Search

Die im Menschen stattfindende metabolische Aktivierung von Arylaminen ist ein komplexer Prozess, dessen toxikologischen Konsequenzen von vielen Variablen abhängen. Die Phase I- und II-Enzyme hCYP1A2 (humanes Cytochrom P450 1A2) und hNAT2 (humane N-Acetyltransferase2), deren ausgeprägter Polymorphismus die Symetrie und somit die aus der Interaktion beider Enzyme resultierende Toxizität beeinflussen kann, stellen Schlüsselenzyme in diesem Prozess dar. Eine isolierte Betrachtung nur eines dieser beiden Schlüsselenzyme würde folglich die realen Verhältnisse des Arylamin-Stoffwechsels nur sehr reduziert widerspiegeln. Mit der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten stabilen Koexpression von hCYP1A2 und hNAT2*4, *5B, *6A und *13 in V79MZ Chinesischen Hamsterzellen werden sowohl das komplexe Zusammenspiel von Phase I und Phase II-Enzymen als auch der kaukasische hNAT2-Polymorphismus umfassend in vitro dargestellt. Die stabile Integration der cDNAs von hCYP1A2 und hNAT2*4, *5B, *6A und *13 ins V79MZ Genom und deren Expression wurde sowohl auf molekularbiologischer Ebene, als auch biokatalytisch eingehend charakterisiert. Unter Verwendung des pcDNA3.1(+)-Vektorsystems gelang es für hCYP1A2 und die polymorphen Formen der hNAT2 ein vergleichbares Expressionsniveau sicherzustellen. Die Verifikation der Substratspezifität rekombinanter hNAT2 aus V79MZ-Zellen bei Umsetzung des Markersubstrates Sulfamethazin gelang über einen Vergleich mit enzymkinetischen Parametern heterolog exprimerter hNAT1 und hNAT2 aus Baculovirus-transfizierten Insektenzellen. Um die Enzymaktivitäten der verschiedenen Allele des hNAT2-Gens miteinander vergleichen zu können, wurde ein standardisiertes, HPLC-UV basiertes Auswahlverfahren für hNAT2-Klone bezüglich der Umsetzung von 2-Aminofluoren zu N-Acetylaminofluoren entwickelt. Die Validität dieses Verfahrens konnte über einen Vergleich des Wildtyps hNAT2*4 mit der allelischen Variante hNAT*13 bestätigt werden, da diese Enzymvariante gemäss in vivo-Ergebnissen aufgrund ihrer gegenüber dem Wildtyp unveränderten Aktivität, als interne Kontrolle fungierte. Desweiteren lagen die für die N-Acetylierung von 2-Aminofluoren und Sulfamethazin ermittelten kinetischen Parameter im physiologischen Bereich und spiegeln damit die für die kaukasische Population typische bimordale Verteilung von langsamen und schnellen Acetylierer-Phänotypen wider. Darüber hinaus konnte in Übereinstimmung mit in vivo- und in vitro-Ergebnissen gezeigt werden, dass die Aminosäuren-Substitutionen Ile114Tyr, Lys268Arg und Arg197Gln mit einem Verlust an enzymatischer Aktivität verbunden sind, welche allerdings nicht auf Proteininstabilitäten sondern auf verringerte Substrataffinitäten zurückzuführen sind. Aufgrund der genotoxikologischen Untersuchungen ist für hNAT2 auf eine Schutzfunktion bei der Umsetzung des 2-Aminofluorens zu schliessen, da es in der Interaktion mit hCYP1A2 die Mutationsfrequenz deutlich senkt. Als Nebenbefund konnte für eine Reihe von unterschiedlich substituierten Aminophenolen gezeigt werden, dass deren Cytotoxizität von der relativen Ringposition ihrer Amino- und Hydroxylgruppe abhängig ist. Insgesamt gelang es also die V79 Cell BatteryTM formell um das Phase II-Enzym hNAT2 zu erweitern, enzymkinetische Unterschiede für die in der kaukasischen Population am häufigsten vorkommenden NAT2-Varianten in vitro zu verifizieren, sowie die toxikologische Relevanz der Interaktion von CYP1A2 und NAT2 zu demonstrieren. Aufgrund der Berücksichtigung mechanistischer und pharmakogenetischer Aspekte, könnte der Einsatz der nunmehr erweiterten V79 Cell BatteryTM, sowohl bei der Neuausrichtung der europäischen Chemikalienpolitk (REACH) als auch im Zusammenhang mit der präklinischen Arzneimittelentwicklung einen wichtigen Beitrag liefern. Metabolic activation of aromatic amines in humans is a complex process, whose toxicological consequences are dependent on many variable factors. The phase-1 and phase-2 enzymes hCYP1A2 (human Cytochrome P450 1A2) and hNAT2 (human N-Acetyltransferase 2), whose pronounced polymorphism can affect the symetry of this interaction, are both key enzymes and have a great impact on the subsequent toxicity. Because of this fact, the independent investigation of only one of these key enzymes would depict only an uncomplete picture of the arylamine metabolism. The stable coexpression of hCYP1A2 and hNAT2*4, *5B, *6A and *13 in V79MZ Chinese hamster cells represents a comprehensive approach on the one hand to depict the complex interaction of phase-1 and phase-2 enzymes and on the other hand reconstruct the caucasian hNAT2-polymorphism in vitro. The stable genomic integration of the cDNAs of hCYP1A2 and hNAT2*4, *5B, *6A and *13 and their expression could be demonstrated with molecularbiological and biocatalytical methods. Comparable expression levels of the recombinant cDNAs could be generated by using the pcDNA3.1(+)-vector system. Substrate specificity of recombinant hNAT2 could be verified by comparison with data of kinetic parameters of recombinant hNAT1 and hNAT2 from baculovirus transfected insect cells. In order to enable a comparison of enzyme activities of the hNAT2 allels, it was necessary to establish a standardized, HPLC-UV based selection method for active hNAT2 clones, with respect to their metabolism of 2-Aminofluorene. Validity of these process could be confirmed by using hNAT2*13 as an internal control and subsequent comparison with hNAT2*4, because no difference in enzymatic activity has been reported between these to alleles according to available literature. Kinetic parameters of N-Acetylation of 2-Aminofluoren and Sulfamethazine were found to be within the physiological range, thus the bimordal distribution of slow and rapid acetylator phenotypes within the caucasian population could be reflected. In compliance with in vitro and in vivo results, loss of enzymatic activity could be shown for aminoacid substitutions Ile114Tyr, Lys268Arg und Arg197Gln. It could be demonstrated, that the loss enzymatic activity is not due to less mRNA- and protein stability but to altered substrate affinities. Concerning the metabolism of 2-Aminofluoren a protective role of hNAT2 is suggested on the basis of genotoxicological approaches, wich have shown, that hNAT2 lowers mutation frequency while interacting whith hCYP1A2. Aside these observations, cytotoxicity of diverse aminophenols could be shown to be dependent from the relative ring position of amino and hydroxyl groups. Overall the V79 Cell BatteryTM could be extended by the implementation of the phase 2 enzyme hNAT2, differences enzyme kinetic parameters for the most common hNAT2 alleles of the caucasian population could be depicted in vitro and toxicological relevance could be demonstrated for the interaction of hCYP1A2 and hNAT2. Thus this work takes into account pharmacogenetic and mechanistic aspects, the extended V79 Cell BatteryTM might significantly contribute to the reform of European chemical policy as well as to preclinical drug development.

Aromatische Amine stellen aufgrund ihrer weiten Verbreitung und hohen Toxizität eine wichtige Gruppe von Umweltchemikalien dar. Ihre Analytik gestaltet sich schwierig, da sie als polare Verbindungen bei der erforderlichen Anreicherung Probleme bereiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb ein Derivatisierungsverfahren entwickelt, bei dem die Verbindungen direkt in wässriger Lösung diazotiert und durch Zugabe von Iodid zu aromatischen Iod-Verbindungen umgesetzt werden. Die Polarität der Analyten wird dadurch gemessen an den Oktanol-Wasser Verteilungskoeffizienten um durchschnittlich 2 Größenordnungen je Aminogruppe vermindert, so dass selbst polare aromatische Amine sehr gut mit Festphasenmikroextraktion (SPME) angereichert werden können. Das Verfahren ist auf ein breites Spektrum aromatischer Amine anwendbar, die sich zusammen derivatisieren und analysieren lassen. Neben alkylierten und halogenierten aromatischen Aminen ist die Derivatisierung gleichermaßen für desaktivierte nitrierte und dinitrierte sowie Diamino-Verbindungen geeignet. Die Derivate wurden mit Flüssig- wie Gaschromatographie getrennt. Mit GC-MS wurden für die untersuchten aromatischen Amine Nachweisgrenzen im unteren ng/L-Bereich erzielt. Durch die Detektion im fullscan-Modus war neben einer sicheren Identifizierung gleichzeitig der Nachweis unbekannter Verbindungen möglich. Dabei genügte ein Probevolumen von nur 10 mL, was zugleich die Voraussetzung zur Analyse biologischer Matrices schaffte. Trotz der zusätzlichen Derivatisierung waren die Reproduzierbarkeiten mit denen etablierter Verfahren zur Bestimmung aromatischer Amine vergleichbar. Mit dem Verfahren konnten zahlreiche aromatische Amine erstmals mit SPME im Abwasser von Rüstungsaltlasten bestimmt werden. Die Iod-Verbindungen ließen sich nach gaschromatographischer Trennung gezielt über einen elementselektiven Atomemissionsdetektor (GC-AED) detektieren, ohne dass Beeinträchtigungen durch Matrixkomponenten auftraten. Auf diese Weise ließen sich aromatische Amine schnell und einfach im Abwasser von Rüstungsaltlasten ausfindig machen. Die Übertragung auf komplexe Matrices erfordert zum Schutz der SPME-Faser die Extraktion aus dem Headspace. Dabei wurde das Gleichgewicht rascher erreicht, so dass bereits nach 25 min die Extraktion vieler Analyten unter Gleichgewichtsbedingungen erfolgte. Dadurch ließen sich für die Mehrzahl der Analyten die Empfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit weiter verbessern. Mit dem Ziel einer umfassenden Untersuchung aromatischer Amine wurde das in-situ Derivatisierung-SPME-Verfahren auf Urin angewendet. Nach saurer Hydrolyse wurde eine Vielzahl iodierter Verbindungen im Urin von Rauchern gefunden. Die Derivatisierung erwies sich dabei als hochgradig selektiv, da selbst in einer derart komplexen Matrix ausschließlich die Derivate aromatischer Amine auftraten. Bei der Detektion der Iod-Verbindungen über GC-AED wurden keinerlei Störungen durch biogene Iod-Verbindungen oder andere Amine beobachtet, so dass die Belastung mit aromatischen Aminen leicht beurteilt werden konnte. Beim Vergleich der Urinproben von Rauchern und Passivrauchern wurden nur geringe Unterschiede beobachtet, wohingegen im Urin von Nichtrauchern wesentlich weniger aromatische Amine enthalten waren. Durch die parallele Detektion mit GC-AED/MS konnte anhand der Massenspektren jedem Iod-Signal ein aromatisches Amin zugeordnet werden. Insgesamt konnte die Zahl der in Urin nachgewiesenen aromatischen Amine erheblich erweitert werden. So wurden über das in-situ Derivatisierungsverfahren mit GC-MS im Urin eines Rauchers über 200 aromatische Amine als iodierte Derivate identifiziert. Es handelte sich vorwiegend um alkylierte und chlorierte Aniline. Erstmals wurden neben den Aminobiphenylen und Naphthylaminen zahlreiche alkylierte Homologe identifiziert. Das Verfahren eignete sich zudem auch für die polaren Diamino-Verbindungen und Aminophenole, von denen einige in Urin nachgewiesen wurden. Gleichzeitig wurden mit Aminopyridinen und Aminochinolinen auch einige heteroaromatische Amine gefunden., Aromatic amines are an important class of pollutants due to their wide spread and high toxicity. The enrichment that is required for trace analysis is difficult due to the polarity of the amino compounds. For this reason, a derivatization method was developed consisting of a diazotisation of the aromatic amines directly in an aqueous solution and the conversion to aromatic iodine compounds by addition of iodide. The polarity of the analytes decreases on average by two orders of magnitude per amino group as measured by the octanol-water partition coefficients. Therefore even polar aromatic amines can be enriched by solid-phase microextraction (SPME). The method is applicable to a broad range of aromatic amines that can be derivatized and analysed simultaneously. Apart from alkylated and halogenated amines the derivatization is also suitable for deactivated nitrated and dinitrated anilines and diamino compounds. Liquid and gas chromatography were both used for the separation of the derivatives that are stable in aqueous solution for several weeks. For GC-MS analysis the limits of detection of the investigated aromatic amines were in the lower ng/L range. The detection in the fullscan-mode permitted an unequivocal verification of the target compounds as well as a general non-target analysis for aromatic amines. A sample volume of only 10 mL was sufficient for a sensitive determination so that biological matrices are also accessible. Despite the additional derivatization the reproducibility was comparable with those of established methods for the analysis of aromatic amines. The developed in-situ derivatization SPME GC-MS method was successfully applied to the determination of aromatic amines in contaminated groundwater at the site of a former ammunition plant. The iodine compounds were detected selectively after gas-chromatographic separation by an element-selective atomic-emission detector (GC-AED), providing a powerful screening method even for unknown aromatic amines after derivatization. By this method aromatic amines were easily traced in the runoff-water of a former ammunition plant, without any interference by matrix components or iodinated reaction products. The method transfer to complex matrices required the extraction from the headspace to protect the SPME-fiber. For most derivatives the sensitivity and reproducibility of HS-SPME was even improved compared to direct extraction. The equilibrium is reached quickly, so that after only 25 min the extraction of many analytes is carried out under equilibrium conditions. The in-situ derivatization SPME method was applied to urine to give an comprehensive overview of the occurring aromatic amines. After acidic hydrolysis and derivatization numerous iodine compounds were found in the urine of smokers. The derivatization proved to be highly selective since even in such a complex matrix exclusively the derivatives of aromatic amines were detected. Thus, GC-AED measurements were not inferred by natural iodine compounds or aliphatic amines that also form iodine derivatives so that the exposure to aromatic amines can be easily judged. For urine samples of smokers and passive smokers only slight differences were found, whereas in the urine of nonsmokers without known exposure to cigarette smoke significantly less compounds were found. By parallel atomic-emission and mass-spectrometric detection with GC-AED/MS for each iodine signal a mass spectrum of the related derivative was assigned. Finally the number of known aromatic amines in urine could be remarkably extended. By in-situ derivatization SPME GC-MS in the urine of a smoking person more than 200 aromatic amines were identified as iodinated derivatives. Most of them were alkylated or chlorinated anilines. For the first time several alkylated homologues of aminobiphenyls and naphthylamines have been found. Furthermore, the method was used to identify the more polar diamino compounds and aminophenols in urine. At the same time, some nitrogen-substituted aminopyridines and aminoquinolines occurred.