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Einleitung: Perifosin ist ein Alkylphospholipid und Inhibitor des in vielen Tumoren aktivierten PI3K/Akt/mTOR Signalweges. Aufgrund seines günstigen Toxizitätsprofils wurde Perifosin in den letzten Jahren im Rahmen von klinischen Studien bezüglich seiner Wirksamkeit gegen verschiedene Krebserkrankungen untersucht. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, größere Einblicke in die in vitro Wirkungsweisen von Perifosin, Bortezomib, Lenalidomid und Adriamycin auf hämatopoetische Progenitorzellen gesunder Spender zu erhalten. Ein weiteres Anliegen war es, die in vitro Wirkungsweisen sowie Zytotoxizität von Perifosin, Bortezomib und Lenalidomid als Einzelsubstanzen und in ausgewählten Kombinationen gegenüber Zelllinien, die hämatologisch-malignen Erkrankungen entstammten, zu untersuchen. Es sollten neue Optionen für Behandlungsschemata mit Perifosin für zukünftige klinische Studien angeregt werden. Methodik: Die Untersuchungen erfolgten an hämatopoetischen Progenitorzellen und malignen Zelllinien unter Einsatz klonogener CFU-Assays, von Trypanblaumessungen (Zellvitalitätsmessungen), Durchflusszytometrie (Apoptosemessungen), immunhistochemischer Verfahren (Caspase-3 und Ki-67) und der IMI-Technik (Hämatologie-Analysegerät XE-5000). Ergebnisse: Alle Wirkstoffe hemmten die CFU-Bildung. Perifosin inhibierte hauptsächlich CFU-GM, die anderen Wirkstoffe CFU-E. Perifosin in Kombination mit Lenalidomid oder Adriamycin zeigte antagonistische Effekte. Trotz ihrer CFU-hemmenden Wirkung erzeugten Perifosin, Bortezomib und Lenalidomid bei CD34+-selektierten hämatopoetischen Progenitorzellen nur eine moderate Zytotoxizität. Perifosin und Bortezomib zeigten konzentrations- und zeitabhängig bei allen getesteten Zelllinien zytotoxische Wirkungen und wiesen zusammen nach 24 Std. Inkubationszeit Additions- oder Synergieeffekte auf (Kombinationsindizes 1.13-0.22). Die durch Lenalidomid getriggerte Zytotoxizität war bei allen Zelllinien niedrig. Im IMI-Kanal erhöhte Perifosin im Gegensatz zu Bortezomib oder Lenalidomid signifikant die Zellzahl. Schlussfolgerungen: Perifosin, Bortezomib und Lenalidomid hemmten in vitro das klonogene Potential der hämatopoetischen Progenitorzellen gesunder Spender, obwohl bei Nagetieren Myelopoese-stimulierende Effekte ermittelt worden waren. Daher kann wahrscheinlich der Abschwächung von Neutropenien nach Wirkstoffgabe keine Bedeutung beigemessen werden. Allerdings inhibierten sie das klonogene Potential nur leicht und führten bei klinisch erreichbaren Plasmakonzentrationen zu einem moderaten Funktionsverlust der gewöhnlichen hämatopoetischen Progenitorzellen. Schlussfolgernd kann nach der Behandlung mit diesen Wirkstoffen von einer Beherrschbarkeit der Hämatotoxizität und dem Verbleib funktioneller hämatopoetischer Progenitorzellen ausgegangen werden. Perifosin und Bortezomib triggerten bei malignen Zelllinien im Gegensatz zu Lenalidomid überwiegend die Zytotoxizität und wirkten hauptsächlich additiv oder synergistisch. Mit der IMI-Technik könnte eine effektive Methode etabliert werden, um Apoptoseinduktion/-prozesse schneller analysieren und die Zytotoxizität von Wirkstoffen, die überwiegend an der Zellmembran interagieren, genauer untersuchen zu können. Trotz vielversprechender Ergebnisse im Labor und in Phase I/II Studien hat es Perifosin nach negativen Phase III Ergebnissen nicht zum klinischen Einsatz geschafft. Aktuell gibt es nur zwei registrierte klinische Studien. Bei hämatologischen Erkrankungen scheint Perifosin versagt zu haben. Es bleibt abzuwarten, wie sich neuere Alkylphospholipide behaupten., Introduction: Perifosine is an alkylphospholipid that inhibits the in many tumors activated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Perifosine has been subject to clinical studies investigating its efficacy against various cancer types due to its good tolerance. Aiming to gain greater insights into the in vitro modes of action of perifosine, bortezomib, lenalidomide and adriamycin on hematopoietic progenitors of healthy donors, further investigation of single substances as well as of their combinations against cell lines derived from hematological-malignant diseases has been conducted. Results could be used for developing new treatment scheme options with perifosine. Methods: Investigation was performed with hematopoietic progenitors and malignant cell lines using clonogenic CFU assays, trypan blue staining (measurements of cell vitality), flow cytometry (measurements of apoptosis), immunohistochemistry (caspase-3 and Ki-67) and the IMI-technique (hematology analyzer XE-5000). Results: All agents inhibited CFU formation. However, perifosine hindered primarily CFU-GM, the other agents retarded CFU-E formation. Perifosine combined with lenalidomide or adriamycin demonstrated antagonistic effects and suppressed the formation of CFU. Despite their CFU inhibiting effects perifosine, bortezomib and lenalidomide caused just moderate cytotoxicity using CD34+-selected hematopoietic progenitors. Perifosine and bortezomib revealed cytotoxic effects against all tested cell lines depending on concentration and time and jointly generated with combination indices ranging from 1.13 to 0.22 and efficacy rates between 25% and 75% after a 24 hrs incubation period synergy effects. Lenalidomide-induced cytotoxicity was low in all tested cell lines. Perifosine in contrast to bortezomib or lenalidomide increased cell numbers within the IMI-channel significantly. Conclusions: Perifosin, bortezomib and lenalidomide inhibited in vitro the clonogenic hematopoietic progenitor’s potential of healthy donors, even though myelopoiesis stimulating effects were previously observed in rodents. However, they inhibited clonogenic potential just slightly and resulted in clinically achievable plasma concentrations with a moderate loss of function of the common hematopoietic progenitors. In conclusion treatment with these agents is associated with controllable hematotoxicity and continuance of functional hematopoietic progenitors. Perifosin and bortezomib triggered with malignant cell lines primarily cytotoxicity and had additive or synergistic effects. Establishment of the IMI-technique could be a method for faster analysis of apoptosis induction/processes in order to investigate the cytotoxicity of agents interacting primarily at cell membranes. Despite promising laboratory and phase I/II study results Perifosine due to negative phase III results hasn´t achieved clinical use. Currently there are just two registered clinical trials ongoing. Perifosine seems to have failed with hematologic diseases. Investigation of alkylphospholipids needs to be awaited.

The severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV) is an emerging, highly pathogenic bunyavirus against which neither antivirals nor vaccines are available. The SFTSV glycoproteins, Gn and Gc, facilitate viral entry into host cells. Gn and Gc are generated from a precursor protein, Gn/Gc, but it is currently unknown how the precursor is converted into the single proteins and whether this process is required for viral infectivity. Employing a rhabdoviral pseudotyping system, we demonstrate that a predicted signal sequence at the N-terminus of Gc is required for Gn/Gc processing and viral infectivity while potential proprotein convertase cleavage sites in Gc are dispensable. Moreover, we show that expression of Gn or Gc alone is not sufficient for host cell entry while particles bearing both proteins are infectious, and we provide evidence that Gn facilitates Golgi transport and virion incorporation of Gc. Collectively, these results suggest that signal peptidase liberates mature Gc from the Gn/Gc precursor and that this process is essential for viral infectivity and thus constitutes a potential target for antiviral intervention. peerReviewed

In dieser Arbeit wurden unterschiedliche HDACi bezüglich ihrer histonacetylierenden und zytotoxischen Wirkung auf unterschiedliche ALL Zelllinien untersucht und charakterisiert. Als Methoden kamen dabei Zellkultur, Western Blot gegen acetyliertes Histon H4, durchflusszytometrische Apoptosemessung und Proliferationsanalyse mit Hilfe eines MTT Assays zum Einsatz. Durch die Auswahl der verwendeten, unterschiedlichen BCP-ALL Zelllinienentitäten konnte ein Großteil pädiatrischer ALL darstellt werden. Es konnte gezeigt werden, das alle von uns verwendeten HDACi an ALL Zelllinien eine zeit- und konzentrationsabhängige Histon H4- Hyperacetylierung, Apoptose und Proliferationsinhibition induzieren. Die ALL Zelllinien mit jeweils charakteristischen zytogenetischen Besonderheiten zeigten keine Unterschiede bezüglich Zytotoxizität und Histon H4-Hyperacetylierung. Weiterhin zeigten unsere Untersuchungen, dass die Histonhyperacetylierung zeitlich vor Beginn der Apoptose induziert wird. Dieses legt einen ursächlichen Zusammenhang zwischen der Histonhyperacetylierung und der in Folge auftretenden Proliferationsinhibition und Apoptoseinduktion bei Behandlung von ALL Zelllinien mit HDACi nahe. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse erscheint es daher möglich, eine direkte Assoziation zwischen Histonacetylierung und Apoptoseinduktion bzw. Proliferationsinhibition zu postulieren. Die Stärke der Zellzahlabnahme an ALL Zellen nach Behandlung mit HDACi ist dabei direkt proportional zur Stärke der Histon H4-Acetylierung. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen das vielversprechende Wirkungsprinzip der HDACi. Durch die Selektivität ihres apoptoseinduzierenden Effektes und ihre gute Verträglichkeit eröffnen die Substanzen die Perspektive für eine mögliche neue und potente Behandlungsoption im Rahmen der ALL- und ALL-Rezidiv-Therapie., Histone deacetylation is associated with transcriptional silencing. In many neoplasms, histone deacetylase inhibitors (HDACi) induce growth arrest, differentiation and apoptosis dependent on concentration and tumor type. However, the effect of HDACi on ALL cell lines has not been determined yet. After incubation of the ALL cell lines Reh, Nalm6, MHH, and Z33 with the HDACi SAHA, CBHA, Pyroxamide, and VPA, we determined apoptosis, proliferation, and histone acetylation by means of flow cytometry (annexin/propidium iodide staining), MTS assay, and western blotting (antibody against acetylated histone H4), respectively. We demonstrate that the HDACi induce a time- and concentration dependent apoptosis. Furthermore, we observed an accumulation of acetylated histone H4 in these cell lines. We conclude that HDACi might be new antitumor agents in childhood ALL.

Die Expression von Genen, die Zellwachstum und -proliferation regulieren, ist bei Krebserkrankungen verändert oder mutiert und führt zu unkontrollierter Zellzyklus-Progression. Zu den potentesten Wachstumsregulatoren zählen sowohl TGF-β1 als auch p21 und c-myc. TGF-β1 (Transforming Growth Factor beta 1) reguliert in Assoziation mit seinem Bindungsprotein sLTBP-4 (»short form« des Latent TGF-β Binding Protein 4), das als wichtigster Modulator der TGF-β1-Bioverfügbarkeit gilt, verschiedenste Funktionen in epithelialen Zellen, wobei seine antiproliferative und somit tumorsuppressive Wirkung eine Hauptfunktion darstellt. Ein Mangel an TGF-β1 führt sowohl zu einer reduzierten Expression des tumorsuppressiven CDKI (Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren) p21, als auch zu einer vermehrten Expression des Protoonkogens c-myc. Beide Mechanismen bedingen sich gegenseitig, sind somit prokanzerogen und induzieren eine verstärkte und ungehemmte Proliferation epithelialer Zellen. In einem in vitro-Modell mit der epithelialen Zelllinie HEK293T wurde in der vorliegenden Arbeit mittels quantitativer Expressionsanalyse untersucht, inwiefern p21 und c-myc in Zellen mit einer modulierten LTBP-4-Expression einer differentiellen Expression unterliegen. Ziel war hierbei das nähere Verständnis der Korrelation des TGF-β1-Bindungsproteins LTBP-4 mit dem CDKI p21 und dem Protoonkogen c-myc in der Karzinogenese epithelialer Zellen. Im Rahmen der molekularbiologischen Untersuchungen wurde zunächst das Genesilencing sowie die Überexpression des sLTBP-4-Gens in HEK293T-Zellen etabliert. Die Ergebnisse der proteinbiochemischen Untersuchungen ergänzten auf qualitativer Basis den molekularbiologischen, quantitativen Nachweis einer erfolgreichen sLTBP-4-Überexpression in HEK293T Zellen. In diesen Zellen wurde das sL4-V5-Fusionsprotein regelmäßig detektiert, was eine erfolgreiche Translation dokumentiert. In den folgenden qPCR-Analysen unterlagen die Gene TGF-β1, p21 und c-myc im vorliegenden in vitro - Modell des sLTBP-4-knock-down entgegen den Erwartungen keiner Expressionsregulation. In sLTBP-4-überexprimierten Zellen wurde eine vermehrte Genexpression von TGF-β1 und p21 sowie eine verminderte c-myc-Expression wie erwartet festgestellt. Die Ergebnisse zeigen somit eine Wechselbeziehung der untersuchten Zielgene im sLTBP-4-Überexpressionsmodell und verdeutlichen deren Expressionskorrelation in der Karzinogenese epithelialer Tumoren., The expression of genes regulating cell growth and proliferation, such as TGF-β1, p21, and c-myc, can be altered or modified in the process of carcinogenesis in epithelial tumors and therefore results in uncontrolled cell cycle progression. TGF-β1 (transforming growth factor beta 1) in association to its binding protein sLTBP-4 (»short form« of latent TGF-β binding protein 4) which is an important modulator of TGF-β1-bioavailability regulates different functions in epithelial cells. Its antiproliferative and therefore tumorsuppressive effects represent a major cellular function. A reduced availability of TGF-β1 results in reduced expression of tumorsuppressive CDKI`s (cyclin dependent kinase inhibitors), in particular p21, as well as in augmented expression of protooncogenes, in particular c-myc. Both mechanisms depend on each other, are procancerogenic and induce enhanced and unarrested proliferation of epithelial cells. In the present project it was analyzed using an in vitro model with the epithelial cell line HEK293T, wether p21 and c-myc in cells with altered LTBP-4-expression undergo a differential expression pattern themselves. The aim of this project was to get a closer insight into the correlation of the TGF-β binding protein LTBP-4 with the CDKI p21 and the protooncogene c-myc during the carcinogenic process of epithelial cells. Gene silencing as well as transient overexpression of the sLTBP-4-gene in HEK293T cells was established under in vitro conditions. The quantitative molecular biological proof of sLTBP-4 overexpression in HEK293T cells through qPCR inquisition was supported by western blot analysis. These proteinbiochemical investigations completed the qPCR survey on a qualitative basis. The sL4-V5 fusion protein was regularly detected, which documents a successful translation. The following qPCR analysis showed contrary to the expectations that there was no regulation of expression of the genes TGF-β1, p21, and c-myc in the model of sLTBP-4-knock-down. Further on it was expected to detect an enhanced gene expression of TGF-β1 and p21, as well as a reduced expression of c-myc in sLTBP-4-overexpressed cells. In this case the analysis showed an upregulation of TGF-β1- as well as p21-expression and a slightly reduced expression of the c-myc-gene. The results of this study indicate a correlation of the tested target genes in the model of sLTBP-4-overexpression and clarify their interdependency in the process of carcinogenesis in epithelial neoplasia.

Green chemicals should display no or little toxicity for men and environment. But how can it be guaranteed that new chemicals meet these requirements? A concept was developed to assess in a quick and easy way the hazard potential of a chemical already during the design of this chemical. This assessment is based on cellular and sub-cellular test systems. In a first step the overall potential of a set of chemicals to interact with biological structures is assessed based on the T-SAR concept (thinking in terms of structure-activity relationships) and on tests with cell cultures. In a second step, specific interaction potentials are assessed. Based on the results of the first step a set of sub cellular test systems for specific interactions with biological structures such as enzyme inhibition is selected (flexible test battery). Results of both steps are included in a hazard potential profile. The concept was applied for two case studies using two biocides and a set of ionic liquids. Results show, that the concept allows a first assessment of the hazard potential of a chemical. However further test systems for specific interaction potentials need to be included.

Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Lebenslauf Einleitung, Literaturübersicht Material und Methoden Ergebnisse Teil 1 Ergebnisse Teil 2 Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis, In dieser Arbeit wurden in vitro- und ex vivo- Untersuchungen zu viralen Infektionen des Trachealepithels des Pferdes und der dadurch ausgelösten Zytokinexpression durchgeführt. Hauptuntersuchungsgegenstand war eine im Institut für Veterinär-Pathologie etablierte Zellkultur aus equinem Trachealepithel (ET Zellen). Die ET Zellen wurden mit den equinen Herpesviren vom Typ 1, 2 und 4 (EHV-1, -2, -4), den equinen Rhinitisviren Perv und 350/72 (equines Rhinitis A Virus: ERAV) und P 1436/73 (equines Rhinitis B Virus: ERBV) sowie mit dem Vesikulären Stomatitisvirus (VSV) und dem Erreger der equinen Arteriitis (EAV) infiziert. Nach Erstinfektion wurden die Zellen zweimal passagiert und es wurden Wachstumskurven für diese Viren erstellt. Außer EHV-4 führten alle verwendeten Viren zu einer produktiven Infektion der ET Zellen. Für ERAV und ERBV ist damit bewiesen, auch die unteren Luftwege des Pferdes zu infizieren und pathogene Mechanismen auslösen zu können. Weiterhin ist die Vermutung über die Bedeutung von EHV-2 für respiratorische Erkrankungen des Pferdes untermauert worden. Interessanterweise kam es für EHV-4, den typischen Erreger der Rhinopneumonitis beim Pferd, nicht zu einer produktiven Infektion der ET Zellen. Möglicherweise handelt es sich um eine restringiert-persistente Infektion, dies muß in weiteren Untersuchungen erforscht werden. Anschließend wurde die Zytokinexpression durch die ET Zellen vor und nach Infektion mit EHV-1, -2, -4 sowie beiden Stämmen der ERAV bestimmt. Dazu wurde nach RNA Isolierung und darauffolgender Umschreibung in cDNA die erhaltene cDNA mit Hilfe zytokinspezifischer Primer vervielfältigt (RT-PCR). Es wurden die Primer für equines Interleukin (IL) -1a, -1b, -2, -4, -5, -6, -8, -10, -11, -13, Tumornekrosefaktor a (TNFa), Interferon g (IFNg) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonienstimulierender Faktor (GM-CSF) verwendet. Für die ET Zellen wurde eine Zytokinexpression für IL-1a, -1b, -6, -8, -10 und -11 nachgewiesen. Alle Zytokine wurden schon vor Infektion exprimiert. Nach viraler Infektion konnten Änderungen der Zytokinexpression beobachtet werden. Als ein wichtiges Ergebnis stellte sich heraus, daß beide ERAV deutlich die Zytokinexpression für IL-11 erhöhten. Bei der angewandten RT-PCR handelt es sich um einen qualitativen Nachweis, in weiteren Untersuchungen sollten zur besseren Auswertung auch quantitative Methoden zum Einsatz kommen. Um Aussagen über das Zytokinspektrum in den unteren Atemwegen der Pferde zu erhalten, wurden weiterhin von 15 Schlachtpferden Zellproben durch Abschaben der Trachea und ihrer Bifurkation mit dem Skalpell gewonnen. Dafür wurden Tracheen von Lungen ohne makroskopisch sichtbare pathologische Veränderungen ausgewählt. Es konnte mRNA für IL-8 (100% der Pferde), IL-2 (67%), IL-1b, -6, -10 (60%), IFNg (53%), IL-1a (20%) sowie für IL-11, TNFa und GM-CSF (13%) nachgewiesen werden. mRNA für IL-4, -5 und -13, welche kennzeichnend für Th2-Lymphozyten sind, konnte bei keinem der Pferde festgestellt werden. Das Vorkommen von IL-2 und IFNg bei einem Großteil der Pferde sowie das Fehlen von IL-4, -5 und -13 zeigen, daß bei Pferden ohne morphologische Veränderungen im Epithel der unteren Atemwege eine Th1-Immunlage vorzuherrschen scheint. Die Zellen von vier Pferden wurden nach der Gewinnung sofort mit EHV-1, -2 und -4 sowie mit den equinen Rhinitisviren infiziert. Hier zeigte sich interessanterweise, daß schon die Kultivierung der Zellen allein zu Änderungen in der Zytokinexpression führte. Aussagen über Änderungen der Zytokinexpression nach Infektion konnten ohne Quantifizierung nicht getroffen werden. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, daß dem equinen Trachealepithel aus immunologischer Sicht große Bedeutung für die Pathogenese respiratorischer Erkrankungen zugeschrieben werden kann und es Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten werden sollte., These studies were undertaken to explore the role of viral infection of the equine tracheal epithelium and virally induced cytokine expression. The main target was a cell culture obtained from equine tracheal epithelial cells (ET cells). The ET cell line was established in the institute for veterinary pathology. It is the second permanent cell line of equines achieved worldwide. ET cells were infected with equine herpesvirus type 1, 2 and 4 (EHV-1, -2, -4); equine rhinitis virus serotype A (strains Perv and 350/72) and serotype B (strain P 1436/73); vesicular stomatitis virus and with equine arteritis virus. After primary infection, the cells were passaged two times and growth kinetics were evaluated for all viruses. All viruses (except EHV-4) led to productive infection of ET cells. These findings confirm the ability of equine rhinitisviruses to infect the lower airways which should be investigated in following studies. Additionally, the results provide further evidence of the infectious potential of EHV-2 as a respiratory pathogen for the lower airways of the horse. Interestingly EHV-4 was not able to set up a productive infection cycle in ET cells. We presumed a restricted persistent infection which should be subject to further investigation. Virally induced expression of cytokines was determined by using the reverse transcription-polymerse chain reaction (RT-PCR). Total cellular RNA was extracted from ET cells, reverse transcripted in cDNA and amplified with cytokine specific primers for equine interleukin (IL) 1a, 1b, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 13, interferon gamma (IFNg), tumour necrosis factor alpha (TNFa) and granulocyte-macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF). ET cells expressed mRNA for IL 1a, 1b, 6, 8, 10 and 11. All cytokines could already be measured before infection, but viral infection led to changes in cytokine expression. An important result in this context is, that both equine rhinitis A viruses increased expression for IL 11. In following studies the use of RT-PCR should be combined with quantitative methods. To evaluate cytokine expression in the tracheal epithelium of the horse, tracheal tissue of 15 slaughtered horses without morphological changes in trachea and lungs were sampled. Cells were obtained by gentle scraping off the tracheal epithelium layer with a scalpel. mRNA for equine IL 8 (100% of the horses), IL 2 (67%), IL 1b, 6, 10 (60%), IFNg (53%), IL 1a (20%) and for IL 11, TNFa and GM-CSF (13%) could be detected. mRNA for IL 4, 5 and 13, which are characteristic for an immunreaction of the th2 phenotype was not found in any horse. In contrast, expression of mRNA for IL 2 and IFNg was present in most of the horses. This and the missing IL 4, 5 and 13 detection indicates a th1 phenotype in the tracheal epithelium of horses without morphological changes. Cells of four horses were infected immediately after scraping with EHV-1, -2 and -4 and with equine rhinitis viruses. Interestingly, culturing of cells alone led to changes in cytokine expression. Viral influence of cytokine expression could not be evaluated because of the lack of quantitative measurement. This work shows that the equine tracheal epithelium apparently plays a central role in immunological reactions in the pathogenesis of respiratory