Search

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Todesursache und angeborene Herzfehler sind die häufigsten Fehlbildungen in der menschlichen Entwicklung. Aufgrund der Geschwindigkeit und Unzugänglichkeit der frühen Herzentwicklung beim Menschen und der Einschränkungen bei der Verwendung von Tieren besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung physiologisch relevanter in vitro-Modelle des menschlichen Herzens. Es gibt jedoch kein in vitro-Modell für alle wichtigen Kompartimente des embryonalen Herzens, das zur Untersuchung der zugrunde liegenden genetischen oder umweltbedingten (teratogenen) Ursachen angeborener Herzkrankheiten verwendet werden könnte. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur Etablierung eines 3D-Herzorganoidmodells (cardioid), das alle fünf Hauptkompartimente des sich entwickelnden Herzens, linke Herzkammer, rechte Herzkammer, Ausflusstrakt, Vorhöfe und Atrioventrikularkanal, umfasst und als cardioid Mehrkammer-Plattform etabliert ist. Die effiziente Differenzierung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen in Herzvorläuferzellen des ersten, anterioren zweiten und posterioren zweiten Herzfelds sowie die weitere Differenzierung in die spezifischen Herzkompartimente (Kammern) ist durch die Verwendung verschiedener Signalfaktoren möglich. Die cardioid Mehrkammer-Plattform wurde verwendet, um die Auswirkungen des Knockouts der entwicklungsrelevanten Gene ISL1, FOXF1, TBX5 und TBX1 zu untersuchen, die im Vergleich zu in vivo-Daten meist die erwarteten Phänotypen zeigten. Zur weiteren Validierung des Systems wurde das Kontraktionsverhalten untersucht, das für die verschiedenen cardioid Subtypen ein unterschiedliches kontraktiles Verhalten zeigte. Wenn sich verschiedene cardioids gemeinsam entwickelten, begannen sie zu interagieren und miteinander zu schlagen, was zeigt, dass sie in der Lage sind, sich wie in vivo funktionell zu verbinden. Die Behandlung mit Retinoiden, Kunststoffresten oder Thalidomid während der Differenzierung zeigte kompartmentspezifische Effekte dieser teratogenen Substanzen. All diese Punkte belegen, dass die cardioid Mehrkammer-Plattform ein wertvolles Instrument ist, das zur Entschlüsselung der Entwicklungsmechanismen des Herzens und der genetischen oder umweltbedingten Ursachen angeborener Herzkrankheiten eingesetzt werden kann. Cardiovascular diseases are the number one cause of death and congenital heart defects are the most common human developmental malformations. Due to the speed and inaccessibility of early cardiac development in humans and limitations of using animals, there is a great necessity to develop physiologically relevant human cardiac in vitro models. However, there is no in vitro model for all major compartments of the embryonic heart that could be used to study the underlying genetic or environmental (teratogenic) causes of congenital heart diseases. This thesis provides a contribution to the establishment of a 3D cardiac organoid (cardioid) model that includes all five major compartments of the developing heart, left ventricle, right ventricle, outflow tract, atria, and atrioventricular canal, which is established as the multi-chamber cardioid platform. The efficient differentiation of human induced pluripotent stem cells into first, second and posterior second heart field cardiac progenitors as well as further differentiation into the specific cardiac compartments (chambers) is possible with the use of distinct signaling factors. The multi-chamber cardioid platform was used to investigate the effect of knocking out the developmentally important genes ISL1, FOXF1, TBX5, and TBX1, which mostly showed expected phenotypes compared to in vivo data. To further validate the system, the contraction behavior was studied, which showed different contractile behavior for the different cardioid subtypes. When different cardioids were co-developing, they started to interact and pace each other, which showed that they have the capability to functionally connect in an in vivo-like fashion. The treatment with retinoids, plastic residues, or thalidomide during the differentiation revealed compartment-specific effects of these teratogenic substances. All these points prove that the multi-chamber cardioid platform is a valuable tool that can be used to unravel developmental cardiac mechanisms and genetic or environmental causes of congenital heart diseases. Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2022

Plakophiline sind Proteine der Armadillo-Familie, die eine Funktion während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus aufweisen. Mutationen in Genen, die für diese Proteine kodieren, führen häufig zu Krankheiten. In dieser Arbeit wird der Phänotyp von Plakophilin 2-defizienten Mausembryonen untersucht, welche Probleme in der Morphogenese des Herzens und dessen Stabilität aufzeigen. Feine Risse in der Herzwand in den Tagen 10.5-11 der Embryogenese führen zu Blutfluss in die Perikardialhöhle und resultieren in embryonalem Tod. In Abwesenheit von Plakophilin 2 löst sich das Zytoskelett-bindende Protein Desmoplakin aus den Zellverbindungen der Kardiomyozyten und bildet Aggregate im Zytoplasma. Im Gegensatz dazu bleiben Zellverbindungen der Epithelien unverändert. Die molekulare Analyse des betroffenen Gewebes lässt eine essentielle Rolle für Plakophilin 2 in der Organisation der Zellverbindungen im Herz ableiten. Besonderen Wert bekamen diese Untersuchungen, als es gelang, die erarbeiteten Zusammenhänge mit einer Krankheit beim Menschen zu koppeln. Beachtlicherweise wurden bei mehr als 25% der an Arrhythmogener-Rechts-Ventikulärer-Kardiomyophathie (ARVC) erkrankten Menschen, Mutationen im Gen für Plakophilin 2 gefunden., Plakophilins are proteins of the armadillo family that function in embryonic development and in the adult, and when mutated can cause disease. We have ablated the plakophilin 2 gene in mice. The resulting mutant mice exhibit lethal alterations in heart morphogenesis and stability at mid-gestation (E10.5–E11), characterized by reduced trabeculation, disarrayed cytoskeleton, ruptures of cardiac walls, and blood leakage into the pericardiac cavity. In the absence of plakophilin 2, the cytoskeletal linker protein desmoplakin dissociates from the plaques of the adhering junctions that connect the cardiomyocytes and forms granular aggregates in the cytoplasm. By contrast, embryonic epithelia show normal junctions. Thus, we conclude that plakophilin 2 is important for the assembly of junctional proteins and represents an essential morphogenic factor and architectural component of the heart. Interestingly we identified heterozygous mutations in the Plakophilin 2 gene in 32 out of 120 patients suffering from arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC). ARVC is associated with fibrofatty replacement of cardiac myocytes, ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death. Many of the identified mutations lead to an early STOP in protein translation and reduced expression of Plakophilin 2 protein likely due to RNA or protein degradation. Since loss of one functional allele of Plakophilin 2 leads to ARVC, we want to investigate the occurrence of typical ARVC-phenotypes in heterozygous Plakophilin 2 mice in future to provide a new insight into possible molecular mechanisms of ARVC.