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Die Gruppe der erblichen Retina- und Makuladystrophien umfasst eine erhebliche Anzahl an Erkrankungen, die durch Mutationen in unterschiedlichen Genen ausgelöst werden und für die, bis auf einige wenige Ausnahmen, keine kausale Therapie existiert. Eine dieser Erkrankungen ist der Morbus Stargardt (STGD1), der sich in den ersten beiden Lebensdekaden manifestiert und mit dem ABCA4 Gen assoziiert ist. Die Genom Editierung, bei der mit Hilfe des CRISPR/Cas Systems ein gezielter Doppelstrangbruch im Bereich der krankheitsauslösenden Mutation gesetzt wird und dadurch die zelleigenen Reparaturmechanismen ausgelöst werden, stellt einen möglichen therapeutischen Ansatz dar. Ziel dieser Arbeit war es, anhand einer Mutation im murinen Abca4 Gen eine Strategie in vitro zu entwickeln, um mittels Genom Editierung große DNA Bereiche durch HDR austauschen zu können. Dazu wurden sowohl für das CRISPR/Cas System unterschiedliche guideRNAs hergestellt und getestet als auch ein Template und ein Reporter entwickelt und erstellt. Diese beiden enthielten u.a. die korrekte DNA-Sequenz für den mutierten Bereich des Abca4 Gens und sollten zusätzlich in die Zelle eingebracht werden. Die Sequenzen der jeweiligen guideRNA wurde in einen Cas9 enthaltendes Plasmid kloniert und die entsprechende Target-Sequenzen in einen NHEJ-Sensor. Dadurch konnte mittels einem BRET-Assay die Aktivität der einzelnen gRNA/Cas9 Komplexe erfasst werden. Bei der Erstellung des Templates bzw. des Reporters wurde eine möglichst geringe Anzahl an Basenpaaren verwendet, damit diese später potenziell in einem in vivo Versuch mittels Transduktion verwendet werden könnten. Die eigentliche Überprüfung der Reparatur durch den Einbau der korrekten DNA-Sequenz erfolgte durch die Transfektion der gRNA/Cas9 Komplexe mit dem Template bzw. Reporter in 3T3-NIH Zellen und wurde mittels FACS-Analyse und PCR mit anschließender Gelelektrophorese ausgewertet. Es konnten mehrere aktive guideRNAs identifiziert werden, von denen ein gRNA/Cas9 Komplex sowohl in Kombination mit dem Template als auch mit dem Reporter zu einer erfolgreichen Reparatur der genomischen DNA führte. Dies konnte sowohl auf Protein-Ebene in der FACS-Analyse als auch auf DNA-Ebene in der Gelelektrophorese nachgewiesen werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch ein möglichst klein gehaltenes Template sowie durch einen aktiven gRNA/Cas9 Komplex eine Reparatur in vitro möglich ist. Durch die besondere Konstruktion der einzelnen Bestandteile stellt dies einen ersten erfolgreichen Schritt für weitere potenzielle in vivo Versuche und der Entwicklung einer möglichen Therapie des STGD1 dar.

Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein vielseitiger Modellorganismus sowohl in der Grundlagenforschung als auch für biotechnologische Anwendung. Für die genetische Veränderung wurden verschiedene Methoden entwickelt, jedoch ist die gezielte Modifikation kerncodierter Gene immernoch sehr schwierig. In dieser Arbeit wird eine Strategie vorgestellt, die es ermöglicht, kerncodierte Gene in Chlamydomonas gezielt mit sequenzspezifischen Zinkfinger-Nukleasen zu verändern. Das COP3-Gen, welches den lichtaktivierbaren Ionenkanal Kanalrhodopsin-1 codiert, diente hierbei als Zielsequenz der für die Deletion hergestellten Zinkfinger-Nukleasen. Um eine Charakterisierung der ZFNs zu ermöglichen, wurde ein Modelstamm generiert, der ein inaktiviertes Markergen enthält. Die Inaktiverung erfolgte hierbei durch Insertion der COP3-ZFN Zielsequenz. Die Transformation dieses Modellstamms mit ZFN codierender Plasmid-DNA und einem Reparatur-Template ermöglichte die Wiederherstellung der Markeraktivität und eine Selektion Antibiotika-resistenter Kolonien. Wenn in diesen Experimenten zusätzlich ein COP3 veränderndes Template benutzt wurde, enthielt 1% der analysierten Klone ein mutiertes COP3-Gen. Der Chlamydomonas Augenfleck ist ein lichtsensitives Organell mit entscheidender Funktion für die phototaktische Orientierung der Alge. Eine Deletionsmutante des Blaulicht-Photorezeptors Phototropin zeigte in Experimenten eine veränderte Regulation der lichtabhängigen Augenfleckgröße. Durch Komplementierung der Phototropin-Dysfunktion konnte der lichtabhängige Regulationsprozess wiederhergestellt werden. Die Expression der Phototropin-Kinasedomäne führte zu einer lichtunabhängigen Reduktion der Augenfleckfläche. Interessanterweise führte auch die Expression der N-terminalen LOV-Domänen zu einer geänderten Regulation des Augenflecks und der Phototaxis. Dies deutet, zusätzlich zur Lichtregulation der Kinasedomäne, auf eine zelluläre Signalfunktion der LOV-Domänen hin., The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is a versatile model for fundamental and biotechnological research. A wide toolset for genetic manipulation has been developed for this alga, but specific modification of nuclear genes is still not routinely possible. Here we present a nuclear gene targeting strategy for Chlamydomonas that is based on the application of zinc-finger nucleases (ZFNs). Initially, we designed a set of ZFNs for targeting the COP3 gene that encodes the light-activated ion channel channelrhodopsin-1. To evaluate the designed ZFNs, we constructed a model strain by inserting a non-functional selection marker interspaced with a short COP3 target sequence into the nuclear genome. Upon co-transformation of this recipient strain with the engineered ZFNs and a DNA repair template, we were able to restore marker activity and select antibiotic resistant clones with active nucleases. In cases where cells were co-transformed with a modified COP3 template, 1% of these clones contained a modified COP3 locus as well. The eyespot of Chlamydomonas is a light-sensitive organelle important for phototactic orientation of the alga. Here we found that eyespot size is downregulated in light. In a strain in which the blue light photoreceptor phototropin was deleted, the light regulation of the eyespot size was affected. We restored this dysfunction in different phototropin complementation experiments. Complementation with the phototropin kinase fragment reduced the eyespot size, independent of light. Interestingly, overexpression of the N-terminal LOV-domains alone also affected eyespot size and phototaxis, suggesting that aside from activation of the kinase domain, they fulfill an independent signaling function in the cell. We propose that phototropin is a light regulator of phototaxis that desensitizes the eyespot when blue light intensities increase.