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Die Blüten von Gerbera Hybriden (Compositae) enthalten verschiedene Flavonglykoside. Diese Verbindungen gehören zu einer der am weitesten verbreiteten Gruppe natürlich vorkommender Flavonoide. Neben ihrem Vorkommen in Blüten, in denen sie die Farbe zusammen mit anderen Flavonoiden beeinflussen, konnten sie auch in vielen anderen Teilen höherer Pflanzen nachgewiesen werden. Darüber hinaus sind die Flavone wichtige Moleküle bei der Induktion der Nodulationsgene in verschiedenen Rhizobium Arten, die wiederum zur Bildung von stickstofffixierenden Wurzelknöllchen bei Leguminosen beitragen. Sie spielen aber auch bei verschiedenen Wechselwirkungen zwischen Insekten und der Wirtspflanze eine wichtige Rolle. In den letzten Jahren wurden zudem therapeutische Wirkungen, die Eigenschaften als bioaktive Substanzen und als Arzneimittel bei der Behandlung von tierischen und menschlichen Erkrankungen verstärkt untersucht und beschrieben. In den Blüten von definierten Gerbera Genotypen konnte eine Enzymaktivität gezeigt werden, die die Einführung einer Doppelbindung zwischen den C-Atomen 2 und 3 der Flavanone Naringenin und Eriodictyol katalysiert. Bei den gebildeten Produkten handelte es sich um die entsprechenden Flavone Apigenin und Luteolin. Wie für die Flavonsynthase II (FNS II) aus anderen Pflanzenarten beschrieben, ist die Enzymaktivität dieser Cytochrom P450-(Cyt P450) abhängigen Monooxygenase in der mikrosomalen Fraktion lokalisiert. Die Reaktion ist strikt von NADPH als Kofaktor abhängig und zeigte ein pH-Optimum von ungefähr 7.5. Die FNS II Aktivität konnte nur in Blütenextrakten von Genotypen mit dominanten Wildtyp Allelen am Locus Fns, nicht aber in Linien mit rezessiven Allelen (fns fns) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse belegten zum ersten Mal eine Korrelation zwischen einem Gen und der Enzymaktivität der FNS II. Weitere genetische Untersuchungen bewiesen die monogene Vererbung der Flavonbildung in Gerbera. Basierend auf den genetischen und biochemischen Ergebnissen wurde Differential Display zur Klonierung eines FNS II cDNA Klons eingesetzt. Aus zwei unterschiedlichen chemogenetisch definierten Gerbera Linen mit dominanten (fns+ .) bzw. rezessiven (fns fns) Allelen am Locus Fns konnte ein Cyt P450 Fragment (CypDDd7a) isoliert werden. Dazu wurden upstream Primer, die aus dem konservierten Bereich der Häm- Bindungsregion der Cyt P450 Proteine abgeleitet wurden, in Kombination mit drei verschiedenen Oligo (dT) Primern verwendet. Der vollständige cDNA Klon (CYP93B2), der sowohl einen offenen Leserahmen und Teile der CypDDd7a Sequenze enthielt wurde über ein 5'-RACE und end-to-end PCR mit genspezifischen Primern isoliert. Northern Blot Analysen mit Gesamt RNA von Gerbera Hybriden ergaben, dass das CYP93B2 Gen nur in Linien mit dominantem Allel fns+ transkribiert wird und dass die Transkriptions- höhe während der Blütenentwicklung im Einklang mit der gemessenen Enzymaktivität der FNS II und der Flavonakkumulation steht. Mikrosomen von Hefezellen, die die cDNA CYP93B2 expremieren, katalysierten die direkte Bildung von [14C]Flavonen aus den entsprechenden [14C]Flavanonen. Demnach konnte gezeigt werden, dass der Klon CYP93B2 ein funktionelle FNS II kodiert. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz zeigte, dass CYP93B2 eine Homologie von 52% zur Sequenz von CYP93B1 besitzt, welche kürzlich als eine (2S)-Flavanon 2-Hydroxylase aus Glycyrrhiza echinata L beschrieben wurde. Durch die Kombination von Genetik, Chemie, Biochemie und Molekularbiologie ist es erstmalig gelungen einen cDNA Kon zu isolieren, der für eine funktionelle FNS II kodiert. Mit Hilfe des FNS II Gens bzw. des entsprechenden Enzyms ist es möglich in einen wichtigen Schritt in dem Flavonoidbiosyntheseweg zu einzugreifen. Dieser Schritt ist an einem wichtigen Verweigungspunkt der Flavonoidbiosynthese lokalisiert, an dem die Synthese von verschiedenen anderen Flavonoiden, wie z.B. Isoflavone, Flavonole, Proanthocyane und Anthocyane, abzweigt. Daher kann durch gezielte gentechnische Ansätze die Synthese der oben genannten Verbindung einschließlich der Flavone durch die Änderung der FNS II Aktivität beeinflusst werden. Darüber hinaus hat das isolierte Gen eine erhebliche Bedeutung bei der direkten Veränderung der Flavonsynthese in verschiedenen Geweben bei der Bildung von neuen Farben in Blüten und Blättern. Außerdem können eine Reihe wirtschaftlich bedeutende Faktoren im Pflanzenbau, die von Krankheitsresistenz, Knöllchenbildung bei Leguminosen bis zu neuen Produkten für die Ernährung und pharmakologische Anwendung reichen, beeinflusst werden [Abstract only in German available.] Die Blüten von Gerbera Hybriden (Compositae) enthalten verschiedene Flavonglykoside. Diese Verbindungen gehören zu einer der am weitesten verbreiteten Gruppe natürlich vorkommender Flavonoide. Neben ihrem Vorkommen in Blüten, in denen sie die Farbe zusammen mit anderen Flavonoiden beeinflussen, konnten sie auch in vielen anderen Teilen höherer Pflanzen nachgewiesen werden. Darüber hinaus sind die Flavone wichtige Moleküle bei der Induktion der Nodulationsgene in verschiedenen Rhizobium Arten, die wiederum zur Bildung von stickstofffixierenden Wurzelknöllchen bei Leguminosen beitragen. Sie spielen aber auch bei verschiedenen Wechselwirkungen zwischen Insekten und der Wirtspflanze eine wichtige Rolle. In den letzten Jahren wurden zudem therapeutische Wirkungen, die Eigenschaften als bioaktive Substanzen und als Arzneimittel bei der Behandlung von tierischen und menschlichen Erkrankungen verstärkt untersucht und beschrieben. In den Blüten von definierten Gerbera Genotypen konnte eine Enzymaktivität gezeigt werden, die die Einführung einer Doppelbindung zwischen den C-Atomen 2 und 3 der Flavanone Naringenin und Eriodictyol katalysiert. Bei den gebildeten Produkten handelte es sich um die entsprechenden Flavone Apigenin und Luteolin. Wie für die Flavonsynthase II (FNS II) aus anderen Pflanzenarten beschrieben, ist die Enzymaktivität dieser Cytochrom P450-(Cyt P450) abhängigen Monooxygenase in der mikrosomalen Fraktion lokalisiert. Die Reaktion ist strikt von NADPH als Kofaktor abhängig und zeigte ein pH-Optimum von ungefähr 7.5. Die FNS II Aktivität konnte nur in Blütenextrakten von Genotypen mit dominanten Wildtyp Allelen am Locus Fns, nicht aber in Linien mit rezessiven Allelen (fns fns) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse belegten zum ersten Mal eine Korrelation zwischen einem Gen und der Enzymaktivität der FNS II. Weitere genetische Untersuchungen bewiesen die monogene Vererbung der Flavonbildung in Gerbera. Basierend auf den genetischen und biochemischen Ergebnissen wurde Differential Display zur Klonierung eines FNS II cDNA Klons eingesetzt. Aus zwei unterschiedlichen chemogenetisch definierten Gerbera Linen mit dominanten (fns+ .) bzw. rezessiven (fns fns) Allelen am Locus Fns konnte ein Cyt P450 Fragment (CypDDd7a) isoliert werden. Dazu wurden upstream Primer, die aus dem konservierten Bereich der Häm-Bindungsregion der Cyt P450 Proteine abgeleitet wurden, in Kombination mit drei verschiedenen Oligo (dT) Primern verwendet. Der vollständige cDNA Klon (CYP93B2), der sowohl einen offenen Leserahmen und Teile der CypDDd7a Sequenze enthielt wurde über ein 5'-RACE und end-to-end PCR mit genspezifischen Primern isoliert. Northern Blot Analysen mit Gesamt RNA von Gerbera Hybriden ergaben, dass das CYP93B2 Gen nur in Linien mit dominantem Allel fns+ transkribiert wird und dass die Transkriptions-höhe während der Blütenentwicklung im Einklang mit der gemessenen Enzymaktivität der FNS II und der Flavonakkumulation steht. Mikrosomen von Hefezellen, die die cDNA CYP93B2 expremieren, katalysierten die direkte Bildung von [14C]Flavonen aus den entsprechenden [14C]Flavanonen. Demnach konnte gezeigt werden, dass der Klon CYP93B2 ein funktionelle FNS II kodiert. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz zeigte, dass CYP93B2 eine Homologie von 52% zur Sequenz von CYP93B1 besitzt, welche kürzlich als eine (2S)-Flavanon 2-Hydroxylase aus Glycyrrhiza echinata L beschrieben wurde.Durch die Kombination von Genetik, Chemie, Biochemie und Molekularbiologie ist es erstmalig gelungen einen cDNA Kon zu isolieren, der für eine funktionelle FNS II kodiert. Mit Hilfe des FNS II Gens bzw. des entsprechenden Enzyms ist es möglich in einen wichtigen Schritt in dem Flavonoidbiosyntheseweg zu einzugreifen. Dieser Schritt ist an einem wichtigen Verweigungspunkt der Flavonoidbiosynthese lokalisiert, an dem die Synthese von verschiedenen anderen Flavonoiden, wie z.B. Isoflavone, Flavonole, Proanthocyane und Anthocyane, abzweigt. Daher kann durch gezielte gentechnische Ansätze die Synthese der oben genannten Verbindung einschließlich der Flavone durch die Änderung der FNS II Aktivität beeinflusst werden. Darüber hinaus hat das isolierte Gen eine erhebliche Bedeutung bei der direkten Veränderung der Flavonsynthese in verschiedenen Geweben bei der Bildung von neuen Farben in Blüten und Blättern. Außerdem können eine Reihe wirtschaftlich bedeutende Faktoren im Pflanzenbau, die von Krankheitsresistenz, Knöllchenbildung bei Leguminosen bis zu neuen Produkten für die Ernährung und pharmakologische Anwendung reichen, beeinflusst werden

Da die Gentechnik und die Molekularbiologie für die moderne Pflanzenzüchtung in den letzten Jahren enorm an Bedeutung gewonnen haben, besteht auch für die Züchtung von gartenbaulichen Nutzpflanzen ein Interesse am Einsatz dieser Methoden. Die erfolgreiche Veränderung der Blütenfarbe bei Petunia hybrida (Meyer et al. 1987) stellt den Anfang der Transformation von Zierpflanzen mit einem konkreten und wirtschaftlich relevanten Ziel dar. Die Ergebnisse dienen nicht nur der Grundlagenwissenschaft, sondern können auch von Gartenbaubetrieben für die wirtschaftliche Nutzung verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die grundlegenden Methoden und Techniken zur Transformation von verschiedenen Pflanzen (vor allem Zierpflanzen) am Lehrstuhl eingeführt. Als Transformationsmethoden wurden dabei das Agrobacterium tumefaciens- System, die Partikel-Kanone und die "floral dip" Methode eingesetzt. Ein Verfahren zur Klonierung von Binärevktoren und deren Übertragung in A. tumefaciens wurde etabliert, mit dessen Hilfe eine Reihe von am Lehrstuhl klonierten Genen in verschiedene Pflanzen übertragen wurde. Neben dem häufig zur Selektion verwendeten Kanamycin-NPTII System, wurde ein Binärvektor mit einer auf Hygromycin basierenden Selektion kloniert. Dieser Vektor kann für nicht auf Kanamycin selektierbare Pflanzen (z.B. Pelargonium) oder für die Zweittransformation einer bereits mit einem anderen Selektionsmarker transformierten Pflanze verwendet werden. Die erfolgreiche Hygromycin-Selektion bei Pelargonium wurde anhand der GUS-Expression nachgewiesen. Mit einer modifizierten Form der "leaf disc"-Transformation wurden Petunia, Osteospermum und Pelargonium transformiert. Die "floral-dip"-Methode wurde zur Tranformation von Arabidopsis thaliana verwendet. Auf Selektionsmedium regenerierte Pflanzen wurden mittels PCR auf Integration der T-DNA überprüft und in vitro vermehrt. Die mit einem FHT Antisense-Konstrukt transformierten Petunia-Pflanzen zeigten im Enzymtest eine deutlich reduzierte Enzymaktivität, so daß von einer erfolgreichen Hemmung der FHT durch den Antisense-Ansatz auszugehen ist. Die Petalen einer genetisch definierten, weißblühenden Linie von Matthiola incana wurden als Testsystem für die transiente Genexpression (Anthocyanbildung) in Blütenblättern mittels Partikel-Kanone eingeführt. Mit der gleichen Methode und einem ANS-Konstrukt beschossene Petalen von Zantedeschia zeigten ein deutlich rote Färbung im Bereich der aufgetroffenen Partikel. Es ist davon auszugehen, daß durch die Gen-Expression der vermutete Block in der Anthocyan-Synthese behoben wird und es zur Bildung von Pelargonidin-Derivaten kommt. Molecular biology and genetic engineering have become increasingly important for modern plant breeding during the last years. This is why these methods are also very interesting for the breeding of ornamental plants. The successful transformation of the flower color of a Petunia hybrida mutant in 1987 (Meyer et al.) initiated the manipulation of ornamental plants for specifically economic reasons. The results are not only important for basic research but are also economically viable for ornamental breeders. This study introduces the basic methods and techniques for the transformation of all kinds of plants (above all ornamental plants). The Agrobacterium tumefaciens-system, the particle gun and the "floral dip"-technique were the methods used to transform plants. At our department we established a method to clone binary vectors and to transform them into A. tumefaciens. The so-established A. tumefaciens helped us to transform genes, that we had cloned in our department, into different kinds of plants. Besides the Kanamycin-NPT II system, which is often used for selection, a binary vector was cloned with a selection based on hygromycin. This vector can be used for plants (e.g. pelargonium) that are selectable but cannot be selected on the basis of kanamycin or for the second transformation of plants already transformed with another selection marker. Successful gene delivery to pelargonium hypocotyls and expression of the foreign genes was demonstrated by histochemical GUS-staining. A modified form of the "leaf disc" method was used to tranform petunia, osteospermum and pelargonium. The 'floral-dip' method was applied to transform Arabidopsis thaliana. With the help of PCR-analysis, plants regenerated under selection conditions were surveyed to find out whether a T-DNA integration has taken place. These plants were then multiplied in vitro. Enzym tests with petunia plants that had been transformed with a FHT antisense-construct showed a much reduced enzym activity. This is why it is most likely that FHT is successfully stopped by the function of the antisense construct. By means of a particle gun the petals of genetic defined white flowering mutant of Matthiola incana were introduced as a test-system for the foreign gene expression concerning anthocyan biosynthesis. Petals of zantedeschia bombarded through the same method with a ANS construct showed a clearly red colouring in the areas where the particles had hit. It is most likely that the possible block in the anthocyan synthesis is removed through the gen expression and that therefore perlargonidin derivates are created.