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Die kontinuierliche Fermentation von Aceton-Butanol-Ethanol (ABE) in einer R��hrkesselkaskade ergab einen stabilen, mehr als 1000 Stunden andauernden Fermentationsprozess mit konstanter L��sungsmittelproduktion. Die zwei Phasen des Stoffwechsels von Clostridium acetobutylicum wurden dabei in den sechs Reaktoren der R��hrkesselkaskade r��umlich voneinander getrennt. Durch die Regelung unterschiedlicher pH-Werte im ersten Bioreaktor (pH1) zwischen 5,6 und 4,3 und durch die ��nderung der kaskadenbezogenen Verd��nnungsraten von D = 0,042 h-1 auf D = 0,092 h-1 wurden Beobachtungen des Fermentationsprozesses in der R��hrkesselkaskade durchgef��hrt und Daten f��r die Erstellung eines mathematischen Modells f��r die Beschreibung von Fermentationsprozessen in der R��hrkesselkaskade generiert. In Fermentationen mit pH1 4,3 wurden h��here kaskadenbezogene Butanol- und L��sungsmittelkonzentrationen cBut bzw. cLM erreicht. Bei der Betrachtung der R��hrkesselkaskade mit sechs Bioreaktoren f��hrte eine Erh��hung der Verd��nnungsrate D zur Steigerung der Butanol- und L��sungsmittelbildungsraten qBut bzw. qLM. Die Zugabe von Acetat in das Medium und die R��ckf��hrung der Fermentationsbr��he aus dem vierten in den zweiten Bioreaktor zeigten einen positiven Effekt des Acetats auf die L��sungsmittelbildung, aber keine Vorteile der R��ckf��hrung in Bezug auf die L��sungsmittelproduktivit��t in der R��hrkesselkaskade. Die h��chsten kaskadenbezogenen Konzentrationen und Bildungsraten wurden bei pH1 4,3 h-1 und D = 0,042 h-1 bei der Betrachtung der drei ersten Bioreaktoren der R��hrkesselkaskade erreicht. Die maximalen Butanol- und L��sungsmittelkonzentrationen betrugen cBut 9,7 gL-1 bzw. cLM 13,6 gL-1 und die Butanol- und L��sungsmittelbildungsraten qBut 0,81 g(Lh)-1 bzw. qLM 1,14 g(Lh)-1 bei vollst��ndigem Substratverbrauch. Die Parametrisierung des mathematischen Modells f��r die Simulationen von Fermentationsprozessen in der R��hrkesselkaskade erm��glichte entsprechende Simulationen, die hohe ��bereinstimmungen mit den experimentellen Daten aufwiesen. Die Simulationsergebnisse in Bezug auf eine positive Auswirkung der Acetatzugabe auf die L��sungsmittelbildung und eine R��ckf��hrung mit einem vernachl��ssigbar geringen positiven Effekt auf die L��sungsmittelbildung wurden durch die Fermentationsergebnisse best��tigt., Continuous acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation in a stirred tank cascade resulted in a stable fermentation process lasting over 1,000 hours with constant solvent production. The two phases of the metabolism of Clostridium acetobutylicum were spatially separated in the six reactors of the stirred tank cascade. By regulating the pH in the first bioreactor (pH1) between 5.6 and 4.3 and changing the cascade-related dilution rates from D = 0.042 h���1 to D = 0.092 h���1, the fermentation process in the stirred tank cascade was observed, and the data for creating a mathematical model for describing fermentation processes in the stirred tank cascade were generated. In fermentations at pH1 4.3, higher cascade-related butanol and solvent concentrations cBut and cLM were achieved. For the stirred tank cascade of six bioreactors, an increase in the dilution rate D led to an increase in the butanol and solvent formation rates, qBut and qLM. Adding acetate to the medium and returning the fermentation broth from the fourth to the second bioreactor showed a positive effect of the acetate on solvent formation and no advantages of returning the fermentation broth in terms of solvent productivity in the stirred tank cascade. The highest cascade-related concentrations and formation rates were achieved at pH1 4.3 h���1 and D = 0.042 h���1 for the first three bioreactors of the stirred tank cascade. The maximum butanol and solvent concentrations were cBut = 9.7 g L���1 and cLM = 13.6 g L���1, and the butanol and solvent formation rates were qBut = 0.81 g (L h)���1 and qLM = 1.14 g (L h)���1 at full substrate consumption. Parameterizing the mathematical model for simulating the fermentation processes in the stirred tank cascade enabled simulations of fermentation processes with high agreement with the experimental data. The fermentation results confirmed simulation results relating to a positive effect of adding acetates on solvent formation and returning the fermentation broth with a negligible positive effect on solvent formation.

Clostridium acetobutylicum is an anaerobic Gram-positive, endospore-forming bacterium and is able to ferment a wide variety of sugars into the solvents acetone and butanol. In this study an analysis of the influence of the regulator proteins AdcS and AdcR on solvent formation was performed. The AdcR binding site was determined in the promoter region of the adcR/adcS operon as well as in the promoter region of the adc operon and the sol operon using footprint assays. A comparison of the AdcR binding site of the operons allowed the identification of a consensus sequence (ATATTTTCATATAAAT) in the promoter region of the adcR/adcS. In growth experiments with recombinant strains of C. acetobutylicum harbouring the genes adcS and adcR on plasmids in sense and antisense orientation, both proteins showed a distinct media dependency. In CG medium, AdcS seems to be an activator, whereas in MES medium it seems to be a repressor of the acetone and butanol production. AdcR seems to be a repressor of the acetone and butanol production in CG medium. In MES medium, AdcR seems to be an activator of the butanol production. In MES medium with glycerol, both proteins repressed the adhE2-dependent butanol production. The effect of the aldehyde ferredoxin oxidoreductase (Aor) on solvent formation was investigated. The aor overexpression and antisense RNA-based downregulation of aor led to a reduced production of acetone and butanol, whereas the aor deletion mutant produced no solvents and a complementation could not restore solvent production to wildtype level. In order to find differences in the transcription of operons, which are involved in solvent formation in the strain C. acetobutylicum delta aor, Northern blot analyses were performed. The analyses indicated a repressed transcription of the adc and the sol operon in the strain C. acetobutylicum delta aor in comparison to the wildtype stain. The transcription of the bdhB operon was not affected.

The hypothermophilic archaeon H. butylicus showed no butanol production after growth experiments. Also, no butanol production was observed after modification of growth conditions and after using a H. butylicus strain from a different source of supply. Thus, H. butylicus is not a butanol-producing archaeon and there is no alternative butanol synthesis pathway present. In this study, a small regulatory RNA of C. acetobutylicum has been described in detail for the first time. The sRNA SolB, which is involved in regulation of the solvent production in C. acetobutylicum, was characterized with respect to the transcript length and the transcription start point. The secondary structure of SolB was deduced from the sequence displaying a putative mRNA binding motif. Some experiments emphasize the correctness of the putative binding motif, but the ultimate evidence still has to be provided. "In silico" analysis with the small regulatory RNA SolB and the genome of C. acetobutylicum predicted a binding of SolB at the RBS of the mRNA of Spo0A (CA_C2071) and AdhE2 (CA_P0035). In both cases, the putative binding motif was involved in the binding. In order to find potential target mRNAs of SolB, proteome comparisons after two-dimensional gel electrophoresis were carried out with the strains C. acetobutylicum wildtype and C. acetobutylicum solB overexpression mutant. The comparisons revealed no apparent difference in the protein synthesis of the two strains. Thus, there were no indications of possible targets of SolB. The characterization of different overexpression and/or integration mutants of C. acetobutylicum regarding solvent production after growth in different media confirmed the mRNAs of Spo0A and AdhE2 as potential targets of SolB. The RNA-RNA band shift experiments using SolB and its possible targets did not result in any retardation. Thus, it still has to be proven whether the mRNAs of Spo0A and AdhE2 ar targets of SolB.

Clostridium acetobutylicum ist ein anaerobes, stäbchenförmiges Bakterium, welches in der Lage ist Sporen zu bilden. Es zeichnet sich vor allem durch seinen biphasischen Gärungsstoffwechsel aus. So werden in der ersten Phase der acidogenen Wachstumsphase hauptsächlich die Säuren Acetat und Butyrat gebildet. Aufgrund der für die Zelle toxischen pH-Absenkung werden diese in der zweiten Phase der acidogenen Wacshtumsphase zum Teil wieder aufgenommen und in die Lösungsmittel Aceton und Butanol umgewandelt. Das adc-Operon codiert für die Acetacetat-Decarboxylase, welche den letzten Schritt in der Acetonsynthese von Acetacetat zu Aceton katalysiert. Durch die Bindung von Spo0A an die Spo0A-Bindestelle im Promoterbereich des adc-Operons wird dessen Transkription aktiviert. Die in einem Operon lokalisierten Proteine AdcR und AdcS stellen vermutlich ebenfalls Regulatoren des adc-Operons dar. Die heterologüberexprimierten Proteine AdcR und Spo0A zeigen eine Bindung sowohl an den Promoterbereich des adc- als auch des adcR/adcS-Operons. Eine AdcR-Bindestelle wurde 151 Bp stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts des adcR/adcS-Operons über Footprint-Experimente identifiziert. Eine Integrationsmutante des Gens adcS zeigt in Wachstumsvesuchen sowohl beim Wachstum auf Glucose als auch auf Glucose mit Glycerin kein verändertes Wachstum und Produktspektrum im Vergleich zum Wildtyp. Transkriptionsstudien der Gene adcR und adcS zeigen während des Wachstums in einer batch Kultur keine Regulation. Während des Wachstums in einer kontinuierlichen Kultur zeigt sich eine deutliche Induktion dieser beiden Gene in der acidogenen Wachstumsphase.

Clostridien bieten einen alternativen und vielversprechenden Therapieansatz, um Krebserkrankungen zu bekämpfen. Rekombinante Sporen können intravenös appliziert werden, keimen nur im hypoxischen Bereich des Tumorgewebes aus und ermöglichen so eine gezielte Abgabe von Wirkstoffen gegen den Tumor. Das C. perfringens Enterotoxin CPE führt durch Bindung an Claudin-4-Rezeptoren, welche im Pankreaskarzinomgewebe bis zu 1000fach überexprimiert werden, zur Lyse der Krebszelle. Für die Anwendung in der Krebstherapie kommt C. perfringens auf Grund seiner pathogenen Eigenschaften nicht in Frage. Da dieser das Toxin nur sporulationsabhängig produziert, muss das Toxin für den Transport durch die Cytoplasmamembran in den gewählten apathogenen Stämmen (C. acetobutylicum bzw. C. sporogenes) an ein Signalpeptid gekoppelt werden. Es sollte ein Expressionssystem entwickelt werden, welches die Verwendung von E. coli als Zwischenwirt erlaubt. Gleichzeitig sollte das System für den Einsatz in der Krebstherapie dahingehend optimiert werden, dass eine ausreichende Konzentration an CPE produziert und auch sezerniert wird.

Für die gentechnische Veränderung von acetogenen Bakterien, wie Clostridium ljungdahlii, Acetobakterium woodii oder Clostridium aceticum, wurde eine Transformationsmethode entwickelt. Durch Überexpression der Gene, welche für die Acetat-Kinase und die Phosphotransacetylase, bzw. der Gene, welche für die Formyl-THF-Synthetase, die Methenyl-THF-Cyclohydrolase, die Methylen-THF-Dehydrogenase und die Methylen-THF-Reduktase des Wood-Ljungdahl-Wegs kodieren, konnte die Acetatproduktion dieser Organismen bei Wachstum auf CO2/H2 gesteigert werden. Durch Inaktivierung der Gene hbd (3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase) oder crt (Crotonase) in C. acetobutylicum wurde eine erhöhte Ethanolproduktion nachgewiesen. Durch die Inaktivierung des Gens hbd konnte eine Steigerung in der Acetatproduktion beobachtet werden. Eine Überexpression der Gene thlA (Thiolase A) und ctfA/B (Acetacetyl-CoA: Acetat/Butyrat-CoA-Transferase) in der hbd-Integrationsmutante führte ebenfalls zu einer Steigerung in der Acetatproduktion. Die Expression des Gens für die Acetoinreduktase aus C. beijerinkcii in C. acetobutylicum WT bzw. der hbd-Integrationsmutante führte zur Produktion von 2,3-Butandiol.

Saccharolytic clostridia produce a wide range of industrially relevant substances which explains their intensive exploration concerning biotechnological applications. Besides butyric and acetic acid and the organic solvents butanol and acetone molecular hydrogen is one of the major fermentation products of these obligate anaerobic organisms. Many clostridia applied for biological hydrogen production are still not characterised genetically. The profitable biotechnological production of hydrogen, especially as an alternative energy carrier still affords the enhancement of product yields as well as volumetric productivities. Besides technical process optimisations genetically engineered production strains may be a promising option. An organism often applied for biological hydrogen production is C. butyricum. To further characterise this organism several genes coding for enzymes of the energy metabolism were cloned by genome walk. The activity of the [FeFe]-hydrogenase could be demonstrated by its coexpression with the corresponding maturation proteins in E. coli BL21(DE3). Furthermore Thiolase was purified by affinity chromatography and its biochemical and kinetic properties were determined. The physiological condensation of acetyl-CoA was measured applying a coupled enzymatic assay where beta-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase from the same organism was used as the second enzyme. As all biosynthetic thiolases the native enzyme from C. butyricum forms homotetramers in solution and its kinetic characteristics were comparable to the ones from closely related enzymes. Sequence analysis of the cryptic plasmid pCB101 from C. butyricum revealed the gene coding for the bacteriocin butyricin 7423. It was expressed as a fusion protein in E. coli and its activity was confirmed by plate diffusion assays employing the purified protein. The bacteriocin exhibited activity only on clostridia and several Bacillus species. Gelfiltration revealed that the protein forms large soluble aggregates and for further biochemical characterisation its isoelectric point was determined. To optimise the biological hydrogen production of C. acetobutylicum genetically modified strains were developed. The genes coding for the [FeFe]-hydrogenases from C. butyricum and C. acetobutylicum were cloned into a suitable shuttle-vector and C. acetobutylicum was transformed with the constructed vectors by electroporation. The recombinant strains were subjected to fermentations and plasmids as well as the corresponding transcripts could be detected in withdrawn cell samples. The overexpression of the plasmid encoded endogenous hydrogenase was verified by western blot analysis and determination of the specific enzyme activities whereas the expression of the C. butyricum hydrogenase was rather low. Fermentation patterns of the recombinant strains did not show any alteration at several applied conditions. The hydrogen yields and productivities were comparable to those of the control strains indicating that the cells’ hydrogenase concentrations are not limiting for the biotechnological hydrogen production. Another strategy involved the construction of shuttle-vectors for the expression of antisense-RNAs (asRNAs) targeting the transcript of the C. acetobutylicum biosynthetic thiolase to alter the organic acid ratios and therefore influence the produced hydrogen yields. Again no alteration of the fermentation pattern could be observed although the corresponding transcripts could be detected specifically in cells derived from the conducted fermentations. In all cases the cellular specific thiolase activities were reduced drastically compared to those of the control strains. Therefore the reduction of the intracellular thiolase concentration does not directly influence the organism’s metabolism. In summary no optimisation of the biological hydrogen production of C. acetobutylicum could be achieved by means of metabolic engineering.

Das Bakterium C. acetobutylicum ist ein Gram-positives, anaerobes Stäbchen und zur Endosporenbildung befähigt. Es zeichnet sich außerdem durch einen charakteristischen zweiphasigen Gärungsstoffwechsel aus. In der exponentiellen Wachstumsphase werden zuckerhaltige Substrate vor allem in die organischen Säuren Acetat und Butyrat umgesetzt (acidogene Phase). In der stationären Phase des Wachstums werden dann die Lösungsmittel Aceton und Butanol gebildet, wobei ein Teil der zuvor gebildeten Säuren wieder aufgenommen wird (solventogene Phase). Der Wechsel von acidogener zu solventogener Phase wird als Lösungsmittel-„shift“ bezeichnet und durch eine Reihe von Faktoren ausgelöst. Dazu zählen hauptsächlich ein niedriger pH-Wert, eine Phosphatlimitierung und hohe Substratkonzentration sowie die Anwesenheit von Butyrat im Medium, wobei bis heute keinem der Faktoren eine Schlüsselrolle zugeordnet werden konnte. Die essentielle Transkriptionseinheit der Lösungsmittelbildung ist das sol-Operon. Vorausgehende Studien zeigten, dass bei der Regulation des sol-Operons neben dem Transkriptionsfaktor Spo0A noch ein weiterer unbekannter Regulator (bisher SolA genannt) eine Rolle spielen könnte. Der Schwerpunkt der Arbeit war die Charakterisierung zweier potentieller SolA-Kandidaten – der globalen Regulatoren CcpA und CodY. Mit verschiedenen molekularbiologischen Methoden wurde die Interaktion mit dem Promoterbereich des sol-Operons untersucht und der Einfluss von „sense“- und „antisense“-Konstrukten sowie von codY-Integrationsmutationen auf die Lösungsmittelproduktion beschrieben.

The DNA-binding protein Spo0A is the master regulator for initiation of sporulation in Bacillus subtilis, which is also the case in Clostridium acetobutylicum. Radioactive primer extension experiments revealed two different transcription start poits for spo0A in C. acetobutylicum. Like in B. subtilis the activity of the two start points are depending on the growth phase. The signal S1 allowed to identify a clear sA-dependent -10- and -35-sequence. A sH-dependent -10- and -35-promoter sequence can be postulated from the other signal S3. But in C. acetobutylicum there does not exist the known promoter switching from B. subtilis. The second transcription start point is active only awhile in the stationary phase. It seems that the transcription of spo0A from this start point allows the organism to increase the amount of spo0A transcript momentarily over a critical level, so sporulation can be initiated in due time. Upstream of the clostridial spo0A gene two imperfect palindromic sequences were identified. Closer inspections showed an overlapping of this sequences with potential binding sites of the repressor protein AbrB. Binding of AbrB at the promoter region of spo0A could mean an additional control and very precise regulation of spo0A expression before initiation of sporulation. As a member of the response regulator family of transcription factors Spo0A must be activated by phosphorylation, which is mediated by a phosphorelay consisting of multiple orphan histidin kinases and two phosphorelay proteins, Spo0F and Spo0B in B. subtilis. Clostridia do not contain components of the so-called phosphorelay, with the exception of the transcription factor Spo0A. Overexpression of potential Spo0A phosphorylating orphan histidine kinases of C. acetobutylicum was not successful with the exception of the kinase encoded by CAC0437. Furthermore, the ClosTron® Gene Knockout System was used as an alternative method to identify the kinase responsible for Spo0A phosphorylation.

Clostridium acetobutylicum ist ein Gram-positives, strikt anaerobes, endosporenbildendes Bodenbakterium, das sich durch einen biphasischen Stoffwechsel auszeichnet. Zuckerhaltige Substrate werden in der exponentiellen Phase des Wachstums zunächst zu den Säuren Acetat und Butyrat umgesetzt. In der stationären Phase des Wachstums werden hauptsächlich die Lösungsmittel Aceton und Butanol gebildet, wobei die Säuren teilweise wieder aufgenommen werden. Die Promoterregionen der Transkriptionseinheiten sol- und adc-Operon sind die Hauptangriffsstellen der Regulationsvorgänge der Lösungsmittelbildung, woran auch DNA-bindende Proteine beteiligt sind. Spo0A als globaler Transkriptionsregulator stellt ein solches Protein dar und ist an der Regulation der Transkription des sol- und des adc-Operons beteiligt. An der Regulation des adc-Operons, das für eine Acetacetat-Decarboxylase kodiert, die den letzten Schritt der Acetonbildung katalysiert, sind weiterhin die beiden Proteine AdcR und AdcS beteiligt. Die zugehörigen Gene bilden ein Operon, das auf dem Megaplasmid pSOL1 lokalisiert ist, und dessen Transkription durch den globalen Transkriptionsregulator Spo0A reguliert wird. Die Wirkung der beiden Proteine AdcR und AdcS auf die Lösungsmittelbildung ist entgegengesetzt: AdcR reprimiert und AdcS aktiviert die Bildung von Aceton. Wie die beiden Proteine ihre Wirkung auf den Promoterbereich des adc-Operons ausüben, ist noch nicht bis ins Detail geklärt, jedoch gilt als sicher, dass das AdcR-Protein über sein N-terminal lokalisiertes helix-turn-helix-Motiv an die Promoterregion des adc-Gens bindet, wobei eine Bindung an eine dort lokalisierte palindromische Sequenz angenommen werden kann. Die Bindung des Proteins AdcS erfolgt, wenn überhaupt, erst bei einer sehr viel höheren Proteinkonzentration, wobei im Fall einer DNA-Bindung über eine Bindung an ein Heptamermotiv im Promoterbereich des adc-Gens spekuliert werden kann.

Für die Etablierung eines induzierbaren Systems in Clostridien im Zuge eines Ansatzes der Anti-Tumor-Therapie wurde ein regulativer Genbereich des lux-Operons aus V. fischeri verwendet. Um die Induzierbarkeit durch Homoserin-Lacton überprüfen zu können, wurden Reportergenexperimente in E. coli und C. acetobutylicum durchgeführt. Dabei konnte in E. coli prinzipiell induzierbares Verhalten festgestellt werden, in C. acetobutylicum war keine Induktion der eingesetzten Reportergene nach Zugabe von Homoserin-Lacton nachweisbar. Für das eingesetzte Reportergen lucB konnte in C. acetobutylicum der Transkriptionsstartpunkt unter induzierten Bedingungen bestimmt werden. Ausgehend von dem innerhalb des lucB-Gens liegenden Transkriptionsstartpunkt konnte eine potentielle Promoterstruktur einschließlich möglicher "lux-box" abgeleitet werden, die möglicherweise Eigenschaften eines induzierbaren Genbereichs besitzt. In beiden eingesetzten C. sporogenes-Stämmen NCIMB10696 und M55 konnte der spo0A-Genbereich mit einer Größe von ca. 2,5 kBp sequenziert werden. In "primer extension"-Experimenten konnte der Transkriptionsstartpunkt von spo0A in C. sporogenes bestimmt werden. Sequenzvergleiche des abgeleiteten spo0A-Promoterbereichs aus C. sporogenes mit spo0A-Promoterstrukturen anderer Clostridien (C. acetobutylicum, C. botulinum, C. perfringens und C. tetani) lieferten Hinweise auf konservierte Promoterstrukturen des spo0A-Gens innerhalb der Clostridien.