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Diplôme : Dr. d'Université

Two scientists contributed to the discovery of the first virus, Tobacco mosaic virus. Ivanoski reported in 1892 that extracts from infected leaves were still infectious after filtration through a Chamberland filter-candle. Bacteria are retained by such filters, a new world was discovered: filterable pathogens. However, Ivanovski probably did not grasp the full meaning of his discovery. Beijerinck, in 1898, was the first to call 'virus', the incitant of the tobacco mosaic. He showed that the incitant was able to migrate in an agar gel, therefore being an infectious soluble agent, or a 'contagium vivum fluidum' and definitively not a 'contagium fixum' as would be a bacteria. Ivanovski and Beijerinck brought unequal but decisive and complementary contributions to the discovery of viruses. Since then, discoveries made on Tobacco mosaic virus have stood out as milestones of virology history.

* INRA Documentation, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon cedex 9 Diffusion du document : INRA Documentation, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon cedex 9

L’étude fondamentale du virus appelé « Beet necrotic yellow vein virus » (BNYVV), responsable de la maladie dite « rhizomanie » de la Betterave sucrière, est fortement perturbée par la présence quasi permanente du virus de la Mosaïque du Tabac (VMT) dans les lots de plantes inoculées. Ce virus n’est cependant pas décelable lors de la première transmission mécanique a une plante-test ; il n’apparaît qu’après plusieurs repiquages. Par contre la méthode sérologique ELISA (CLARK & ADAMS 1977) montre la présence, dans le jus même de radicelles de betteraves rhizomaniées du champ, de très faibles quantités (inférieures à 100 nanogrammes/ml) de VMT appartenant tantôt à la souche U1, tantôt à la souche U2, ou encore aux 2 en mélange. Dans un cas précis, tous les prélèvements provenant d’un même champ ont réagi positivement au VMT. Le fait de déceler la présence du VMT dans les isolats provenant de champs différents de régions diverses nous incite à penser qu’il existe une association entre ce virus et celui de la Rhizomanie., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been used to detect TMV in the rootlets of beets infected with beet necrotic yellow vein virus (BNYVV). TMV was present only in very low concentrations in the infected beets and its detection by mechanical inoculation to Chenopodium quinoa needed a series of transmissions. The possibility that the presence of TMV could have arisen as a glasshouse contamination was refuted by the serological findings.

L’infection préalable des plantes de piment (Capsicum annuum L.) par le virus de la mosaïque du tabac (TMV) supprime toute résistance à Phytophthora capsici Leon. dans les tissus de la tige pendant la période de multiplication active du virus. L’infection par le virus Y de la pomme de terre (PVY) inhibe une phase tardive de cette même résistance. Le virus de la mosaïque du concombre (CMV) ne modifie pratiquement pas l’expression de la résistance à P. capsici. Ces résultats semblent montrer que les 3 virus, qui sont des agents pathogènes fréquemment rencontrés sur Capsicum annuum L., modifient de façon spécifique le métabolisme cellulaire. Par ailleurs, on remarque que les mécanismes de résistance développés par le piment pour contrôler chacun de ces virus sont de type différent. Vis-à-vis de la mosaïque du tabac, on trouve un gène dominant induisant une hypersensibilité localisée. Les diverses résistances au virus Y sont contrôlées par des gènes récessifs mettant en jeu des mécanismes de restriction de la multiplication. Il n’existe pas de résistance véritable au virus de la mosaïque du concombre mais des moindres sensibilités, de type polygénique, s’exprimant surtout au stade adulte. Il existe peut-être un lien entre le mode de multiplication de ces virus et la nature des résistances efficaces apparues sous la pression de la sélection naturelle., Inoculation of pepper plants by tobacco mosaic virus (TMV) 8 to 18 days before Phytophthora capsici infection suppresses the resistance to the fungus in the stem tissues. Infection of the plants by potato virus Y (PVY) inhibits a late phase of this resistance. Cucumber mosaic virus (CMV) has practically no effect on the expression of resistance to Phytophthora. Those results seem to show that the three viruses, which are frequently found on Capsicum annuum, have a specific effect on the host cells metabolism. It is known that the resistance mechanisms developed during evolution by the pepper to control each of these viruses are different: dominant hypersensibility (TMV), recessive restriction of multiplication (PVY) or polygenic mature plant tolerance (CMV). It is suggested that a link could exist between the mode of multiplication of these viruses and the nature of the efficient resistance to the viral diseases.

Tobacco leaves of Nicotiana tabacum L., variety Samsun NN, show a low cinnamic acid-4-hydroxylase activity and a rather high O-methyltransferase activity. Caffeic acid, the substrate of the latter enzyme, is methylated specifically in the meta position. In TMV-infected leaves a strong increase in the activities of phenylalanine ammonia-lyase and of these two enzymes occurs at the time of appearance and development of the necrotic reaction.

The sensitivity to TMV of two varieties of N. Tabacum “Samsun” and “Xanthi” nc grown either on a mixture of peat and perlite, or in hydroponic conditions is influenced by calcium nutrition. 8 different levels of calcium in nutrient solutions provide a linear variation or the total calcium content in the whole plant and in the leaves and also in the protoplasts isolated from these leaves. The first result is that a local calcium content in the whole plant higher than 2,5% of dry material induces a resistance of tobacco to TMV. Under this value, the sensitivity to TMV increases following a biphasic curve with two maxima at 1-2 and 7,5 meq/l Ca in nutrient solutions. Nevertheless the correlation between the total calcium content of one vegetal organ and its susceptibility to TMV isn’t so clear, and consequently the molecular interpretation of the phenomenon is more difficult. Several hypothesis are proposed to understand the action of calcium during the numerous events leading to the viral infection of tobacco. First of all the TMV infectivity depends on the CaCl₂ concentration (maximal between 10 and 50mM) in the inoculum and this is related to the calcium nutrition level. This demonstrates a direct effect of calcium but its interpretation “in situ” is not evident. Secondly the actions of calcium as a second messenger and therefore of calmodulin are investigated as they can be involved in an early stimulation of the plant reaction against the viral infection. The tobacco calmodulin is purified and characterized, then its amount related to the total proteins is measured. The rate of calmodulin is independent from calcium nitration and from the infectious stage in tobacco plants. Finally and amplificated phosphorylation of one polypeptide of PM = 33000 is observed in TMV infected leaves two hours after their inoculations. Is this protéophosphorylation Ca and/or CaM dependent? What is likely action on the sensitivity of tobacco in relation with the calcium nutrition?; Par l’utilisation de deux méthodes de culture, sur tourbe-perlite et hydroponique strict, nous avons mis en évidence une influence de la nutrition calcique sur la sensibilité des tabacs de deux variétés « Samsun » et « Xanthi » n. C. Une gamme de 0,5 à 10 meq/l Ca a permis la différenciation des teneurs en Ca total des tabacs entiers et des feuilles, observable également au niveau des protoplastes issus de ces feuilles. Le premier résultat global obtenu est le suivant : des teneurs en Ca total des plantes entières supérieures à 2,5% de la masse de matière sèche favorisent la résistance des tabacs au VMT. En deçà de cette valeur, la sensibilité des plantes augmente suivant une courbe biphasique avec deux maxima correspondant à 1-2 et 7,5 meq/l Ca dans les solutions nutritives pour la culture sur tourbe-perlite. Cependant, la corrélation entre la teneur en Ca total d’un organe de la plante entière et sa sensibilité au VMT n’est pas aussi simple à établir, rendant difficile l’interprétation du phénomène à un niveau moléculaire. Diverses hypothèses sont envisagées sur le rôle du Ca dans la chaîne des évènements marquant l’infection du tabac par le VMT. D’une part, le pouvoir infectieux du VMT dépend de la concentration en CaCl₂ de l’inoculum (maximum entre 1 et 50 mM) et ceci est lié au niveau de nutrition calcique. Ce phénomène tend à rendre compte d’un effet direct du Ca mais qui reste difficilement interprétable « in situ ». D’autre part, nous nous sommes attachés plus particulièrement à l’étude du rôle de Ca en tant que messager secondaire et par conséquent de la calmoduline, car ils peuvent rendre compte d’un déclenchement précoce de la réaction de la plante contre l’infection virale. Tout d’abord la calmoduline de tabac a été isolée et caractérisée, puis son taux relatif par rapport aux protéines totales est apparu indépendant de l’état infectieux et du niveau de nutrition calcique, donc de la teneur en Ca total de la plante. Enfin, une amplification de la phosphorylation d’une bande protéique correspondant à un polypeptide de PM = 33000 a été observée dans les tissues infectés par le VMT, deux heures après l’inoculation. Il reste à savoir si cette protéophosphorylation est régulée par le Ca et/ou la calmoduline, et quel est son rôle sur la sensibilité des tabacs en relation avec la nutrition calcique.

A strain of Tobacco Mosaic Virus was isolated from Tomato leaves grown in Madagascar, in the region of Tananarive. Its optimal temperature for multiplication is between 30 and 34 degrees C, which makes it thermophilic compared to the common strain. This strain, however, does not appear to be identical to the thermoresistant TC strain.

Une méthode immunoenzymatique (méthode ELISA de type sandwich) a été appliquée au dosage du virus de la mosaïque du tabac dans trois types de tissus de tabac (Nicotiana tabacum var. « Samsun ») infectés et cultivés « in vitro » : cals, bourgeons végétatifs en multiplication rapide et plantules enracinées. Les anticorps anti-VMT sont couplés avec la (3β-glucose oxydase : la grande stabilité de cette enzyme, peu utilisée jusqu’alors en virologie végétale, permet une conservation de longue durée du conjugué. Il existe, pour la courbe étalon, une linéarité entre 7 et 125 ng/ml de virus purifié, déterminant ainsi la zone de dosage. Dans nos conditions, la quantité minimale d’antigène que l’on peut doser est de l’ordre de 0,1 (μg de virus/g de matière fraîche et la reproductibilité des résultats est estimée à 15 p. 100. La teneur en antigène viral est respectivement 20 et 40 fois plus élevée dans les bourgeons et les plantules que dans les cals., An immunoenzymatic assay (ELISA) has been used to measure the level of virus synthesis in callus, proliferating vegetative buds and rooted plantlets of tobacco (Nicotiana tabacum var. Samsun) cultured « in vitro » and infected by tobacco mosaic virus. The enzyme, coupled with TMV antibodies, was (3β-glucose oxidase : its high stability allows a long term storage of the conjugate. The tissue extracts were diluted so that the virus concentration ranged from 7 to 125 ng/ml (for linear response of standard) and virus levels were estimated by comparison with this standard curve. The amount of virus in buds and plantlets was respectively 20 and 40 times that in callus. This method gave reproducible results (variability less than 15 %), was very sensitive (down to 0.1 μg virus per gram fresh material is measurable) ; it could be a very helpful tool to study plant-virus interactions.

The hypersensitivity reaction in Nicotiana tabacum var. Xanthi n.c. infected with Tobacco mosaic virus (T.M.V.) leads to the production of aromatic amides (ferulylputrescine, diferulylputrescine, p-coumarylputrescine and di-p-coumarylputrescine) inthe cells around the necroses. Similar compounds are formed in Xanthi plants after floral induction. p-coumarylputrescine, di-p-coumarylputrescine and caffeylputrescine strongly inhibit T.M.V. multiplication.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been used to detect TMV in the rootlets of beets infected with beet necrotic yellow vein virus (BNYVV). TMV was present only in very low concentrations in the infected beets and its detection by mechanical inoculation to Chenopodium quinoa needed a series of transmissions. The possibility that the presence of TMV could have arisen as a glasshouse contamination was refuted by the serological findings.; L’étude fondamentale du virus appelé « Beet necrotic yellow vein virus » (BNYVV), responsable de la maladie dite « rhizomanie » de la Betterave sucrière, est fortement perturbée par la présence quasi permanente du virus de la Mosaïque du Tabac (VMT) dans les lots de plantes inoculées. Ce virus n’est cependant pas décelable lors de la première transmission mécanique a une plante-test ; il n’apparaît qu’après plusieurs repiquages. Par contre la méthode sérologique ELISA (CLARK & ADAMS 1977) montre la présence, dans le jus même de radicelles de betteraves rhizomaniées du champ, de très faibles quantités (inférieures à 100 nanogrammes/ml) de VMT appartenant tantôt à la souche U1, tantôt à la souche U2, ou encore aux 2 en mélange. Dans un cas précis, tous les prélèvements provenant d’un même champ ont réagi positivement au VMT. Le fait de déceler la présence du VMT dans les isolats provenant de champs différents de régions diverses nous incite à penser qu’il existe une association entre ce virus et celui de la Rhizomanie.

The origin of the light scattered from macromolecular solutions is considered and a discussion is made around the use of laser and light beating spectroscopy to analyze the scattered field spectrum. Several experiments are reviewed where quasi elastic light scattering has been applied.

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