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Enzymes are versatile biocatalysts capable of performing selective reactions. The advantages of enzymes in comparison to classical chemistry including chemical catalysts are the generally milder process conditions and avoidance of harmful reactants. Their high selectivity and specificity are especially beneficial for the enzymatic synthesis of new products with potential applications in drug research. Therefore, in the past decades, the utilization of isolated enzymes or whole-cell biocatalysts has spread through a growing number of biotechnological industries. The applications comprise the production of chiral building blocks for the pharmaceutical and fine chemical industry, the enzymatic synthesis of drug metabolites for testing of toxicity, function, biological activity, degradation and the production of biocatalytically modified natural products, which all play a role in drug discovery. Especially Oreste Ghisalba's contributions, which paved the way for the industrial use of enzymes, will be considered in this review.

Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde die Grundlage für die Etablierung einer neuartigen Gruppe von Zyklasen in der chemoenzymatischen Synthese geschaffen mit dem Fernziel eine „biokatalytischen Werkzeugkiste“ zu entwickeln, mit der sich gezielt Heterozyklen mit bestimmten Eigenschaften herstellen lassen. Hierfür wurde eine kürzlich charakterisierte Gruppe von IMOMA-Zyklasen, die in unterschiedlichen Naturstoffbiosynthesen Sauerstoffheterozyklen über eine intramolekulare oxa-MICHAEL-Addition bilden, eingehender untersucht und ihr Potential für eine synthetische Nutzung evaluiert. Die durchgeführten Arbeiten erweiterten die Auswahl an charakterisierten IMOMA-Zyklasen und schaffen am Beispiel der detaillierten Studie zu AmbDH3 eine Blaupause für entsprechende Untersuchungen verwandter Zyklasen in der Zukunft. Hiermit rückt eine Verwendung dieses neuen Enzymtyps in der chemoenzymatischen Synthese näher. Die bisher gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass die Verwendung dieser Zyklasen gegenüber der verfügbaren chemischen Synthesemethodologie für die IMOMA bedeutende Vorteile, wie eine hochkonservierte Stereoselektivität und die Möglichkeit zur kinetischen Racematspaltung, bietet.

Contaminants deriving from human activities represent a constantly growing threat to our environment and have a direct impact on plant and animal health. To alleviate this ecological imbalance, biocatalysis offers a green and sustainable alternative to conventional chemical processes. Due to their broad specificity, laccases are enzymes possessing excellent potential for synthetic biotransformations in various fields as well as for the degradation of organic contaminants. Herein, we produced laccases in submerged cultures of P. ostreatus and T. versicolor in three different media. The fungi/medium combination leading to the highest enzymatic activity was malt extract (2%) + yeast extract (3%) + glucose (0.8%). Laccase production was further increased by supplementing this medium with different concentrations of Cu2+, which also provided a better understanding of the induction effect. Additionally, we disclose preliminary results on the interaction of laccases with mediators (ABTS and violuric acid - VA) for two main applications: lignin depolymerisation with guaiacylglycerol-?-guaiacyl ether (GBG) as lignin model and micropollutant degradation with Remazol Brilliant Blue (RBB) as enzymatic bioremediation model. Promising results were achieved using VA to increase depolymerization of GBG dimer and to enhance RBB decolorisation.

Terpene bilden mit mehr als 80000 bekannten Verbindungen die größte Klasse sekundärer Naturstoffe. Terpene sind strukturell komplexe Verbindungen, die definierte Stereozentren aufweisen und in allen Bereichen des Lebens vorkommen. Die Terpene werden dabei ausgehend von azyklischen Prenyldiphosphaten durch Terpensynthasen gebildet. Infolge ihrer vielfältigen Eigenschaften und strukturellen Besonderheiten werden sie als Pharmazeutika und Bausteine vor allem für die „ex-chiral-pool“ Synthese neuer Verbindungen verwendet. Das größte Einsatzgebiet haben Terpene allerdings in der Duft- und Aromaindustrie, wo sie aufgrund ihrer ansprechenden Olfaktorik sowohl in Form von Reinstoffen als auch etherischen Ölen Anwendung finden. Durch ihre besonderen pharmazeutischen und olfaktorischen Eigenschaften erfahren die Terpene eine steigende kommerzielle Aufmerksamkeit, weshalb insbesondere die Suche nach neuen Terpenoiden und die Funktionalisierung vorhandener Terpene in den Blickpunkt gerückt sind. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden zwei verschiedene biotechnologische Ansätze für die Bildung neuer Terpenoide gewählt. Zum einen wurden unnatürliche Farnesyldiphosphate mit heterolog exprimierten Sesquiterpensynthasen zu neuen komplexen Terpenoiden umgesetzt. Die unnatürlichen Derivate wurden zunächst auf die Substratakzeptanz überprüft und entstehende Produkte anschließend durch die Anwendung der präparativen Gaschromatographie isoliert und die Struktur aufgeklärt. Ferner wurden die Biotransformations-produkte einer olfaktorischen Analyse unterzogen, um potentielle Terpenoide für den Einsatz als Duftstoffe zu identifizieren. Anschließend wurden Biosynthesewege für die gebildeten Produkte postuliert und diskutiert. Ein biotransformiertes Terpenoid wurde zudem durch Semisynthese weiter verändert und funktionalisiert, um den Strukturraum der Terpenoide zu erweitern. Des Weiteren wurden mehrere Mutanten einer Sesquiterpensynthase hergestellt und deren Einfluss auf die carbokationische Reaktionskaskade beurteilt. Zum anderen wurden Terpene und etherische Öle durch enzymatische Katalyse oxyfunktionalisiert, wobei kommerziell verfügbare Enzyme genutzt wurden. Im Fokus steht hierbei die Bildung von duftstoffrelevanten Verbindungen sowie die Erweiterung des Einsatzgebietes der etherischen Öle. Dazu wurden zunächst reproduzierbare Enzymtests entwickelt und optimiert. Anschließend wurde die Substratakzeptanz der eingesetzten Terpene überprüft und die entstehenden Produkte massenspektrometrisch analysiert. Unbekannte Produkte wurden ebenfalls isoliert, strukturell aufgeklärt und Reaktionsmechanismen zur Bildung der Produkte postuliert und diskutiert.

Ausgangspunkt für die vorliegenden Studien zu PKS-Ketoreduktase-Domänen waren die β-Hydroxy-α-methyl-Strukturelemente verschiedener Polyketid-Naturstoffe. Über mehrere Validierungsstufen wurde eine Auswahl von Ketoreduktase-Domänen getroffen, die das Spektrum reduktionsaktiver Ketoreduktase-Typen abdeckte und Domänen früher, wie auch später Module umfasste. Die MS/MS-Protein-identifizierung bestätigte anschließend die erfolgreiche Genexpression und Isolierung der korrekten Proteindomänen. Insgesamt standen somit sieben rekombinante KR Domänen mit insgesamt elf Derivaten für die Enzymaktivitätstests zur Verfügung. Die für die Studien benötigten β-Keto-α-methyl-Substrate sollten über eine Route mit möglichst direktem Zugang zu einem breiten Spektrum an Derivaten dargestellt werden. Die effiktivste der untersuchten Synthesestrategien basiert im Schlüsselschritt auf einer decarboxylativen CLAISEN-Kondensation nach MASAMUNE et al. Diese biomimetische Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung verschiedener Derivate auf der vorletzten Stufe. Insgesamt waren 14 β-Keto-α-methyl-Derivate zugänglich, wobei der Fokus auf den SNAC-Thioestern lag. Der nächste Schritt beinhaltete die Etablierung eines geeigneten photometrischen Messverfahrens für die Reaktionsverfolgung. Diese erfolgte über den NADPH-Verbrauch während der enzymatischen Reduktion. Zur Validierung dieser Methode wurden die Versuche zu einer Reihe an KR-Domänen von WEISSMAN et al. erfolgreich reproduziert. Hierauf basierend, wurden die relativen Aktivitäten für alle Enzym-Substrat-Kombinationen ermittelt und weiterführend die Reduktionsprodukte auf den Umsatz und die Konfiguration des β-Hydroxy-α-methyl-Motivs hin untersucht. Die Ketoreduktase Domänen mit den höchsten relativen Aktivitäten über das gesamte SNAC-Substratspektrum waren TylKR1, AmpKR2, sowie MycKRA. Die anderen Domänen zeigten eine stärker ausgeprägte substratabhängige Reduktionsaktivität. Je strukturell näher das Surrogat allerdings dem natürlichen Substrat war, desto höher waren die Aktivität und die Stereoselek¬tivität. EryKR1 reduzierte mit hoher relativer Aktivität die kleinen Substrate K-MMN und K-EMN. Wohingegen EryKR6 und MycKRB die höchsten Werte bei den etwas größeren, linearen Substraten K-PaMN und K-PiMN aufwiesen. Die absolute Produktkonfiguration wurde anschließend mittels einer Kombination aus NMR-Untersuchungen der β-Hydroxy-Reduktionsprodukte und der entsprechenden 9-AMA-Ester bestimmt. Die Stereoselektivitäten der KR Domänen waren insgesamt sehr hoch, jedoch teilweise auch abhängig von der betrachteten Enzym-Substrat-Kombination. Die Orientierung des Substrats im aktiven Zentrum während der Katalyse ist dabei von zentraler Bedeutung. Je bevorzugter eine katalytisch aktive Orientierung eingenommen wird, desto stärker sollte dies in einer höheren Stereoselektivität resultieren. Mit den vorliegenden Ergebnissen konnten einerseits Studien von KEATINGE-CLAY, LÜDEKE und WEISSMAN reproduziert und bestätigen werden sowie andererseits das Spektrum an Enzym-Substrat-Kombinationen um Surrogate mit natürlichen und nicht-natürlichen Polyketidstrukturen vergrößert werden. Dabei zeigte sich, je ähnlicher die Polyketidstruktur der Surrogate denen der natürlichen Substrate war, desto höher waren die Stereoselektivitäten. Die Produktkonfigurationen entsprachen hierbei den in der Natur vorkommenden. Nicht-natürliche Substrate führten teilweise zu einer Abkehr von diesen Konfigurationen. Die gezeigten, signifikanten Wirkungen von kleinen tags, wie z. B. His6, auf die Aktivität der Ketoreduktase Domäne unterstreichen dabei, dass Interaktionen mit Distanz zum aktiven Zentrums ebenfalls Einfluss auf dieses nehmen können. Unmittelbar relevant für die Stereoselektivität sind aber die Interaktion der KR mit anderen Domänen, insbesondere der ACP über Protein-Protein-Wechselwirkungen, und die Protein-Substrat-Wechselwirkungen. Ein erstmaliger Einblick in den Einfluss von nicht-natürlichen Substraten und Surrogaten bei KR-Domänen später PKS-Module konnte in dieser Arbeit gezeigt werden.

Die Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (CODH) ist ein Schlüsselenzym des reduktiven Acetyl-CoA Wegs, und katalysiert in diesem die Reduktion von CO2 zu CO mit Raten von bis zu 12 s 1. Die Rückreaktion, die Oxidation von CO, katalysiert die CODH mit Raten von bis zu 31000 s-1. Beide Reaktionen finden am aktiven Zentrum des Enzyms, einem [NiFe4S4OHx]-Cluster (C Cluster), statt. Das Genom des hydrogenogenen Bakteriums C. hydrogenoformans beinhaltet fünf putative CODHs, welche vermutlich unterschiedliche Funktionen im Organismus ausüben. Diese Arbeit charakterisiert CODH-II und CODH-IV strukturell und biochemisch. In CODH-II wurden dafür Seitenketten der 1. und 2. Koordinationssphäre des C-Clusters ausgetauscht und einer strukturellen und kinetischen Analyse unterzogen. Der zweite Teil der Arbeit analysiert den Einfluss von O2 auf CODH-II und CODH-IV. In Lösung zeigte CODH-II bei Inkubation mit O2 einen Verlust der CO-Oxidationsaktivität. Analog dazu konnte in CODH-II Kristallen die Zerstörung des C Clusters durch O2 verfolgt werden. Elektrochemisch wurde das Verhalten der CODH-II in der Gegenwart von O2 mit der CODH-IV, für welche eine Rolle in der oxidativen Stressantwort von C. hydrogenoformans diskutiert wird, verglichen. CODH-IV ist sauerstofftoleranter als CODH-II und katalysiert die Oxidation von CO hocheffizient nahe des CO-Diffussionslimits. Die Aufklärung der Struktur von CODH-IV erlaubte die Identifikation einer möglichen Ursache der höheren O2-Toleranz. Die Strukturen beider CODHs ähneln sich stark. Allerdings weist CODH IV an der Rückseite des C-Clusters eine dichtere Packung der Seitenketten auf, wodurch der Cluster von einem Angriff durch O2 abgeschirmt werden könnte. CO-Dehydrogenase (CODH) is a key enzyme of the reductive acetyl-CoA pathway, in which it catalyses the reduction of CO2 to CO with rates up to 12 s-1. CODH catalyses the reverse reaction, the oxidation of CO with rates up to 31000 s-1. Both reactions take place at the active site of the enzyme, a [NiFe4S4OHx] cluster (cluster C). The genome of the hydrogenogenic bacterium C. hydrogenoformans contains five putative CODHs which might serve distinctive functions within the organism. This study characterises CODH-II and CODH-IV structurally and biochemically. Residues of the first and second coordination sphere of cluster C from CODH-II were exchanged and analysed concerning their structural and biochemical properties. The second part of this study analyses the influence of O2 on CODH-II and CODH-IV. CODH-II showed in solution a loss in CO-oxidation activity upon incubation with O2. In an analogous experiment, the destruction of cluster C by O2 was followed crystallographically. A role for CODH-IV in the oxidative stress response of C. hydrogenoformans has been discussed previously. Therefore, the behaviour of CODH-II and CODH-IV was analysed electrochemically in the presence of O2. CODH IV is more O2-tolerant than CODH-II and catalyses the oxidation of CO with high efficiency close to the diffusion limit of CO. Reasons for the enhanced O2-tolerance of CODH-IV could be deduced by elucidating its structure. Generally, both CODHs show high structural similarity. However, at the backside of cluster C CODH-IV shows a tighter packing of residues by which the cluster C might be shielded from O2.

[no abstract]

Phenolic compounds such as catechol represent a particular type of micropollutant whose high stability prevents rapid decay and metabolization in the environment. We successfully cloned a catechol 2,3-dioxygenase (C2,3O) from Pseudomonas putida mt-2 and expressed it in Escherichia coli BER2566. The biomass isolated from shake-flask fermentations was used to partially purify the enzyme. The enzyme proved unstable in clarified liquid fractions (50 mM Tris buffer, pH 7.6) and lost more than 90% of its activity over 7 h at 25 °C. In the presence of 10% acetone, the process was slowed down and 30% residual activity was still present after 7 h incubation. Storage of the enzyme in clear liquid fractions also proved difficult and total inactivation was achieved after 2 weeks even when kept frozen at –20 °C. Lowering the storage temperature to –80 °C preserved 30% activity over the same period. Only minor reactivation of the affected enzyme could be achieved after incubation at 20 °C in the presence of FeSO4 and/or ascorbic acid. Activity loss seems to be due mostly to Fe2+ oxidation as well as to subunit dissociation in the tetrameric structure. However, complete degradation of 1.0 mM catechol could be achieved at 20 °C and pH 7.6 over a 3 h period when using a suspension of whole cells or alginate-encapsulated cells for the biotransformation. Contrary to the clear liquid fractions, these forms of biocatalyst showed no significant sign of inactivation under the working conditions.

Dicarboxylic acids (DCA) are versatile chemical intermediates of industrial importance, e. g., for polymer production. The majority of industrial DCA are produced by chemical conversion. However, the chemical synthesis of long-chain unsaturated DCA is still challenging. An alternative is the biotechnological production with genetically modified yeasts. We explore the flavogenic yeast Candida guilliermondii as novel biocatalyst for DCA bioproduction.

[no abstract]

Ziel dieser Doktorarbeit war die Prüfung des Anwendungspotenzials eines neuartigen Biokatalysators für das synthetisch organische Labor und die Evaluierung dessen Substratspektrums. Das Lyophilisat von Pleurotus sapidus ist zur allylischen Oxidation von cyclischen Olefinen in der Lage und besitzt viele erfolgversprechende Eigenschaften. Es ist nicht giftig, sicher und einfach herzustellen, spezifisch in der Reaktion und zeigt ein breites Substratspektrum. Die katalytische Reaktion folgt den Regeln der Radikalchemie, weshalb die Regioselektivität gut vorhersagbar ist. Aus diesen Gründen ist der Biokatalysator sowohl fürs industrielle als auch fürs akademische Umfeld gut geeignet. Basierend auf den Erkenntnissen der Biotransformation von Valencen 12 konnten zahlreiche weitere Mono- und Sesquiterpene erfolgreich biotransformiert werden. Um den neuartigen Biokatalysator in einem organisch chemischen Labor nutzen zu können, wurde zunächst ein Scale-up durchgeführt. Anschließend wurde eine Standardmethode entwickelt, um das größtmögliche Potenzial des Biokatalysators zu erreichen. Jedoch bietet vor allem die Aufarbeitung nach der Biotransformation Optimierungspotenzial. Dadurch wäre sicherlich auch eine Steigerung der Ausbeuten möglich. Cyclohexen 45 und seine Derivate konnten erfolgreich zu Enonen und Allylalkoholen oxidiert werden. Substrate, welche das Cyclohexengrundgerüst enthalten, wurden bevorzugt umgesetzt. Hingegen konnte Cyclohepten 48 nur langsam und Cyclopenten 20 gar nicht biotransformiert werden. Eine benzylische Oxidation mit dem Lyophilisat des P. sapidus ist grundsätzlich möglich, läuft aber mit geringeren Umsetzungsraten als die allylische Oxidation ab. Bei vielen Substraten, einschließlich der heterocyclischen Substrate, war eine Umsetzung nur dann möglich, wenn ein stabilisiertes Radikal gebildet werden konnte. Bei den O-Heterocyclen wurde die Bildung von Lactonen bevorzugt und die Boc-geschützten N-Heterocyclen bildeten Diole, welche mittels Röntgendiffraktometie vermessen werden konnten. Mit Ausnahme des terpenoiden Citronellals 86 konnte kein weiteres acyclisches Substrat oxidiert werden. Mittels MALDI- und IR-Analytik konnte aber die Umsetzung des aus Polybutadien bestehenden Polyöls 110 bestätigt werden. Für zukünftige Projekte wäre eine vollständige Strukturaufklärung mit Hilfe von Modellverbindungen eventuell möglich. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der Biokatalysator erfolgreich in mehrstufigen organischen Synthesen eingesetzt werden kann. Dadurch konnte zum Beispiel in der Synthese von Weinlacton 104 ein chromhaltiges Oxidationsmittel PDC vermieden werden. Bei der Biotransformation von Neroloxid 101 konnte ein neuartiges, nicht-literaturbekanntes Molekül 103 isoliert werden, welches ein interessantes Aromaprofil besitzt. The aim of this thesis was the examination of the synthetic potential of a new biocatalyst and the evaluation of its substrate spectrum. The lyophilisate of an edible fungus Pleurotus sapidus is able to perform the allylic oxidation of cyclic olefins and has many promising features. It is non-toxic, safe and readily available even for synthetic laboratories without microbiological expertise. In addition the reaction with the biocatalyst is specifically and has a broad substrate scope. The catalytic reaction works in accordance with the rules of radical chemistry, therefore the regioselectivity is well predictable. For these reasons the new biocatalyst is well suited for the application in industrial as well as in the academic area. Based on the results of the biotransformation of valencene 12 numerous other mono- and sesquiterpenes have been successfully bioconverted. For using the novel biocatalyst in an organic laboratory, a scale-up was performed first. Subsequently, a standard method was developed. However, the work-up after the biotransformation provides still potential for optimization. Cyclohexene 45 and its derivatives were successfully oxidized to enones and allyl alcohols. Substrates, which contain the cyclohexene backbone, were preferably converted. By contrast, cyclopentene 20 was not recognized as a substrate at all, and cycloheptene 48 was oxidized very slowly to the corresponding enone 49 and ketone 50. Benzylic substrates were also converted by PSA although significantly slower than cycloalkenes. Remarkable is the fact, that for many substrates, including heterocyclic substrates, a conversion was only possible, when a stabilized radical could be formed. O-heterocycles preferred the formation of lactones and Boc-protected N-heterocycles formed diols, which could be analyzed by X-ray diffraction. With the exception of the terpenoic citronellal 86 no further acyclic substrates could be oxidized. The conversion of Polyöl 110, which consists of polybutadiene, has been verified by MALDI and IR-analytics. For future projects, a complete structural analysis using model compounds would be eventually possible. In addition, this work shows that the biocatalyst can be successfully used for multistage organic synthesis. In the synthesis of winelactone 104 a chrome-VI-containing oxidadant PDC could be avoided. The bioconversion of neroloxide 101 resulted in an isolation of a new molecule 103. This molecule 103 shows a very interesting aroma profile and is not known in the literature yet.

Ziel dieser Doktorarbeit war die Prüfung des Anwendungspotenzials eines neuartigen Biokatalysators für das synthetisch organische Labor und die Evaluierung dessen Substratspektrums. Das Lyophilisat von Pleurotus sapidus ist zur allylischen Oxidation von cyclischen Olefinen in der Lage und besitzt viele erfolgversprechende Eigenschaften. Es ist nicht giftig, sicher und einfach herzustellen, spezifisch in der Reaktion und zeigt ein breites Substratspektrum. Die katalytische Reaktion folgt den Regeln der Radikalchemie, weshalb die Regioselektivität gut vorhersagbar ist. Aus diesen Gründen ist der Biokatalysator sowohl fürs industrielle als auch fürs akademische Umfeld gut geeignet.Basierend auf den Erkenntnissen der Biotransformation von Valencen 12 konnten zahlreiche weitere Mono- und Sesquiterpene erfolgreich biotransformiert werden. Um den neuartigen Biokatalysator in einem organisch chemischen Labor nutzen zu können, wurde zunächst ein Scale-up durchgeführt. Anschließend wurde eine Standardmethode entwickelt, um das größtmögliche Potenzial des Biokatalysators zu erreichen. Jedoch bietet vor allem die Aufarbeitung nach der Biotransformation Optimierungspotenzial. Dadurch wäre sicherlich auch eine Steigerung der Ausbeuten möglich.Cyclohexen 45 und seine Derivate konnten erfolgreich zu Enonen und Allylalkoholen oxidiert werden. Substrate, welche das Cyclohexengrundgerüst enthalten, wurden bevorzugt umgesetzt. Hingegen konnte Cyclohepten 48 nur langsam und Cyclopenten 20 gar nicht biotransformiert werden. Eine benzylische Oxidation mit dem Lyophilisat des P. sapidus ist grundsätzlich möglich, läuft aber mit geringeren Umsetzungsraten als die allylische Oxidation ab.Bei vielen Substraten, einschließlich der heterocyclischen Substrate, war eine Umsetzung nur dann möglich, wenn ein stabilisiertes Radikal gebildet werden konnte. Bei den O-Heterocyclen wurde die Bildung von Lactonen bevorzugt und die Boc-geschützten N-Heterocyclen bildeten Diole, welche mittels Röntgendiffraktometie vermessen werden konnten.Mit Ausnahme des terpenoiden Citronellals 86 konnte kein weiteres acyclisches Substrat oxidiert werden. Mittels MALDI- und IR-Analytik konnte aber die Umsetzung des aus Polybutadien bestehenden Polyöls 110 bestätigt werden. Für zukünftige Projekte wäre eine vollständige Strukturaufklärung mit Hilfe von Modellverbindungen eventuell möglich.In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der Biokatalysator erfolgreich in mehrstufigen organischen Synthesen eingesetzt werden kann. Dadurch konnte zum Beispiel in der Synthese von Weinlacton 104 ein chromhaltiges Oxidationsmittel PDC vermieden werden. Bei der Biotransformation von Neroloxid 101 konnte ein neuartiges, nicht-literaturbekanntes Molekül 103 isoliert werden, welches ein interessantes Aromaprofil besitzt., The aim of this thesis was the examination of the synthetic potential of a new biocatalyst and the evaluation of its substrate spectrum. The lyophilisate of an edible fungus Pleurotus sapidus is able to perform the allylic oxidation of cyclic olefins and has many promising features. It is non-toxic, safe and readily available even for synthetic laboratories without microbiological expertise. In addition the reaction with the biocatalyst is specifically and has a broad substrate scope. The catalytic reaction works in accordance with the rules of radical chemistry, therefore the regioselectivity is well predictable. For these reasons the new biocatalyst is well suited for the application in industrial as well as in the academic area.Based on the results of the biotransformation of valencene 12 numerous other mono- and sesquiterpenes have been successfully bioconverted. For using the novel biocatalyst in an organic laboratory, a scale-up was performed first. Subsequently, a standard method was developed. However, the work-up after the biotransformation provides still potential for optimization.Cyclohexene 45 and its derivatives were successfully oxidized to enones and allyl alcohols. Substrates, which contain the cyclohexene backbone, were preferably converted. By contrast, cyclopentene 20 was not recognized as a substrate at all, and cycloheptene 48 was oxidized very slowly to the corresponding enone 49 and ketone 50. Benzylic substrates were also converted by PSA although significantly slower than cycloalkenes.Remarkable is the fact, that for many substrates, including heterocyclic substrates, a conversion was only possible, when a stabilized radical could be formed. O-heterocycles preferred the formation of lactones and Boc-protected N-heterocycles formed diols, which could be analyzed by X-ray diffraction.With the exception of the terpenoic citronellal 86 no further acyclic substrates could be oxidized. The conversion of Polyöl 110, which consists of polybutadiene, has been verified by MALDI and IR-analytics. For future projects, a complete structural analysis using model compounds would be eventually possible.In addition, this work shows that the biocatalyst can be successfully used for multistage organic synthesis. In the synthesis of winelactone 104 a chrome-VI-containing oxidadant PDC could be avoided. The bioconversion of neroloxide 101 resulted in an isolation of a new molecule 103. This molecule 103 shows a very interesting aroma profile and is not known in the literature yet.

In vorliegender Dissertation werden Grundlagen für die in situ Synthese von Polyketid-Sekundärmetaboliten erarbeitet. Die Verwendung permeabilisierter Escherichia coli Zellen ist ein neuartiger, vielversprechender Ansatz zur Synthese von komplexen Sekundärmetaboliten. Eine Behandlung von Zellen mit geringen Konzentrationen geeigneter Detergenzien führt dazu, dass niedermolekulare Verbindungen die Zellmembran ungehindert passieren können, während größere Biopolymere, wie z.B. Enzyme, in der Zelle verbleiben und für Synthesen genutzt werden können. Analyse und Manipulation des metabolischen Netzwerks ermöglichen darüber hinaus das Design maßgeschneiderter Biokatalysatoren. Durch Substratlimitierung können die permeabilisierten Zellen dazu genutzt werden, möglichst selektiv einzelne Biosyntheserouten zu bevorzugen. Zunächst wurde geprüft, ob es grundsätzlich möglich ist, den zellfremden Polyketid-Sekundärmetaboliten Flaviolin in permeabilisierten E. coli Zellen zu synthetisieren. Bedingungen für die Permeabilisierung der Zellmembran von E. coli BL21 wurden hierzu ermittelt und optimiert. Anhand der Anforderungen zur selektiven Synthese von Flaviolin wurde eine geeignete Syntheseroute ausgewählt. Die Syntheseroute wurde durch gezielte Überexpression von Schlüsselenzymen (Acetyl-CoA-Synthase (Acs) und Polyketid-Synthase (RppA)), sowie Deletion von Enzymen, welche unerwünschte Nebenreaktionen katalysieren (Acetat-Kinase (AckA) und Phospho-Transacetylase (Pta)), weiter optimiert. Darauf aufbauend konnte die Synthese von Oxytetracyclin (OTC) in permeabilisierten E. coli Zellen realisiert werden. Zur erfolgreichen Umsetzung der Synthese kamen modulare Versorgungssysteme für die benötigten Cofaktoren ATP, NADPH und SAM zum Einsatz, welche speziell für die Anforderungen einer Synthese mit permeabilisierten Zellen adaptiert wurden. Die Produktivität von einem Gramm des entwickelten Katalysatorgemischs, bestehend aus fünf E. coli Stämmen, beträgt 3,6∙10^(-3) nmol Oxytetracyclin pro Stunde und erreicht eine Endkonzentration von 1,88∙10^(-3) mmol/L. Für Synthesen komplexer Polyketide konnte in dieser Machbarkeitsstudie eine völlig neue Methode erschlossen werden. Eine Umsetzung in industrielle Produktionen bedarf noch weiterer Optimierung der Biokatalysatoren. The foundations for in situ Synthesis of natural compounds, especially polyketide secondary metabolites, are subject of this thesis. Using permeabilised cells for the synthesis of complex structures is a new, promising technique. Treatment of cells with low concentrations of surfactants enables low molecular weight compounds to diffuse through the membrane, while large biopolymers, i.e. enzymes, are trapped inside the cell and can be used for syntheses. Analysis and manipulation of the metabolic network allows for the design of tailored biocatalysts. Permeabilized cells can be used to selectively address distinct biosynthetic routes by limiting the substrates. First, the synthesis of the heterologous polyketide secondary metabolite flaviolin in permeabilized cells of E. coli was tested. Conditions for successful permeabilization of the cellular membrane were determined and optimized. Synthesis routes for flaviolin were developed depending on the demand of a selective synthesis. The synthesis was further optimized by overexpression of key enzymes (acetyl-CoA synthase (Acs) and polyketide synthase (RppA)) and deletion of enzymes catalyzing undesired side reactions (acetate-kinase (AckA) and phospho-transacetylase (Pta)). Based on the results, the synthesis of oxytetracycline (OTC) could be realized in permeabilized cells of E. coli. Modular supply modules supporting the reaction were developed for the essential cofactors ATP; NADPH and SAM regarding the demands of in situ synthesis. The productivity of one gram of the biocatalyst mixture, containing of five strains of E. coli, could be determined as 3,6∙10^(-3) nmol oxytetracycline per hour, reaching a final concentration of 1,88∙10^(-3) mmol/L. For the synthesis of complex polyketide secondary metabolites, this proof of principle study reveals a completely new method. Implications in industrial processes, however, require further optimizations of the biocatalysts.

[no abstract]

Cytochrome P450 erfreuen sich in den letzten Jahren immer größerer Beliebtheit als Biokatalysatoren, da sie den Einbau von atomarem Sauerstoff in nicht aktivierte C-H-Bindungen katalysieren. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Charakterisierung der P450 CYP109D1, CYP260A1, CYP260B1, CYP264A1 und CYP266A1 aus S. cellulosum So ce56. Hierfür wurden die P450 in E. coli rekombinant exprimiert und mögliche Substrate wurden mit den gereinigten Enzymen identifiziert. Um für die anschließende Produktcharakterisierung ausreichende Produktmengen herzustellen, wurde ein universell einsetzbares E. coli Ganzzellsystem etabliert, bei dem das jeweilige P450 mit einem heterologen Redoxsystem, bestehend aus Adrenodoxinreduktase (AdR) und Adrenodoxin (Adx), coexprimiert wurde. Dieses System konnte durch den Austausch der schwer exprimierbaren AdR durch die E. coli eigene Reduktase (Fpr) entscheidend optimiert werden. Gleichzeitig wurde durch den erstmaligen Einsatz des M9CA-Mediums die endogene Bildung von Indol und die daraus resultierende Inhibition der P450 Biotransformationen verhindert. Mit dem CYP260A1-abhängigen Ganzzellsystem wurden 9 Steroide erfolgreich umgesetzt und die Produkte anschließend isoliert und charakterisiert. Interessanterweise stellte sich heraus, dass es sich bei CYP260A1 um die erste beschriebene 1α-Steroidhydroxylase handelt, mit der es möglich ist, bislang noch nicht bekannte Steroidderivate herzustellen. In the last years, Cytochromes P450 have become more and more popular as biocatalysts due to their ability to introduce molecular oxygen into non-activated C-H bonds. This work is concerned with the characterization of the P450s CYP109D1, CYP260A1, CYP260B1, CYP264A1 and CYP266A1 from Sorangium cellulosum So ce56. For this purpose, the P450s were recombinantly expressed in E. coli and the purified enzymes were used to identify po-tential substrates. In order to obtain sufficient quantities of product for structural characteriza-tion, a universally applicable E. coli whole-cell system was established, in which the respective P450 was co-expressed with a heterologous redox system consisting of adrenodoxin reductase and adrenodoxin. This system could be significantly enhanced by the exchange of the badly expressable AdR by the E. coli own reductase (Fpr). With the first-time application of M9CA medium the endogenous indole synthesis and its inhibitory effect on the P450 bio-transformations could be suppressed. Using this whole-cell system; the products of the CYP260A1 dependent biotransformations from 9 steroids could be isolated and character-ized. Interestingly, CYP260A1 was shown to act as a 1α-steroidhydroxylase. Thus, CYP260A1 is a promising candidate for biotransformations aiming at the production of hith-erto unknown steroid derivatives.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Fermentationsprozesses für die Produktion der Cytrochrom P450 Monooxygenase in Escherichia coli. Dieses Enzym findet Anwendung in der chemischen Industrie für die Herstellung bio-basierender Polymere. Es aktiviert O2-Moleküle und fügt ein Sauerstoffatom in das Substrat ein. Diese Eigenschaft macht die Produktion des Enzyms schwierig, da mit steigendem Sauerstoffeintrag auch die Enzymaktivität steigen könnte. Die Oxidationsreaktion kann den Metabolismus der Zelle schädigen und so zu niedrigeren Produktausbeuten führen. Daher war es wichtig den Einfluss des Sauerstoffeintrages auf den Prozess zu untersuchen. Als Stamm wurde der E. coli K-12 HMS174(DE3) verwendet, der ein pET Plasmid, auf dem die Monooxygenase sowie die dazugehörige Reduktase kodiert ist (pET28a_Cyp153-CPR_M.aq.), enthält. Zuerst wurde mit Schüttelkolbenversuchen der Einfluss der Temperatur untersucht, bei denen die Kultivierung bei 30 °C gegenüber 37 °C einen stabileren Biomasseverlauf zeigte. Anschließend erfolgten Fermentationen in einem Bioreaktor. In diesen Fermentationsversuchen wurde der Einfluss des Sauerstoffeintrages (10% pO2 vs. 30%), der Induktionsmethode (Puls(Voll)-induktion vs. Teilinduktion), der Induktionsstärke (0,5 µmol vs. 0,9 µmol IPTG * g-1 BTS), als auch der Einfluss der Fermentationsmethode (Standard Fedbatchprozess mit 40 g * L-1 BTS vs. Hochzelldichte-Fermentation (HCD) mit 100 g * L-1 BTS) auf die Produktbildung untersucht. Die gemessenen Parameter umfassten den Biomasseverlauf, Restsubstrat- und Nukleotidanalyse mittels HPLC, Kohlenstoffbilanzen sowie spezifische Sauerstoffaufnahme und Produktbildung. Da E. coli vor allem bei hoher Expressionsrate zur Bildung von Inclusion Bodies (IBs) neigt, wurde zusätzlich die Verteilung des Produktes in lösliche bzw. unlösliche Fraktion mittels Gelelektrophorese analysiert. Beim Vergleich des Einflusses verschiedener Belüftungsraten auf das Wachstum und die Produktbildung, zeigten sich nur geringe Unterschiede. Die Erhöhung der Induktionsstärke hatte einen schwachen Einfluss auf das Wachstum, brachte aber keine signifikante Produktsteigerung. Der Vergleich der Induktionsmethoden zeigte jedoch große Unterschiede in Hinsicht auf Wachstum und Produktivität. Die Fermentationen mit Teilinduktion bewiesen Stabilität und höhere Produktivität gegenüber der Fermentation mit Vollinduktion. Bei der Vollinduktion wurde durch die stärkere Induktion die Zelle dermaßen überlastet, dass es zu einem kompletten Einbruch des Wachstums kam. Auch der HCD Fermentationsprozess zeigte nur schwache Produktbildung verglichen mit dem Standard Fedbatchprozess und erwies sich daher als nicht wirtschaftlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Teilinduktionsprozess mit schwacher Induktion am besten für die Produktion der Monooxygenase mit diesem System geeignet war. The goal of this work was the design of a fermentation process for the production of cytochrome P450 monooxygenase in Escherichia coli. This enzyme is used for the production of bio-based polymers in chemical industry. It activates oxygen molecules and inserts one oxygen atom into a substrate. This behavior could influence the production of monooxygenases because the oxygen flux may also result in higher enzyme activity. Additionally, oxidation reactions driven by the monooxygenase activity may cause adverse effects on host metabolism, thereby resulting in lowered product yields. Hence, the influence of the aeration rate onto the process outcome was investigated. The selected expression host E. coli K-12 HMS174(DE3) contains a pET plasmid encoding the monooxygenase and the corresponding reductase (pET28a_Cyp153-CPR_M.aq.). In a first step the influence of the temperature on growth behavior was tested in shaking flask experiments and 30 °C turned out to be superior to 37 °C in terms of stability. Subsequently fermentations in a bioreactor were performed and the influence of oxygen saturation (10% pO2 vs. 30%), induction strength (0.5 µmol vs. 0.9 µmol IPTG * g-1 DM), the induction method (single-pulsed vs. limited), and the fermentation strategy (standard fed batch process with 40 g * L-1 DM vs. high cell density fermentation (HCD) with 100 g * L-1 DM) on process performance and product yield were investigated. The generated data include biomass formation, HPLC analysis of organic by-products and nucleotides, product formation, calculation of carbon balance as well as specific oxygen uptake rate. Additionally, the distribution of the soluble and insoluble product fractions were quantified by SDS-page as high-level expression often leads to inclusion body (IB) formation. The influence of different oxygen saturations on growth behavior and product yield showed only little diversities. The variation of the induction level showed also minor influence on cell growth and no influence on the product yield. The comparison of the induction method resulted in significant differences in cell growth and productivity. The fermentation processes with limited induction showed stable cell growth and higher product titers compared to the single-pulse induction. The full induction strategy led to extremely high gene expression rates which exceeded host physiology and consequently cell metabolism got overstrained and growth ceased. The HCD fermentation showed similar volumetric yields compared to the standard fed batch process and is therefore noncompetitive in terms of cost effectiveness. In summary, the fed batch process with limited induction and low induction strength proved to be the optimal setup for the production of the investigated monooxygenase system. vorgelegt von: Martin Schönlieb Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2012

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