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Die Parodontitis, eine multifaktoriell bedingte, entzündliche Erkrankung des Zahnhalteapparates, stellt neben Karies die Hauptursache für Zahnverlust bei Erwachsenen dar und entsteht überwiegend auf dem Boden mikrobieller Plaqueansammlung. Zudem scheinen Änderungen der vaskulären Strukturen und Funktionen nicht nur bei der Entstehung und Pathogenese entzündlicher Erkrankungen einschließlich parodontalen Entzündungen eine wichtige Rolle zu spielen, sondern auch für post-inflammatorische Regenerationsprozesse von großer Bedeutung zu sein. Als Regulator von Durchblutung und Gefäßfunktion ist die vasomotorische Innervation in anderen Geweben und Organen wie beispielsweise der Haut schon lange im Fokus wissenschaftlichen Interesses. Der genaue Phänotyp der vaskulären Innervation humaner Gingiva wurde bisher jedoch nur unzureichend charakterisiert. Ebenso wenig liegen detaillierte Daten zur möglichen Veränderung der Innervation entzündlicher Gingiva vor. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, unter validen, kontrollierten Bedingungen die lokale monoaminerge, cholinerge und sensible Innervation auf chemoanatomischer Ebene in parodontal gesunden Probanden (n=14; 18-77 Jahre) mittels immunhistochemischer Methoden zu analysieren, mögliche Veränderungen des Phänotyps bei zunehmender Entzündung in zwei verschiedenen Altersgruppen aufzuzeichnen und diese miteinander zu vergleichen. Jedem Patienten wurden jeweils zwei maxilläre Gingivabiopsien entnommen; die erste Probe wurde zur Baselineuntersuchung aus klinisch gesunder Gingiva exzidiert, die zweite, nachdem die plaqueinduzierte experimentelle Gingivitis hervorgerufen und der Entzündungszustand anhand klinischer Parameter bestätigt worden war. Immunreaktionen gegen spezifische Marker der peripheren Transmittersysteme wurden in beiden Serien untersucht und kombinatorische Immunreaktionsmuster mit Hilfe von Doppelfluoreszenz-Komarkierung und konfokaler Laserscanmikroskopie visualisiert. Als Marker dienten Antikörper gegen die für die verschiedenen Innervationstypen jeweils charakteristischen Proteine: i) den vesikulären Monoamintransporter 2 (VMAT2), die katecholaminsynthetisierenden Enzyme Tyrosinhydroxylase (TH), L-Dopa-Decarboxylase (DDC) und Dopamin-ß-Hydroxylase (DBH) und den peptidergen Kotransmitter Neuropeptid Y (NPY) für noradrenerg, sympathische Nerven, ii) den vesikulären Acetylcholintransporter (VAChT), Cholin-Acetyltransferase (ChAT) und die peptidergen Kotransmitter Vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP) und Peptide Histidine-Methionine (PHM) für cholinerg, parasympathische Nerven und iii) Calcitonin gene-related Peptid (CGRP) und Substanz P (SP) für sensible Nerven. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass identische Blutgefäße in der Gingiva gleichzeitig von sympathischen VMAT2+/TH+/DDC+, parasympathischen VAChT+/ChAT+/VIP+ und sensiblen CGRP+/SP+ Nerven innerviert werden. Innerhalb der einzelnen Fasern gab es jedoch keinen Hinweis auf eine katecholaminerg-cholinerge Kolokalisation. Diese Beobachtungen waren in allen Gruppen konsistent. Abgesehen von einer sig. Reduktion von TH-ir, perivaskulären Fasern in der tiefen Lamina propria und für NPY in perivaskulären, papillären Fasern sowie in nonvaskulären Fasern, die bei steigendem Alter beobachtet wurden, gab es keine altersabhängigen Veränderungen in gesunder Gingiva. Inflammationsbedingt konnte in beiden Altersgruppen eine reziproke Plastizität der sympathischen gegenüber der cholinergen Innervation ermittelt werden. Darüber hinaus verhielt sich die Dichte beider Innervationstypen bei zunehmender Entzündung in Gingivabiopsien älterer Patienten invers zu denen junger Probanden. Während die Zahl sympathischer Nerven in jungen Patienten mit steigendem Entzündungsgrad sig. abfiel und unter gleichen Bedingungen in den Proben älterer Studienteilnehmer stieg, zeigte die cholinerge Innervation ein dazu inverses Reaktionsbild, sig. steigend in jungen und sinkend in älteren Patienten. Die Dichte sensibler Nerven stieg in beiden Altersgruppen mit zunehmender Entzündung, wobei sig. Veränderungen vordergründig für CGRP-positive Fasern zu beobachten waren. Die Zahl SP-ir Fasern nahm allein perivaskulär in der tiefen Lamina propria älterer Probanden sig. zu und zeigte ansonsten nur einen steigenden Trend. Die Daten deuten auf eine mögliche neurovaskuläre Beteiligung an der Regulation immunmodulatorischer Prozesse hin, die auf der Koinnervation identischer Gefäße durch voneinander getrennte noradrenerge, cholinerge und sensible Fasern beruht. Außerdem scheinen sich die antientzündlichen Signal-wege zwischen jungen und älteren Patienten zu unterscheiden, was mit einer veränderten neuronalen Verteilung und Immunantwort einhergeht. Aufgrund der pleiotropen vasoregulatorischen und immunmodulatorischen Eigenschaften von Noradrenalin, Acetylcholin und der Neuropeptide ist es wahrscheinlich, dass diese Dreifach-Gefäßinnervation sowie die non-vaskuläre Innervation eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Gingivitis und Parodontitis spielen.

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2021; Aachen : RWTH Aachen University 1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme (2021). = Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2021, Underlying question: The Keap1-Nrf2-ARE system constitutes an integral part of cell protection mechanisms and is therefore the subject of current scientific interest. Research on this matter is prevalently based on mouse models. So far systematic studies on the localization of Nrf2 regarding anatomical/histological structures were lacking. Hence, the present thesis aimed to investigate the distribution of Nrf2 in various murine tissues. Materials and methods: The distribution of Nrf2 in numerous organs and tissue types was determined via sample collection out of BL6-strain mice, immunohistochemical staining using a Nrf2-specific antibody and subsequent miscroscopic evaluation. Leading results: The study showed a pronounced staining predominantly in epithelial structures, which could be observed, among others, in the gastrointestinal tract, the urogenital tract and also in glandular tissue. This staining intensity contrasted strongly at times to the remaining tissue structures. Where present, glandular and immunological cells tended to be notably stained as well. Essential points of discussion: Epithelia are subject to frequent exposition to contaminants and regularly exhibit high rates of cell proliferation and differentiation; the increased detection of Nrf2 could plausibly be ascribed to both these mechanisms. The same applies to a lesser degree to glandular and immunological cells as well. Conversely, the remaining tissue structures were not expected to have shown any pro-nounced Nrf2 activity. Conclusion and outlook: Further studies for corroboration of the observed distribution patterns as well as for investigation of the explanatory approaches given in the present thesis are expedient and can be performed based on the staining protocol employed here., Published by RWTH Aachen University, Aachen

Die Entdeckung aberrant aktivierter Rezeptor-Tyrosinkinasen wie EGFR, ALK und ROS1 in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen (NSCLC) und die Entwicklung von Inhibitoren, die spezifisch die Tyrosinkinaseaktivität hemmen, ermöglichen eine zielgerichtete Therapie und stellen einen großen Fortschritt in der Behandlung von Lungenkarzinomen dar. Die Inhibitoren wirken ausschließlich in Tumoren mit aktivierter Kinase, sodass eine zuverlässige Diagnostik essentiell für eine erfolgreiche Behandlung ist. Während EGFR-Mutationen mittels PCR-basierter Methoden und Sequenzierungen nachgewiesen werden können, sind FISH-Analysen als Diagnostikstandard für Genrearrangierungen bei ALK und ROS1 schwierig, zeit- und kostenintensiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden qRT-PCR-basierte Assays zur Identifizierung ALK- und ROS1-rearrangierter Tumore in der Routinediagnostik entwickelt, die für eine Verwendung an Paraffin-Gewebe konzipiert wurden, für Biopsie- und Resektatmaterial gleichermaßen geeignet sind und die aufgrund der gleichzeitigen Isolierung von RNA und DNA materialsparend mit der EGFR-Diagnostik kombiniert werden können. Der Nachweis basiert auf einer quantitativen Messung der exprimierten Fusionstranskripte, die Rearrangierungen anhand einer unbalancierten Amplifikation von Amplikons im 5‘- und 3‘-Bereich von ALK bzw. ROS1 zuverlässig nachweist. Die entwickelten qRT-PCR-Assays wurden auf große NSCLC-Serien angewendet (ALK: 976 NSCLC, ROS1: 671 NSCLC) und einer vergleichenden Analyse mit FISH und Immunfärbungen unterzogen. ALK- und ROS1-Rearrangierungen konnten zuverlässig und sensitiv anhand der unbalancierten Genexpression nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden mit den qRT-PCR-basierten Analysen neue Subgruppen von NSCLC identifiziert, die eine erhöhte Gesamttranskript-Expression von ALK und ROS1 ohne Genrearrangierung besaßen. Da rearrangierte Tumore unabhängig vom Fusionspartner und gleichzeitig Tumore mit einer erhöhten Expression identifiziert werden können, eignet sich der qRT-PCR-Assay auch zum Nachweis von ALK- und ROS1-Rearrangierungen in anderen Tumorentitäten, sowie zum Nachweis einer Überexpression wie z. B. einer erhöhten ALK-Expression in Neuroblastomen. Da Immunfärbungen eine einfache und kostengünstige Screeningmethode darstellen, wurden in dieser Arbeit drei neu entwickelte ALK-IHC-Systeme (1A4, D5F3, D5F3/Ventana) in zwei Serien mit 250 bzw. 219 NSCLC (darunter 21 bzw. 20 ALK-rearrangierte NSCLC) sowie der ROS1-Antikörper D4D6 in einer Serie mit 251 NSCLC (darunter 8 ROS1-rearrangierte NSCLC) zum Nachweis von ALK- bzw. ROS1-Rearrangierungen getestet. Mit den ALK-Antikörpern wurden eine hohe Sensitivität von 95 – 100 % und eine Spezifität > 99 % erreicht. Auch die Sensitivität und Spezifität des ROS1-Antikörpers war mit einem falsch-positiv und einem falsch-negativ detektierten Fall sehr hoch, sodass im Ergebnis dieser Arbeit ein Screening auf ALK- und ROS1-rearrangierte NSCLC mittels Immunfärbungen empfohlen wird. ALK und ROS1 IHC-positive Tumore sollten zusätzlich mittels qRT-PCR oder FISH auf das Vorhandensein einer Rearrangierung getestet werden, da eine Unterscheidung zwischen Tumoren mit Rearrangierung und erhöhter Expression anhand der Proteinexpression nicht möglich ist. Mit diesem Vorgehen können NSCLC zuverlässig und kostengünstig sowie material- und zeitsparend auf ALK- und ROS1-Rearrangierungen untersucht werden. Weiterführende Analysen ergaben Hinweise darauf, dass auch die in einer Subgruppe von NSCLC (1 %) detektierte Expression von ALK-Transkripten ohne Genrearrangierung zu einer Aktivierung von ALK führen kann. Die Expression von nicht-rearrangiertem ALK führte zu einer detektierbaren Menge an ALK-Protein. In einem der Fälle wurde ein potentiell aktivierender Aminosäureaustausch in der Kinasedomäne (S220Y) identifiziert. Die ALK- Expression der nicht-rearrangierten NSCLC war mit der Genexpression der ALK-Liganden MDK und PTN sowie der Aktivierung des ALK-Targets STAT3 assoziiert, sodass ALK-exprimierende NSCLC-Zellen – in Analogie zu Neuroblastomzellen – mit ALK-Inhibitoren therapierbar sein könnten. In dieser Studie wurde bei 8 % der NSCLC eine deutliche ROS1-Expression ohne Genrearrangierung beobachtet; in 25 % dieser Fälle waren Transkriptvarianten von ROS1 exprimiert. Eine Sequenzanalyse von nicht-rearrangierten Fällen mit unbalancierter ROS1-Expression identifizierte 5 bislang nicht beschriebene Transkriptvarianten, denen eine unterschiedliche Anzahl von Exons im 5‘-Bereich fehlten. Die Transkriptvarianten führen bei einer Translation zu verkürzten ROS1-Proteinen, die alternative Funktionen besitzen und tumorigen wirken könnten. Bei einem dieser Tumore wurde die Expression eines ROS1-Proteins mit Kinase-Domäne beobachtet. Die Tyrosinkinase LTK ist aufgrund ihrer großen Homologie zu ALK ein interessanter Kandidat für eine zielgerichtete Therapie von NSCLC. In dieser Arbeit wurde erstmalig die Genexpression von LTK systematisch quantitativ und qualitativ in einer großen Serie von 542 NSCLC untersucht, sowie die Existenz von Genrearrangierungen in Lungenkarzinomen überprüft. Mit einer qRT-PCR-Analyse wurde in 9 % der NSCLC eine unbalancierte Expression des 3‘-Bereichs identifiziert. LTK-Rearrangierungen wurden anhand von FISH-Analysen nicht nachgewiesen und scheinen in NSCLC keine Rolle zu spielen. Eine Untersuchung auf potentielle Transkriptvarianten identifizierte eine neue, in NSCLC-Tumorzellen exprimierte, LTK-Variante, bei der die Exons 2 – 7 fehlen. Das potentielle Translationsprodukt enthält die Kinasedomäne, jedoch nur einen Teil des extrazellulären Bereichs und eine veränderte Transmembrandomäne, was sich auf Lokalisation und Regulierung der Kinase auswirken sollte. Somit ist eine aberrante Aktivierung der Kinase möglich, sodass LTK auch ohne Rearrangierung eine Relevanz für die Pathogenese und Therapierbarkeit von NSCLC besitzen könnte. Die in dieser Arbeit identifizierten tumorspezifischen Expressionen von ALK-, ROS1- und LTK-Transkripten und Transkriptvarianten ist potentiell in der Pathogenese einer Subgruppe von NSCLC beteiligt. In weiterführenden Studien muss geklärt werden, ob die entsprechenden Tumore mit spezifischen Inhibitoren therapierbar sind.

Das Ovarialkarzinom ist eines der häufigsten Malignome der Frau. Die Charakterisierung der Primärkulturen aus Ovarialkarzinomgewebe und Asciteszellen erfolgte durch immunhistochemische Färbungen (IHC) und genetische Verfahren (CGH, FISH, FICTION). Das Wachstumsverhalten und das tumorigene Potential wurden durch Transmigrationsassays und Xenotransplantation in SCID-Mäuse untersucht. Alle Kulturen bildeten Tumore nach Xenotransplantation. In der CGH zeigten sich ovarialkarzinomtypische Aberrationen. Mit der FISH konnte ein Tumorzellanteil zwischen 70 und fast 100% nachgewiesen werden. Mit der IHC konnte nur ein geringerer Teil der Tumorzellen identifiziert werden. Diese Diskrepanz wurde im FICTION-Experiment bestätigt. Ursächlich können kulturbedingte Veränderungen der Zellen oder eine epithelial-mesenchymale Transition sein. Eine genetische Untersuchung der Zellen auf Einzel-Zell-Niveau ist zur Charakterisierung von Primärkulturen notwendig, die durch IHC sinnvoll ergänzt werden kann.

Today, the construction of tissue microarrays in order to investigate the expression of proteins and genes on large case series is an approved and accepted method. The applicability of the tissue microarray technique for analysis of bone marrow biopsies has not been tested before and up to now not been mentioned in literature. The aim of our work was the construction of bone marrow TMAs, the analysis of arising technical difficulties and the immunohistochemical analysis of 15 markers used on the TMAs. The technique has been validated in a direct manner by the comparison with the corresponding full tissue sections and indirectly by the comparison with data from international literature. In our study we include 148 cases of acute leukemia, which comprise 115 AML (according to the FAB classification: 10 M0, 12 M1, 30 M2, 5 M3, 29 M4, 15 M5, 1 M6, 2 M7 und 11 not classified) and 33 ALL (23 B- and 5 T-ALL, 5 not classified). Some cases were punched twice, the others three times each. After the construction of the tissue microarrays we performed a morphological analysis of the H&E-stained section and an immunohistochemical analysis of the expression of the following markers: CD3, CD10, CD15, CD20, CD34, CD61, CD68, CD79a , CD99, CD117, CD138, MPO, HbA1, Glycophorin and TdT. The results can be summarized as follows: The TMA technique is an adequate method for the evaluation of bone marrow biopsies. In morphological analysis of the H&E-stained TMAs 6 (4%) of the 148 cases (384 punches overall) were not evaluable. 14 of the 384 punches (4%) because of missing tumor cells and 28 (7%) because of missing tissue (table 23). The number of sample losses is comparable to data of studies about TMAs on different tissues. By the immunohistochemical analysis of 15 markers on the three TMAs we obtained a number of 2220 analyses (each consisting of 2 resp. 3 punches) and 5760 single analyses, of which 723 (13%) were not evaluable, 437 (8%) of these because of missing tumor cells and 286 (5%) because of missing tissue (table 23). For the direct comparison of TMA cases with conventional sections we chose 7 of the 15 markers (CD3, CD10, CD20, CD34, CD68, CD117 und TdT. It revealed a concordance of 100%, which correlates well data in international literature, where a concordance between 82,5 - 100% was reached on different tissues. The results of the immunohistochemical analysis on maximum 0,6mm2 sized cores correspond surprisingly in 100% to those of the full section. In our study we were able to show that the utilisation of the TMA technique on bone marrow biopsies of acute leukemias is a reliable and effective method. Future large case cohort studies could be performed especially while using a combination of the TMA technique with DNA arrays with substantial time and cost savings. Dispite minor material losses due to the application of the TMA technique these studies can result in a broader and improved information content.