntheses results in a rather suboptimal total network flux. However, with respect to available experimental data the prediction quality is comparable to previous (FBA) approaches. As major benefit, the method relies on a flexible structure that allows for the integration of diverse experimentally observed data. Here, incorporating free Gibbs-energy and metabolite concentration values enabled the prediction of thermodynamically feasible flux modes without prior restriction of flux directions.

Ca(2+)-Ionen sind ein universeller sekundärer Botenstoff in eukaryotischen Zellen und übertragen Information durch wiederholte, kurzzeitige Erhöhungen der cytosolischen Ca(2+)-Konzentration (Ca(2+) Spikes). Ein bekannter Mechanismus, der solche Ca(2+)-Signale erzeugt, beinhaltet die Freisetzung von Ca(2+)-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum durch IP3-sensitive Kanäle. Puffs sind elementare Ereignisse der Ca(2+)-Freisetzung durch einzelne Cluster von Ca(2+)-Kanälen. Intrazelluläre Ca(2+)-Dynamik ist ein stochastisches System, allerdings konnte bisher keine vollständige stochastische Theorie entwickelt werden. Die vorliegende Dissertation formuliert die Theorie mit Hilfe von Interpuffintervallen und Pufflängen, da diese Größen im Gegensatz zu den Eigenschaften der Einzelkanäle direkt messbar sind. Die Theorie reproduziert das typische Spektrum bekannter Ca(2+)-Signale. Die Signalform und das durchschnittliche Interspikeinterval (ISI) hängen sensitiv von den genauen Eigenschaften und der räumlichen Anordnung der Cluster ab. Im Gegensatz dazu hängt die Beziehung zwischen Mittelwert und Standardabweichung der ISI weder von den Clustereigenschaften noch von der räumlichen Anordnung ab, sondern wird lediglich von globalen Feedbackprozessen im Ca(2+)-Signalweg reguliert. Diese Beziehung ist essentiell für die Funktion des Signalwegs, da sie trotz der Zufälligkeit der ISI eine Frequenzkodierung ermöglicht und den maximalen Informationsgehalt der Spikesequenzen bestimmt. Neben der theoretischen Analyse enthält die vorliegende Arbeit auch experimentelle Puff- und Spikemessungen an lebenden HEK-Zellen, die wichtige Ergebnisse verifizieren. Insgesamt wird durch die integrierte theoretische und experimentelle Untersuchung auf verschiedenen Stufen molekularer Organisation gezeigt, dass stochastische Ca(2+)-Signale verlässliche Informationsträger sind, und dass der Mechanismus durch globalen Feedback an die spezifischen Anforderungen eines Signalpfads angepasst werden kann. Ca(2+) is a universal second messenger in eukaryotic cells transmitting information through sequences of concentration spikes. A prominent mechanism to generate these spikes involves Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum Ca(2+) store via IP3-sensitive channels. Puffs are elemental events of IP3-induced Ca(2+) release through single clusters of channels. Intracellular Ca(2+) dynamics are a stochastic system, but a complete stochastic theory has not been developed yet. As a new concept, this thesis formulates the theory in terms of interpuff interval and puff duration distributions, since unlike the properties of individual channels, they can be measured in vivo. This leads to a non-Markovian description of system dynamics, for which analytical solutions and efficient stochastic simulation techniques are derived. The theory reproduces the typical spectrum of Ca(2+) signals. Signal form and average interspike interval (ISI) depend sensitively on detailed properties and spatial arrangement of clusters. In difference to that, the relation between the average and the standard deviation of ISIs does not depend on cluster properties and cluster arrangement, and it is robust with respect to cell variability. It can only be regulated by global feedback processes in the Ca(2+) signalling pathway. That relation is essential for pathway function, since it ensures frequency encoding despite the randomness of ISIs and determines the maximal spike train information content. Apart from the theoretical investigation, this thesis verifies key results by live cell imaging of Ca(2+) spikes and puffs in HEK cells. Hence, this work comprises a systems level investigation of Ca(2+) signals, integrating data and theory from different levels of molecular organisation. It demonstrates that stochastic Ca(2+) signals can transmit information reliably, and that the mechanism can be adapted to the specific needs of a pathway by global feedback.

Transkriptionelle Netzwerke (Transkriptionsfaktoren, epigenetische Modulatoren und spezifische Zielgene) stellen die unterste Ebene der zellinternen Signalübertragung dar. Eingebettet in verschiedene stimulusabhängige Signalwege bedienen sich ihre Komponenten genetischer und epigenetischer Mechanismen, um Zielgene transkrip-tionell zu regulieren und Veränderungen der Chromatinstruktur hervorzurufen. In der vorliegenden Arbeit wurde die hierarchische Organisation und Zusam-mensetzung des MEK-ERK-abhängig gesteuerten transkriptionellen Netzwerks und seine Veränderung im Zuge der HRAS-vermittelten onkogenen Transformation von HA1-Zellen untersucht. Viele Arbeiten haben sich bereits eingehend mit der Charak-terisierung einzelner Komponenten und Zielgene beschäftigt (Wagner et al. 2005, Reddy et al. 2002, Sun et al. 2006, Kapitel 1). Im Unterschied zu den zitierten Studien wurde in der vorliegenden Arbeit ein umfassendes Protokoll zur genomweiten De-chiffrierung transkriptioneller Netzwerke unter Kombination von experimentellen und bioinformatischen Methoden entwickelt und durchgeführt. Die Analyse ge-nomweiter Expressionsprofile un- und U0126-behandelter immortaler und HRASV12-transformierter humaner Nierenepithelzellen (HA1EB, HA1ER) erlaubte die Identifi-zierung von 138 auf- und 103 abregulierten genspezifischen IDs der RAS-ERK-abhängig gesteuerten Signalkaskade. Regulierte Transkriptionsfaktoren wurden i-dentifiziert und im Westernblot, sowie zum Teil mittels Durchflusszytometrie und RT-PCR validiert und nachfolgend transienten siRNA-Experimenten unterzogen. Für die Transkriptionsfaktoren ELK3, SRF und den hierarisch darunter liegenden Faktor FRA1 wurden Expressionsprofile der spezifischen siRNA-vermittelten Hemmung in beiden Zelllinien erstell und mit bioinformatischen Methoden (TRAP, GSEA-GO) a-nalysiert um direkte und indirekte sowie gemeinsame Zielgene zu ermitteln. Zusätz-lich wurde der Effekt auf phänotypischer Ebene (Softagar, MTT) überprüft. In der vorliegenden Arbeit ließ sich keine direkte Hierarchie der drei Transkrip-tionsfaktoren SRF, FRA1 und ELK3 bestätigen. Allerdings konnte zum ersten Mal eine gemeinsam regulierte Gruppe von Genen identifiziert werden, die darauf schließen lässt, dass die drei Transkriptionsfaktoren sowohl in HA1EB, als auch in HA1ER Teile eines gemeinsam regulierenden Netzwerks sind. Aus den Proliferationsexperimenten wurde zudem bestätigt, dass jeder Transkriptionsfaktor individuell eine essentielle Rolle bei der Promotion maligner Eigenschaften spielt. Für alle drei Transkriptionsfak-toren konnte eine RAS-abhängige starke Verschiebung der spezifisch angesteuerten Gene nachgewiesen werden. Diese Verschiebung wurde mittels TRAP und GSEA auch für alternative Regulatoren der spezifischen Zielgene festgestellt. Die nähere Analyse der FRA1-abhängigen Zielgene führte zu neuen Erkenntnis-sen zur Umordnung des Transkriptoms im Zuge der onkogenen Transformation. Die FRA1-spezifischen Zielgene in HA1EB und HA1ER weisen unterschiedliche Funktio-nalitäten auf. So wurden in HA1EB viele Gene identifiziert, die im Rahmen der Im-munantwort eine Rolle spielen und in HA1ER nicht reguliert werden. In den RAS-transformierten HA1ER konnten dagegen Gene identifiziert werden, die in der Tu-morprogression eine Rolle spielen (FRA1, STAT3, MTA1, TCFL5). Die Verifizierungen mittels qPCR und ChIP bestätigten 5 der 38 möglichen FRA1-Zielgene. Von diesen, FRA1, AEBP1, FRA1, TCFL5, NPAS2 und YWHAZ ist lediglich FRA1 bereits als FRA1-Zielgen beschrieben. Die Funktionen der neu identifizierten RAS-abhängigen FRA1-Zielgene untermauerten bereits bekannte Funktionen der FRA1-vermittelten Transkription (Differenzierung, Proliferation, zirkadiane Rhythmen, Apoptose) und erweitern sie um verschiedene Aspekte wie Metabolismus und Rückkopplungen in die Signaltransduktion, die noch nicht für die RAS-abhängige FRA1-vermittelte Transktiption beschrieben worden sind. Dazu gehören unter anderem Interaktionen mit TGFbeta, WNT, JAK/STAT und JNK. Daneben sind in den HA1ER eine Vielzahl von Regulatoren des RHO-Signalwegs identifiziert worden, was für FRA1 auf bisher unbekannte Interaktionen mit RAC/RHO-Signalwegen schließen lässt. Transcriptional networks represent the final level of internal signal transmission. They are embedded in different signalling pathways and use genetic as well as epi-genetic mechanisms to regulate their according target genes. During oncogenic trans-formation they are undergoing massive rearrangements in composition, regulation and interaction. This leads to radical changes in the transcriptome and drives the on-cogenic phenotype of the according cells. My thesis employs the composition of the MEK-ERK-dependent transcriptional net-work and its alteration during the HRAS-oncogene-mediated transformation in HA1-cells. By commencing from already known components: SRF, Ternary Complex Fac-tors (TCF: SAP1, SAP2/ELK3, ELK1) and members of the AP1-complex (JUN, FOS-proteins) I analyzed the alteration in expression of secondary targets and their inter-action as well as their relation to the superior factors. Therefore I compared genome wide expression profiles (Affymetrix, HG-U133A) of immortal HA1EB and HRASV12-oncogene-transformed HA1ER-cells with and without U0126-induced MEK/ERK-inhibition and extracted several MEK/ERK-dependent transcription factors. Among them where FRA1 and ELK3, two transcription factors already known to be involved in oncogenesis and proliferation associated processes. ELK3 needs SRF as crucial binding partner to function. Therefor I also included SRF into the subsequent analysis. The three transcription factors function in different time-dependent hierarchy states so we supposed a putative hierachical network be-tween them. I established transient knockdown cells deriving from HA1EB and HA1ER for all three transcription factors and generated further expression profiles from them. Additionally I verified the importance of these transcription factors on survival and proliferation via MTT and Softagar experiments. Using different statis-tically and bioinformatical methods (GSEA, TRAP) in collaboration with the Max-Planck-Institute for molecular Genetics Berlin, several direct and indirect targets of these transcription factors were predicted. These were partially overlapping in all transcription factors. Also, in comparison of the immortal and the transformed cell line, a shift of functionalities and composition of the different target gene populations and collaborating factors could be detected for all three transcription factors. It was found that in HA1EB FRA1 seems more likely to regulate immunresponsive genes as well as genes associated with the cytoskeleton and nucleus organisation whereas in HA1ER FRA1 regulates a large group of transcription- and signalling-associated genes. Additionally it could be shown that in both cell lines FRA1 regulates genes in-volved in epigenetic processes as well as circadian rhythms which are known to be important aspects in oncogenic transformation. I verified 37 different putative target genes of FRA1 using qRT-PCR (Taqman) and partially also ChIP-analysis. Of these 37genes, 5 were fully validated as directly regu-lated targets of FRA1: FRA1, AEBP1, YWHAZ, NPAS2 and TCFL5. They imply functionalities connected to proliferation and differentiation (AEBP1, FRA1, TCFL5) as well as apoptosis (YWHAZ) cell cycle control and circadian rhythm (NPAS2, AEBP1), feedbacks into the signalling (YWHAZ, AEBP1) and metabolism (NPAS2, AEBP1). Summarised the work of this thesis contributes to the decipherment of the direct and indirect targets of the according transcription factors and strengthens the argument of a general and massive shift of the transcriptional network during oncogenic trans-formation of cells. The importance of all three transcription factors on the survival of genes could be proved via proliferation assays. Additionally the functionality of their according targets could be integrated into processes connected to oncogenic trans-formation.