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Untersuchungen haben gezeigt, dass Futterzusatzstoffe effektiv zur Reduzierung von Durchfallerkrankungen, die von pathogenen Escherichia coli bei Absetzferkeln ausgelöst werden, eingesetzt werden können. Die intestinale porzine Epithelzelllinie IPEC-J2 wurde als ein in vitro Modell eingesetzt, um die Wirkung von Futterzusatzstoffen auf die Adhäsion sowie die zelltoxischen Effekte eines F4-positiven E. coli Stamms (ETEC, Abbotstown) zu bestimmen. Ein nicht pathogender Stamm (DSM 2840) wurde herangezogen, um den F4-Fimbrien Einfluss zu testen. Die Charakterisierung der Epithelkonfluenz wurde durch die Messung des Transepithelialen Elektrischen Widerstandes (TEER) von IPEC-J2 Zellen erhoben. Die zu untersuchenden Futterzusatzstoffe wurden als wassserlösliche Extrakte in verschiedenen Verdünnungen und Inkubationszeiten (6 und 24 Stunden) eingesetzt. Die erfolgreiche Anbindung des F4 positiven E. coli Stamms an das IPEC-J2 Epithel führte bereits kurz nach der in vitro Infektion zu einer Reduzierung des TEER. Im Gegensatz dazu zeigte der Stamm DSM 2840 keine Veränderung des TEER. Die Extrakte von einer Säurenmischung (AM), Rinderkolostrum (CM), Ananasstammextrakt, gemahlenen und getrockneten Kernobststeinen (DS), Thymian (TY) und Hefezellwandbestandteilen von Saccharomyces cerevisiae (PV) übten keine positiven Effekte auf das IPEC-J2 Epithel aus. Die Verringerung des Widerstandes nach der der ETEC-Infektion war in allen Versuchsgruppen vergleichbar und wurde durch die Zugabe der einzelnen Substanzen nicht beeinflusst. In einem nächsten Schritt wurde die Immunantwort von Ferkeln auf eine Impfung gegen PRRSV untersucht, nachdem verschiedene Futtermittelzusatzstoffe eingesetzt wurden. In dem Tierversuch wurden über die Dauer von 39 Tagen in fünf Gruppen je zehn abgesetzte Ferkel im Alter von drei Wochen eingesetzt. Die unterschiedlichen Versuchsgruppen beeinhalteten eine autolisierte Hefepräparation (PV), getrocknete und gemahlene Kernobststeine (DS), Rinderkolostrum (CM) oder einen probiotischen Bacillus cereus var. Toyoi NCIMB 40112 als Zusatz. Die Ferkel wurden eine Woche nach der Einstallung im Alter von drei Wochen gegen PRRSV geimpft. Dabei wurden Blutproben vor der Impfung sowie 7, 21 und 35 Tage nach der Impfung entnommen, um das Blutbild zu bestimmen und die Immunzellen mittels Durchflusszytometrie zu phänotypisieren. Zusätzlich wurden die spezifischen IgG Antikörpertiter bestimmt und ein ELISpot Assay etabliert, um spezifische Interferon-γ produzierende Lymphozyten detektieren zu können. Die Leistungsparamter wurden durch die einzelnen Diäten nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu zeigten die hämatologischen Parameter und das Gesamtblutbild altersabhängige Veränderungen. Fütterungsbedingte Effekte konnten nicht aufgezeigt werden. Die Analyse der Lymphozytenoberflächenmarker wiesen deutliche zeitabhängige Veränderungen, aber keine diätbedingten Effekte auf. Die CD4-CD8α+ Zellen erreichten ihre höchste Zahl 21 Tage nach der Impfung, um anschließend wieder abzusinken (P = 0,007). Die CD2+CD5- Zellen nahmen in allen Gruppen bis zum Tag 35 stetig ab (P < 0,001). Die CD2+CD5+ Zellen verblieben während des gesamten Beobachtungszeitraums konstant, während die Anzahl der CD2-CD5+ und CD4+CD8α- Zellen über die Zeit abfielen (P = 0,07, P < 0,001). Die CD4+CD8α+ doppelt positiven Zellen stiegen in allen Gruppen altersbedingt an (P = 0,001). Die CD21+ Zellen und CD14+ Zellen wurden nur teilweise durch das Alter beeinflusst. Zunehmende spezifische IgG-Titer wurden im Versuchszeitraum bestimmt (P < 0,001). Gruppenspezifische Effekte konnten jedoch, ähnlich wie bei den INF-γ produzierenden T Zellen, nicht nachgewiesen werden. Die Immunsystementwicklung bei Ferkeln scheint somit typischen zeitabhängigen Mustern zu folgen. Fehlende fütterungsbedingte Effekte auf die Immunantwort könnten in diesem Versuch auf die ausgewogene Ernährung und die guten sanitären Bedingungen begründet werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass mithilfe der TEER-Messmethode der schädigende Einfluss auf das Epithel und die Zellintegrität, ausgelöst durch eine F4 positive ETEC- Anbindung an IPEC-J2 Zellen, dargestellt werden konnte. Somit könnte das Zellkulturmodell zusammen mit der TEER-Messmethode ergänzend zu in vivo Infektionsversuchen mit Ferkeln als Screening-Tool eingesetzt werden. Die Wirksamkeit der Futterzusätze im Tier könnte sich unter anderen Bedingungen, z.B. weniger guter Haltungshygiene, anders darstellen als in vorliegendem Versuch., Feed additives have been shown to be effective in reducing the incidence of post weaning diarrhea caused by pathogenic Escherichia coli in piglets. The intestinal porcine epithelial cell line IPEC-J2 was used as an in vitro model to assess effects of additives on the adhesion and cell toxic effects of a F4 positive E. coli strain (ETEC, Abbotstown). A non pathogenic strain (DSM 2840) was used to determine the impact of F4 fimbria. The confluence of the epithelium was characterized by measurement of transepithelial electrical resistance (TEER) of the IPEC-J2 cells. The feed additives were prepared as aqueous extract and tested in different dilutions and incubation times (6h and 24h). The F4 positive E. coli strain adhered to IPEC-J2 cells and reduced TEER shortly after in vitro infection. The strain DSM 2840 showed no TEER impairment. Extracts from organic acid mix (AM), bovine colostrum (CM), pineapple stems (BM), drupe stones (DS), a phytogenic product with thyme (TY) and yeast preparations of Saccharomyces cerevisiae (PV) had no positive effects on the IPEC-J2 epithelium. The TEER decrease after ETEC infection was in a comparable level and was not affected by the added substances. The cell culture model might be suitable as screening tool, to complement in vivo challenge trials with piglets. The immune response of piglets to a vaccination against the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) was tested after feeding different feed additives. The trial included five groups of ten piglets and lasted 39 days. Feed additives were added to a control diet (C). Tested substances included an autolyzed yeast preparation from Saccharomyces cerevisiae (PV), dried and milled drupe stones (DS), dried bovine colostrum (CM) and the probiotic B. cereus var. Toyoi. Three-week-old piglets were vaccinated against PRRS-Virus, blood samples were taken before vaccination and 7, 21, and 35 days after vaccination for complete blood counts, flow cytometry for immune cell phenotyping, measurement of specific IgG antibodies and ELISpot assay to detect specific interferon γ-producing lymphocytes. Animal performance was not affected by the experimental diets. Hematological parameters and complete blood counts displayed time-dependent changes, feed-related effects were not observed. The analysis of the expressed lymphocyte surface markers showed distinct time dependent shifts but no dietary effects. CD4-CD8α+ cells reached highest levels on day 21 post vaccination and decreased thereafter (P = 0.007), the CD2+CD5- cells decreased in all groups towards day 35 (P < 0.001). CD2+CD5+ cells were determined at constant levels during the observation period, while CD2-CD5+ cells increased and CD4+CD8α- cells decreased over time (P = 0.07, P < 0.001). CD4+CD8α+ double positive cells increased age-dependently in all groups (P = 0.001). CD21+ cells and CD14+ cells were only partially affected by age. Increasing levels of specific IgG were determined (P < 0.001), but group effects could not be demonstrated as for the interferon γ producing T cells. The development of the immune system in piglets seems to follow a typical time-dependent pattern, the lack of dietary effects on the immune response in this trial might be due to a balanced diet and appropriate sanitary conditions. In conclusion, the destructing effect on cell integrity of IPEC-J2 cells by F4-positive ETEC could be demonstrated by using TEER measurements. Consequently, the cell culture model might be suitable as screening tool complementing in vivo trials with piglets. The efficiency of feed additives in animals have to be interpreted carefully, as under different conditions, e.g. impaired hygiene, results might be different compared to the present experiment.

In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss eines phytogenen Futterzusatzstoffes, zweier polyphenolreicher Apfelextrakte sowie vier phytogener Substanzen auf die Adhäsion zwischen einem enteropathogenen Escherichia coli-Stamm und der intestinalen porcinen epithelialen Zelllinie IPEC-J2 in vitro getestet. Weiterhin wurden in einem Fütterungsversuch 24 weibliche und 24 kastrierte männliche abgesetzte Ferkel im Alter von 28 Tagen in zwei aufeinanderfolgenden Versuchsreihen auf vier Fütterungsgruppen aufgeteilt. Das Ferkelaufzuchtfutter enthielt in der Kontrollgruppe 0,2 % Weizenkleie. Der Versuchsgruppe B wurde 0,2 % der Gruppe C 0,2 % des phytogenen Ferkelfutters Fresta F und der Versuchsgruppe D 0,2 % eines polyphenolreichen Apfelextraktes hinzugefügt. Einmal wöchentlich erfolgte die Erhebung der zootechnischen Daten. An den Versuchstagen 25 –28 wurden die Tiere zur Probenentnahme euthanasiert und Blut-, Kot-, Urin-, Digestaproben aus dem Ileum sowie Gewebeproben aus dem Jejunum entnommen. Zusätzlich zu den Leistungsdaten wurde die scheinbare praecaecale Verdaulichkeit und die Gesamtverdaulichkeit des Rohproteins sowie der Aminosäuren ermittelt. Aus Gewebeproben des Jejunums wurden die Bürstensaummembranen isoliert, aus denen anschließend der Proteingehalt sowie die Aktivitäten der intestinalen Enzyme Saccharase, Maltase, Laktase, Aminopeptidase N und der alkalischen Phosphatase bestimmt wurden. Jejunumproben wurden auch zur Bestimmung der Genexpression der intestinalen Enzyme Saccharase, Maltase, Laktase, Aminopeptidase N sowie des natriumabhängigen Glukosetransporters-1 (SGLT-1) herangezogen. Weiterhin wurden elektrophysiologische Messungen am Jejunum in Ussingkammern durchgeführt. Die antioxidative Kapazität des Blutplasmas wurde mithilfe des FRAP-und des TEAC-Tests aus dem Plasma bestimmt. Die Ergebnisse der in vitro- Untersuchungen zeigten signifikante Reduktionen der Adhäsion der E.coli- Bakterien an den IPEC-J2-Zellen durch Zugabe von Bockshornkleesamen, Pektin, der beiden Apfelextrakte und des Zusatzes Fresta F®. Die phytogenen Substanzen Glucoraphanin und Sulforaphan bewirkten keine signifikante Reduktion der Adhäsion. Die Ergebnisse des Fütterungsversuchs zeigten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Leistungsparameter. Die praecaecale Verdaulichkeit der Aminosäure Valin erhöhte sich in der Bockshornkleegruppe verglichen mit der Kontrollgruppe und der Fütterungsgruppe D (Apfelextrakt). Die praecaecale Verdaulichkeit von Isoleucin erhöhte sich in der Fütterungsgruppe D (Apfelextrakt) verglichen mit den Fütterungsgruppen B (Bockshornkleesamen) und C (Fresta F®). Die Gesamtverdaulichkeit der Aminosäuren Threonin, Valin, Isoleucin und Lysin erhöhte sich der Apfelextraktgruppe gegenüber den anderen drei Versuchsgruppen. Die Gesamtverdaulichkeit von Leucin und Tyrosin erhöhte sich ebenfalls in der Apfelextraktgruppe verglichen mit den Fütterungsgruppen B und C. Der Zusatz der phytogenen Futterzusatzstoffe hatte keinen Einfluss auf die Aktivitäten der intestinalen Enzyme Laktase, Maltase, Saccharase, Aminopeptidase N und der alkalischen Phosphatase. Auch die antioxidative Kapazität im Blutplasma wurde durch die Futterzusätze nicht beeinflusst. Die elektrophysiologischen Messungen in der Ussingkammer zeigten keine Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen. Die Ermittlung der Genexpression mithilfe der PCR zeigte eine Verringerung der Expression der Saccharase in den Fütterungsgruppen B (Bockshornkleesamen) und C (Fresta F®) verglichen mit der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einfluss auf die Adhäsion von E. coli und der IPEC-J2-Zelllinie für weiterführende Studien interessant sein könnte. Ein Einsatz entsprechender Zusatzstoffe könnte zur Vorbeugung bakterieller Durchfallerkrankungen in der Absetzphase bei Ferkeln sinnvoll sein., In the present study, the influence of a phytogenic feed additive, two polyphenol-rich apple extracts and four phytogenic substances on the adhesion between an enteropathogenic E. coli and an IPEC-J2-cell line was examined. In a feeding trial, 24 female and 24 castrated male piglets (weaned at the age of 28 days) were assigned to four feeding groups in two successive series of experiments. The starter diet contained 0.2 % wheat bran in the control group A, 0.2 % fenugreek seeds in group B, 0,2 % of the phytogenic feed additive Fresta F® in group C and 0.2 % of a polyphenol-rich apple extract in group D. The zootechnical data were determined once a week. After a feeding period of four weeks, the piglets were euthanized and samples of blood, urine, digesta of the ileum and tissues of the jejunum were collected. In addition to the performance data, the apparent ileal digestibility and the total digestibility of crude protein as well as amino acids was determined. The tissues of the jejunum were used to isolate the brush border membranes to determine content of protein and the activity of the intestinal enzymes maltase, succrase, Laktase, aminopetidase n and the alkaline phosphatase. The gene expression of the intestinal enzymes maltase, succrase, Laktase, aminopetidase n and the alkaline phosphatase and the sodium-glucose transporter (SGLT-1) were determined in the tissue of the jejunum. Furthermore, electrophysiological measurements of jejunal tissues were conducted in the Ussing chamber. The antioxidative capacity of the blood plasma was established with the FRAP-and the TEAC-Assay. The results of the in vitro investigations showed significant reductions of the adhesion between E.coli and IPEC-J2-cells by addition of the Fresta F®, fenugreek seeds, pectin and both apple extracts. There was no significant reduction of the adhesion when using Glucoraphanin and Sulforaphan. The results of the feeding trial did not show any significant differences between the feeding groups in regard to the performance data. The analyses of the ileal digestibility of the amino acid valine in group B (fenugreek seeds) showed a significant decrease compared to the groups A (control) and D (apple extract). The ileal digestibility of isoleucine showed a significant increase in group D (apple extract) compared to group B (fenugreek seeds) and C (Fresta F®). The analyses of the total digestibility of the amino acids threonine, valine, isoleucine and lysine showed a significant increase in group D compared to the three other groups. The total digestibility of leucine and thyrosine showed a significant increase in group D compared to groups B and C. The additions of the phytogenic feed additives did not have any influence on the activities of the intestinal enzymes Laktase, maltase, succrase, aminopeptidase n and the alkaline phosphatase. The feed additives did not influence the antioxidative capacity of the blood plasma either. The electrophysiological measurements in the Ussing chamber also did not show any differences between the feeding groups. The determination of the gene expression using PCR showed a reduction of the gene expression of succrase in the treatment group B (fenugreek seeds) and C (Fresta F®) compared to the control group. The results assumed that the influence on the adhesion between E. coli and IPEC-J2 could be of interest for further investigations. The use of appropriate additives could be useful for the prevention of bacterial diarrhea in weaning piglets.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung verschiedener organischer Säuren und eines Säurengemisches als Futterzusatz bei früh abgesetzten Ferkeln, die daraus resultierenden Einflüsse auf die intestinale bakterielle Mikrobiota und mögliche Einflüsse auf die Leistungsparameter der Tiere. Der Tierversuch bestand aus insgesamt 84 Ferkeln, die im Alter von 23 Tagen abgesetzt wurden. Es wurden die folgenden organischen Säuren geprüft: 5 g/kg Ameisensäure, 5 g/kg Benzoesäure und eine Kombination aus 1 g/kg Ameisensäure, 3 g/kg Benzoesäure, 1 g/kg Zitronensäuremonohydrat, 1 g/kg Kaliumsorbat und 0,2 g/kg Cuxarom Spice 301. Die Messung des Harn - pH ergab einen signifikant niedrigeren pH-Wert in der Benzoesäuregruppe im Gegensatz zur Kontroll- und Ameisensäuregruppe. Die Hippursäurekonzentration war in der Benzoesäuregruppe signifikant höher als in der Kontroll- und Kombinationspräparatgruppe. In Letzterer war die Konzentration jedoch ebenfalls signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Bezüglich der untersuchten mikrobiellen Metaboliten wies die Ameisensäuregruppe bei der Betrachtung des Gesamtlaktatgehalts im proximalen Jejunum signifikant weniger Laktat auf als die Kombinationspräparatgruppe. Die Untersuchung der flüchtigen Fettsäuren ergab eine signifikant geringere n-Valeriansäurekonzentration in der Kontroll- und Benzoesäuregruppe gegenüber der Ameisensäuregruppe (p = 0,012). Es wurden tendenziell geringere E.coli Keimzahlen in der Ameisensäuregruppe gegenüber der Kontrollgruppe beobachtet (p = 0,068). In allen Gruppen konnte mittels Multiplex-PCR das est-II-Gen als dominantes Pathogenitätsgen nachgewiesen werden. Die Kontrollgruppe wies im Gegensatz zu den Säuregruppen eine höhere Varianz an Pathogenitätsgen- tragenden E.coli auf. Auch war die Anzahl der positiv getesteten Tiere in der Kontrollgruppe höher als in den Säuregruppen. Die quantitative Untersuchung der Bakterienpopulationen im Colon ergab in der Ameisensäuregruppe eine signifikante Senkung der Escherichia spp, gegenüber der Benzoesäure- und Kombinationspräparatgruppe. Das Verhältnis der Escherichia spp. zu Eubakterien ergab einen signifikanten Unterschied zwischen der Ameisensäure- und Kombinationspräparatgruppe. Der Pathogenitätsfaktor elt-IA von E.coli war in der Kombinationspräparatgruppe signifikant höher als in den übrigen Gruppen. Bei der Betrachtung des Verhältnis elt-IA zu Eschericha spp. zeigte sich ein signifikant niedrigerer Wert in der Kontroll- und Benzoesäuregruppe gegenüber der Ameisensäuregruppe. Die mittels DGGE untersuchten Kotproben zeigten im Laufe des Versuchzeitraumes in der Kontroll-, Ameisensäure- und Benzoesäuregruppe eine ständige Abnahme der bakteriellen Diversität. Demgegenüber steht die Kombinationspräparatgruppe, in deren Kot am 9. Tag nach dem Absetzen ein Abfall der Bakteriendiversität nachzuweisen war, die jedoch zum 14. Tag hin wieder anstieg. Die Bakteriengemeinschaften in den Kotproben waren am 5. und 9. Tag kaum unterschiedlich zwischen den Gruppen. Am 14. Tag jedoch gab es signifikante Unterschiede, so war die Kontrollgruppe in sich homogener als die Säuregruppen. Bezüglich der scheinbaren praecaecalen Verdaulichkeit konnte in der Kontrollgruppe eine signifikant höhere Cysteinverdaulichkeit gegenüber der Kombinationspräparatgruppe und eine signifikant höhere Methioninverdaulichkeit der Kontrollgruppe gegenüber der Benzoesäure- und Kombinationspräparatgruppe festgestellt werden. Die Methioninverdaulichkeit der Ameisensäuregruppe war ebenfalls signifikant höher als die der Kombinationspräparatgruppe (p < 0.0001). Die Überprüfung der Ameisensäure- und Benzoesäurekonzentration in der Digesta ergab, dass schon im Magen die Konzentration der eingesetzten Säure stark verringert war, und am Ende des Jejunums eine scheinbare praecaecale Verdaulichkeit von mehr als 99% bestand. Die Leistungsparameter zeigten eine Lebendmassezunahme um 10,5% und eine Senkung des Futteraufwands der Tiere in der Ameisensäuregruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Signifikante Ergebnisse konnten jedoch nur in der 5. Versuchswoche gefunden werden. In der ersten Versuchswoche nahmen die Tiere der Ameisensäuregruppe signifikant mehr Futter auf als die Tiere der Kombinationspräparatgruppe. Effekte organischer Säuren auf die intestinale Mikrobiota von Absetzferkeln wurden in dieser Arbeit festgestellt. Ameisensäure sticht dabei durch geringere Escherichia spp. Zellzahlen und vermindertes Auftreten an Pathogenitätsfaktoren hervor. Hinsichtlich der Leistungsparameter war Ameisensäure ebenfalls die effektivste Säure in dieser Studie. Auch mittels Einsatz von Benzoesäure sind einige Effekte besonders im Hinblick auf die Hippursäurebildung und die Harn pH-Wert Absenkung zu verzeichnen. Das Kombinationspräparat zeigte gegenüber der Kontrollgruppe die schwächsten Effekte. Eine Kombination wirksamer organischer Säuren summiert somit nicht die positiven Effekte der einzelnen Säure., The current study was conducted to test the use of various organic acids and an acid mixture as feed additives for early-weaned pigs, the resulting effects on the intestinal bacterial microbiota and possible effects on performance parameters of the animals. The study was performed on a total of 84 pigs weaned at the age of 23 days. The following organic acids were tested: 5 g/kg formic acid, 5 g/kg benzoic acid and a combination of 1 g/kg formic acid, 3 g/kg benzoic acid, 1 g/kg citric acid monohydrate, 1 g/kg potassium sorbate and 0.2 g/kg Cuxarom Spice 301. The urinary pH was significantly lower in the benzoic acid group compared to the control and formic acid groups. The hippuric acid concentration was significantly higher in the benzoic acid group compared to the control and combined acid groups. In the latter, the concentration was however higher than in the control group. With regards to the tested microbial metabolites, a significantly lower concentration of lactate was found in animals in the formic acid group compared to the combined acid group after measurement of the total lactate in the proximal jejunum. Measurement of volatile fatty acids resulted in a significantly lower n-valerian acid concentration in the control and benzoic acid groups compared to the formic acid group (p = 0.012). The number of E.coli bacteria in the formic acid group had a tendency to be lower than in the control group (p = 0.068). Using Multiplex-PCR, the est-II-gene was shown to be the dominant pathogenicity gene in all groups. The control group exhibited a higher variance of pathogenicity gene containing E.coli compared to the other groups. In addition, the number of animals testing positive was higher in the control group than in the remaining groups. The quantitative tests of bacteria populations in the colon resulted in a significant decrease of the Escherichia spp bacteria in the formic acid group compared to the benzoic acid and combined acid groups. The ratio of Escherichia spp. and eubacteria was significantly different between the formic acid and the combined acid groups. The pathogenicity factor elt-IA from E.coli was significantly higher in the combined acid group compared to the remaining groups. The ratio of elt-IA and Eschericha spp. had a significantly lower value in the control and benzoic acid groups compared to the formic acid group. In the fecal samples examined with DGGE, a continuous decrease of bacterial diversity occurred in the control, formic acid and benzoic acid groups over the course of the study. In contrast, in the combined acid group an initial decrease in the bacterial diversity in the feces was observed on day 9 after weaning was followed by an increase observed on day 14. With regards to the bacterial colonies in the fecal samples no substantial difference was observed between the groups on days 5 and 9. On day 14, however, significant differences could be shown with the control group being more homogenous than the acid groups. Regarding the praecaecal digestibility, the control group showed a significantly higher cystein digestibility than the combined acid group and a significantly higher methionine digestibility compared to the benzoic acid and combined acid groups. The methionine digestibility in the formic acid group was also significantly higher than in the combined acid group (p < 0.0001). Measurements of the formic acid and benzoic acid concentration in the digesta showed that the concentration of the supplemental acids had decreased in the stomach very strong, and the apparent praecaecal digestibility at the far end of the jejunum was more than 99%. Testing of the performance parameters showed an increase in body weight by 10.5% and a decrease in the feed conversion of the animals in the formic acid group compared to the control group. These findings were only significant in the 5th study week. In the 1st study week, the animals in the formic acid group consumed significantly more feed than the animals in the combined acid group. The current study shows that organic acids have various effects on the intestinal microbiota of weaning pigs. Formic acid was of particular interest due to its correlation with lower Escherichia spp. bacterial numbers and less frequent occurrence of pathogenicity factors. Regarding performance parameters, formic acid was also the most effective acid in this study. The use of benzoic acid resulted in some important effects particularly with regards to the formation of hippuric acid and the decrease in urinary pH-values. The use of the combined acid supplement showed only minor effects compared to the control group. A combination of active organic acids does therefore not result in an additive effect.

Die vorliegende Studie wurde zur Evaluierung moglicher Effekte eines auf einer Pflanzenmischung basierenden Futterzusatzstoffes und zwei weiteren pflanzlichen Komponenten (Bockshornkleesamen und Susholzwurzel) auf einen enteropathogenen Escherichia (E.) coli-Stamm durchgeführt. Des Weiteren sollten mögliche Effekte auf die intestinale Mikrobiota und das Immunsystem bei abgesetzten Ferkeln überprüft werden. Zur Ermittlung möglicher antiadhäsiver Effekte gegenüber einem enteropathogenen E. coli-Stamm erfolgten durchflusszytometrische Untersuchungen in einem in vitro-Infektionsmodell mit einer IPEC-J2-Zelllinie. Ergänzend wurden Untersuchungen zur Bildungskapazität der Pflanzenmaterialien an den E. coli-Stamm durch Ermittlung des bakteriellen Wachstums der an die auf einer Mikrotiterplatte beschichteten Pflanzenmaterialien gebundenen Bakterien durchgeführt. Für die Ermittlung antimikrobieller Effekte Gegenuber dem E. coli-Stamm wurde das Wachstum der Bakterien unter dem Einfluss verschiedener Konzentrationen der Pflanzenmaterialien ermittelt. Anschließend wurde ein Fütterungsversuch mit insgesamt 48 männlichen kastrierten Ferkeln in drei Versuchsdurchgangen durchgeführt. Die Ferkel wurden in jedem Durchgang gleichmäßig auf vier Fütterungsgruppen aufgeteilt, sodass pro Versuchsdurchgang jeder Fütterungsgruppe vier Ferkel zugeordnet werden konnten. Alle Tiere erhielten ein bedarfsdeckend zusammengesetztes Alleinfutter für Ferkel, dem in der Versuchsgruppe B 0,04% FRESTAR F zugesetzt wurden, Versuchsgruppe C erhielt 0,2% FRESTAR F und Versuchsgruppe D 0,15% Bockshornkleesamenpulver. Am fünften und 19. Versuchstag wurden die Ferkel oral mit einem Lebendimpfstoff (SALMOPORCR, Firma IDT) gegen Salmonella Typhimurium vakziniert, um einen möglichen Einfluss auf die Ausbildung spezifischer Antikörper im Serum zu ermitteln. Am 28. und 29. Versuchstag wurden Blut- und Darmproben sowie Digestaproben aus dem Duodenum, proximalen und distalen Jejunum, Ileum, Zäkum und Kolon entnommen. Neben zootechnischen Daten (Lebendmasse, Tageszunahmen, Futteraufnahme und Futteraufwand) wurden die scheinbare Verdaulichkeit des Rohproteins, der intestinale pH-Wert und der Trockensubstanzgehalt der Digesta untersucht. Einflusse der pflanzlichen Zusatzstoffe auf die intestinale Mikrobiota wurden anhand der bakteriellen Metaboliten (Laktat, kurzkettige Fettsauren) bestimmt. Zur Ermittlung immunmodulatorischer Einflusse erfolgten durchflusszytometrische Bestimmungen zur Phanotypisierung der Leukozyten aus dem Blut und der Lamina epithelialis des proximalen Jejunums. Des Weiteren wurde die Phagozytoseaktivitat isolierter peripherer Mono- und Granulozyten mittels opsonierter E. coli (PhagotestR) im Durchflusszytometer gemessen. Zur Beurteilung der Proliferationsleistung der Lymphozyten aus dem Blut der Tiere wurden diese mit den Mitogenen Pokeweed Mitogen (PWM), Concanavalin A (Con A) und Phythamagglutinin M (PHA-M) stimuliert. Die Haptoglobingehalte und spezifischen Immunglobulingehalte gegen Salmonella Typhimurium im Serum wurden mit Hilfe von Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) ermittelt. In den in vitro-Untersuchungen konnte eine verminderte Adhäsion eines enteropathogenen Escherichia coli-Stamms an eine intestinale Epithelzelllinie (IPEC-J2) durch den Einsatz der Pflanzenmaterialien ermittelt werden. Dabei reduzierte sich die relative Fluoreszenzintensiät der markierten adhärierten E. coli an den Epithelzellen unter dem Einfluss von FRESTAR F um 52,7%, unter dem Einfluss von Bockshornkleesamen um 57,6%. Außerdem zeigten sich Bildungskapazitäten der pflanzlichen Substanzen gegenüber dem E. coli-Stamm Antimikrobielle Effekte der eingesetzten Pflanzenmaterialien konnten in vitro nicht nachgewiesen werden. In den Fütterungsversuchen zeigten sich keine Effekte von FRESTAR F und Bockshornkleesamen auf die zootechnischen Parameter. Durch den Einsatz der pflanzlichen Zusatzstoffe reduzierte sich der pH-Wert im Bereich des distalen Jejunums, des Ileums, Zäkums und Kolons (p 0,05). Es zeigten sich auch numerische Effekte der Zusatze auf die Laktatkonzentration im Dünn- und Dickdarm. Die immunologischen Parameter zeigten einen Einfluss von Bockshornkleesamen auf den relativen Anteil der γδ-T-Zellen (TCR+CD8α-) und der antigenpräsentierenden Zellen (MHCII+CD5-) im Blut der Ferkel (p< 0,05). Während der relative Anteil der γδ-T-Zellen in der Kontrollgruppe bei 9,4% (3,92-20,7) lag, erhöhte sich dieser durch den Einsatz von Bockshornkleesamen auf 17,2% (7,28-35,0). Für die antigenpräsentierenden Zellen zeigte sich ein Abfall des relativen Anteils von 30,5% (11,2- 43,4) in der Kontrollgruppe auf 20,9% (16,4-36,0) in der Bockshornkleesamen-Gruppe. Alle anderen immunologischen Parameter blieben durch den Einsatz der Zusatzstoffe unbeeinflusst. Es zeigten sich keine Effekte der Futterzusammensetzung auf die Lymphozytenproliferation, die Phagozytoseaktivitat der neutrophilen Granulozyten und Monozyten sowie die Antikörperbildung nach oraler Vakzinierung gegen Salmonellen. Anhand der vorliegenden Ergebnisse lasst sich schlussfolgern, dass die geprüften Zusatze im Intestinaltrakt von Ferkeln Einfluss auf die Adhäsion pathogener Escherichia coli-Stamme an Enterozyten sowie auf die Zusammensetzung und metabolischen Aktivitäten der intestinalen Mikrobiota haben. Es sollten weiterführende Untersuchungen zur Abklärung des antiadhäsiven Potenzials im Tier und zur konkreteren Beurteilung der Bedeutung der ermittelten immunmodulatorischen Einflusse durchgeführt werden., The present study was performed to evaluate potential effects of a mixed phytogenic feed additive (FRESTAR F) and two further components (fenugreek seeds and liquorice roots) on a porcine enteropathogenic Eschericha coli- strain. Furthermore, potential effects on the intestinal microbiota and the immune system of weaned piglets were validated. To establish possible anti- adhesive effects of the phytogenic additives to an enteropathogenic E. coli- strain, porcine jejunal epithelial cells (IPEC-J2) marked by fluorescent dye were examed in a flow cytometry. Additionally the bond capacity of the phytogenic additives towards the E. coli–strain was detected by measuring bacterial growth rate. Antimicrobial influences were investigated by incubating the bacteria with the test materials at different concentrations and measuring the bacterial growth rate. After the in vitro investigations a feeding trial with 48 male castrated piglets was performed for 28 days. The piglets were divided into four groups, which all received a standard piglet diet covering the piglets`needs. For control group A no additive was applicated, the diet for group B was supplemented with 0.04% FRESTAR F, in diet C 0.2% FRESTAR F was added and the diet for group D was supplemented with 0.15% fenugreek seeds. The piglets were vaccinated with a live vaccine against Salmonella Typhimurium (SALMOPORCR, IDT) to investigate the influence on development of specific antibody titers. Blood and tissue samples of the proximal jejunum were taken and the digesta of the duodenum, proximal and distal jejunum, ileum, caecum and colon were collected. Beside zootechnical parameters the apparent digestibility of crude protein, the pH-value and dry matter content of the digesta were measured. The digesta samples were also tested for the impact of FRESTAR F and fenugreek seeds on the intestinal bacterial metabolites such as lactate and short chain fatty acids. For immunomodulatory investigations, flow cytometric analyses were realised to characterise various immune cell populations in the blood and in the lamina epithelialis of the proximal jejunum. The phagocytic activity of isolated monocytes and granulocytes was analysed by PhagotestR. The proliferation behaviour of peripherial blood lymphocytes was measured after stimulation with pokeweed mitogen, Concanavalin A and Phythaemagglutinin M. Serum concentrations of haptoglobin and Salmonella antibody titers were determined with the help of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA). The in vitro investigations could demonstrate potential anti-adhesive effects of the phytogenic feed additives on the enteropathogenic E. coli-strain. As a result of this the relative fluorescence intensity of adhered bacteria to the epithelial cells (IPEC-J2) was reduced. Inclusion of FRESTAR F resulted in a reduction of 52.7%, whereas the addition of fenugreek seeds led to a reduction of 57.6%. No antimicrobial effects for the utilised phytogenic products could be proved. Health status and zootechnical parameters of the piglets were not affected by the feed additives in the feeding trials. The pH-values in the distal jejunum, ileum, caecum and colon were significantly reduced by the phytogenics compared to the control group (p

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Verabreichung von 300 g Propylenglykol (PPG) pro Kuh und Tag als Bestandteil einer Totalen Mischration auf Parameter der Tiergesundheit, des Stoffwechsels sowie der Reproduktions- und Milchleistung untersucht. Die Studie wurde im Zeitraum vom 28.02.06 bis zum 06.07.07 in einem kommerziellen Milcherzeugungsbetrieb (durchschnittliche 305-Tage-Milchleistung 11 049 kg) in Mecklenburg-Vorpommern durchgeführt. Insgesamt wurden 258 Tiere der Rasse Deutsche Holstein in eine kontrolliert durchgeführte Feldstudie aufgenommen. Auf Grund des erwarteten Kalbetermins und der Milchleistung in der Vorjahreslaktation wurden die Tiere in Studienblöcke eingeteilt und randomisiert der Versuchs- bzw. Kontrollgruppe zugeordnet. Die Futterration der Versuchsgruppe (VG, n=127) unterschied sich von der Ration der Kontrollgruppe (KO, n=131) durch den Zusatz von 300 g PPG pro Kuh und Tag. Die TMR, bestehend aus 49,5% Maissilage, 8,8% Luzernesilage, 5,5% Grassilage, 7,2% Sojaextraktionsschrot, 7,1% Rapsextraktionsschrot, 7,1% Weizen, 5,9% Maismehl, 7,2% Biertreber, 1,5% Gerstenstroh sowie 1,4% Fett und Mineralstoffen (Angaben in Gewichts-% der Trockenmasse), wurde zweimal täglich zubereitet und über einen Zeitraum von der Kalbung bis zum 40. Laktationstag verabreicht. Bei allen Studientieren wurde täglich die Körpertemperatur sowie der Ketosestatus unter Verwendung von Ketostix® (Bayer HealthCare LLC, Mishawaka, USA) erfasst. Zusätzlich wurden Blutproben innerhalb von 12 Stunden nach der Kalbung sowie an den Tagen 4, 10±2, 20±2, 40±2 und 70±2 aus der Vena coccygea entnommen. Die Blutproben wurden zentrifugiert und das gewonnene Serum bei -25 °C bis zur Analyse gelagert. Die Serumproben wurde an ein kommerzielles Labor zur Bestimmung der nicht veresterten Fettsäuren (NEFA), Beta-Hydroxybutyrat (BHB), Bilirubin (BILI), Glucose (GLUC), Fructosaminen (FRUC) sowie der Aktivität der Aspartat-Aminotransferase (AST), Glutamat- Dehydrogenase (GLDH) und Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) versandt. Der Body Condition Score (BCS) sowie die Rückenfettdicke (BFT) wurden, mit Ausnahme von Tag 4 p.p., zu den Zeitpunkten der jeweiligen Blutprobenentnahme bestimmt. Bei Betrachtung des gesamten Beobachtungszeitraumes ergaben sich keine Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen in der Anzahl der aufgetretenen Erkrankungen. Im Hinblick auf eine den Stoffwechsel stabilisierende Wirkung der Verabreichung von PPG konnten statistisch keine Einflüsse auf die Parameter AST, GLDH, GGT, BILI, GLUC und FRUC nachgewiesen werden. Auf die Konzentration von BHB übte die Verabreichung von PPG an den Tagen 20 und 40 p.p. einen senkenden, aus klinischer Sicht aber nicht relevanten Effekt aus. Der Einfluss der Verabreichung von PPG auf die Höhe der Konzentration der NEFA konnte auf Grund des Studiendesigns nicht eindeutig beantwortet werden. Weder die absoluten Werte des Body Condition Score und der Rückenfettdicke, noch die Veränderung der zuvor genannten Parameter im Zeitverlauf wurden durch die Verabreichung von PPG als Bestandteil der TMR beeinflusst. Die Verabreichung von PPG als Bestandteil der TMR führte weder zu einer Beeinflussung der erzeugten Milchmenge noch der Milchinhaltsstoffe. Infolgedessen blieb die energiekorrigierte Milchleistung unbeeinflusst. Die Fruchtbarkeitsleistung, gemessen an den Parametern Rastzeit, Erstbesamungserfolg, Konzeptionsrate, Güstzeit und Abgang auf Grund mangelnder Fruchtbarkeit, wurde durch die Verabreichung von PPG als Bestandteil der TMR nicht beeinflusst. Nach den Ergebnissen dieser Studie erscheint der Nutzen der Verabreichung von PPG als Bestandteil einer TMR fraglich. Wichtige ökonomische Zielgrößen wie das Krankheitsgeschehen, die Milchleistung und die Fruchtbarkeit blieben unbeeinflusst. Eine generelle Verabreichung von PPG post partum als Bestandteil einer TMR kann nicht empfohlen werden., The objective of this study was to evaluate the effect of postpartum (p.p.) supplementation of 300 g propylene glycol (PPG) per cow and day via a total mixed ration (TMR) on animal health, metabolism, reproductive performance and milk production. The study was conducted in a commercial dairy farm (production average 11 049 kg/yr) in Mecklenburg-Vorpommern, Germany. A total of 258 multiparous Holstein-Friesian cows were enrolled in a randomized and controlled field study. Animals were blocked on the basis of expected calving date and previous milk production and allocated to one of two treatment groups. The ration fed in the control group (n=131) was supplemented with propylene glycol (300 g per cow and day) before offering it to the study group (n=127). The TMR, containing (in weight-% dry matter) 49.5% corn silage, 8.8% alfalfa silage, 5.5% gras silage, 7.2% soybean meal, 7.2% rape forage cake, 7.1% wheat, 5.9% corn meal, 2.8% brewer`s grain, 1.5% barley straw, 1.4% fat and minerals, was mixed and offered twice daily for a period of 40 days postpartum. All animals were checked on a daily basis from parturition up to day 40 p.p. for the incidence of fever and ketosis using Ketostix® (Bayer HealthCare LLC, Mishawaka, USA). Blood samples were collected within 12 hours at the day of parturition, on day (D) four, ten (D10±2), twenty (D20±2), forty (D40±2) and seventy (D70±2). Samples were centrifuged and serum was stored at -25 °C until analysis. Body Condition Score (BCS) and Back Fat Measurement (BFT) values were recorded on the same days, except on day four. Serum samples were shipped to one commercial laboratory for the determination of Nonesterified fatty acids (NEFA), Betahydroxybutyrate (BHB), Bilirubin (BILI), Glucose (GLUC), Fructosamine (FRUC) and activities of Aspartate- aminotransferase (AST), Glutamate-dehydrogenase (GLDH) and Gamma-glutamyl- transferase (GGT). Differences were not found between the treatment groups regarding the incidence of diseases during the entire study period. The concentrations of AST, GLDH, GGT, BILI, GLUC and FRUC were comparable between the treatment groups. Concentrations of BHB indicated a more balanced metabolic situation, especially on day 20 and 40 postpartum for cows treated with propylene glycol compared to the control group. Referring to the test day results from the local dairy herd improvement association (Landeskontrollverband Mecklenburg-Vorpommern, Güstrow) the total yield of energy corrected milk (4.0% fat, 3.4% protein) did not differ between the two treatment groups in a period of 305 days postpartum. Also milk composition and somatic cell count was not affected by treatment. Neither reproductive performance nor changes of BCS or BFT during the study period were significantly influenced by treatment. Although indicators of metabolic status were improved by postpartum use of propylene glycol, economic benefits are questionable for dairy farms with good management programs. As the most important economic factors milk production and reproductive performance were not influenced supplementing PPG in a TMR fed postpartum.

Zwei E.coli-Phytasen (Optiphos und FB-Phytase) wurden hinsichtlich ihrer biochemischen Fähigkeiten untersucht (pH-Verhalten, Temperaturverhalten und –stabilität sowie proteolytische Stabilität), um deren Eignung als Futterzusatzstoff zu überprüfen. Als Vergleichsenzym wurde die kommerziell erhältliche Aspergillus-Phytase Natuphos® hinzugezogen. Die Ergebnisse zum pH- Verhalten zeigen, dass die pH-Optima der untersuchten Enzyme im sauren Bereich liegen. Die E.coli-Phytasen weisen ihre pH-Optima bei 4,5 und 5,0 auf, während Natuphos® die optimale Wirkung bei pH 5,5 zeigt. Im neutralen pH-Bereich sind alle Enzyme inaktiv. Das Temperaturoptimum der Phytasen wurde ermittelt, indem die Enzyme bei acht unterschiedlichen Temperaturen zwischen 30°C und 80°C in Natriumacetatpuffer mit dem für das jeweilige Enzym optimalen pH-Wert für 60 Minuten inkubiert wurden. Die anschließenden Aktivitätsbestimmungen zeigten, dass die Termeraturoptima für beide E.coli-Enzyme bei 55°C und für die Aspergillus-Phytase bei 50°C liegen. Die Temperaturstabilität der Phytasen wurde für drei unterschiedliche Temperaturen und jeweils für eine Gesamtdauer von 120 Minuten bestimmt. Die Enzyme wurden in Natriumacetatpuffer mit dem jeweils optimalen pH-Wert inkubiert und anschließend die Phytaseaktivität gemessen. Die Temperaturstabilitätsmessungen in wässriger Lösung zeigen, dass Natuphos® von den drei getesteten Enzymen am stabilsten, Optiphos hingegen am wenigsten stabil ist. Schon bei 20-minütiger Inkubation bei 50°C weist die Optiphos-Phytase unter 10% Restaktivität auf, FB-Phytase und Natuphos® hingegen noch 60% respektive 80% Restaktivität. Die Phytasen wurden ferner hinsichtlich ihrer Hitzestabilität beim Pelletiervorgang untersucht. Hierbei wurde als Vergleichsenzym die Peniophora-Phytase ZY-Phytase hinzugezogen. Die zu einem Mischfutter für Broiler supplementierten Phytasen wurden beim Pelletieren vier unterschiedlichen Temperaturen zwischen 55°C und 85°C ausgesetzt. Das E.coli-Enzym Optiphos (in der granulierten Form) war die stabilere der beiden E.coli-Phytasen. Bei 85°C wies dieses Enzym eine Restaktivität von 77% auf. Auch das Vergleichsenzym Peniophora war unter diesen Bedingungen stabil (96% Restaktivität bei 85°C). Die FB-Phytase war sowohl in granulierter Formulierung als auch in Pulverform bei 85°C inaktiv, aber auch die Pulverform des Optiphos-Enzyms war bei 85°C nicht stabil. Um die Widerstandsfähigkeit der Phytasen gegenüber Proteasen zu testen, wurden die Enzympräparate für 20 Minuten in wässriger Pepsin- bzw. Pankreatinlösung bei 40°C inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vergleichsenzym Natuphos® empfindlich gegenüber Pepsin, besonders aber gegenüber Pankreatin ist. Optiphos verlor in beiden Medien etwa 45% der Aktivität und ist somit nur mäßig stabil gegenüber proteolytischer Inaktivierung. FB-Phytase ist relativ unempfindlich gegenüber Inaktivierung durch Pepsin (etwa 74% Restaktivität), jedoch empfindlich gegenüber Pankreatin. Auch wurde der Einfluss von Digestaüberstand auf die Enzyme untersucht. Die Inkubationen erfolgten bei 40°C für 60 Minuten in der Digestalösung aus dem Magen und proximalem Jejunum vom Schwein. In der Magendigesta mit einem pH-Wert von 5,05 waren sowohl die Aspergillus-Phytase als auch die E.coli-Phytasen stabil. In der Jejunaldigesta (pH-Wert 6,34) waren die E.coli-Phytasen Optiphos und FB-Phytase mit Restaktivitäten von 35% und 38% eher instabil, Natuphos® zeigte hingegen mit 70% Restaktivität eine akzeptable Stabilität. Der Weg und die Effizienz des Substratabbaus der Aspergillus-, E.coli- und Bacillus-Phytasen wurden durch Inositolphosphatbestimmung mittels HPLC untersucht. Für jedes der zu prüfenden Enzyme wurde eine Enzymlösung hergestellt und diese mit Substratlösung (Natriumphytat) für unterschiedliche Zeiten (15, 45, 90 und 120 Minuten) bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion der Phytase gestoppt und die Inositolphosphatbestimmung mittels HPLC durchgeführt. Es konnte für die Aspergillus-Phytase ein Hauptabbauweg des Substrates über das 1,2,4,5,6-IP5 und das 1,2,5,6-IP4 bis zum 1,2,5-IP3 gefunden werden. Für das E.coli-Enzym Optiphos wurde mittels HPLC ein Weg des Substratabbaus vom IP6 zum 1,2,3,4,5-IP5 und dann über das 2,3,4,5-IP4 zum 2,4,5-IP3 gefunden. Der Abbauweg der Bacillus amyloliquefacens-Phytase konnte wie folgt dargestellt werden: IP6, 1,2,4,5,6-IP5, 2,4,5,6-IP4. Die E.coli-Phytase war von den drei untersuchten Enzymen am schnellsten und am effizientesten beim Substratabbau: schon nach 90 Minuten war das Substrat komplett abgebaut und auch das Abbauprodukt IP5 war nicht mehr vorhanden. Weder die Aspergillus- noch die Bacillus-Phytase konnten IP6 komplett abbauen, zudem fand der Substratabbau deutlich langsamer statt als bei der E.coli-Phytase. Um die Möglichkeit einer Synergie zwischen der Optiphos- und der Bacillus-Phytase hinsichtlich des Phytatabbaus zu prüfen, wurden diese beiden Enzyme nacheinander zum Phytatabbau eingesetzt und das Ergebnis anschließend durch die Bestimmung der Inositolphosphate im HPLC untersucht. Zunächst wurde das Enzym Optiphos für 60 Minuten mit Natriumphytat inkubiert, anschließend die Reaktion gestoppt und dieselbe Probe mit dem Bacillus-Enzym nochmals für 45 respektive 90 Minuten inkubiert. Beim Abbau des Substrates konnten durch kombinierten Einsatz der E.coli- und Bacillus-Phytase deutliche Verbesserungen gezeigt werden: Beide Phytasen agierten in diesem Versuch synergistisch und konnten somit den Phytatabbau im Vergleich zur Wirkung einer einzelnen Phytase optimieren. Die in-vivo-Studie wurde konzipiert, um den dosisabhängigen Effekt von Optiphos in den hauptsächlich aus Mais und Optigrain bestehenden Diäten für Ferkel zu bestimmen. Die Diäten hatten eine marginale Ca- und P-Versorgung und wurden während der sechswöchigen Fütterungsperiode (24.-65. Lebenstag der Ferkel) ohne oder mit Phytasesupplementierung zu der Basaldiät mit den Enzymen Optiphos (bakterieller Ursprung aus E.coli) und Natuphos® (pilzlicher Ursprung aus Aspergillus niger) in Dosierungen von 125, 250, 500 und 1000 FTU/kg Futter verabreicht. Das Fütterungsexperiment hatte zum Ziel, die Effizienz der bakteriellen E.coli-Phytase in abgestuften Konzentrationen auf verschiedene Leistungsparameter im Vergleich zur pilzlichen Phytase oder der Negativkontrolle ohne Enzymsupplementierung einschätzen zu können. Die untersuchten Leistungsparameter waren Wachstum, Gewichtszunahme, Futteraufwand, Kotkonsistenz sowie die scheinbare Verdaulichkeit mit Fokus auf Kalzium, Phosphor und Rohasche. Das E.coli-Enzym Optiphos war im Fütterungsversuch im Hinblick auf Leistung und scheinbare Verdaulichkeit ebenso effektiv wie das kommerziell erhältliche Natuphos®: Der positive Effekt auf die Gewichtszunahme war sowohl bei Natuphos® als auch bei Optiphos am ausgeprägtesten während der dritten bis sechsten Woche des Experiments. Beide Enzyme zeigten einen gleichermaßen positiven Einfluss auf die Gewichtszunahme bei Absatzferkeln. Im Vergleich zur unsupplementierten Diät konnte der Zusatz von 1000 FTU/kg von Optiphos und Natuphos® die Futteraufnahme signifikant erhöhen. Die Ergebnisse der Bestimmung des MCP-Äquivalents zeigen, dass bis zum Level von 500 FTU/kg Optiphos effizienter ist und im Gegensatz dazu Natuphos® bei einem Gehalt von 1000 FTU/kg überlegen ist. Bei Zugabe niedrigerer Mengen unterhalb von 1000 FTU/kg ist Optiphos bei der Verbesserung der P-Verdaulichkeit überlegen (das optimale Level ist die Zugabe von 800 FTU/kg)., Two E.coli phytases (Optiphos and FB-Phytase) were examined regarding their biochemical abilities (pH behaviour, temperature behaviour and –stability as well as proteolytic stability) to validate their suitability as feed additives. The commercially available Aspergillus phytase Natuphos® has been consulted as the comparing enzyme. The results of the pH behaviour show that the pH optimum of the examined enzymes is located in the acidic range. The optimal pH values of the E.coli phytases are 4.5 and 5.0, whereas Natuphos® shows the best effect at pH 5.5. In the neutral pH range all enzymes are inactive. The temperature optimum for the phytases was determined by incubating the enzymes in a sodium acetate buffer with the optimal pH value for each of the enzymes at eight different temperatures in the range of 30°C to 80°C for 60 minutes. The subsequent determination of the phytase activity showed a temperature optimum at 55°C for both E.coli phytases and an optimal temperature of 50°C for the Aspergillus enzyme. The temperature stability of the phytases was determined for three different temperatures and with a total period of 120 minutes. The enzymes were incubated in sodium acetate buffer with the optimal pH value for each of the enzymes. Afterwards the phytase activity was determined. The measurements of temperature stability in aqueous solution show that Natuphos® ist the most stable of the three examined enzymes, whereas Optiphos is the least stable one. After 20 minutes of incubation at 50°C Optiphos already has a residual phytase activity of less than 10%, however FB-Phytase and Natuphos® exhibit residual activities of 60% and 80% respectively. The phytases were also examined regarding their heat stability during the pelleting process. In this case the Peniophora phytase ZY-Phytase was consulted as the comparing enzyme. The phyases were added to a mixed ration for pigs which was exposed to four different temperatures between 55°C and 85°C while pelletizing. The E.coli enzyme Optiphos (in the granulated form) was the more stable E.coli phytase. At 85°C this enzyme had a residual activity of 77%. The comparing enzyme Peniophora was also stable under these conditions (96% residual activity at 85°C). The FB-Phytase was inactivated at 85°C both in the granulated form and as powder. The powder form of the Optiphos enzyme was also not stable at 85°C. To assay the resistance of the phytases against proteases the enzyme preparations were incubated in an aqueous pepsin- or pancreatin solutionat 40°C. The results show that the comparing enzyme Natuphos® is sensitive to pepsin but even more sensitive to pancreatin. Optiphos lost about 45% of its activity in both media and is therefore only moderately resistant to proteolytic inactivation. FB-Phytase is relatively insensitive towards the pepsin inactivation (about 74% residual activity). The influence of digesta supernatant on the enzymes has been tested as well. The incubations were carried out at 40°C for 60 minutes in a digesta solution from the stomach and proximal jejunum of a pig. In the digesta of the stomach with a pH value of 5.05 the Aspergillus phytase as well as the E.coli phytases were stable. The E.coli phytases Optiphos and FB-Phytase were instable in the digesta of the jejunum (pH value 6.34) and showed residual activities of 35% and 38% respectively. Natuphos® showed a reasonable stability with 70% residual activity. The pathway as well as the efficiency of dephosphorylation of the Aspergillus-, the E.coli- and the Bacillus phytases were assayed by determining the inositolphosphates using HPLC. For every analysed enzyme an enzyme solution was prepared and then incubated at 37°C with a substrate solution (sodium phytate) for different periods (15, 45, 90 and 120 minutes). Subsequently the phytase reaction was stopped and the determination of the inositolphosphates by use of HPLC was conducted. For the Aspergillus phytase a main pathway of the substrate dephosphorylation has been found, wich leads to the 1,2,5-IP3 via 1,2,4,5,6-IP5 and 1,2,5,6-IP4. The pathway for the E.coli enzyme Optiphos leads from the IP6 via 1,2,4,5,6-IP5 and 2,3,4,5-IP4 to the 2,4,5-IP3. The pathway of dephosphorylation of the Bacillus amyloliquefaciens phytase can be constituted as follows: IP6, 1,2,4,5,6-IP5, 2,4,5,6-IP4. The E.coli phytase was the fastest and most efficient enzyme for substrate degradation of the three assayed enzymes: after 90 minutes the substrate was already completely degraded and the degradation product IP5 was also inexistent. Neither the Aspergillus phytase nor the Bacillus phytase were able to degrade the IP6 completely, moreover the substrate degradation proceeded obviously more slowly than in case of the E.coli phytase. To verify the possibility of a synergy of the Optiphos- and the Bacillus phytase concerning the phytate degradation, the two enzymes were applied successively for phytate degradation. The result was analysed via determination of inositolphosphates using HPLC. At first the Optiphos enzyme was incubated with sodium phytate for 60 minutes, then the reaction was stopped and the same sample was incubated with the Bacillus enzyme for 45 or 90 minutes respectively. By combined application of both the E.coli- and the Bacillus phytase notable improvements in substrate degradation could be demonstrated: Both phytases acted out synergetically in this trial and were therefore able to optimise phytate degradation in comparison to the effect of a single phytase. The in vivo study was conducted to determine the dose dependent effect of Optiphos in the diets for piglets containing mainly corn and Optigrain. The diets had a marginal Ca- and P supply and were fed to the piglets with or without phytase supplementation with the enzymes Optiphos (bacterial origin from E.coli) and Natuphos® (fungal origin from Aspergillus niger) during a six-week feeding period (24th to 65th days of life) in dosages of 125, 250, 500 and 1000 FTU/kg. The study aimed to assess the efficacy of the bacterial phytase at graded levels in comparison to the fungal phytase or the negative control without enzyme supplementation on performance parameters. The determined performance parameters were growth, weight gain or feed efficiency, faecal consistency and apparent digestibility with focus on calcium, phosphorus and crude ash. In the feeding trial the E.coli enzyme Optiphos was as effective as the commercial Natuphos® regarding the performance and apparent digestibility. The most positive effect on weight gain was observed during the 3rd to 6th week of the experiment. Both enzymes showed an equally positive influence on weight gain in weaning piglets. In comparison to the unsupplemented diet the supplementation of 1000 FTU/kg of both Optiphos and Natuphos® is able to increase the feed intake significantly. The results from the determination of the MCP equivalent show that up to a level of 500 FTU/kg Optiphos was more efficient. In contrast to this Natuphos® is superior at a level of 1000 FTU/kg. With addition of levels below 1000 FTU/kg Optiphos is superior in the improvement of phosphorus digestibility (the optimal level is the addition of 800 FTU/kg).

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der frühzeitigen Gabe des Probiotikums Enterococcus faecium NCIMB 10415 (ab dem 1. Lebenstag) auf die Mikrobiota des gastro-intestinalen Traktes von Ferkeln zu untersuchen. Es sollten sowohl der Verbleib des zu-geführten Stammes im Magen-Darm-Trakt der Ferkel als auch die bakterielle Zusammen-setzung der Mikrobiota des Magens, distalen Jejunums und Colon ascendens der Ferkel in allen wichtigen Produktionsphasen (Saugperiode, Übergang zum Festfutter, Absetzen) auf der Gattung- und Spezies-Ebene qualitativ und quantitativ mithilfe von Real-Time PCR unter-sucht werden. Ausgehend von der Hypothese, dass artverwandte bzw. das gleiche Habitat besiedelnde Bakterien am ehesten Kandidaten für einen probiotischen Einfluss sind, galt ein besonderes Augenmerk den gastrointestinalen Populationen der Laktobazillen. Die Arbeit wurde im Rahmen des DFG-Forschungsprojekts 438 „Integrative Analyse der Wirkungs-mechanismen von Probiotika beim Schwein“ zwischen 2005 und 2007 durchgeführt. Für den Versuch wurden Sauen der Rasse Deutsche Landrasse x Duroc und ihre Nach-kommen in zwei Fütterungsgruppen – Kontroll- und Probiotikumgruppe – eingeteilt und räumlich getrennt gehalten. Die Saugferkel wurden am 28. Lebenstag von der Muttersau ab-gesetzt. Die Supplementierung der Ferkel der Probiotikumgruppe mit dem Probiotikum be-gann am ersten Tag und dauerte bis zum 56. Lebenstag. In der Saugperiode wurden Ferkel mit dem Probiotikum ab dem 1. bis zum 14. Tag in Form eines Inokulums (4,8x109 KBE/ml) und ab dem 14. bis zum 34. Tag durch Inokulum und Beimischung zum Prästarter-Futter (1,6x107 KBE/g) versorgt. Ab dem 35. Lebenstag erfolgte die Gabe des Probiotikums ausschließlich als Beimischung zum Starter-Futter (4,1x106 KBE/g). Das Futter der Sauen sowie der Kontrollferkel enthielt kein Probiotikum. Je fünf Ferkel pro Gruppe wurden am 7., 14., 28., 35. und 56. Tag getötet, und es wurden Digestaproben aus Magen, distalem Jejunum und Colon ascendens entnommen. Der spezifische Nachweis und die Quantifizierung des probiotischen Enterococcus faecium NCIMB 10415 in den Digestaproben wurde über eine SYBR-Green Real-Time PCR mit dem spiked-matrix- Standard durchgeführt. Qualitative Veränderungen der gesamten bakteriellen Zusammensetzung in den untersuchten Proben wurden mithilfe der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) dargestellt. Die Modifizierung der Mikroflora auf der Gattungsebene wurde quantitativ über SYBRGreen- und TaqMan- Real-Time PCR-Assays ebenso mit einem spiked-matrix-Standard und den Primern für Lactobacillus spp., Entero-coccus spp., Bifidobacterium spp. und Escherichia spp. ermittelt. Auf der Spezies-Ebene wurden Lactobacillus acidophilus, L. amylovorus, L. johnsonii, L. mucosae, L. reuteri sowie die mit dem verfütterten probiotischen Stamm eng verwandten E. faecium und E. faecalis quantifiziert. Die Bestimmung der bakteriellen Stoffwechselaktivität erfolgte durch Messung der Konzentrationen von Laktat, Ammoniumionen und flüchtigen Fettsäuren in den unter-suchten Digestaproben. Der untersuchte probiotische Stamm E. faecium NCIMB 10415 kann den Transit durch Magen und Dünndarm der Ferkel überleben und in einem vermehrungsfähigen Zustand das Colon ascendens erreichen. Die höchsten Konzentrationen des Probiotikums in Magen, distalem Jejunum und Colon ascendens wurden nach zweiwöchiger Supplementierung ge- messen, eine weitere Verfütterung führte zu keiner Erhöhung der Populationsgröße mehr. Die errechneten prozentualen Anteile von E. faecium NCIMB 10415 an der gesamten bakteriellen Population lassen die Schlussfolgerung zu, dass der untersuchte Stamm nur eine unter-geordnete Rolle in der gastrointestinalen bakteriellen Gemeinschaft spielt. Die nach dem Ab- setzen steigenden prozentualen Anteile des Probiotikums an der gesamten bakteriellen Population im Magen und im distalen Jejunum könnten darauf hindeuten, dass zumindest in diesen Lokalisationen die frühzeitige Supplementierung mit E. faecium NCIMB 10415 die weitere Zusammensetzung der Mikrobiota beeinflussen kann. Hinsichtlich der mittels DGGE ermittelten Zusammensetzung der eubakteriellen Populationen konnten in der Saugperiode nur vereinzelt statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Fütterungsgruppen ermittelt werden. Nach dem Absetzen (31., 35. und 56. Tag) jedoch waren die Magen-, Jejunum- und Colon ascendens-Mikrobioten der Probiotikum-Ferkel signifikant diverser als die der Kontrolltiere. Die bakteriellen Populationen waren zwischen den Tieren der Probiotikum-Gruppe in allen Lokalisationen und zu fast allen Beobachtungszeitpunkten ähnlicher als in der Kontrollgruppe, was ebenfalls auf eine höhere Stabilität und Homogentität der gastrointestinalen Mikrobiota in der Probiotikum-Gruppe hindeutet. Auf der Gruppen-Ebene (Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp., Escherichia spp.) zeigte der probiotische Stamm E. faecium NCIMB 10415 nur auf Entero-coccus spp. in Magen, Jejunum und Colon ascendens an allen Beobachtungszeitpunkten eine statistisch signifikant fördernde Wirkung. Die Zahl der für den Organismus potenziell günstigen Laktobazillen erhöhte sich im Magen und Colon ascendens in der Probiotikum- Gruppe nur tendenziell in der Saugphase und nach dem Absetzen. Für die Bifidobakterien wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen beiden Fütterungsgruppen ermittelt. Die Belastung des Magen-Darm-Traktes mit Escherichia spp. war in der Probiotikumgruppe nur geringfügig geringer als in der Kontrollgruppe. Betrachtet man die Ergebnisse der Analyse der gastrointestinalen Laktobazillen-Populationen, so lässt sich mit Blick auf L. johnsonii eine fördernde Wirkung von E. faecium NCIMB 10415 feststellen. Die Zellzahlen dieser Spezies waren in der Probiotikum-Gruppe sowohl im Magen als auch im distalen Jejunum und im Colon ascendens vor und nach dem Absetzen signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Der unter den untersuchten Laktobazillen-Population fast in allen untersuchten Lokalisationen und an allen Beobachtungstagen dominante Stamm – L. reuteri – unterlag dagegen keinem statistisch signifikanten probiotischen Einfluss. Nur tendenziell waren Zellzahlen von L. reuteri und L. amylovorus bei den Probiotikum-Tieren, vorwiegend nach dem Absetzen, höher als jene in der Kontrollgruppe. Obwohl nur wenige untersuchte Proben L. mucosae-positiv waren, war eine statistisch signifikante Wirkung des verfütterten probiotischen Stamms auf diese Spezies im distalen Jejunum festzustellen – fast an allen Beobachtungstagen waren sowohl die absoluten als auch die relativen Zellzahlen in der Probiotikum- Gruppe kleiner als in der Kontrolle, was mit einer möglichen verminderten Abschilferung der Epithelzellen in das Darmlumen verbunden sein könnte. L. acidophilus wurde unter den untersuchten Laktobazillen-Populationen zu den Begleitspezies gezählt; der Stamm wurde an keinem Beobachtungstag und an keiner der untersuchten Lokalisationen von E. faecium NCIMB 10415 nachweislich beeinflusst. Hinsichtlich der Verbesserung der Mikrobiota durch die Produktion von Laktat waren nur wenige statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen zu registrieren. Tendenziell war die Konzentration an L(+)-Laktat in der Probiotikum-Gruppe sowohl im Jejunum als auch im Colon an fast allen Beobachtungstagen höher als in der Kontrolle. Jedoch bestand keine Korrelation zwischen den Zellzahlen von E. faecium NCIMB 10415 bzw. Enterokkoken und dem gemessenen Laktat. Dagegen konnte eine solche Korrelation für Zellzahlen von Lactobacillus spp. und einzelne andere Lactobacillus- Spezies festgestellt werden. Dies, ebenso wie die erhöhten L. johnsonii- Zellzahlen, die tendenzielle Reduzierung von Escherichia spp. sowie niedrigere Ammoniak-Konzentrationen an allen Beobachtungszeitpunkten und erhöhte Essig- und n-Buttersäure-Mengen nach dem Absetzen in der Probiotikum-Gruppe deuten darauf hin, dass E. faecium NCIMB 10415 eine zumindest indirekte Wirkung auf die intestinale Mikrobiota der Ferkel aufweist., This study examined the effects of the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 as a diet supplement (administered from the 1st day post natum) on the intestinal microbiota of piglets. Using different PCR methods, we investigated (both qualitatively and quantitatively) the bacterial composition of the microbiota in the stomach, distal jejunum, and colon ascen-dens of piglets throughout the suckling period, the transition to solid food, and the weaning period, thereby keeping track of the applied probiotic within the gastrointestinal tract. Based on the expectation that similar bacteria and those occupying the same habitat are the most likely candidates for a probiotic influence, the main focus was on the gastrointestinal popula-tions of lactobacilli. For the trial, sows (Landrace x Duroc) and their litter were divided into a probiotic- and a control group and were kept separately. Piglets were weaned on the 28th day of life. The sup-plementation of piglets in the probiotic group began on day 1 and lasted until the 56th day of life. During the suckling period, from day 1 to 14, piglets received the probiotic via inoculum (4,8x109 CFU/ml) and via supplement to the pre-starter diet (1,6x107 CFU/g) from day 14 to 34. Starting on day 35, the probiotic was administered along with the starter diet (4,1x106 CFU/g). The sow and piglet diet of the control group contained no probiotic. Five piglets per group were euthanised on day 7, 14, 35, and 56, respectively, and digesta samples were re-moved from the stomach, distal jejunum and colon ascendens. SYBR-Green real time PCR with spiked matrix standards was applied for the specific detection and quantification of the probiotic E. faecium NCIMB 10415 in the digesta samples. Qualitative changes of the overall bacterial composition in the samples under examination were identified using the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) method. Quantita-tive modifications to the microbiota on the genus level were examined by SYBR-Green and TaqMan real time PCR assays, using spiked matrix standards and primers for Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp., and Escherichia spp. On the species level, Lactobacillus acidophilus, L. amylovorus, L. johnsonii, L. mucosae, and L. reuteri, as well as E. faecium und E. faecalis were quantified. Concentrations of lactate, ammonium ions and short chain fatty acids were measured in order to evaluate the degree of metabolic activity. E. faecium NCIMB 10415 survived the transit through the stomach and small intestine of the piglets and was found in the colon ascendens in high cell numbers. The highest concentration of the examined probiotic in the gastrointestinal tract was measured two weeks into the trial – subsequent supplementation led to no further increase in the size of the population. The ratio of E. faecium NCIMB 10415 within the overall bacterial population suggested that the exam-ined strain plays a subordinate role in the gastrointestinal bacterial community. However, in-creasing ratios of the probiotic regarding the total bacterial population in stomach and distal jejunum samples after weaning may point to modifying effects on the composition of the mi-crobiota in these localisations, which resulted from an early supplementation with E. faecium NCIMB 10415. Regarding the eubacterial composition, only sporadic statistically significant differences be-tween the two trial groups became visible before weaning. After weaning (days 31, 35, and 56), however, the microbiota of the stomach, distal jejunum and colon ascendens of the probi- otic piglets was significantly more diverse than that of the control piglets. At the same time, bacterial populations were more similar between animals of the probiotics group in all local-isations and at almost all points of observation, which also indicates a higher consistency and homogeneity of the gastrointestinal microbiota within that group. On the bacterial group level (Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp., Escherichia spp.), the probiotic strain showed a significant beneficial effect only on Entero-coccus spp. in all locations and at all points of observations. The number of potentially bene-ficial lactobacilli tended to increase in the stomach and colon ascendens of probiotic piglets in both the suckling and the post-weaning period. As for bifidobacteria, no statistically signifi-cant difference could be found. The number of harmful Escherichia spp. was slightly lower in the probiotics group compared to the control group. Concerning the results of the analysis of gastrointestinal lactobacilli, an effect of E. faecium NCIMB 10415 on Lactobacillus johnsonii could clearly be discerned. The cell numbers of this species were significantly higher in the probiotics group in all three locations and both before and after weaning. The dominant lactobacillus strain – L. reuteri – was, however, not significantly affected by the administered probiotic. Cell numbers of L. reuteri and L. amylo-vorus tended to be higher in the probiotics group, but not by a significant margin. For L. mu-cosae, despite reduced presence in sample extracts (it is being detected in only a few samples), a statistically significant effect was detected: on almost all days of observation, both absolute and relative cell numbers of L. mucosae were smaller in the probiotic group compared to the control group. As this strain is known to adhere to intestinal mucus, this may be connected to a reduced cell turnover of intestinal epithelium. L. acidophilus was counted among the accompanying species within the examined population of lactobacilli – at no point in time and in none of the localisation was it demonstrably affected by E. faecium NCIMB 10415. With a view to the possible improvement of the microbiota through augmented production of lactate, only isolated significant differences between the two trial groups were registered. On almost all days of observation, there was a tendency for the concentration of l-lactate to be higher in the probiotics group, both in the jejunum and in the colon ascendens. There was, however, no correlation between the cell numbers of E. faecium NCIMB 10415 – or enteroc- coci, respectively – and the amount of lactate registered. Yet such a correlation was detected between the cell numbers for Lactobacillus spp. and single other lactobacillus species. This observation, along with the increase in cell numbers for L. johnsonii, the tendency towards a reduction of Escherichia spp., a lower concentration of ammonia at all points in time, and a quantitative increase of acetic and n-butyric acid after weaning in the probiotics group, sug-gests that E. faecium NCIMB 10415 does exert an indirect effect on the composition and ac-tivity of the intestinal microbiota of piglets.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung möglicher Auswirkungen des probiotischen Enterococcus faecium NCIMB 10415 auf die intestinale Mikrobiota und die daraus resultierende mögliche Beeinflussung von Leistungs- und Gesundheitsparametern. Ferner sollte eine Methode zum spezifischen Nachweis des Probiotikums im Verdauungstrakt entwickelt werden, um es von den vorhandenen Enterokokken abgrenzen zu können. 20 Sauen und ihre Nachkommen wurden in zwei gleich große Versuchsgruppen aufgeteilt und räumlich getrennt gehalten. Die Ferkel wurden am 28. Lebenstag abgesetzt und anschließend in Gruppen gehalten. Die Kontrollgruppe erhielt eine Standard- Diät, das Futter der Versuchsgruppe enthielt zusätzlich im Sauen-, Saugferkel- und Absetzer- Futter je 1,6 x 106, 1,7 bzw. 2 x 105 Zellen des Probiotikums pro kg Futter. Die Leistungsdaten der Sauen umfassten Wurfgröße, Ferkelverluste bis zum Absetzen, abgesetzte Ferkel, Gewichtsverlust während der Laktation und durchschnittliche tägliche Futteraufnahme (ADFI). Bei den Ferkeln wurden ADFI, durchschnittliche tägliche Zunahmen (ADG) und das ADG : ADFI Verhältnis (G:F) bestimmt. Ferner wurde das Auftreten und die Schwere von Durchfallerkrankungen der abgesetzten Ferkel dokumentiert. Es wurden Kotproben von Sauen 10 Tage a.p. und 14 Tage p.p. sowie Kotproben von Ferkeln am 7., 14., 21., 28., 35., 56. und 70. Lebenstag gewonnen. Ferner wurden am 14., 28., 35. und 56. Tag je fünf Ferkel pro Gruppe getötet und Digestaproben aus Magen, Jejunum, Ileum und Colon entnommen. Ein spezifischer Nachweis des Probiotikums durch Koloniehybridisierung zur Bestimmung der Zellzahlen des Probiotikums und Abgrenzung von den residenten Enterokokken des Darmes wurde für Enterococcus faecium NCIMB 10415 entwickelt und angewandt. E. coli- Isolate aus Kotproben wurden mittels Multiplex- Polymerase- Kettenreaktion auf das Vorkommen von neun schweinetypischen Pathogenitätsgenen untersucht. Veränderungen der bakteriellen Zusammensetzung im Kot wurden mithilfe der denaturierenden Gradienten- Gelelektrophorese (DGGE) dargestellt. In Digesta erfolgte zum einen die Messung der Konzentrationen flüchtiger Fettsäuren (FFS), Laktat und Ammoniak, ferner wurde durch Kultivierung auf Nährböden die Koloniebildenden Einheiten (KbE) der Gesamt- Anaerobier, Milchsäurebakterien, Coliformen und Enterokokken bestimmt. Die Anwendung des Probiotikums führte im Gruppenvergleich nur selten zu signifikanten Unterschieden. Die Leistungsdaten der Sauen und Ferkel wurden nicht sichtbar beeinflusst. Nach dem Absetzen kam es zu einer signifikanten Reduktion von Durchfällen in der Probiotikagruppe (p≤0,05). Die Ammoniak- Konzentrationen in dieser Gruppe schienen im Jejunum nach dem Absetzen ebenfalls reduziert (p≤0,1). Bei den FFS und Laktat konnten wie auch bei den bakteriellen Zellzahlen im Darm keine Unterschiede beobachtet werden. Das Probiotikum konnte in allen Bereichen des Verdauungstraktes und im Kot nachgewiesen werden. Die direkte Übertragung des Probiotikums vom Muttertier auf die Ferkel ohne direkte Zufütterung wurde gezeigt. Ferner zeigten sich bereits ohne Zufütterung des Probiotikums bei Saugferkeln annährend gleich hohe Zellzahlen im Kot wie bei regelmäßiger Aufnahme des Probiotikums nach dem Absetzen. Die Menge aufgenommenen Probiotikums scheint demnach eine eher untergeordnete Rolle in Bezug auf die Zellzahl dieses Bakteriums im Verdauungstrakt zu spielen. Das Auftreten potentiell pathogener E. coli im Kot schien in der Probiotikagruppe reduziert. Der aus den DGGE- Profilen aus Ferkelkot errechnete Sörensen- Ähnlichkeitskoeffizient zeigte eine signifikant höhere Ähnlichkeit zwischen den Tieren der Probiotikagruppe am 14. und 56. Tag als die der Kontrollgruppe (p≤0,02), am 28. und 35. Tag waren diese Unterschiede nur tendenziell ausgeprägt (p≤0,1). In Anbetracht eines breit angelegten Versuchsansatzes konnten bei der Verwendung des Probiotikums Enterococcus faecium NCIMB 10415 nur vereinzelt geringe Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Das Probiotikum scheint bei Anwendung in dieser Form und Konzentrationen dennoch Einfluss auf die intestinale Mikrobiota der Ferkel auszuüben; die als günstig anzusehenden Effekte auf Gesundheit und Leistung waren letztendlich aber nur schwach ausgeprägt., In this study the impact of probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 on the intestinal microbiota and the resulting effects on performance and health status of piglets and sows was investigated. A method to detect the probiotic Enterococcus within total intestinal enterococci was developed. 20 sows and their litters were divided into two trial groups and kept separately. Piglets were weaned at 28th day of life. Control group received standard diet while probiotic group was fed the same diet supplemented with 1,6 x 106, 1,7 and 2 x 105 cells of E. faecium NCIMB 10415 per kg feed for sows, suckling and weaned piglets, respectively. Performance of sows was measured in litter size, piglet losses, weaned piglet, weight loss during lactation and average daily feed intake (ADFI). In piglets ADFI and average daily gain (ADG) was determined and gain to feed ratio (G:F) was calculated. Incidence and severity of diarrhea was documented in weaned piglets. Fecal samples of sows were collected 10 days ante partum and 14 days post partum. Feces of piglets was obtained on days 7, 14, 21, 28, 35, 56 and 70, respectively. On days 14, 28, 35 56 five piglets of each group were sacrificed and digesta samples were collected from stomach, jejunum, ileum and colon. A method to enumerate specific cell counts of probiotic bacteria in comparison to total enterococci counts in digesta and feces was developed using colony hybridization technique. Fecal samples were screened for potential pathogenic E. coli using multiplex polymerase chain reaction. The influence on bacterial composition in piglet feces was investigated by denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE). Amounts of short chain fatty acids (SCFA), lactic acid (LA) and ammonia in digesta as well as colony forming units (CFU) of total anaerobes, lactic acid bacteria, coliforms and enterococci were measured. Only few differences could be observed between the trial groups after addition of E. faecium NCIMB 10415 to pig diets. No influence was detectable on performance parameters of piglets and sows. Diarrhea was significantly reduced in the probiotic group after weaning (p≤0,05). Ammonia contents were reduced in jejunal digesta in the probiotic group (p≤0,1) while SCFA and LA concentrations as well as bacterial CFU showed no differences between the trial groups. Probiotic E. faecium NCIMB 10415 could be detected in all gut sections and feces of probiotic fed piglets. Direct transmission of the probiotic enterococcus from sows to piglets could be demonstrated while specific cell counts in suckling piglets without any feed supplementation already reached similar levels compared to cell counts in digesta and feces of weaned piglets fed probiotic- supplemented diets. Therefore the amount of ingested probiotic appearently did not affect the level of intestinal cell counts of the probiotic as expected. Incidence of potential pathogenic E. coli in feces appeared to be reduced in the probiotic group. Soerensen´s similarity coefficient showed significant higher similarity in bacterial composition of piglet feces within the probiotic group on day 14 and 56 compared to the control group as determined by DGGE. With regard to the number of parameters investigated during this trial the addition of probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 induced only few measureable effects on probiotic fed pigs. Nevertheless the intestinal microbiota was affected by this treatment while positive effects on health and performance remained inconsistent.

Getreidereiche Diäten für Geflügel und Schweine mit hohem NSP-Gehalt werden mit Nicht-Stärke-Polysaccharid spaltenden Enzymen supplementiert, um den antinutritiven Effekt der Nicht-Stärke-Polysaccharide, die gesteigerte Digestaviskosität sowie alle damit verbundenen Folgeeffekte abzuschwächen. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Auswirkungen des Einsatzes der beiden Enzympräparate Roxazyme G2 (Multienzympräparat) und Ronozyme WX (Monoenzympräparat) der Firma DSM Nutritional Products (Grenzach-Wyhlen, Germany) im Vergleich zu einer nicht enzymsupplementierten Kontrolle zu betrachten. Das Monoenzympräparat enthält als einziges Enzym eine Endo-(1,4)-ß-Xylanase (EC-Nr.: 3.2.1.8.), welche von Thermomyces lanuginosus ssp. abgeleitet ist. Das Multienzympräparat weist drei Haupt-Enzymaktivitäten auf: Eine Endo-(1,4)-ß-Glucanase (EC 3.2.1.4.), eine Endo-(1,3-1,4)-ß-Glucanase (EC 3.2.1.6.) und eine Endo-(1,4)-ß-Xylanase (EC 3.2.1.8), welche vom Pilz Trichoderma longibrachiatum abgeleitet sind. Des weiteren soll die Hypothese, dass sich unter Einsatz NSP-spaltender Enzyme die Konzentration mikrobieller Stoffwechselprodukte und der mikrobielle Nährstoffumsatz verändert, untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden sowohl ein in-vitro Wachstumsversuch mit Digesta aus dem Gastrointestinaltrakt eines Ferkels und verschiedenen NSP-haltigen Substraten, als auch ein Fütterungsversuch mit Schweinen der Rasse EUROC (21. bis 57. Lebenstag) durchgeführt. Bei der statistischen Auswertung der Daten mit dem Computer- Programm Spss für Windows (Version 12.0) wurde einheitlich der verteilungsfreie Test nach Kruskall-Wallis angewendet, weil nicht alle erhobenen Parameter eine Normalverteilung zeigten. Als Folge-Test wurde, sofern sich Trends bzw. Signifikanzen zeigten, der Mann-Whitney-Test durchgeführt. Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p = 0,05, also 5 %, zu Grunde gelegt. Im Rahmen dieses Fütterungsversuches mit drei Gruppen (Kontrollgruppe ohne Enzymzusatz, Roxazyme-supplementierte Gruppe, Ronozyme- supplementierte Gruppe) und jeweils 20 Tieren pro Gruppe (zu gleichen Teilen männliche und weibliche) wurden zunächst über vier Wochen die üblichen Leistungsparameter wie Lebendmasse, Lebendmassezunahme, Futterverzehr, Futteraufwand und die Kotkonsistenz erhoben und anschließend, nach einem neuntägigen Abschnitt, Digesta-Proben von Magen, Jejunum und Colon zur Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit (Rohprotein, Rohfett, Rohfaser, ADF, NDF, Rohasche, Stärke und Aminosäuren) genommen. Die Bestimmung der praecaecalen Verdaulichkeit erfolgte mittels Indikatormethode mit Chromoxid (Cr2O3) als Marker, welches der Versuchsdiät zu 0,5% zugesetzt worden war. Bei den Leistungsparametern war die Lebendmassezunahme über den Zeitraum der ersten bis vierten Versuchswoche im Vergleich zur Kontrollgruppe unter Roxazymezusatz um 6,8 % und unter Supplementation mit dem Monoenzympräparat Ronozyme um 7,1 % verbessert. Allerdings war diese Verbesserung statistisch nicht signifikant. Eine Verminderung des Futteraufwandes konnte über den Zeitraum der 1. bis 4. Versuchswoche des Fütterungsversuches bei der Monoenzympräparat-Gruppe beobachtet werden. Allerdings war dies keine statistisch signifikante Verringerung des Futteraufwandes. Die Verdaulichkeiten von Rohfaser, Rohasche, ADF, NDF und Stärke sowie die der Summe der Aminosäuren waren bei der Monoenzympräparatgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, numerisch gesehen, geringfügig erhöht. Die erwähnten Unterschiede sind, insbesondere hinsichtlich der praecaecalen Verdaulichkeit der Stärke bei den enzymsupplementierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe, aber derart gering, dass man den oft postulierten Käfigeffekt zumindest in dieser Untersuchung nicht nachvollziehen kann. Berücksichtigen muss man in diesem Zusammenhang die insgesamt sehr hohe praecaecale Verdaulichkeit der Versuchs-Diät. Dies führt dazu, dass mögliche Effekte des Enzymzusatzes hinsichtlich der praecaecalen Verdaulichkeit, im Vergleich zur Kontrollgruppe, nicht mehr deutlich erkennbar sind. Die Viskosität der Digestaproben wurde ermittelt, um eine mögliche Viskositätssenkung infolge Enzymsupplementation erkennen zu können. Die Viskosität der Jejunaldigesta war unter Zusatz des Multienzympräparates im Vergleich zur Kontrollgruppe als Trend gesenkt worden, während sie unter Gabe des Monoenzympräparates sogar signifikant erniedrigt worden war im Vergleich zur Kontrollgruppe. Beim Verdauungsabschnitt Colon war nur unter Supplementation mit dem Monoenzympräparat eine deutliche numerische Senkung der Digestaviskosität zu verzeichnen. Des weiteren wurden in den Digestaproben die bakteriellen Metaboliten Ammoniak, Lactat und die kurzkettigen Fettsäuren bestimmt und auch der Gehalt an konjugierten und dekonjugierten Gallensäuren ermittelt, um die möglicherweise unterschiedlichen Auswirkungen der beiden Enzympräparate auf die gastrointestinale Mikrobiota sichtbar machen zu können. Es sollte der Hypothese nachgegangen werden, dass sich die Konzentration bakterieller Metaboliten sowie der mikrobielle Nährstoffumsatz unter Enzymsupplementation möglicherweise ändert. Beim Vergleich der enzymsupplementierten Gruppen mit der Kontrollgruppe waren hinsichtlich der gemessenen bakteriellen Metaboliten keine statistisch signifikanten Unterschiede zu erkennen. Die Hypothese, dass sich die Konzentration mikrobieller Metaboliten und der mikrobielle Nährstoffumsatz unter Supplementation mit NSP-hydrolysierenden Enzymen verändert, fand, wenn auch nicht statistisch absicherbar, tendenziell Bestätigung. Unter anderem zeigte sich dies beim Colon in einer bei beiden Enzymgruppen numerisch erhöhten Gesamtmenge der gebildeten freien Fettsäuren als mögliches Indiz für eine gesteigerte bakterielle Fermentation. Der tendenziell senkende Effekt der Ronozymezulage auf die Dekonjugation der Gallensäuren könnte dahingehend gedeutet werden, dass der Xylanasezusatz zu Diäten für Ferkel ebenso wie beim Geflügel zur Zurückdrängung gallensäuredekonjugierender Mikroorganismen führt. Ein Agardiffusionstest mit Magen-, Jejunal- und Colondigesta diente dem Nachweis der in den jeweiligen Digestaproben vorherrschenden Enzymaktivitäten und damit dem Vergleich der den Diäten zugesetzten Enzympräparate. Hierbei stellte sich heraus, dass das Monoenzympräparat Ronozyme stabiler ist im Vergleich zum Multienzympräparat Roxazyme und es daher eher in der Lage ist, weiter distal im Verdauungstrakt seine Wirkung zu entfalten. Die größere Stabilität des Ronozymes und die damit verbundene Eigenschaft noch weiter distal im Verdauungstrakt wirken zu können, zeigt sich auch bei der Viskositätssenkung in den Colondigesta. Während das Roxazyme zu fast keiner Senkung der Viskosität in diesem diesem distalen Darmabschnitt im Vergleich zur Kontrollgruppe führt, erwirkt das Monoenzympräparat Ronozyme hingegen eine deutliche Viskositätssenkung. Die in-vitro -Studie dieser Dissertation mit Digestaproben hat gezeigt, dass intestinale Bakterien unterschiedlich auf das Vorhandensein NSP-spaltender Enzyme reagieren. Die Produktion zahlreicher NSP- Fragmente durch das Multienzympräparat aus dem (1,3-1,4)-ß-Glucan könnte das bakterielle Wachstum im Jejunum erhöhen, während die Hydrolyse des (1,4)-ß-Arabinoxylans durch die (1,4)-ß-Arabinoxylanase des Ronozymes das Bakterienwachstum in allen untersuchten Segmenten des Gastrointestinaltraktes zu hemmen scheint, Corn-based diets for poultry and swine rich in NSP-content were supplemented with NSP-degrading enzymes in order to diminish the anti-nutritive effect of non-starch-polysaccharides, the increased digesta-viscosity and all subsequent related effects. The aim of this study is to investigate the consequences of using both enzyme preparations Roxazyme G2 (multienzyme-preparation) and Ronozyme WX (monoenzyme-preparation) from DSM Nutritional Products (Grenzach- Wyhlen, Germany) and to compare these to a control-group whose diet is not supplemented. The monoenzyme-preparationcontains only an endo -(1,4)-ß-xylanase activity (EC-Nr.:3.2.1.8.) derived from Thermomyces lanuginosus ssp.. The multienzyme-preparation performs three major enzyme activities: An endo -(1,4)-ß-glucanase (EC 3.2.1.4.), an endo -(1,3-1,4)-ß-glucanase (EC 3.2.1.6.) and an endo -(1,4)-ß-xylanase (EC 3.2.1.8) all of wich are derived from Trichoderma longibrachiatum. In addition, the hypothesis that the concentration of microbial metabolic products and the microbial metabolism of nutrients change with the use of NSP- degrading enzymes will be tested. To this end, an in-vitro study to estimate the growth potential of bacteria from digesta samples of the gastrointestinal tract of a piglet with different NSP-containing substrates was carried out as well as a feeding trial with weaned piglets (race EUROC aged from 21 to 57 days old). For the statistical analysis of the data, the computer program Spss for Windows (version 12.0) was used. Because of the fact that not all parameters showed a normal distribution, a Kruskal-Wallis statistical test, which is a distribution-free test, was performed. In the event that trends or any statistical significance appeared, the Mann-Whitney-test was conducted as a follow-up test. The underlying probability for error was 5 %. The feeding trial was conducted with three groups: a control-group fed a basal diet without enzyme supplementation, a Roxazyme-supplemented group and a Ronozyme- supplemented group. Each group consisted of 20 piglets (ten males and ten females). Performance parameters such as live-weight, live-weight gain, feed consumption, feed conversion ratio and consistency of faeces were recorded over a period of four weeks. Subsequently, after a period of nine days, digesta samples from the stomach, jejunum and colon were taken to determine the ilial digestibility of crude protein, crude fat, crude fibre, acid detergent fibre (ADF), neutral detergent fibre (NDF), crude ash, starch and amino acids. The ilial digestibility was determined through an indicator method using chromium oxide (Cr2O3) as a marker. The three diets were supplemented by 0,5 % chromium oxide. Evaluation of the performance parameters showed the live weight gain in the first four weeks was about 6,8 % higher in the multienzyme-enzyme-preparation group and 7,1 % higher in the mono-enzyme- supplemented group than in the control-group. However, this improvement was not statistically significant. A decrease of the feed conversion ratio in the mono-enzyme group was observed during the 1st to 4th week of the feeding trial. However, this also proved to be insignificant. In numerical terms, the digestibility of crude fibre, crude ash, ADF, NDF and starch as well as the digestibility of total amino acids of the mono-enzyme preparation group increased marginally compared to the control-group. These observed differences between the enzyme supplemented groups compared to the control group, especially the ileal digestibility of starch, were so slight that it is not possible to confirm if they were due in this case to the often postulated cage-effect . This data must also be considered in light of the very high ileal digestibility of the diet used in this study. As a result of this, possible or expected effects of enzyme supplementation on the ileal digestibility when compared to the control-group are not clearly discernible. The viscosity of digesta samples were determined in order to identify a possible decrease of viscosity resulting from the added enzymes. Compared to the control-group, the viscosity of jejunal digesta samples decreased as a trend in the group receiving a multi-supplemented diet, whereas it decreased significantly under mono-enzyme addition. The digesta samples from the colon only displayed a numerical decrease of the digesta viscosity. In addition, bacterial metabolites like ammonia, lactate and volatile fatty acids in the digesta samples were determined and the concentration of conjugated and deconjugated bile acids was ascertained in order to make the possibly different effects of both enzyme preparations on the gastrointestinal microbiota visible. The hypothesis that the concentration of microbial metabolic products as well as the microbial metabolism of nutrients is possibly changing under enzyme addition will be examined. In regard to the bacterial metabolites measured, a comparison of both enzyme supplemented groups with the control group showed no statistically significant differences. The hypothesis that the concentration of microbial metabolic products as well as the microbial metabolism of nutrients is changing with NSP-degrading enzyme supplementation, was confirmed although it was not represented statistically. This is demonstrated in the colon as a numerically increased concentration of total volatile fatty acids. This could be an indication for an increased bacterial fermentation under enzyme supplementation. The tendency that the Ronozyme supplemented diet has a decreasing effect on the deconjugation of bile acids could show that a xylanase supplement in piglet s diets leads to a restraining effect on bile acid deconjugating microbiota as it does in poultry. An agar diffusion assay with digesta samples from the stomach, jejunum and colon serves as evidence of the digesta samples predominant enzyme activities and with that a comparison of the diet s supplemental enzyme preparations. Here it emerges that the mono-enzyme preparation Ronozyme is more stable when compared to the multi-enzyme preparation Roxazyme and is therefore better able to display its effect further distal in the gastrointestinal tract. The decreased viscosity in digesta samples from colon also demonstrates Ronozyme s greater stability and associated ability to be effective in more distal parts of the gastrointestinal tract. While Roxazyme caused barely any decrease in viscosity in the distal part of the intestine when compared to the control group, the mono-enzyme preparation Ronozyme, however, caused a clear reduction in viscosity. The in-vitro study with digesta samples in this dissertation has shown that intestinal bacteria react differently to the presence of NSP-degrading enzymes. Production of multiple NSP fragments by the multienzyme preparation from the (1,3-1,4)-ß-Glucan may enhance bacterial growth in jejunum, while the hydrolysis of (1,4)-ß-arabinoxylans with the (1,4)-ß-arabinoxylanase of the Ronozyme seemed to inhibit bacteria in all tested intestinal segments.