Search

Die Psoriasis stellt als chronisch entz��ndliche Hauterkrankung Betroffene und Behandler*innen vor besondere Herausforderungen. Psoriatische Keratinozyten sind hyperproliferativ und weisen ein Differenzierungsdefizit auf. Neben systemischen bestehen auch topische Therapieoptionen. Das glykosidierte Phospholipid Inositol-C2-PAF k��nnte sich f��r die topische Behandlung der Erkrankung eignen. In auf der immortalisierten Keratinozytenzelllinie HaCaT basierenden in vitro-Modellen konnten antiproliferative und differenzierungsf��rdernde Effekte des Wirkstoffes nachgewiesen werden. Bei murinen in vivo-Versuchen wurde die psoriatische Krankheitsaktivit��t signifikant reduziert. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Erkenntnisse auf prim��re humane Keratinozyten und Fibroblasten erweitert werden. Daf��r wurden aus Pr��putien isolierte Zellen in 2D-Monokulturen mit aufsteigenden Konzentrationen des Wirkstoffes behandelt. Der Einfluss auf die metabolische Aktivit��t der Zellen wurde mit dem MTT-Assay und der Effekt auf die Proteinmasse mit dem SRB-Assay gemessen. Au��erdem wurde eine von der Firma InSphero bereitgestellte, aus humanen prim��ren Keratinozyten und Fibroblasten bestehende 3D-Kokultur charakterisiert. Durch die Gabe des proinflammatorischen, psoriasisrelevanten Zytokins TNF�� wurde dieses 3D-Modell in einen entz��ndlichen Zustand versetzt. Mit Hilfe der Immunfluoreszenzanalyse wurde der Einfluss von Inositol-C2-PAF auf den Differenzierungsprozess der Keratinozyten unter entz��ndlichen und nicht-entz��ndlichen Bedingungen anhand der terminalen Differenzierungsmarker Keratin 1 und Filaggrin bestimmt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Wirkstoff mit steigender Inkubationszeit eine steigende Potenz in der Hemmung der metabolischen Aktivit��t und der Proteinmasse aufweist. Dabei deutete sich an, dass die Proteinmasse bei niedrigeren Konzentrationen des Wirkstoffes gehemmt wird als die metabolische Aktivit��t. Dar��ber hinaus zeigte sich, dass Fibroblasten mit einer drei- bis f��nffach erh��hten IC50 eine deutlich geringere Sensitivit��t gegen��ber dem Wirkstoff aufweisen als Keratinozyten. Bei den Fibroblasten konnte die metabolische Aktivit��t in niedrigen Konzentrations-bereichen induziert werden. Das 3D-Kokultur-Modell lie�� sich als ad��quates Hautmodell mit einem dermalen und einem epidermalen Anteil charakterisieren. Die Epidermis zeigte einen mehrschichtigen Aufbau mit Zunahme des Differenzierungsgrades in den h��heren Schichten. Es ist jedoch nicht gelungen, die Kultur mit TNF�� psoriasoform inflammatorisch zu ver��ndern. Der Effekt von Inositol-C2-PAF auf die Kultur war durch eine Erh��hung der Differenzierungsmarker Keratin 1 und Filaggrin gekennzeichnet., As a chronic inflammatory skin disease, the psoriasis poses challenges to both patients and practitioners. Psoriatic keratinocytes are hyperproliferative and exhibit a deficit in differentiation. There are topical as well as systemic therapies available. The glycosidated phospholipid Inositol-C2-PAF may be suitable for topical treatment of the disease. In vitro-models based on the immortalized keratinocyte cell line HaCaT demonstrated antiproliferative and differentiation-promoting effects of the compound. In murine in vivo-experiments the psoriatic disease activity was significantly reduced. In this work, these findings were extended to primary human keratinocytes and fibroblasts. Cells isolated from foreskin were grown in 2D-monocultures and were treated in the presence of increasing concentrations of the drug. To measure the effect on the metabolic activity of the cells the MTT-assay was used. The influence on the protein mass was determined using the SRB-assay. In addition, a 3D-coculture consisting of human primary keratinocytes and fibroblasts provided by InSphero was characterized. The administration of the proinflammatory and psoriasis-relevant cytokine TNF�� induced an inflammatory state in the 3D-model. Immunofluorescence analysis of two different markers of terminal keratinocyte differentiation, keratin 1 and filaggrin, was used to determine the influence of Inositol-C2-PAF on the differentiation process under inflammatory and non-inflammatory conditions. In this work, the compound showed an increasing potency in inhibiting the metabolic activity and the protein mass in a time-dependent manner. The protein mass was inhibited at lower concentrations than the metabolic activity. In addition, fibroblasts had a significantly lower sensitivity to the drug than keratinocytes which resulted in a three- to fivefold increase of their IC50. The metabolic activity of fibroblasts was induced at low concentrations of the compound. The 3D-coculture model was characterized as an adequate skin model with a dermal and an epidermal portion. The epidermis showed a multilayered structure with an increase in the degree of differentiation in the higher layers. However, TNF�� failed to induce psoriasis-like inflammatory changes in the culture. Inositol-C2-PAF induced the differentiation markers keratin 1 and filaggrin.

Endothelzell-basierte Therapien vermitteln regenerative Effekte hinsichtlich der Revaskularisierung von ischämischen Geweben. Doch ist die Verfügbarkeit von autologen Endothelzellen aufgrund einer krankheitsbedingt reduzierten Frequenz im peripheren Blut oder einer verminderten Integrität der endogenen Endothelzell-Populationen eingeschränkt. Hingegen ist es möglich, allogene endotheliale Vorläuferzellen aus der Nabelschnur in zelltherapeutisch relevanten Mengen zu isolieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Eigenschaften allogener humaner Nabelschnur (NS)-abgeleiteter sog. Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) mit denen von venösen NS-abgeleiteten Endothelzellen verglichen. Aufgrund der nachgewiesenen Immunogenität von allogenen ECFCs wurde eine weiterführende Strategie zur Reduktion dieser immunogenen Eigenschaften durch die Koapplikation mit Mesenchymalen Vorläuferzellen (MSCs) verfolgt. Humane ECFCs wurden mit MSCs desselben Spenders kombiniert und in funktionellen in vitro- und in vivo-Assays untersucht. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass IFNγ-stimulierte ECFC/MSC-Kokulturen eine reduzierte Expression von HLA-Molekülen zeigen. Entsprechend induzierten spezifische CD8+ T-Zellen eine reduzierte Lyse der kokultivierten ECFCs und MSCs. Die Kokultur von ECFCs und MSCs mit allogenen Immunzellen führte zu einer nahezu vollständigen Inhibition der T-Zell-Proliferation. Um die reduzierte Immunogenität von ECFC und MSC in vivo zu verifizieren, wurden die Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert, welche nachfolgend mit humanen PBMCs rekonstituiert wurden. So konnte nachgewiesen werden, dass die Koapplikation von ECFCs und MSCs nicht nur die Entstehung von stabilen Gefäßnetzwerken begünstigt, sondern zudem in den Transplantaten zu einer verringerten Immunzell-Infiltration führte. Die Koapplikation von ECFCs mit MSCs könnte daher eine klinische Nutzung dieser allogenen Quelle für die therapeutische Unterstützung der Vaskularisierung ermöglichen., Endothelial cell-based therapies promote tissue regeneration and vascularization after ischemic damage. The availability of autologous endothelial progenitor cells is restricted in diseased patients, however therapeutically relevant numbers of allogeneic Endothelial Progenitor Cells can be isolated from an umbilical cord (UC). In the present study, the immunogenic properties of these Endothelial Colony Forming Cells (ECFCs) were first compared to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Both cytokine-treated endothelial cells induced CD4+ and CD8+ T cell proliferation after coculture with allogeneic immune cells. So far, the potential interactions between ECFCs and Mesenchymal Stem/Progenitor Cells (MSCs) concerning their immunological features is poorly understood, but we hypothesize that MSCs might improve the immune compatibility and vessel building characteristics of ECFCs. Therefore, human UC-derived ECFC and MSC cocultures from the same donor were analyzed using various functional in vitro and in vivo assays. Stimulation of these cocultures with IFNγ caused strongly reduced expression levels of HLA-molecules compared to ECFC monocultures. The decreased molecular density on the cocultured ECFCs resulted in reduced cytotoxic CD8+ T cell-mediated lysis. Further, during IFNγ stimulation, the combination of ECFCs with MSCs prevented initiation of allogeneic T cell proliferation. To verify this concept in vivo, ECFCs and MSCs were co-transplanted in a humanized allograft mouse model in immunodeficient mice in order to effectively induce stable microvessels. These experiments demonstrate that when MSCs are co-applied with ECFCs, they not only support the formation of stable blood vessels, but also lead to fewer HLA-DR+ human vascular structures and fewer infiltrating human leukocytes. The data presented indicate that crosstalk between UC-derived ECFCs and MSCs might lower the risk of allogeneic ECFC rejection.

Die Erfassung von Morphologie und Bewegung sowie mono- und heterotypischer Interaktionen kultivierter Zellen stellt einen wichtigen Aspekt der medizinischen Forschung dar. Mikroskopische Zeitrafferaufnahmen können Aufschluss über das Verhalten von Zellen in vitro geben, und werden insbesondere bei Fragestellungen zur Zellmotilität und Zell-Zell-Interaktion herangezogen. Eine parallele mikroskopische Beobachtung mehrerer Zellpopulationen bei gleichzeitiger Kontrolle der Versuchsparameter stellt allerdings weiterhin eine Herausforderung dar. Besonders kontinuierlich betriebene Bioreaktoren erfüllen die dafür nötigen Voraussetzungen. In der vorliegenden Arbeit wurden hohlfaserbasierte, mikroskopierbare Bioreaktoren in ein System zur Langzeitkultivierung von Zellen eingebunden. Durch Einsatz bezüglich Temperatur, pH und pO2 getrennt regelbarer Perfusionskreisläufe sowie der Kombination eines piezoelektrischen Mikroskoptischs mit einer steuerbaren Kamera können die Bioreaktoren einzeln adressiert werden. Dies ermöglicht die cinemikrographische Analyse von Zellen unter variierbaren Bedingungen. Das System wurde auf Robustheit getestet und im Folgenden in Experimenten zu Zellverhalten und -interaktion angewendet. Die parallele Analyse von beliebig wählbaren Bereichen in einem oder mehreren Reaktoren ermöglicht die Anwendung in Kokulturexperimenten. Das Reaktordesign wurde angepasst, um Ziel- und Feederzellen in indirekter Kokultur zu beobachten und mit der Monokultur zu vergleichen. Das Konzept der „connected co-culture“ wurde anhand von primären parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen überprüft., The analysis of morphology and motility as well as mono- and heterotypic interactions of cultured cells is an important aspect of biomedical research. Microscopic time-lapse imaging can give insights into cell behaviour in vitro, especially in the context of cell motility and cell-cell interactions. However, microscopic analysis of higher numbers of distinct cell populations while maintaining homogenous culture conditions is challenging. Continuously perfused bioreactors meet the requirements for exact control of process parameters. In this study, hollow-fibre based bioreactors were integrated into a system for long-term microscopic observation of cultured cells. Distinct perfusion loops and a combination of a piezo-electric microscope stage with a digital camera allowed the control and observation of individual bioreactors, thus enabling cinemicrographic analysis of cells under user defined conditions. The system was characterized regarding perfusion and process control and was subsequently applied in studies on cell behaviour in vitro. The analysis of user defined regions of interest in parallel made the system applicable for co-culture experiments. The design of the reactors des was modified to allow indirect co-culturing of feeder- and target cells. As proof- of-concept, primary parenchymal and non-parenchymal liver cells were analysed in connected co-culture.

Ein Lebewesen ist auf die Entwicklung eines Blutgefäßsystems angewiesen, wenn seine Größe die Versorgung der Zellen mit Sauerstoff und Metaboliten zur Energiegewinnung durch Diffusion von der Oberfläche nicht mehr suffizient zulässt. Angiogenese, das Aussprossen neuer Blutgefäße aus bereits Bestehenden, nimmt dabei eine zentrale Rolle ein. Sie hat ihren Stellenwert nicht nur in der Organentwicklung, sondern ist auch im adulten Organismus präsent z.B. bei Wundheilung, Infektabwehr und dem weiblichen Zyklus, aber auch bei pathologischem Gefäßwachstum wie es bei malignen Tumoren oder der Frühgeborenen-Retinopathie beobachtet wird. Endothelzellen sind die zentralen Protagonisten der Angiogenese, murale Zellen (glatte Muskelzellen und Fibroblasten) haben ebenfalls Einfluss auf Gefäßwachstum und Homöostase. Die Angiogenese der Lungengefäße unterliegt möglicherweise einer besonderen Regulation. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung pulmonaler Angiogenese in vitro an primären humanen pulmonalen Endothelzellen allein und im Verband mit pulmonalen glatten Muskelzellen. Folgende Ziele wurden definiert: 1. Etablierung und Charakterisierung eines in vitro Sphäroidmodells der Angiogenese humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen allein und in Kokultur mit humanen pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen, welches angiogenes Aussprossen in einer dreidimensionalen Gelmatrix ermöglicht. 2. Quantifizierung der Angiogenese des Späroidmodells unter Einsatz validierter angiogener Faktoren. 3. Vergleich der Angiogenese von Endothel-Monokultursphäroiden und Endothel-Glattmuskelzell Kokultursphäroiden. 4. Vergleich der Angiogenese systemischer mikrovaskulärer Endothelzellen und pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen. Das Sphäroidmodell wurde als zuverlässiger und gut reproduzierbarer in vitro Assay etabliert. Die Quantifizierung der angiogenen Endothelsprossen erfolgte mittels eines mikroskopischen Video-Imaging Systems und selbst erstellter Software semi-automatisiert. Die kapillaren Sprossen im dreidimensionalen Gel wurden immunhistologisch als Endothelzellen bzw. Endothelzellen mit peripheren, stabilisierenden glatten Muskelzellen charakterisiert. Es zeigte sich hierbei eine gute Analogie zur in vivo Angiogenese.Humane pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen zeigten sowohl Spontanangiogenese als auch Wachstumsfaktor -induzierte Angiogenese (VEGF, bFGF, TGF-beta). Die zelluläre Interaktion von pulmonalen Endothelzellen und glatten Muskelzellen veränderte die in vitro Angiogenese. Die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese der Kokultursphäroide aus Endothelzellen und Glattmuskelzellen war reduziert gegenüber der der Endothel-Monokultursphäroide. Des Weiteren wurde ein signifikant stärkerer angiogener Effekt von TGF-beta bei durch VEGF- bzw. bFGF- stimulierten Kokultursphäroiden als bei ebenso stimulierten Monokultursphäroiden beobachtet. Damit konnte die Interaktion von Endothelzellen und glatten Muskelzellen bei der Angiogenese einem bestimmten Wachstumsfaktor zugeordnet werden. Ein Unterschied der in vitro Angiogenese systemischer und pulmonaler Endothelzellen zeigte sich nicht. Die Herauslösung der Endothelzellen aus dem gesamten Organverband könnte hierfür ursächlich sein, weiterführende Untersuchungen in dieser Richtung sind notwendig um Organ-abhängige Unterschiede der Angiogenese zu zeigen. Zusammenfassend ist es gelungen, ein Sphäroidmodell zur Untersuchung pulmonaler Angiogenese in vitro zu etablieren, und eine Basischarakterisierung dieses Modells vorzunehmen., An organism becomes dependent on the development of a vascular system when its size constricts sufficient supply of the cells with oxygen and metabolites by diffusion. Angiogenesis, i.e. the sprouting of new vessels from existing vasculature, is a central mechanism in organ development and repair. It was not only shown to be important for organogenesis, but it is prevailing in adult organisms for example in wound healing, immune defense and the female cycle but also in pathologic vessel growth, malignancies and the retinopathy of prematurity. Endothelial cells play a central role in angiogenesis but other vascular cells (smooth muscle cells and fibroblasts) also influence vessel growth and homeostasis. Potentially, angiogenesis of pulmonary vessels is differentially regulated compared to vessels of the systemic circulation. The Aim of this study was the investigation of pulmonary angiogenesis in vitro using pulmonary endothelial cells alone and in association with smooth muscle cells. The following aims were addressed: 1.) Establishment and characterization of an in vitro spheroid-model for angiogenesis of human pulmonary microvascular endothelial cells alone and in coculture with human pulmonary artery smooth muscle cells, which allows angiogenic sprouting in a three-dimensional gel matrix. 2.) Quantification of the angiogenic response in the spheroid model using validated angiogenic growth factors. 3.) Comparison of the angiogenesis of endothelial cell monoculture-spheroids and endothelial-smooth muscle cell coculture-spheroids. 4.) Comparison of the angiogenesis of systemic microvascular endothelial cells and pulmonary microvascular endothelial cells. The spheroid model was established as a reliable and well reproducible in vitro assay. Quantification of angiogenic endothelial sprouting was performed in a semi-automatic manner using a microscopic imaging system and customized software. Capillary sprouts in the three-dimensional gel matrix were immunohistologycally characzerized and consisted of endothelial cells or endothelial cells with peripherally located, stabilizing smooth muscle cells, showing good similarity to in vivo angiogenesis. Human pulmonary microvascular endothelial cells underwent spontaneous angiogenesis as well as growth factor-induced angiogenesis (VEGF, bFGF, TGF-beta) in this model. The cellular interactions of pulmonary endothelial cells and smooth muscle cells influenced the in vitro angiogenesis: growth factor-induced angiogenesis of coculture-spheroids composed of endothelial cells and smooth muscle cells was reduced in comparison to pure endothelial cell spheroids. Furthermore, a significantly stronger angiogenic effect of TGF-beta on VEGF- and bFGF-stimulated coculture-spheroids than on analogically stimulated monoculture-spheroids was observed. This finding suggested intercellular interactions between endothelial cells and smooth muscle cells that regulate angiogenesis in response to TGF-ß. A significant difference of angiogenesis bewteen systemic and pulmonary endothelial cells could not be detected. Extraction of the endothelial cells out of their original environment may be causative for this. To address organ-dependent differences in angiogenesis, further studies will be necessary. Summarizing, this study documents the successful establishment and fundamental characterization of a spheroid model to investigate pulmonary angiogenesis in vitro.