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Das Repertoire an Virulenzfaktoren ermöglicht der Gattung Yersinia eine Infektion von Menschen sowie Invertebraten. Die bei Umwelttemperaturen (10-20°C) exprimierten Gene des insektiziden Toxinkomplexes (Tc) von Y. enterocolitica sind in einer Pathogenitätsinsel angeordnet. In dieser Arbeit wurde die Holin-Endolysin-Spanine-Kassette der Pathogenitätsinsel charakterisiert. Die Phagenproteine können ihren Wirt temperatur-abhängig nur bei 37°C, durch die Protease Lon kontrolliert, lysieren. Außerdem wurde ein insektizider Virulenzfaktor bei Y. frederiksenii identifiziert und als YacT bezeichnet, der zur Beeinträchtigung von Hämozyten beiträgt. Due to a repertoire of virulence factors representatives of genus Yersinia are able to infect humans or invertebrates. The genes encoding the insecticidal toxin complex (Tc) of Y. enterocolitica are encoded on the pathogenicity island and activated at environmental temperatures. In this study, a holin-endolysin-spanins cassette from that island was characterized. The phage proteins are able to lyse their own host in a temperature-dependent manner at 37°C regulated by protease Lon. Additionally, a new insecticidal virulence factor was identified in Y. frederiksenii and termed YacT which influences morphology of hemocytes.

Infektionen durch MRSA können aufgrund der zunehmenden Therapieresistenz der Erreger ernsthafte Verläufe zeigen. Daher ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien ein Ziel der aktuellen Infektionsforschung. Ein vielversprechender Ansatz liegt in der Verwendung pathogenspezifischer, monoklonaler Antikörper gegen immunodominante Antigene der Erreger. Durch die Fortschritte in der Genomforschung der vergangenen Jahre ist nun die Analyse der Gesamtheit der Pathogenitätsfaktoren eines bakteriellen Erregers möglich. Durch eine funktionelle Genomanalyse mit Hilfe immunologischer Detektionssysteme können antigene Bakterienzellstrukturen identifiziert werden. Daraus abgeleitete Targetstrukturen sollen die Grundlage bilden für die Entwicklung spezifischer humaner Antikörper, die in alternativen Therapieansätzen zusätzlich zur antimikrobiellen Chemotherapie zukünftig an Bedeutung gewinnen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Expressionsgenbank eines MRSA-Stammes hergestellt und mittels Patientenseren nach immunodominanten Antigenen gesucht. Die aus einem Partialverdau der genomischen DNA gewonnenen Fragmente wurden in einen Expressionsvektor kloniert. Die so hergestellte Genbank des ausgewählten MRSA-Stammes A 134 umfasst ca. 10000 Klone. Ein vergleichendes Screening der Genbank erfolgte mit dem Serum eines Patienten mit einer MRSA-Sepsis und mit dem Serum einer negativen Kontrollperson. Die DNA-Inserts der immunoreaktiven Klone wurden sequenziert und durch Datenbankvergleiche identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass der gewählte Ansatz geeignet ist, um immunodominante Antigene, die während einer Sepsis exprimiert werden, zu identifizieren. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen putativen immunodominanten Antigenstrukturen umfassen ein Holin, die Amidase LytA, Faktoren des isd-Genclusters, der für die Cadmiumresistenz wichtige Transporter CadA, unbekannte Proteine der Staphylokokken-Pathogenitätsinsel SaPI3 und Protein A. Interessanterweise wurden durch den methodischen Ansatz vorwiegend Proteine auf mobilen genetischen Elementen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während einer S. aureus-Infektion nicht nur Gene für das Wachstum der Zellen und Virulenzfaktoren wie Toxine und Adhäsine, sondern auch mobile Elemente exprimiert werden. Die Bedeutung dieser Prozesse für das Infektionsgeschehen ist allerdings bislang unbekannt und zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit diese Elemente für die Pathogenese von Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene müssen auch in zukünftigen Arbeiten durch Subklonierung weiter charakterisiert werden. Eine weitere interessante Beobachtung ist die Identifizierung eines Bakteriophagens, der in das isd-Gencluster inserierte, das für die Aufnahme von Eisen eine Bedeutung besitzt. Inwieweit durch die Insertion des Phagens die Eisenaufnahme in dem klinischen Isolat gestört wird, müssen zukünftige Studien zeigen. Die positive Reaktion des Patientenserums mit dem Protein A ist am wahrscheinlichsten auf die Antiköperbindung am FC-Fragment zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass während der Infektion verstärkt Protein A gebildet wird, das durch die Bindung von Antikörpern am Fc-Teil eine immunsuppressive Wirkung durch die Neutralisierung opsonisierender und Toxin-inaktivierender Antikörper besitzt. Durch die Sequenzierung und Datenbankanalyse der positiven Klone konnte ein erster Überblick über immunodominante Antigene von S. aureus erhalten werden. Da auf den Insertelementen meist mehrere putative Antigene kodiert sind, müssen in zukünftigen Arbeiten die identifizierten Insertelemente subkloniert und damit weiter charakterisiert werden. Dadurch sollte es möglich sein, die immunogenen Strukturen zu erkennen und diese für die Entwicklung monoklonaler Antikörper zu nutzen., Infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are increasingly difficult to threat due to the presence of multiple antibiotic resistance traits. Therfore, the developemet of alternative strategies are urgently demanded to combat severe staphylococcal infections. Immunotherapy has become a promising approach using specific, monoclonal antibodies against defined immunodominant structures (antigens) of the bacterium. The recent progress of genome-based research of bacterial pathogens allows now the global analysis of factors involved in pathogenicity. The identification of such virulence-associated factors might result in the development of specific antibodies against bacterial pathogens which may administered supplementary to antibiotics increasing the success of of a therapy. In this study an expression library of an MRSA strain was constructed. For this purpose, genomic DNA of a MRSA strain was digested with Sau3A and DNA fragments of 3 to 10 kb were ligated into the expression vector ZAP-express. The gene library encompasses approximately 10,000 clones. To detect specific antigenic structures the expression library was screened by using human sera of MRSA septiceamic patients and sera of asymptomatically colonized individuals. Clones which specifically reacted with the patients sera were further analyzed by DNA-sequencing and BLAST analysis. Several staphylococcal antigenic and immunodominant structures were identified including a putative holin and a gene with strong homology to the amidase lytA. Both proteins may phage-derived as they show significant similarity to a range of phage proteins. In addition, genes of the isd-locus reacted with the immunsera. These genes encode proteins which are important for transport of iron into the cell. Furthermore, a cadmium resistance factor (cadA), unknown proteins localized on Staphylococcus aureus pathogenicity island 3 (SaPI3) and protein A showed a positive reaction with the immune sera. Interestingly, almost all proteins identified are associated with mobile genetic elements. The results of the study suggests that proteins encoded on mobile genetic elements are indeed expressed during infection which in turn are recognized by the immune system resulting in the production of specific antibodies. To what extend these antibodies contribute to a successful defence of staphylococcal cells is currently not known and subject of ongoing studies. Moreover, the antigenic and immunodominant structures identified in this study have to subcloned to characterize their immunoreactive potential. The positive reaction of the patient serum with protein A is probably caused by the antibody-binding capacity of the protein to the FC-fragment of antibodies. An alternative theoretical opportunity could be that an acute S. aureus infection causes a massive production of protein A that subsequently consume antibodies due to binding of the FC-Fragment. The sum of these events may cause a dramatic immunsuppressive effect. In conclusion, several putative immunodominant structures have been identified being the basis for further studies to assess whether or not these structures may serve as targets of an antibody-based therapy of infections caused by S. aureus.

Der humanpathogene Krankenhauskeim C. difficile hat sich in den letzten Jahren zu einem der häufigsten Erreger nosokomialer und Antibiotika-assoziierter Darmerkrankungen entwickelt. Die Symptome variieren von leichtem Durchfall bis zu pseudomembranöser Kolitis. Nach heutigen Kenntnissen beruht die Infektion auf den Hauptvirulenzfaktoren Toxin A und B. In dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Toxinproduktion und dem Metabolismus untersucht, um aufzudecken, welche Adaptionsstrategien auf ein verändertes Nährstoffangebot die Toxinproduktion beeinflussen. Die Supplementierung mit Cystein und L-Lactat zeigte im Stamm 630 delta erm eine reduzierte extrazelluläre Toxinkonzentration. Die Umsetzung von Cystein führte durch die Bildung von H2S zu einem Eisenmangel. Da Eisen in Form von Ferredoxin nicht für die Übertragung von Elektronen zur Verfügung stand, wurden viele Stoffwechselwege stark reduziert. Im Zentralstoffwechsel wurde die Reaktion der Milchsäuregärung erhöht und es wurden große Mengen L-Lactat sekretiert. Im Gegensatz dazu kam es bei einer Supplementierung mit L-Lactat zu einer Aufnahme des Lactats. Das Lactat wurde über eine über Elektronen-Bifurkation laufende Lactatdehydrogenase zu Pyruvat umgesetzt, wodurch das NAD+/NADH-Verhältnis reduziert wurde. Da die Toxine intrazellulär ähnliche Konzentrationen zeigten, könnte die Reduktion der extrazellulären Toxinkonzentration durch eine aus dem veränderten Redoxpotential resultierenden Konformationsänderung des Holins TcdE zustande kommen. Während eine hohe Glucosekonzentration aufgrund einer Kohlenstoff-Katabolitrepression im Stoffwechsel zu reduzierten extrazellulären Toxinkonzentrationen führte, zeigte eine moderate Glucosekonzentration erhöhte Toxinkonzentrationen. Dies beruhte auf einer höheren Umsetzung von Aminosäuren und einem reduzierten NAD+/NADH-Verhältnis. Die Zugabe von Mannose führte zu erhöhten extrazellulären Toxinkonzentrationen. Kultivierungen mit Mannose zeigten keine, für Kultivierungen mit Glucose nachgewiesene, Zellaggregation in der stationären Phase. Auf diese kann der Unterschied im sekretierten Toxin zurückgeführt werden. Die Abhängigkeit der Toxine von der Zellaggregation und von der Lactatkonzentration konnte auf weitere C. difficile-Isolate übertragen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Verständnis der Zusammenhänge zwischen Stoffwechsel und Toxinproduktion in C. difficile und bieten daher Ansätze für die Erforschung neuer therapeutischer Strategien., In the last few years the human pathogen C. difficile has developed to one of the most common causes of nosocomial and antibiotic-associated intestinal infections with symptoms vary from mild diarrhoea to pseudomembranous colitis. The major virulence factors are the toxins A and B. Here, the relationship between toxin production and metabolism was investigated in order to uncover which adaptation strategies to an altered nutrient supply influence toxin production. Supplementation with cysteine and L-lactate led to a reduced toxin secretion of strain 630 delta erm. By cysteine supplementation, the toxin production was reduced by a severe iron limitation due to formed hydrogen sulphide during cysteine degradation, resulting in insoluble iron sulphide. This led to a reduced activity of many metabolic pathways in which iron is used as ferredoxin for the transfer of electrons. The carbon flow was re-directed into lactic acid fermentation and high amounts of L-lactate were secreted. In contrast, external supplementation with L-lactate led to an uptake of lactate. By electron bifurcation, the lactate is converted to pyruvate, which reduced the NAD+/NADH ratio. Due to similar intracellular toxin concentrations, conformational changes in the holin TcdE caused by the altered redox potential were suggested as the reason for the reduced extracellular toxin concentration. High glucose concentrations resulted in reduced extracellular toxin concentrations due to carbon catabolite repression in the metabolism. A moderate glucose concentration increased toxin production compared to glucose-free cultures. This was probably due to a higher conversion of amino acids and a reduced NAD+/NADH ratio. The addition of mannose led to strongly increased extracellular toxin concentrations compared to cultivation with glucose. This can be attributed to metabolic differences between planktonic cells and biofilms as the cells grown with mannose did not show cell aggregation in the stationary phase as was demonstrated for cells grown with glucose. The dependence of toxin production on cell aggregation and lactate concentration could also be transferred to other isolates of C. difficile. The results of this work extend the understanding of the relationships between metabolism and toxin production in C. difficile and therefore offer approaches for the investigation of new therapeutic strategies.