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Die Integration von Enzymen für bioelektrochemische Anwendungen kann mithilfe von redoxaktiven Polymeren (RAPs) realisiert werden. Diese dienen als Immobilisierungsmatrix, um Biokatalysatoren auf leitfähigen Materialien zu stabilisieren, und als Kommunikationsmatrix, um Elektronen zwischen dem Enzym und der Elektrode zu übertragen. Das Formalpotential der RAPs muss dabei an das Redoxpotential des Enzyms angepasst werden. In dieser Arbeit wurde ein neuer Ansatz zur Feinabstimmung des Formalpotentials von RAPs unter Hinzunahme von Hofmeister-Salzen untersucht. Die Auswirkung der Salze auf den Solvatationszustand der RAPs führte zur Optimierung des Elektronentransfers in enzym/polymer-modifizierten Elektroden, wodurch u.a. die Sensitivität von Biosensoren für die Detektion von Nitrat und Phosphat im Bereich der Agrarwirtschaft gesteigert werden konnte.

Die begrenzten Testkapazitäten in Speziallaboren stellen einen limitierenden Faktor in der Bekämpfung einer Pandemie dar. Kann der Einsatz von Biosensoren dabei helfen, diese Kapazitäten zu vergrößern? Ein Lab-on-chip Ansatz wurde untersucht, der sowohl Quantifizierung von Nukleinsäure-Amplifizierung, als auch Schmelzkurvenanalyse von Amplifikaten ermöglicht. Dabei wurde die Methode der Schleifen-vermittelten, isothermalen Amplifizierung (LAMP) betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Prozess der Synthetisierung und der Denaturierung von Nukleinsäure mithilfe der Biosensoren gemessen werden kann. Die Integration geeigneter Komponenten im Biosensor erlaubt die Durchführung der benötigten Temperaturprofile für beide Prozesse. Die vorgestellte Methode beschreibt ein Lab-on-Chip-System für den Einsatz der Datenerhebung von quantifizierter LAMP und angehängter Schmelzkurvenanalyse und legt den Grundstein für ein miniaturisiertes und valides Point-of-care Nukleinsäure-Testinstrument. The capacity of centralized clinical diagnosis laboratories represents a significant limiting factor in the fight against a pandemic. Can these capacities be extended by the use of electrochemical biosensors? A lab-on-chip system was investigated that allows the execution a monitoring of nucleic acid amplification and melt curve analysis of the resulting products. Here in, the method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) was used. It is shown that the processes of synthetization and denaturation of cDNS can be measured by the applied biosensors. The integration of appropriate components inside the biosensor allows the conduction of the necessary thermal profiles for both processes. The presented method describes a lab-on-chip system for the application in quantitative LAMP and consecutive melt curve analysis and opens the way for the development of a miniaturized, high-valid point-of-care nucleic acid test device.

To understand the complex biochemistry and biophysics of biological systems, one needs to be able to monitor local concentrations of molecules, physical properties of macromolecular assemblies and activation status of signaling pathways, in real time, within single cells, and at high spatio-temporal resolution. Here we look at the tools that have been / are being / need to be provided by chemical biology to address these challenges. In particular, we highlight the utility of molecular probes that help to better measure mechanical forces and flux through key signalling pathways. Chemical biology can be used to both build biosensors to visualize, but also actuators to perturb biological processes. An emergent theme is the possibility to multiplex measurements of multiple cellular processes. Advances in microscopy automation now allow us to acquire datasets for 1000’s of cells. This produces high dimensional datasets that require computer vision approaches that automate image analysis. The high dimensionality of these datasets are often not immediately accessible to human intuition, and, similarly to ‘omics technologies, require statistical approaches for their exploitation. The field of biosensor imaging is therefore experiencing a multidisciplinary transition that will enable it to realize its full potential as a tool to provide a deeper appreciation of cell physiology.

Mit über 850 Arten ist die Gattung Allium eine der bekanntesten Gattungen. Insbesondere in der Untergattung Melanocrommyum wurden zahlreiche interessante Verbindungen isoliert. So wurde in A. stipitatum Pyridinyl-N-oxide gefunden; Marasmin, hauptsächlich aus südafrikanischen Tulbaghia-Arten bekannt, wurde aus A. suworowii isoliert. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Charakterisierung eines roten Pigments, dass von einigen Arten der Untergattung Melanocrommyum bei Gewebeschäden, durch Alliinasereaktion von Pyrrol-2-cysteinsulfoxid, gebildet wurde. Obwohl zwei Veröffentlichungen die Struktur und mögliche Substrate beschreiben, sind aufgrund früherer Ergebnisse des Arbeitskreis Keusgen konkrete Zweifel an der Korrektheit beider Strukturen aufgekommen. Das zweite Ziel war die Synthese dieser Verbindung sowie biosensorischer Messungen, um die Verbindung hinsichtlich ihrer Oxidationsempfindlichkeit und Polymerisationsneigung zu charakterisieren. Die dritte Komponente der Forschungsarbeit, die während der Promotion durchgeführt wurde, war die Entwicklung neuartiger Oberflächenmodifizierungsverfahren. Diese wurde hierbei stark durch die Gattung Allium, beziehungsweise die darin vorkommenden Naturstoffe wie Fructane und Pyrrolverbindungen, inspiriert. Kristallisationsexperimente des roten Farbstoffs zeigten, dass die zuvor veröffentlichten Strukturen nicht korrekt waren. Es wurde bestätigt, dass die Struktur vier „Pyrroleinheiten“ enthält, welche zwei Bipyrroleinheiten bilden, die ihrerseits durch Disulfidbrücken verbunden sind. Für das Zielmolekül wurde eine einfache Eintopfsynthese entwickelt, für die die Edukte gut zugänglich sind. Durch alkalische Hydrolyse und Disproportionierung von 2-Thiocyanatopyrrol wurde (biomimetisch) das Pyrrolyl-2-thiosulfinatopyrrol in geringen Konzentrationen gebildet, das nach mehreren Kondensationsschritten zum roten Farbstoff führte. Bei der Optimierung der Syntheseroute wurde eine Reaktion mehrerer 2-Thiocyanatopyrrole entdeckt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Hydrolyse drei verschiedener Thiocyanatopyrrole in alkoholischen Lösungsmitteln die S-alkylierten Produkte sowie Disulfide in akzeptablen Ausbeuten isolieren lassen. Für alle Substrate, die in alkalischen, alkoholischen Lösungsmitteln hydrolysiert wurden, konnten auch Carbonimidothioate nachgewiesen werden. Die Polymerisationsneigung von Pyrrolverbindungen führte zur einer Oberflächenmodifizierung mittels N-substituierten-Pyrrol / Pyrrol-Copolymeren. Oberflächen-Plasmon-Resonance- (SPR) –Studien dieser Oberflächen, zeigten einen hohen Grad an Kompatibilität mit bestehenden Protokollen. EDC / NHS-Aktivierung und kovalente Immobilisierung von Biomolekülen sowie adsorptive Methoden waren aufgrund der Vielseitigkeit dieser Methode möglich. Ein weiteres Merkmal der Copolymere war die hervorragende Bindungsaffinität für Polysaccharide wie Mannan. Die anschließende Immobilisierung unter Verwendung des in der Keusgen-Gruppe etablierten Fusionsproteins ConA-Sav, lieferte gute Bindungsraten. Eine Regeneration der Oberfläche unter Verwendung eines komplementären Monosaccharids (α-D-Methylmannopyranosid) war jedoch nur teilweise möglich. Die zweite Methode zur Darstellung neuartiger Oberflächen für biosensorische Anwendungen wurde unter Nutzung der natürlichen Affinität von BSA ((Rinderserumalbumin (BSA)) zu Goldsubstraten entwickelt, was zu einer Gold / BSA / Gold-Nanopartikel-(AuNP) Sandwich-Plattform führte. Tests unter Verwendung eines Antikörpers, der adsorptiv an die Oberfläche der Nanopartikel gebunden wurde, zeigten eine hohe Performance. Die Messungen waren hinsichtlich der Bindungsraten sowohl von BSA als auch Goldnanopartikeln reproduzierbar; Für die Anti-BSA-Deposition auf AuNP wurde ein linearer Zusammenhang zwischen Bindungsrate und Konzentration zwischen 15 µg / ml und 30 µg / ml erhalten. Schließlich wurde eine auf Polysacchariden basierende Oberflächenmodifikation unter Verwendung einiger allgemein verfügbarer Polysaccharide hergestellt: Inulin, Dextran, Arabinogalactan und Pullulan. Die Bindungsraten der verschiedenen modifizierten Glykane (Mercaptoanilin und Carboxymethyl modifiziert) wurden unter Verwendung der SPR bewertet. Sie ergaben unabhängig vom Durchschnittsgewicht der Glykane sehr ähnliche Ergebnisse, was auf eine horizontale statt einer vertikalen Bindung solcher Polyzucker schließen lässt. Die Schichten zeigten eine hohe Affinität für das ConA-Sav-Fusionsprotein und ermöglichten es dem EDC / NHS-Verfahren, beispielsweise BSA, zu immobilisieren und die Anti-BSA-Bindung bestätigte die erfolgreiche Immobilisierung. Obwohl diese Strategie unter Verwendung von modifizierten Glykanen zufriedenstellende Ergebnisse lieferte; sind weitere Forschungen zur Entwicklung eines Spacers zwischen Goldoberfläche und den Polysacchariden Bestandteil aktueller Forschung., With over 850 species, the genus Allium is one of the most prominent genera. Especially in the subgenus Melanocrommyum, numerous exciting compounds have been isolated. For example, noteworthy concentrations of pyridinyl-N-oxides were found in A. stipitatum; marasmin, known chiefly from South African Tulbaghia species, was found in A. suworowii. The aim of this work was the characterization of a red pigment produced by some species of the Melanocrommyum subgenus, upon tissue damage from allinase reaction of pyrrole-2-cysteine sulfoxide. Although two publications describe the structure and potential substrates, because of prior results of the Keusgen group, doubts have arisen concerning the correctness of both structures. The second target was the synthesis of this compound, along with biosensor measurements, to determine the response upon treatment with oxidation agents and subsequent polymerization. The third component of the research, conducted during the Ph.D. thesis, was the development of novel surface modification procedures inspired by the genus Allium, or, more precisely, its several natural products like fructans and pyrrole compounds. Crystallization experiments showed that the previously published structures for the red pigment are not correct. It was confirmed that the chemical structure contains four pyrrole moieties forming two bipyrrole units connected by disulfide bridges. Thus, the substance is closely related to porphyrins but shows a distinct step-like structure. A simple one-pot synthesis for the target molecule, involving easily to prepare educts, was developed. Alkaline hydrolysis of 2-thiocyanato-pyrrole was used to create a biomimetic synthesis yielding pyrrolyl-2-thiosulfinato-pyrrole in low concentrations, finally leading to the red pigment after several condensation steps. A novel reaction concerning several 2-thiocyanato-pyrroles was discovered during the optimization of the red pigment synthesis. It was shown that after hydrolysis of three different thiocyanato-pyrroles in alcoholic solvents, the S-alkylated products and disulfides could be isolated in acceptable yields. This reaction poses an alternative approach to non-N-substituted pyrrole thioethers. For all substrates that were hydrolyzed in alkaline alcoholic solvents, carbonimido-thioates were produced. Inspired by the tendency of pyrrole compounds to polymerize, a novel surface modification, involving N-substituted-pyrrole/pyrrole copolymers was developed. Surface-Plasmon-Resonance-(SPR)-studies conducted with these surfaces did show a high degree of compatibility with existing protocols. EDC/NHS- activation and covalent immobilization of biomolecules were possible due to the versatility of this method. Another trait of the copolymers was the excellent binding affinity for polysaccharides like man-nan. Polar- (carbonic acid) and unipolar- modified copolymers allowed the binding of mannan: the subsequent immobilization and use of the fusion protein ConA-Sav, which was established in the Keusgen group, was one of the primary targets and showed good results. Regeneration of the surface using a complimentary monosaccharide (α-D-methyl-mannopyranoside) was unfortunately only partially possible. The second method for biosensing SPR-surfaces was developed using the natural affinity of bovine serum albumin (BSA) to gold substrates, which led to a gold/BSA/gold nanoparticle-sandwich-platform. Tests, using an antibody bound adsorptively to the surface of the nanoparticles, did show high performance. The measurements were reproducible concerning the binding rates of BSA and gold nanoparticles; the binding-event of anti-BSA showed a linear relationship of binding rate and concentration between 15 µg/mL and 30 µg/mL. Lastly, a polysaccharide-based surface modification was established using some broadly available polysaccharides: inulin, dextran, arabinogalactan, and pullulan. The saccharides were successfully carboxymethylated and modified with 4-mercapto aniline to allow simple modification of gold-SPR-chips. The binding rates of the different modified glycans were evaluated using the SPR-technique. They produced highly similar results, regardless of the average weight of the glycans, suggesting a horizontal instead of a vertical binding of such poly sugars. The layers did show a high affinity for the ConA-Sav fusion protein and allowed EDC/NHS procedure to immobilize e.g., BSA, and anti-BSA binding confirmed successful immobilization. Although this strategy using modified glycans did provide satisfying results; more research is ongoing to develop a spacer between the gold surface and the polysaccharides.

An optochemical sensor concept is presented based on the transducing properties of near-surface indium gallium nitride quantum wells. In contrast to the established electrical read-out in chemical sensing, the photoluminescence response of group III-nitride quantum wells is applied as transducer signal. Oxidative and reductive adsorbates are studied with respect to their influence on spectrum and intensity of the quantum well photoluminescence. Indium gallium nitride quantum wells are positioned within the space charge region caused by the Fermi-level pinning at the semiconductor surface. Pronounced adsorbate-caused spectral shifts of the photoluminescence are observed which are attributed to changes of the near-surface electric field. Respectively, the quantum-confined Stark effect can be applied as transducer signal with sensitivity to the local electric field. A pronounced blue shift and a reduction of the photoluminescence intensity is observed in presence of oxygen for polar quantum wells. It is presumed that oxygen increases the near-surface band bending and weakens the internal piezo fields in these structures. Hence, the spectral blue shift of the photoluminescence can be attributed to a reduction of the quantum-confined Stark effect. In contrast, a spectral red shift is observed in presence of atomic hydrogen with a thin layer of platinum acting as a catalyst on the gallium nitride surface. Atomic hydrogen is found to reduce the near-surface band bending which corresponds to an increased quantum-confined Stark effect in polar quantum wells. The sensitivity of the transducers strongly depends on the chemical pre-treatment and oxidative state of the surface. Strongest sensitivity for oxygen is observed directly after thermal annealing. In order to enable local variations of ambient gases on the surface, an integration of the optical transducers in a microfluidic sensor structure is demonstrated. Transparent microfluidic channels are realized on the surface of polar indium gallium nitride quantum well structures using optical lithography. A reduction of the quantum well photoluminescence is observed and a tendency for a spectral blue shift in presence of oxygen. Additionally, semi-polar and non-polar quantum wells are investigated with respect to their spectral photoluminescence response to adsorbates. The spectral photoluminescence response is found to be strongly dependent on the polarity of the quantum wells. Adsorbate-caused spectral shifts of the photoluminescence are most pronounced for polar quantum wells with strong piezo fields present inside the quantum wells. The intrinsic piezoelectric field is expected to cause a strong pre-tilt of the polar quantum well band structure which leads to a higher sensitivity for variations of the externally induced electric field. Spectral shifts of the photoluminescence up to 25 meV are found for polar quantum wells in presence of oxygen. In comparison, reduced spectral shifts of less than 10 meV are observed for semi-polar structures, and almost vanishing spectral sensitivity for non-polar structures. Due to their high spectral sensitivity, polar quantum wells are considered as promising candidates for sensor structures based on the quantum-confined Stark effect. Optical biosensing is demonstrated using such polar indium gallium nitride quantum well structures. First investigations are performed with the iron storage molecule ferritin which exists with varying iron-load. Ferritin and apoferritin (corresponds to ferritin without iron-load) molecules are immobilized on the sensor surface. A significant spectral photoluminescence shift is found depending on the iron-load of the molecules. In presence of apoferritin a spectral red shift of approximately 13 meV is observed compared to the reference surface. In contrast, only a minor spectral blue shift of less than 2 meV is found for ferritin. Polar indium gallium nitride quantum wells are found to enable a new approach for sensing ferritin-bound iron as a potential biomarker in medical applications.

In dieser Arbeit wurde ein impedimetrischer Aptasensor zur Detektion von Staphylococcus aureus entwickelt. Dazu wurde ein Aptamer verwendet, das spezifisch an das auf der Oberfläche von Staphylococcus aureus vorkommen- de Protein A bindet. Das Aptamer wurde mit einem Alkanthiol modifiziert und mit Merkaptohexanol auf einer Goldelektrode ko-immobilisiert, wobei ei- ne Dichte von 2,41·10^12 Aptamere pro cm² erreicht werden konnte. Die Bin- dung von Protein A und vitalen Staphylococcus aureus an die immobilisierten Aptamere konnte mit der elektrochemischen Impedanzspektroskopie detektiert werden, wobei ein Anstieg der Impedanz gemessen wurde. Das Fitten der Spek- tren mit dem modifizierten Randles-Ersatzschaltbild ergab, dass sich allein der Ladungstransferwiderstand signifikant mit dem Anstieg der Analytkonzentra- tion ändert. Der impedimetrische Aptasensor zeigt ein Detektionslimit von 10 koloniebildenden Einheiten pro ml und eine scheinbare Dissoziationskon- stante von 111 ± 96 koloniebildenden Einheiten pro ml. Zudem weist der Sen- sor eine hohe Spezifität auf, da die Protein A-defizienten Bakterien Escherichia coli und Staphylococcus epidermidis nicht detektiert werden konnten. Es wurde ein Modell zur Bestimmung der Impedanz erstellt, basierend auf der Änderung der für den Ladungstransfer verfügbaren Fläche A(faraday). Die simulierten Kur- ven stimmen sehr gut mit den gemessenen Kurven überein, was beweist, dass die Behinderung des Ladungstransfers durch die Anbindung des Analyten die Ursache des Impedanzanstiegs ist. Trotz der Sättigung aller Bindungsstellen ist ein Ladungstransfer zu beobachten, was bedeutet, das durch die Anbin- dung des Analyten, der Ladungstransfer nicht komplett inhibiert wird. Die Diffusions- und Elektronentransferkonstanten für die Aptamer-modifizierten Elektroden sind niedriger als die für blanke Elektroden. Dass heißt, die Dif- fusion und der Ladungstransfer des Redoxmediators Kaliumhexacyanoferrat werden durch die immobilisierten Aptamere gehemmt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aptamere Defekte in die selbstorganisierende Monoschicht induzieren, welche wie Mikroelektroden fungieren. Diese Erkenntnisse können zukünftig zur Verbesserung des Designs der Oberfläche von impedimetrischen Aptasensoren genutzt werden.

Bei neovaskulären Krankheiten wie der altersassoziierten Makuladegeneration oder der diabetischen Retinopathie kommt es zu einer Überproduktion von VEGF im Bereich der Netzhaut. Durch Gefäßneubildungen oder erhöhte Exsudation kommt es zu Ablösungen der Netzhaut und zu massiven Einschränkungen des Sehvermögens. Die bisherige Therapie besteht unter anderem aus klonalen VEGF-Antikörpern, welche subretinal injiziert werden. Eine Messung der direkten Auswirkung und eine personalisierte Anpassung der Therapie ist dabei nicht möglich. Um einen neuen Biosensor zur VEGF-Messung im Auge nutzen zu können, war das Ziel der Arbeit daher eine Zelllinie zu etablieren, die kein eigenes VEGF produziert.Der Gen-Knockout des VEGF ist mithilfe des CRISPR-Cas9 Systems erfolgt. Dazu wurden mehrere guideRNAs erstellt, welche die Cas9 Endonuklease spezifisch zur richtigen Basensequenz im Genom führen soll. Nach Klonierung der Guides in ein Plasmid, welches für Cas9 codiert, und Kontrolle der Ausführung, zeigten drei Guides eine gute Aktivität im Test mit dem NHEJ-Sensor. Nach Optimierung der Transfektions- und Selektionsbedingungen für die ausgewählten ARPE-19 Zellen wurde die Transfektion mit diesen drei Guides in verschiedenen Kombinationen durchgeführt.Durch die Separation einzelner Zellklone wurden verschiedene Zelllinien etabliert, welche anschließend auf den erfolgreichen Gen-Knockout auf Proteinlevel kontrolliert wurden. Der dafür verwendete Sandwich-ELISA zeigte drei Zelllinien auf, bei denen das VEGF unter der Nachweisgrenze lag. Im Proliferationsassay zeigte sich keine Verminderung der Zellteilung im Vergleich mit den Wildtyp ARPE-19 Zellen.In folgenden Schritten gilt es nun den VEGF-Biosensor auf der Zellmembran dieser Zellen zu verankern und die Zellen im Bereich der Augenhintergrundes immobilisiert dauerhaft zu kultivieren. Dann kann durch die Zugabe des Luciferasesubstrats jederzeit die aktuelle VEGF-Konzentration gemessen werden und die Therapie entsprechend angepasst werden., Neovascular diseases like the age-related macular degeneration or the diabetic retinopathy come along with a pathological upregulation of VEGF in the area of the retina. The formation of new vessels and an increased exudation leads to a detachment of the retina and thereby to a loss of vision. Amongst others, the treatment of these diseases is composed of the subretinal injection of monoclonal antibodies targeting VEGF. A measurement of the direct impact and a personalized adjustment of the therapy is still not possible. The aim of this study was the creation of a cell line unable to express VEGF on its own, thereby allowing the use of a new biosensor detecting VEGF in the eye.The CRISPR-Cas9 system was used to knockout the VEGF gene. Several guideRNAs were designed to guide the endonuclease Cas9 to the target sequence within the genome. They were cloned in a plasmid which also contains the coding sequence for Cas9, checked for the correct integration and tested for their activity using a custom made NHEJ biosensor. Three of these guides showed high activity and were subsequently used for the knockout strategy. The conditions for transfection and selection of the used ARPE-19 cells were optimized whereupon the transfection was carried out using three guideRNAs in different combinations.After the transfection, single cell clones were separated and subsequently tested for the success of the knockout at protein level. The VEGF-sandwich-ELISA detected no VEGF expression in three cell lines. The proliferation assay showed no reduction of the cell division rate compared to wildtype ARPE-19 cells.After finishing this study with the generation of the three VEGF-knockout cell lines, the VEGF-biosensor can be expressed on the surface of these cells. An immobilization of the cells and implantation in the eye opens the possibility of a noninvasive measurement of VEGF by only adding the substrate for the luciferase. Thus, the therapy could be individually adjusted for each patient.

Die Alzheimer Demenz ist eine neurodegenerative Erkrankung, bei der es zur Störung der Gedächtnis- und Lernfunktion, bzw. dessen zellulären Korrelat der Langzeitpotenzierung (LTP), kommt. Dabei scheint das Amyloid-beta (Aβ) eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Erkrankung zu spielen. Aber auch andere Derivate des Amyloidvorläuferproteins (APP) wie die lösliche α- und β-Form des Proteins (sAPPα und sAPPβ) werden immer mehr in Betracht gezogen die Gedächtnisfunktion ebenfalls zu beeinflussen. Dabei sind die genauen Wirkmechanismen all dieser Proteine bisher jedoch noch nicht vollständig geklärt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher mit Hilfe von zwei Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierten Biosensoren zu untersuchen wie sich die Phosphorylierung der extracellular signal-regulated Kinase (ERK) und des cAMP responsive element binding Protein (CREB), zweier bedeutender Kinasen der LTP, durch die Behandlung mit sAPPα, sAPPβ und Aβ verändert. Dabei ließen sich zunächst Unterschiede in der Phosphorylierung feststellen, abhängig von dem zur Induktion der LTP verwendtem Stimulans. So fällt die Phoyphosphorylierung durch die Stimulation mit KCl geringer aus als durch die Stimulation mit Glutmat. Anschliessend wurde die Wirkung der verschiedenen Peptide auf die durch KCl oder Glutamat induzierte Phosphorylierung von ERK und CREB untersucht. Dabei zeigte sich, dass es durch sAPPα sowohl für ERK als auch für CREB zu einer Erhöhung der Phosphorylierung kommt, sowohl unter Stimulation mit Glutamat ebenso wie unter Stimulation mit KCl. Durch sAPPβ zeigte sich eine Abnahme der Phosphorylierung von ERK nach Stimulation mit Glutamat und eine Zunahme nach Stimulation mit KCl. Für CREB zeigte sich keine Änderung nach Behandlung mit sAPPβ und Stimulation mit Glutamat und eine Erhöhung nach Stimulation mit KCl. Im Gegensatz dazu lässt sich durch die Behandlung mit Aβ eine Abnahme nicht nur für ERK, sondern auch für CREB beobachten. Die hier beschriebenen Beobachtungen sind konsistent mit anderen Studien, die eine neuroprotektive und LTP fördernde Wirkung von sAPPα und eine LTP hemmende Wirkung von Aβ postulieren. Für sAPPβ konnte erstmalig ein Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK und CREB und damit auf die LTP gezeigt werden. Die Wirkung ist dabei abhängig vom Stimulationsreagenz sowohl phosphorylierungsfördernd und -hemmend. Insgesamt konnte nicht nur bestätigt werden, dass sAPPα, sAPPβ und Aβ die LTP über eine Änderung der Phosphorylierung von ERK und CREB beeinflussen, sondern jeweils auch eine zeitliche Dynamik der Änderung aufgezeigt werden, die es ermöglicht genauere Rückschlüsse auf die Pathomechanismen der Alzheimer Demenz zu ziehen

In dieser Arbeit wurde eine neuartige Möglichkeit zur Funktionalisierung von beliebigen Oberflächen entwickelt und getestet. p-(N-maleimido)phenyl- (MP) und p-Aminophenyl-Reste (AP) wurden auf CVD gewachsenem Graphen via Elektroreduktion der jeweiligen Diazoniumkationen abgeschieden. Die so funktionalisierten Graphenschichten wurden auf verschiedenste Materialien transferiert. Die Präsenz der funktionellen Gruppen wie auch ihre kovalente Anbindung wurde durch Infrarotellipsometrie und Ramanspektroskopie bestätigt. Für das MP-funktionalisierte Graphen wurde mittels optischer Simulation der IRSE-Daten die Dicke der MP-Schicht zu 4.4 nm vor und 4.8 nm nach dem Transfer bestimmt. Die Dicke nach Transfer wurde zusätzlich durch Infrarot-gekoppelte Rasterkraftmikroskopie zu 4.4 nm bestimmt. MP-Graphen wurde via MICHAEL-Addition sowohl mit p-Nitrobenzylmercaptan (NBM), als auch mit Cystein-terminierter Peptidnukleinsäure (PNA) modifiziert. Die jeweiligen Moleküle wurden nach dem Transfer per IRSE nachgewiesen. Die Modifikation mit NBM wurde darüber hinaus in einem Mikrofluidikaufbau in-situ verfolgt. Die Zeitabhängigkeit der Anreicherung an der MP-Oberfläche wurde mit der auf einer Goldoberfläche verglichen. AP-Graphen wurde mittels Zero-Length-Crosslinking mit p-Nitrobenzoesäure (NBA), sowie Carboxyl-funktionalisierten Nanokristallen (Quantum Dots) modifiziert. Die kovalente Anbindung wurde durch Vorhandensein der Amid-I-Bande nachgewiesen und der erfolgreiche Transfer mittels Photolumineszenz-Spektroskopie. Um das herausragende Potential des Transfers von funktionalisiertem Graphen zu zeigen, wurde PNA-modifiziertes MP-Graphen auf ein vorkontaktiertes Sensor-Array transferiert. Durch einfache Widerstandsbestimmung des Graphens konnte die Hybridisierung mit komplementärer DNA von 1b-mismatch DNA unterschieden werden., A new pathway for the functionalization of arbitrary surfaces was developed and tested. p-(N-maleimido)phenyl (MP) and p-Aminophenyl (AP) residues were deposited on CVD grown graphene on copper, via electroreduction from the respective diazonium cation. The functional graphene layers were subsequently transferred to a variety of substrates, comprising metals (gold), insulators (SiO2, glass) and flexible ones (PTFE tape). The presence and covalent attachment of the desired groups was confirmed via infrared ellipsometry and Raman backscattering spectroscopy. The thickness of the Maleimidophenyl layer was determined via optical simulation of the IR ellipsometry data. The resulting 4.4 nm prior to and 4.8 nm after transfer to a gold film on silicon are in good agreement. The thickness after transfer was additionally measured using AFM, amounting as well to 4.4 nm. All results are in good agreement and confirm the possibility to transfer covalently functionalized graphene without noticeable loss. MP functionalized graphene was modified wet-chemically. MP-functionalized graphene was modified using the MICHAEL addition, attaching p Nitrobenzylmercaptane (NBM) or cysteine terminated peptide nucleic acid (PNA) to the surface. The success of modification and subsequent transfer was confirmed via infrared ellipsometry. MP graphene was furthermore integrated in a microfluidic setup. The time dependence of the accumulation of NBM on the functionalized graphene was compared to a similar on a plain gold surface. The different behaviour strongly hints at a covalent bonding between thiol and maleimide. AP functionalized graphene was modified via zero-length crosslinking with p Nitrobenzoic acid (NBA) and COOH containing Nanocrystals (Quantum Dots). The covalent attachment was shown by the presence of the amide bonds. Additionally, the successful transfer of the Quantum Dots was demonstrated via photoluminescence spectroscopy. To prove the outstanding potential of the transfer of functionalized graphene, PNA-modified MP-graphene was transferred on top of a pre-contacted sensor array. By simple current measurement, complementary DNA strands could be distinguished from the respective 1 b mismatch DNA.

Aufgrund der zahlreichen Gemeinsamkeiten des olfaktorischen und visuellen Systems von \(\textit {Drosophila melanogaster}\) könnte das PDZ Domänen Protein INAD in der olfaktorischen Signaltransduktion eine analoge Rolle einnehmen. Ziel war es INAD morphologisch nachzuweisen. Mittels elektrophysiologischen Messungen und Verhaltenstests wurde die olfaktorische Reaktion untersucht. Eine reduzierte Reizantwort der Nullmutante lässt auf eine Beteiligung des Proteins an der Olfaktorik schließen. In der Elektrophysiologie zeigten die INAD Mutanten zudem eine reduzierte Regeneration nach Adaptation. Außerdem wurde die olfaktorische Perzeptionsfähigkeit auf industrielles Abwasser getestet. Die Taufliegen sind in der Lage Bestandteile des Abwassers und Variationen der Inhaltsstoffe zu detektieren. GC-MS Analysen ergaben Substanzen, wie Ester, Carbonsäuren und Thiophene, als identifizierte Inhaltsstoffe. Es handelt sich um mögliche Indikatorsubstanzen, die den Grad der Verschmutzung des Abwassers anzeigen.

Wir präsentieren eine Plattformtechnologie zur mobilen, markerfreien Detektion von mehreren Protei-nen gleichzeitig. Ein photonischer Kristall, der mit Liganden lokal funktionalisiert ist, dient hier als Sen-sor. Über ein kompaktes, Kamera-basiertes Messsystem wird die Proteinanbindung an die Sensoroberfläche in ein Intensitätssignal umgewandelt, über dessen Amplitude die Proteinkonzentration bestimmt werden kann. Um die Detektionsgrenze dieser Technologie weiter zu verbessern, werden hier photonische Kristalle mit einer multiperiodischen und aperiodischen Gitterstruktur simulativ und expe-rimentell untersucht. Dafür werden die Gesamtempfindlichkeit und die Resonanzgüte jeder Struktur bestimmt und mit der bisher verwendeten monoperiodischen Struktur verglichen. Es konnte festge-stellt werde, dass die Resonanzgüte von mono- über multi- bis aperiodisch sich deutlich verbessert. Eine Steigerung der Gesamtempfindlichkeit konnte nicht festgestellt werden. Jedoch konnte anhand von Analysen der elektrischen Feldverteilung innerhalb der verschiedenen Strukturen beobachtet werden, dass die Modenausbreitungen in den aperiodischen Strukturen stark lokalisiert wird und die elektrische Feldstärke in diesen „Hot-Spots“ deutlich über der mittleren Feldstärke, die eine flächige Funktionalisierung repräsentiert, liegt. Diese lokale Resonanzausbildung konnte zudem bereits in ersten experimentellen Untersuchungen bestätigt werden.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung eines kapazitiven massensensitiven Drucksensors auf sein Resonanzverhalten und sein Auflösungsvermögen. Dafür wird ein Messsystem entwickelt, das den Sensor elektrostatisch zur Resonanz anregt und die Resonanzfrequenzen elektrisch misst. Das Resonanzverhalten wird mit unterschiedlichen Messmethoden verglichen. Das Auflösungsvermögen des Sensors wird mit Variation der elektrischen Spannungen optimiert und mit dünnen Goldschichten und Partikeln im Pikogrammbereich bestimmt. Zusätzlich wird der Sensor biochemisch beschichtet und auf seine Selektivität untersucht. Dazu gehört der Nachweis der spezifischen Bindung mit Proteinen und Antikörpern auf dem Sensor. Das Messsystem wurde durch Integration der Ausleseschaltung miniaturisiert und durch Integration der Fluidik automatisiert. Hierfür wurde die Ausleseschaltung auf den Sensorchip integriert und das Resonanzverhalten wurde mit dem des diskreten Sensors verglichen. Eine vollautomatische und programmierbare Fluidik wird entwickelt, die Flüssigkeiten auf den Sensor dispensiert, spült, trocknet und die Messung wieder aufnimmt. Der Sensor mit integrierter Elektronik wird in das Messsystem mit Fluidik integriert und im Spülprozess getestet. Zusätzlich wird eine Mikrofluidik mit Kapillarpumpe für den Sensor entwickelt, um das Probenvolumen zu reduzieren und das gesamte Messsystem zu miniaturisieren. The present work shows the characterisation of a capacitive mass-sensitive pressure sensor on resonance behaviour and resolution. For this, a measurement system is developed, which electrostatically excites the sensor and electrically measures the resonance frequencies. The resonance behaviour is compared with different measurement methods. The resolution is optimized by varying the electrical voltages and is determined with thin gold layers and particles in the picogram range. Additionally, the sensor is coated with a biochemical layer and is analyzed for ist selectivity. This includes the detection of the specific binding of proteins and antibodies onto the sensor. The measurement system is miniaturized by the integration of a readout circuit and is automatized by the integration of a fluidic system. The readout circuit is integrated on the sensor chip and the resonance behaviour is compared to the behaviour of the discrete sensor. A programmable fluidic is developed by dispensing liquids, rinsing, drying and measuring the frequency automatically. The sensor with integrated readout circuit is integrated into the fluidic system and tested by rinsing and drying. In addition, a microfluidic system with a capillary pump is developed to reduce the sample volume and to miniaturize the entire measurement system.

Verlässliche und effiziente Methoden der Legionellen-Detektion sind für den Bereich der Hygiene in öffentlichen Gebäuden überaus wichtig. Die Legionellose ist eine der häufigsten Todesursachen infolge von nosokomial erworbenen Infektionen. Die etablierten Legionellentests liefern erst nach 3-7 Tagen Ergebnisse. Eine schnellere Methode wird dringend gebraucht. Beispielsweise werden Biosensoren in vielen Bereichen der Analytik eingesetzt. Allerdings lässt sich auf den entsprechenden Sensorchips nur jeweils ein Experiment durchführen. Diese Einschränkung kostet Material und Geld. Die RIfS erweist sich als Methode, mit der ganze Legionella pneumophila-Zellen nachgewiesen werden können. Allerdings liegt die untere Nachweisgrenze bei 1000000-10000000 Zellen/ml. Eine Quantifizierung der Zellen erweist sich als schwierig, weil die Sensorsignale am Ende der Dissoziationsphase nicht zuverlässig mit den Zell-Konzentrationen korrelierten. Der Grund ist offenbar, dass die Zellen auf der OF keine im physikalischen Sinne wohl definierte Schicht bilden. Durch REM konnten große leere Bereiche auf einer OF festgestellt werden und häufige Überlappungen der Zellen. Die Korrelation zwischen der Steigung in der Anfangsphase der Bindung und der Konzentration ist offenbar zuverlässiger, da Überlappungen etc. in der Anfangsphase keine große Rolle spielen.

eingereicht von: Dominik Zauner Zsfassung in dt. und engl. Sprache Linz, Univ., Dipl.-Arb., 2015

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue, optimierte Synthesestrategie für die modlulare Herstellung von Redoxpolymeren auf Basis einer Epoxidöffnungsreaktion entwickelt. Es wurden Methoden zur Stabilisierung von Redoxpolymerfilmen durch Quervernetzung und Methoden zur selektiven Quervernetzung mittels geschützter Quervernetzer entwickelt. Durch Trennung der Osmiumkomplexsynthese von der Polymerrückgratsynthese war es möglich, das Formalpotential der verwendeten Osmiumkomplexe an den Kofaktor PQQ anzupassen. Außerdem konnten die Redoxpolymere durch Modifikation mit Phenothiazinen für Bioanodenanwendungen optimiert werden. Abschließend wurde ein voltammetrischer pH-Sensor auf Basis zweier Redoxpolymere hergestellt und charakterisiert.

In der durchgeführten Arbeit wurden neue Immobilisierungsstrategien zur Etablierung eines amperometrischen Biosensors, welcher Polyphenole erfasst, untersucht. Ziel war es eine „Handheld-Unit“ unter Verwendung einer Dickschichtelektrode (Thick-Film Technology, TFT) zu entwickeln. Zur Erfassung von Polyphenolen wurde das Enzym Laccase ausgewählt, welche die Oxidation von Phenolen zu Chinonen katalysiert. Dabei wurden in dieser Arbeit die Laccasen aus Rhus vernicifera, Agaricus bisporus und Trametes versicolor auf die mögliche Verwendung als biologische Komponente des Biosensors getestet. Für die untersuchten Immobilisierungsstrategien erwies sich die Laccase aus Trametes versicolor als geeignet. Als Immobilisierungsreagenz wurde Polylactid (PLA) als neuer Ansatz zur Immobilisierung von Laccase zur Detektion von Polyphenolen gewählt. Verschiedene Polylactide wurden untersucht. Die Leitfähigkeit des Polymers konnte sowohl mit Aktivkohle wie auch mit Carbon Nanotubes (CNT) erreicht werden, wobei die Verwendung von CNT ein stabileres Signal lieferte. Des Weiteren wurde die Immobilisierung von Enzymen auf TFT-Sensoren mittels Photolinkern untersucht. Dabei wurden die Photolinker N-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoat (Sulfo-HSAB), 4-Fluoro-3-Nitrophenyl-azid (FNPA) und die Kombination aus 3-Aminopropyltriethoxysilan/Glutaraldehyd (APTES/GDA) getestet. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl die Empfindlichkeit und die Robustheit des Sensors am Größten ist, wenn das Enzym Laccase mittels FNPA immobilisiert wurde. Es wurden Realproben (grüner Tee (Camellia sinensis), Aroniasaft und Cranberrysaft) mittels TFT-Sensor vermessen und diese Ergebnisse mit den Ergebnissen der Referenzmethode nach Folin-Ciocalteu verglichen. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Biosensor-Ergebnisse gut für Screenings geeignet sind. Sowohl für die Immobilisierungsstrategie mit PLA, als auch für die Immobilisierungsstrategie mittels des Photolinkers FNPA wurde die Lagerstabilität der beschichteten Biosensoren überprüft. Beide Beschichtungsstrategien haben eine gute Lagerstabilität (PLA-Beschichtung: mindestens 83 Tage, FNPA-Beschichtung mindestens 28 Tage).

Dieser Artikel beschreibt neuartige Sensoren (sog. Organic Thin-film Transistor Sensors, engl.), die auf organischen Dünnschichttransistoren basieren. Neben den unterschiedlichen Sensortypen werden auch mögliche Anwendungsfelder und die besonderen Eigenschaften sowie Vorteile von OTFT-Sensoren behandelt. Es wird zudem der aktuelle Stand und die mögliche zukünftige technologische Entwicklung wiedergegeben.

Deutsch Astrid Zsfassung in dt. und engl. Sprache Graz, Univ., Dipl.-Arb., 2013

Ill., graph. Darst.

Charakterisierung von Poly(ethylenglykol)-Derivaten mittels Reflektometrischer Interferenzspektroskopie und AFM. Untersuchung der Sensoroberflächen auf spezifische Wechselwirkung, unspezifische Adhäsion und Regenerierbarkeit. Characterization of Poly(ethylenglycol)-Derivates with Reflectrometric Interferencespectroscopy and AFM. Examination of specific and non-specific interactions with the sensor-surface.

Ill.

Ill., graph. Darst.

Ill., graph. Darst.

Erkennungsschichten von Biosensoren sind Beschichtungen, die es ermöglichen, spezifisch Moleküle (z.B. Gene oder Proteine) zu detektieren. Kern der Funktionsweise von Biosensoren, die DNA-Stränge erkennen, ist eine Hybridisierungsreaktion zwischen einem auf dem Biosensor gebundenen DNA-Strang (Fänger-DNA) und dem komplementären DNA-Strang (Ziel-DNA), der beispielsweise aus einer Blutprobe stammt. Die zentrale Rolle für die Hybridisierungsreaktion spielt die Erkennungsschicht. Sie enthält die Fängermoleküle und ermöglicht damit die Detektion der entstandenen Hybridisierung durch den unter der Erkennungsschicht befindlichen Sensor. Man unterscheidet generell zwischen zwei- und dreidimensionalen Erkennungsschichten. Damit wird die unterschiedliche Anbindung der Fängermoleküle auf der Sensoroberfläche bezeichnet. Im Falle von zweidimensionalen Erkennungsschichten koppeln die DNA-Moleküle, z.B. mittels Thiol- oder Amino-Gruppen, auf der Oberfläche des Sensors, während für dreidimensionale Schichten die Anbindung im gesamten Volumen einer zumeist polymeren Beschichtung erfolgt. In letztere diffundieren die Fängermoleküle in die Schicht ein und reagieren an entsprechenden Kopplungsgruppen mit dem Polymer, so dass eine kovalente Verbindung entsteht und die Fänger festgehalten (immobilisiert) werden. Vorteil der dreidimensionalen Erkennungsschichten ist die potentiell höhere Dichte der immobilisierten Fänger auf der Sensoroberfläche und damit eine höhere mögliche Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit. Ziel der Arbeit war es, hydrophile Polymere mit bestimmten Eigenschaften herzustellen und den Einfluss ihrer Hydrophilie und ihres Netzwerkaufbaus auf Sensitivität und Selektivität der Erkennungsschicht zu untersuchen. Im Rahmen der Arbeit wurden Polymere auf der Basis von Polyorganosiloxan (EPS), Acrylamid und Polyhydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) synthetisiert. Zum Nachweis der Anwendbarkeit der Polymere wurden Sensor-Chips damit beschichtet und diese mit synthetischen DNA-Proben getestet. Dafür wurden sowohl optische als auch elektrochemische Testmethoden verwendet. Die eingesetzten optischen Methoden sind die Fluoreszenzmikroskopie und die konfokale Laser-Scan-Mikroskopie. Letztere ermöglicht eine drei-dimensionale Darstellung der Verteilung der DNA-Moleküle in der Erkennungsschicht. Mit den elektrochemischen Messungen konnte gezeigt werden, welche der untersuchten Erkennungsschichten für amperometrische Biosensoren geeignet sind. Außerdem konnte damit die Sensitivität und Selektivität der Erkennungsschichten quantifiziert werden. Die fluoreszenzmikroskopischen Messungen wurden an allen drei ausgewählten Erkennungsschichten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass Polyorganosiloxan und Acrylamid in signifikantem Maße auch unspezifisch DNA-Moleküle binden, und damit für die Verwendung als Erkennungsschicht ungeeignet sind. Weiter verfolgt wurde Poly-HEMA, da hier die spezifische Bindungsform (Hybridisierung mit Hilfe der Fänger-DNA) dominiert. Amperometrische Messungen mit einer Poly-HEMA-Erkennungsschicht auf einem DNA-Chip, bestätigten die fluoreszenmikroskopisch gewonnen Ergebnisse und zeigten, dass diese Erkennungsschicht redoxcycling-kompatibel ist. Das bedeutet, dass sich ein Redoxmediator in der Erkennungsschicht oxidieren und reduzieren lässt. Die minimale Konzentration von DNA-Molekülen, die mit dem gewählten Versuchsaufbau detektierbar war, betrug 0,01 nM. Diese Sensitivität wurde stark von der Netzwerkdichte beeinflusst. Die Sensitivität der mit einer Poly-HEMA-Erkennungsschicht aufgebauten Sensoren sinkt deutlich mit wachsender Vernetzungsdichte des Poly-HEMA. Bei Verdopplung der Netzwerkdichte sinkt die Sensitivät auf ein Drittel. Durch das Ermitteln der sogenannten Schmelztemperatur (Temperatur der Dehybridisierung) konnte die Selektivität bestimmt werden. Untersucht wurde die Detektierbarkeit des Schmelzpunktunterschiedes zwischen einem passenden DNA-Strang (Match) und einem, der sich durch eine Base von der passenden DNA-Unterschied (Mismatch bzw. Einpunktmutation). Der Schmelzpunktunterschied blieb über den gesamten Variationsbereich der Netzwerkdichte detektierbar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche haben darlegen können, dass dreidimensionale Erkennungsschichten für DNA-Moleküle eine Alternative zu herkömmlichen zweidimensionalen Erkennungs-schichten bilden. Darüberhinaus verspricht das dreidimensionale Netzwerk der Erkennungsschichten ein großes Entwicklungspotential. Recognition layers of biosensors are coatings, enabling a specific detection of molecules (e.g. genes or proteins). The core of the operation principle of biosensors, detecting DNA strands, is a hybridizing reaction between such a DNA strand (probe DNA) bounded to the biosensor and a complementary one (target), e.g. from a blood sample. The main part of this hybridizing reaction is the recognition layer. It contains the probe DNA and enables the detection of the occurred hybridization using the sensor positioned under the recognition layer. There are two as well as three-dimensional recognition layers. They can be distinguished by the different types of binding of probe DNA to the sensor surface. In the case of two-dimensional recognition layers the DNA molecules are bound to the surface of the sensor, e.g. by thiol or amino groups. Three-dimensional recognition layers show binding of the DNA molecules in the entire volume of the coating, being mostly common for polymers. Within such a three dimensional binding, the probe DNA diffuses into the layer and reacts with the corresponding coupling groups of the polymer, creating a covalent binding and thus immobilizing the probe DNA. The advantage of three-dimensional recognition layers is the potentially higher density of the immobilized probe DNA on the sensor surface and thus a potentially higher sensitivity and reproducibility. The object of this work is to develop hydrophilic polymers with certain characteristics and the investigation of the influence of their hydrophile and network structure on sensitivity and selectivity of the recognition layer. Within the scope of this work polymers based on polyorganosiloxane (EPS), acrylamide and polyhydroxyethylmethacrylate (polyHEMA) have been synthesized. To prove the applicability, polymer sensor chips were coated accordingly, and then tested using synthetic DNA samples. Therefore, optical and electrochemical test methods were employed. The optical methods were fluorescence and confocal laser scan microscopy. The latter allows to observe a three-dimensional distribution of the DNA molecules in the recognition layers. Upon conducting electrochemical measurements it could be shown, which of the examined recognition layers are suitable for amperometric biosensors. In addition sensitivity and selectivity of the recognition layers could be quantified. The fluorescence microscopy measurements were carried out on all three selected recognition layers. The results suggest that polyorganosiloxane and acrylamide bind significant quantities of nonspecific DNA molecules. Thus it can be concluded that polyorganosiloxane and acrylamide are not suitable as recognition layers. Following-on polyHEMA was used, since the specific binding form (hybridization using probe DNA) dominates in this system. Amperometric measurements with the polyHEMA recognition layer on a DNA chip confirmed the fluorescence microscopy results and indicated the redox-cycling compatibility of this recognition layer, implying that a redox mediator can be oxidized and reduced in the recognition layer. The minimum concentration of DNA molecules, which was detectable with the selected experimental setup, was 0.01 nM. This sensitivity was strongly influenced by the network density. The sensitivity of the sensors coated with a polyHEMA recognition layer clearly declined with increasing polyHEMA network density. By doubling the network density, the sensitivity will be reduced to a third. The selectivity could be determined by measuring the so-called melting point (i.e. the temperature of dehybridization). It was investigated if different melting points of a perfect complementary DNA strand (called match) and one with one base differing from the complementary strand (called mismatch) could be distinguished. This difference remained detectable over the entire variation range of the network density. The experiments carried out in this work are demonstrating that three-dimensional recognition layers for DNA molecules are an useful alternative to conventional two-dimensional recognition layers. Due to the three dimensional structure the recognition layers developed here are offering a vast potential for future developments.

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In dieser Arbeit wird ein mikrofluidisches System zum Nachweise von hormonaktiven Substanzen (engl. EDC´s) in wässrigen Lösung vorgestellt. Diese Plattform-Technologie besteht aus vier getrennten mikrofluidischen Einheiten aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und Glas, und bietet damit die Möglichkeit einen selektiven Nachweis von mindestens zwei Substanzen pro ein Einweg Chip, dessen Oberfläche mit den jeweiligen Rezeptoren immobilisiert ist. Der Chip selbst enthält eine integrierte Silizium-basierte Lichtquelle. Das Nachweiskonzept basiert auf der direkten Fluoreszenzanalyse. Zur Optimierung der elektrischen Parameter wurden Elektrolumineszenzmessungen (EL) als Funktion der Farbstoffkonzentration( QD800) im Kanal durchgeführt.

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The aim of this work was the development of an amperometric biosensor for cyanide by the use of a three-step reaction cascade involving two enzymes. In the first step of this cascade, the enzyme cyanidase (EC 3.5.5.1) hydrolyzes cyanide to formic acid and ammonia. In the following, formate, the corresponding base of formic acid, is oxidized to carbon dioxide by catalysis of formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2), while NAD, serving as cosubstrate, is reduced to NADH. In the third step, the oxidized form of a redox mediator reacts with NADH, yielding NAD and the reduced form of the mediator. Amperometric detection is possible for formate on the first, NADH on the second and the reduced form of the mediator on the third step of the cascade. Technically, two different sensor setups were used. On the one hand, a flow-through system was employed. It consisted of an injection valve, enzyme cartridges and a flow cell with amperometric electrode chips. On the other hand, gas phase experiments were carried out by placing a mixture onto an electrode chip. The mixture contained the enzymes and reagents necessary for the reaction cascade. The electrode chip was put in the gas phase of a sealed vessel. An acid component resided at the bottom of this vessel. Addition of cyanide containing samples into the acid resulted in protonation of cyanide, leading to hydrogen cyanide. Hydrogen cyanide then entered the gas phase and reached the mixture covering the electrode chip. Detection of formate at the first step of the cascade was possible solely by platinum working electrodes. In a flow-through setup, cyanidase immobilized in a cartridge was not able to completely hydrolyze the cyanide in samples. The remaining cyanide interacted with the platinum electrode, interfering with measurements. A removal of non-hydrolyzed cyanide by formation of metal complexes was not successful. Detection of NADH was feasible by the use of a flow-through setup. The limit of detection and the limit of quantification were determined to be 0.7 and 2.4 µM, respectively. The linear range extended from the limit of detection up to 1 mM. Nitriles and sulfide did not interfere, while thiocyanate showed a moderate interference. However, formate is expected to cause disproportionate signals by design. Estimation of cyanide in real samples with complex matrices such as plant extracts were possible. The correctness of the determination of cyanide concentrations in extracts of leaves of cherry laurel were checked by the use of the DIN method 38405-13 as a reference. With an average deviation of -4,8%, the sensor results were in good conformance with the reference results. Moreover, a good storage stability was found. After more than three months, no decrease of sensitivity could be observed. In contrast, gas phase measurements proved to be problematic. Additions of cyanide-free liquids into the acid component induced signals similar to those of cyanide containing samples, supposedly caused by the influence of changes in water vapor pressure. Meldola Blue as a redox mediator together with graphite working electrodes showed to be the only combination able to differentiate between cyanide free and cyanide containing samples (millimolar concentration range). During these experiments, concentrations of hydrogen cyanide in gaseous phase were between 2 and 800 ppm. Other mediators such as ferricyanide or quinones were found to be unsuitable. Signal heights were hardly reproducible, even when using Meldola Blue. Furthermore, the rate of signal response changed in the course of experiments. Also, the orientation of the electrode chip influenced the signal trend. The mixture could not be fixated on the chip. Chemical and electrochemical modifications of the working electrode were dissatisfying. To successfully develop a practicable amperometric gas sensor, further investigations are necessary. Yet, the three-step reaction cascade basically seems to be suited for measurements in gaseous phase., Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines amperometrischen Biosensors für Cyanid unter Ausnutzung einer dreistufigen Reaktionskaskade mit Beteiligung von zwei Enzymen. In der ersten Stufe dieser Kaskade wird Cyanid bzw. dessen korrespondierende Säure Blausäure von Cyanidase (EC 3.5.5.1) zu Ammoniak und Ameisensäure umgesetzt. Formiat als korrespondierende Base der Ameisensäure wird anschließend von Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2) zu Kohlendioxid oxidiert, wobei NAD als Cosubstrat zu NADH reduziert wird. Auf der dritten Stufe reagiert die oxidierte Form eines Redoxmediators mit NADH und wird unter Regeneration von NAD in die reduzierte Form überführt. Amperometrisch quantifizierbar sind Formiat auf der ersten, NADH auf der zweiten sowie die reduzierte Form des Mediators auf der dritten Stufe. Technisch kamen zwei verschiedene Sensoraufbauten zum Einsatz. Zum einen wurde ein Durchflusssystem benutzt, das aus einem Injektionsventil, Enzymkartuschen und einer Durchflusszelle für amperometrische Elektrodenchips bestand. Zum anderen wurden Messungen in der Gasphase durchgeführt, wobei ein Elektrodenchip mit einer Mischung aus den für die Kaskade benötigten Enzymen und Reagenzien bedeckt und im Gasraum eines abgeschlossenen Gefäßes platziert wurde. Am Boden des Gefäßes befand sich eine Säurekomponente, die nach Zugabe von Proben darin enthaltenes Cyanid protonierte. In der Folge trat Blausäure in den Gasraum über und gelangte zur Mischung auf dem Elektrodenchip. Formiat aus der ersten Stufe der Kaskade konnte nur durch Platin-Arbeitselektroden detektiert werden. Im Durchflusssystem war eine Kartusche mit immobilisierter Cyanidase jedoch nicht in der Lage, das gesamte Cyanid umzusetzen. Das restliche Cyanid interferierte mit der Platin-Elektrode und störte so die Messung. Ein Abfangen des nicht hydrolysierten Cyanids durch Bildung von Metallkomplexen war nicht erfolgreich. Für die Bestimmung von Cyanid durch Detektion von NADH über ein Durchflusssystem wurde eine Nachweisgrenze von 0,7 µM und eine Bestimmungsgrenze von 2,4 µM ermittelt. Der lineare Bereich erstreckte sich von der Bestimmungsgrenze bis zu 1 mM. Nitrile sowie Sulfid störten die Messung nicht, Thiocyanat interferierte leicht. Es kann allerdings davon ausgegangen werden, dass Formiat im Vergleich zu Cyanid überproportional hohe Signale hervorruft. Messungen von Realproben mit komplexen Matrices wie Pflanzenextrakten waren möglich. Die Richtigkeit der ermittelten Cyanidkonzentrationen in Extrakten von Kirschlorbeerblättern wurde mit der DIN-Methode 38405-13 überprüft, wobei mit einer mittleren Abweichung von -4,8% eine gute Übereinstimmung gefunden wurde. Weiterhin wurde eine gute Langzeitstabilität des Aufbaus festgestellt. Nach mehr als drei Monaten konnte noch kein Abfall der Sensitivität beobachtet werden. Messungen im Gasraum erwiesen sich dagegen als problembehaftet. Zugaben von cyanidfreien Flüssigkeiten in die Säurekomponente verursachten Signale, die in vielen Fällen die gleiche Höhe wie Signale cyanidhaltiger Proben erreichten. Ein starker Einfluss des Wasserdampfdrucks auf das Signal wird vermutet. Lediglich bei Einsatz des Mediators Meldolablau zusammen mit Graphit-Arbeitselektroden, also unter Ausnutzung der vollständigen, dreistufigen Kaskade, konnten cyanidfreie von cyanidhaltigen Proben im millimolaren Konzentrationsbereich unterschieden werden. Die dabei im Gasraum vorhandenen Blausäuremengen bewegten sich zwischen 2 und 800 ppm. Weitere untersuchte Mediatoren wie Kaliumhexacyanidoferrat und Benzochinonderivate erwiesen sich als weitgehend ungeeignet. Die Signalhöhen waren jedoch auch mit Meldolablau als Mediator nur schwer reproduzierbar. Zudem verschlechterte sich das Ansprechverhalten des Sensors mit fortschreitender Messdauer. Die Orientierung des Elektrodenchips im Gasraum nahm ebenfalls Einfluss auf den Signalverlauf. Versuche, die Mischung auf dem Elektrodenchip zu fixieren, verliefen unbefriedigend. Ebenso zeigten chemische und elektrochemische Modifikationen der Arbeitselektrode wenig Erfolg. Hier bedarf es weiterer Entwicklungsarbeit, um einen praktikablen amperometrischen Gassensor nach dem vorgestellten Messprinzip zu erhalten. Die dreistufige Reaktionskaskade scheint jedoch grundsätzlich geeignet für Messungen im Gasraum.

Nervensysteme basieren auf der Zusammenarbeit zahlreicher Nervenzellen. Um ihre Arbeitsweise aufklären zu können, benötigt man eine Methode, die es erlaubt, die Aktivität einer großen Zahl von Nervenzellen auf der Ebene einzelner Zellen zu beobachten. In der vorliegenden Arbeit wurden hierfür geeignete Sensoren entwickelt. Mit rauscharmen Elektrolyt-Oxid-Silizium-Feldeffekttransistoren (EOS-FETs) konnten die beim Feuern von Säugetierneuronen entstehenden sehr kleinen extrazellulären Spannungen detektiert werden. Ausgehend von den Skalierungsgesetzen der Zell-Transistor-Kopplung und der Rauschmechanismen wurde eine optimale Sensorgröße abgeleitet. Möglichkeiten zur Reduzierung des Verstärker- und Transistorrauschens wurden untersucht und eine Prozeßführung entwickelt, die rauscharme, glatte und optisch homogene Chips liefert. Die Charakterisierung der nach diesem Prozeß gebauten Transistoren zeigte sowohl die erwartete Abhängigkeit des Rauschens von den Parametern des Transistors als auch die gute Übereinstimmung der Kennlinien mit dem Ergebnis eines numerischen Simulationsprogramms für Feldeffekttransistoren. Nervenzellen aus dem Hippocampus der Ratte wurden auf den Chips kultiviert. Die spontanen Aktionspotentiale einzelner Neurone konnten verletzungsfrei und mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis detektiert werden. Das Transistorrauschen erwies sich als so gering, daß bereits die thermodynamische Grenze extrazellulärer Messungen erreicht wurde: Das Rauschen wurde nicht mehr von den Transistoren, sondern von den Zellen dominiert. Ein zur Beschreibung dieses Abdichtungsrauschens entwickeltes Modell konnte die Beobachtungen, insbesondere den ungewöhnlichen Exponenten der Frequenzabhängigkeit, erklären. Zum Vergleich mit der traditionellen Methode für extrazelluläre Messungen, planaren Metallelektroden, wurden dichte, erwachsene Kulturen aus Rattenneuronen untersucht. Die dabei beobachteten Signale waren um knapp eine Größenordnung stärker als es von Metallelektroden berichtet wird. Die Diskrepanz wird diskutiert und auf die Andersartigkeit der Meßmethoden und der Kontaktausbildung zurückgeführt. Die hier vorgestellten Transistoren weisen mehrere für Sensoren wünschenswerte Eigenschaften auf: Ihr Rauschen bewegt sich nahe an der thermodynamischen Grenze, ihre glasartige Oberfläche ist biokompatibel, chemisch homogen und extrem glatt, so daß das biologische System durch die Anwesenheit der Sensoren nicht beeinflußt wird. Sie sind in der Lage, neben den elektrischen auch chemische Signale der Zellen zu detektieren, und kommen in gewissem Sinne sogar ohne jegliche Zellsignale aus, können sei doch bereits die bloße Adhäsion von Zellen nachweisen. Diese Merkmale machen die Transistoren interessant für zahlreiche weitere Anwendungen in Neurobiologie, Zellbiologie und Pharmakologie. Und mit der Beobachtung des Abdichtungsrauschens steht eine neue Methode zur Untersuchung der Zelladhäsion zur Verfügung, die sich zudem auch in vielen nichtbiologischen Situationen anwenden läßt. Nervous systems are based on the cooperation of numerous neurons. In order to investigate their functioning a method is required which allows the observation of the activity of a large number of neurons at the level of individual cells. In this thesis, suitable sensors for this application have been developed. With low-noise electrolyte-oxide-silicon field-effect transistors the small extracellular voltages arising during the elicitation of action potentials could be detected. Starting from the scaling laws of the cell-transistor-coupling and the noise mechanisms an optimal sensor size was determined. Measures to reduce the noise of amplifier and transitors were examined and a process was developed which yields chips with low noise and a smooth and optical homogeneous surface. The characterisation of the transistors built with this process showed the expected dependency of the noise on the transistors' parameters and a good agreement of the device behaviour with the results of a numerical simulation package for field-effect transitors. Neurons from the rat's hippocampus were cultivated on the chips. Spontaneous action potentials were recorded with good signal-to-noise ratios and without injuring the neurons. The transistor noise proved to be so low that the thermodynamic limit of extracellular measurements became visible: The noise was not dominated any more by the transitors but by the cells. A model developed to describe this sealing noise was able to to explain the observations, in particular the unusual exponent of frequency dependence. In order to draw a comparison with the traditional method for extracellular recordings (planar metal electrodes) dense mature cultures of rat neurons were examined. The observed signals were about a magnitude larger than those reported from metal electrodes. The discrepancy is discussed and attributed to the differences of the measurement methods and the contact types. The transistors presented in this work have several features desirable for sensors: Their noise is close to the thermodynamic limit, their glass-like surface ist biocompatible, chemical homogeneous and extremly flat, which prevents influencing the biological system by the sensors' presence. They are able to record not just the electrical, but also the chemical signals of the cells and can even do without any cell signals at all, as they are able to detect the mere adhesion of cells. These features render the transistors attractive for many additional applications in neurobiology, cell biology and pharmacology. The observation of adhesion noise provides a new method to investigate cell adhesion and in addition can be applied in many non-biological situations.

Ill., graph. Darst.

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