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Ustilago maydis ist ein phytopathogener Basidiomyzet, dessen dimorpher Lebenszyklus die sexuelle und pathogenen Entwicklung miteinander verknu��pft und in Abh��ngigkeit des Wirts Zea mays abl��uft. Die Transition von saprophytischer zu biotropher Phase erfordert hierbei eine streng regulierte und komplexe Integration verschiedenster Signalwege, die u��ber ein hierarchisches Transkriptionsfaktornetzwerk realisiert wird. Nach erfolgter Zellfusion zweier kompatibler Sporidien, die u��ber ein Pheromon-/Rezeptorsystem vermittelt wird, bildet sich ein dikaryotisches Filament, welches die biotrophe Phase einleitet. Die hierbei eingesetzte Regulationskaskade unterliegt der Kontrolle der vom b-Locus kodierten, heterodimeren Transkriptionsfaktoren bE und bW, die neben dem filament��sen Wachstum und einem G2-Zellzyklusarrest die Induktion weiterer Transkriptionsfaktoren ausl��sen. Der bW/bE-abh��ngig exprimierte Zinkfingertranskriptionsfaktor Rbf1 steuert dabei als zentraler Regulator 90 % der b-regulierten Gene. Rbf1 ist, unabh��ngig von b, sowohl notwendig als auch ausreichend fu��r die Initiation der pathogenen Entwicklung; fu��r den weiteren Infektionsverlauf ist b notwendig. Die Expression von rbf1 w��hrend der Infektion unterliegt einer strengen Kontrolle; w��hrend es auf der Blattoberfl��che zur Induktion kommt, reprimiert die Interaktion zwischen bW/bE und Clp1, einem weiteren direkt b-induzierten Faktor, die rbf1 Expression. Zwei Tage nach der Infektion ist keine rbf1 Expression mehr nachweisbar. Mikroskopische und qRT-PCR Analysen in dieser Arbeit konnten zeigen, dass rbf1 lediglich fu��r den ��bergang zur biotrophen Phase ben��tigt wird, da eine prolongierte Expression zu einer aberranten Zellkernverteilung und zum Verlust der Virulenz fu��hrt. W��hrend rbf1 selbst jedoch unmittelbar nach der Penetration nicht mehr aktiv ist, werden ungef��hr die H��lfte der rbf1-regulierten Gene auch im weiteren Infektionsverlauf in planta exprimiert. Diese Weiterfu��hrung der Regulation wird durch die rbf1-abh��ngigen Transkriptionsfaktoren Hdp2 und Biz1 realisiert. Neben Aufrechterhaltung der Expression rbf1-vermittelter Gene, treibt vor allem Hdp2 die biotrophe Phase von U. maydis voran. ChIP-Seq Analysen konnten die Bindung von Hdp2 an zahlreiche Promotoren von pathogenit��tsrelevanten Genen in planta zeigen und deuten nicht nur auf eine Regulation von charakterisierten Effektoren, sondern auch auf eine Weiterfu��hrung der Signalkaskade durch die Kontrolle weiterer Transkriptionsfaktoren hin. hdp2 selbst unterliegt einer komplexen Kontrolle, die ein Zusammenspiel aus verschiedenen Transkriptionsfaktoren und zwei alternativen Promotoren erfordert. Auf der Blattoberfl��che wird hdp2 von Rbf1 induziert, das nach der Penetration der Pflanze von Biz1 abgel��st wird. Die ��bernahme der Regulation durch Biz1 erfolgt, nachdem ein gewisser Schwellenwert von Biz1 erreicht ist und ist gleichzeitig mit einem Wechsel der Promotoren verbunden. W��hrend Rbf1 vor einem 5���-Exon von hdp2 bindet, findet die Bindung von Biz1 innerhalb des Introns statt, wodurch ein Transkript entsteht, das ein alternatives Startcodon bei der Translation verwendet und Hdp2 um 55 Aminos��uren verl��ngert. Die beiden Hdp2 Isoformen, Hdp2S und Hdp2L, weisen keine signifikanten Unterschiede bezu��glich konservierter Dom��nen auf und zeigen keine Unterschiede hinsichtlich der Induktion von Zielgenen oder der pathogenen Entwicklung. Die Proteinvarianten sind damit als Nebenprodukte der Verwendung von zwei unterschiedlichen entwicklungsabh��ngigen Promotoren zu interpretieren. Die Verwendung alternativer Promotoren wurde genomweit analysiert und konnte bei weiteren pathogenit��tsrelevanten Genen identifiziert werden. Dies liefert Hinweise auf eine stadienspezifische Regulation dieser Gene w��hrend der Transition von saprophytischer zu biotropher Phase von U. maydis und wird von den Hauptregulatoren Rbf1, Hdp2 und Biz1 ma��geblich kontrolliert. Die entwicklungsspezifische Regulation besitzt dabei eine ��hnlichkeit mit der in h��heren Eukaryoten und ist ein Novum in Pilzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen wesentlich dazu bei, das Verst��ndnis fu��r den regulatorischen Aspekt der fru��hen biotrophen Phase und deren beteiligte Faktoren n��her zu erweitern, wodurch neue Anhaltspunkte fu��r anschlie��ende Untersuchungen der pathogenen Entwicklung von U. maydis erlangt werden konnten.

Der Basidiomyzet Ustilago maydis besitzt einen dimorphen Lebenszyklus, bei dem sexuelle und pathogene Entwicklung eng miteinander verknüpft sind und in Verbindung mit der Wirtspflanze Mais ablaufen. Die komplexen Entwicklungsveränderungen müssen streng reguliert werden und erfordern die Integration verschiedenster Signalwege. Der Wechsel von hefeartigem, saprophytischem Wachstum zur Ausbildung des pathogenen dikaryotischen Filaments wird durch ein eng verbundenes Netzwerk aus Transkriptionsfaktoren kontrolliert. Dieses Netzwerk integriert die Pheromon-Perzeption zweier kompatibler Sporidien, wodurch die Zellfusion ermöglicht wird, sowie den anschließenden Beginn der biotrophen Entwicklung durch die Bildung des heterodimeren bE/bW-Transkriptionsfaktorkomplexes. Das bE/bW-Heterodimer löst eine Regulationskaskade aus, die maßgeblich vom Master-Regulator Rbf1 gesteuert wird. Während der Pflanzenpenetration wird die Funktion beider Proteine durch die Wechselwirkung mit Clp1 gehemmt; zu einem späteren Zeitpunkt ist die Expression des "Hauptreglers" Rbf1 nicht mehr nachweisbar. Die b-Kaskade wird weitestgehend reprimiert. Die Expression von bE/bW allein reicht aus, um eine pathogene Entwicklung auszulösen. Die ektopische Expression von Rbf1 löst die initialen Schritte der pathogenen Entwicklung aus. Das betont die zentrale Rolle beider Faktoren. Durch eine Kombination von RNA- und ChIP-Seq Analysen konnte ich die komplexe Kontrolle von Genen durch bE/bW, Rbf1 und Hdp1 während des Übergangs zur pathogenen Entwicklung zeigen. Sowohl Promotor-Bindung als auch Expressionsdaten zeigen eine komplexe Kontrolle durch bE/bW-Rbf1 und Hdp1-Rbf1 Interaktion und damit verbundene kombinatorische DNA-Bindung. Hdp1 beeinflusst sowohl die prf1- als auch die b-Expression und reagiert sowohl auf Pheromon-Signale als auch auf die Zellfusion und verbindet die b-Kaskade weiter mit dem über Prf1 gesteuerten Pheromon-Signalweg. Die beiden für die Pflanzeninfektion essentiellen Transkriptionsfaktoren Biz1 und Hdp2 übernehmen zu einem späteren Zeitpunkt die zentrale Funktion von Rbf1. Ustilago maydis verwendet unterschiedliche kombinatorisch wirkende Regulatoren um die verschiedenen Signale vor und nach der Infektion der Pflanze zu integrieren und/oder zu differenzieren. Das transkriptionelle Netzwerk, das die Transition von saprophytischem zu biotrophem Wachstum reguliert, ist hierarchisch aufgebaut und lässt sich in Entwicklungsstadium-abhängige Module aufgliedern, die ihrerseits wiederum hierarchisch gegliedert sind. Aufeinanderfolgende Wellen von Transkriptionsfaktoren regulieren gemeinsam die kritischen Veränderungen die mit der Lebensweise von Ustilago maydis einhergehen. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit der Grundstein für ein CrisprCas basiertes System zur Anreicherung spezifischer DNA-Bereiche mit assoziierten Molekülen gelegt werden. In weiterführenden Experimenten, bei denen die „gene centered“ Analyse von DNA-bindenen Proteinen im Vordergrund steht, wird es möglich sein, weitere Knotenpunkte des Netzwerks zu identifizieren und darüber hinaus die Integration von essentiellen pflanzenspezifischen Signalen zu verstehen.

Die häufigste Leukämieform im Kindesalter, mit einem Anteil von ca. 80% ist die akute lymphoblastische Leukämie (ALL). Bei ca.75% der ALL im Kindes- und Jugendalter werden chromosomale Aberrationen numerischer oder struktureller Art, wie z.B. Translokationen, Inversionen oder Deletionen nachgewiesen. Die am häufigsten vorkommende Translokation t(12;21)(p13;q22) mit einem Anteil von ca. 25% resultiert in der Bildung des chimären Transkriptionsfaktors ETV6/RUNX1. Die Transkriptionsfaktoren ETV6 und RUNX1 sind elementare Regulatoren der Hä-matopoese. Deren Fusionsprodukt ETV6/RUNX1 interferiert entscheidend mit dieser Regulation und bewirkt eine veränderte Funktion der hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren ETV6 und RUNX1, die in der Struktur des Fusionsproteins begründet ist. Zum jetzigen Zeitpunkt geht man davon aus, dass ETV6/RUNX1 mit dem endogenen RUNX1 um dieselben Promotorbereiche ihrer Zielgene konkurriert und dass das N-terminal im Fusionsprotein gelegene ETV6 Co-Repressoren wie z.B. N-CoR, mSin3A und Histondeacetylasen (HDAC) rekrutiert. Die Rekrutierung dieser Co-Repressoren führt zu einer Kondensation der Chromatinstruktur und somit zu einer Repression der Zielgene. Dies bedeutet, dass die Expression von ETV6/RUNX1 v.a. eine Inaktivierung von Genen bewirkt, die normalerweise durch RUNX1 aktiviert werden. Verschiedene Studien im Mausmodell, mit eineiigen Zwillingen und retrospektive Studien mit Nabelschnurblut von Neugeborenen zeigten u.a. dass die Bildung des Fusionsgens ETV6/RUNX1 den initialen Schritt in der Pathogenese ETV6/RUNX1-positiver ALL dar (first hit) darstellt („Greaves-Hypothese“). Für die Ausbildung einer klinisch manifesten Leukämie sind jedoch weitere genetische Veränderungen, sogenannte second hits notwendig. Ein solcher second hit kann z.B. die Deletion des zweiten endogenen ETV6-Allels sein, die besonders häufig in ETV6/RUNX1 positiven ALL gefunden wird. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, zur Aufklärung dieser molekularen Mechanis-men durch die genomweite Identifizierung von DNA-Bindungsstellen und damit von Zielgenen des chimären Transkriptionsfaktors ETV6/RUNX1 und deren Einordnung in die zellulären Prozesse beizutragen, die letztendlich zur Ausprägung der Leukämie führen. Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wurden ChIP-Seq-Analysen von etablierten ETV6/RUNX1 positiven humanen Prä-B Leukämie-Zelllinien REH und UoC-B6 sowie von primären ALL-Blasten aus Knochenmarkproben von Kindern (ALL_#1 und ALL_#2) mit ETV6/RUNX1 positiven ALL durchgeführt um potenzielle ETV6/RUNX1 Zielgene zu identifizieren. Die Chromatin-Immunpräzipitation ist eine sensitive und spezifische Methode zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Proteinen und DNA. Gegenüber herkömmlichen Genexpressionsanalysen hat die ChIP den entscheidenden Vorteil, dass durch die Anwendung spezifischer Antikörper und anschließender Sequenzierung regulatorische Elemente der DNA, wie z.B. Promotoren, direkt untersucht und Zielregionen bzw. potenzielle Zielgene von Transkriptionsfaktoren identifiziert werden können. Für das Gelingen der ChIP wurden die Versuchsbedingungen optimiert. Dazu gehörten die Bestimmung der optimalen Zellzahl pro Ansatz, der Art und Dauer der Fixierung sowie die Evaluation geeigneter ETV6 und RUNX1 Antikörper. Unter diesen für die ChIP-Seq optimierten Bedingungen wurden mit den ETV6/RUNX1 positiven humanen Prä-B Leukämie-Zelllinien REH und UoC-B6 sowie mit den ETV6/RUNX1 positiven ALL-Blasten aus dem KM von Kindern (ALL_#1 und ALL_#2) 935 potenzielle proteincodierende ETV6/RUNX1 Zielgene (Kerngenset), identifiziert. Durch die Zuordnung dieses Kerngensets zu biologischen Prozessen bzw. Signalwegen wurden 23 Signalwege identifiziert, die statistisch signifikant überrepräsentiert sind (p-value, The most common form of leukemia in childhood, accounting for about 80% of all forms, is acute lymphoblastic leukemia (ALL). Chromosomal aberrations of a numeri-cal or structural type, e.g. translocations, inversions or deletions, are found in around 75% of cases of ALL in childhood and adolescence. The most common translocation t(12;21)(p13;q22), with a share of around 25%, results in the formation of the chimeric transcription factor ETV6/RUNX1. The transcription factors ETV6 and RUNX1 are elementary regulators of hemato-poiesis. Their fusion product ETV6/RUNX1 interferes decisively with this regulation and the structure of the fusion protein leads to a change in the function of the hematopoietic transcription factors ETV6 and RUNX1. It is currently assumed that ETV6/RUNX1 competes with the endogenous RUNX1 for the same promoter regions of their target genes and that the N-terminal recruits ETV6 co-repressors located in the fusion protein such as N-CoR, mSin3A, and histone deacetylases (HDAC). The recruitment of these co-repressors leads to condensation of the chromatin structure and thus to repression of the target genes. This means that ETV6/RUNX1 expression chiefly causes the inactivation of genes that are normally activated by RUNX. Different studies of a mouse model, with monozygotic twins, and retrospective stu-dies with umbilical cord blood of newborns show among other things that the formation of the fusion gene ETV6/RUNX1 is the initial step (first hit) in the pathogenesis of ETV6/RUNX1-positive ALL (“Greave’s hypothesis”). However, additional genetic changes, known as second hits, are necessary for the development of clinically manifest leukemia. One of these second hits can be the deletion of the second endogenous ETV6 allele, for example, which is found particularly frequently in ETV6/RUNX1-positive ALL. The objective of this doctoral thesis was to contribute to the explanation of these molecular mechanisms through the genome-wide identification of DNA binding sites and thus of target genes of the chimeric transcription factor ETV6/RUNX1 and its integration into cellular processes that ultimately lead to the manifestation of leukemia. To address this question, ChIP-Seq analyses of established ETV6/RUNX1-positive human pre-B leukemia cell lines REH and UoC-B6 and of primary ALL blasts from bone marrow samples from children (ALL_#1 and ALL_#2) with ETV6/RUNX1-positive ALL were conducted to identify potential ETV6/RUNX1 target genes. Chromatin immunoprecipitation is a sensitive and specific method for examining the interactions between proteins and DNA. Compared with conventional gene expression analyses, ChIP has the decisive advantage that by using specific antibodies and subsequent sequencing, regulatory elements of DNA such as promoters are examined directly and target regions and potential target genes of transcription factors can be identified. The test conditions were optimized to ensure the success of ChIP, including determination of the optimized cell count per batch, the type and duration of fixation, and the evaluation of suitable ETV6 and RUNX1 antibodies. Under these conditions optimized for ChIP-Seq, 935 potential protein-coding ETV6/RUNX1 target genes (core gene set) were identified with the ETV6/RUNX1 positive human pre-B leukemia cell lines REH and UoC-B6 and with the ETV6/RUNX1 positive ALL blasts from the bone marrow of children (ALL_#1 and ALL_#2). By allocating this core gene set to biological processes or signaling pathways, 23 signaling pathways were identified that are statistically significantly over-represented (p

Zur Analyse der Genregulation durch die Bindungen von Transkriptionsfaktoren an DNA, wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) für Gewebe in der Biene etabliert. Hierbei konnte durch gezielte Optimierung, bei gleicher Effizienz der CHIP-Methode, die Menge des notwendigen Gewebes um den Faktor 10 bis 50 reduziert werden. An den Creb- und Jun-like-Promotoren wurden Trankriptionsfaktor-Bindungsstellen (TFBS) identifiziert und die Funktionalität der Methode demonstriert. Für den weitergehenden Einsatz der ChIP-Methode wurden Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor Creb für die Biene hergestellt. Die Anwendung der ChIP-Methode in Verbindung mit der Hochdurchsatzsequenzierung (ChIP-seq) liefert erste Hinweise auf genomweite Bindungsstellen des Activating-Transcription-Factor-2 (Atf-2) in neuronalen Zellen des Bienengehirns. Die Untersuchungen von TFBS aus der ChIP-seq und der Korrelation mit der mRNA Expression zeigen, dass für aussagekräftige Erklärungen zur genomweiten Genregulation, Experimente in einem viel größerem Maßstab notwendig sind. Die Grundlagen für solche zukünftigen Untersuchungen an kleinen Gewebeproben sind jetzt durch diese Arbeit geschaffen. In this work a chromatin immunoprecipitation (ChIP) has been developed first time for brain tissue of the honey bee to examine the regulation of genes by the binding of transcription factors to DNA. The optimized ChIP protocoll enables experiments with very low amounts of tissue. Using ChIP, transcription factor binding sites (TFBS) at the promoters of the Creb and Jun-like genes were identified and the functionality of this method demonstrated. To broaden the application of the ChIP technique, honeybee Creb antibodies were developed. Combining the ChIP technique with high throughput sequencing (ChIP-seq) indicates genome wide distribution of binding sites of the activating transcription factor 2 (Atf-2) in neuronal cells of the honeybee brain. The performed low number experiments of transcription factor binding and the correlation to mRNA expression demands for extensive ChIP-seq experiments on a broad scale to get significant results. The foundation for these further studies is presented in this dissertation.