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TTuberculosis continues to be a major cause of morbidity and mortality worldwide, mainly in developing countries, despite being a curable disease. The rapid and accurate diagnosis of active TB is essential for rapid initiation of treatment and disease control. The development of new rapid diagnostic tests for active TB represents a real challenge for the optimization of the diagnosis.The main objective of our thesis work was to develop and evaluate real-time PCR approaches targeting the IS6110 insertion sequence for the detection of sputum MTB DNA. We first developed a real-time PCR targeting the IS6110 repeat sequence for the quantification of MTB DNA. The evaluation of the sensitivity optimization steps of the IS6110 PCR made it possible to specify the analytical performances and the sensitivity gain compared to a PCR targeting the single gene senX3. After a comparison of six lysis / extraction protocols, the Chelex® method proved to be the most efficient in the recovery of DNA. The diagnostic performance of optimized PCR was evaluated and compared with automated Xpert MTB / RIF PCR on a panel of 62 respiratory specimens.In a second step, we compared the diagnostic performance of the optimized IS6110 PCR, the Xpert MTB / RIF test and the highly marketed ultra-sensitive version of the Xpert MTB / RIF Ultra leader PCR assay for the detection of sputum MTB DNA. having a low bacillary load.Finally, from 203 LCR collected in the context of the diagnosis of aseptic meningitis in Burkina Faso, we evaluated the performance of the multiplexed real-time PCR (IS6110, HSV1, HSV2) combined with extraction by the Chelex® method for the detection of MTB and Herpes DNA.; La tuberculose continue d’être une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde, principalement dans les pays en voie de développement, bien qu’elle soit une maladie curable. Le diagnostic rapide et précis de la TB active est essentiel pour l’initiation rapide du traitement et le contrôle de la maladie. Le développement de nouveaux tests rapides de diagnostic de TB active représente un véritable challenge pour l’optimisation du diagnostic.L’objectif principal de nos travaux de thèse était de développer et d’évaluer des approches de PCR en temps réel ciblant la séquence d’insertion IS6110 pour la détection de l’ADN de MTB dans les expectorations.Nous avons tout d’abord développé une PCR en temps réel ciblant la séquence répétée IS6110 pour la quantification de l’ADN de MTB. L’évaluation des étapes d’optimisation de la sensibilité de la PCR IS6110 a permis de préciser les performances analytiques et le gain de sensibilité comparativement à une PCR ciblant le gène unique senX3. Au terme d’une comparaison de six protocoles de lyse/ extraction la méthode Chelex® s’est avérée être la plus efficace dans la récupération de l’ADN. La performance diagnostique de la PCR optimisée a été évaluée et comparée avec la PCR automatisée Xpert MTB/RIF sur un panel de 62 échantillons respiratoires.Dans un deuxième temps, nous avons comparé la performance diagnostique de la PCR IS6110 optimisée, le test Xpert MTB/RIF et la version ultrasensible récemment commercialisée du test PCR leader Xpert MTB/RIF Ultra pour la détection de l’ADN de MTB dans des expectorations ayant une faible charge bacillaire.Enfin, à partir de 203 LCR collectés dans le cadre du diagnostic de méningites aseptiques au Burkina Faso, nous avons évalué la performance de la PCR en temps réel multiplexe (IS6110, HSV1, HSV2) combinée à l’extraction par la méthode Chelex® pour la détection de l’ADN de MTB et d’Herpès.

TTuberculosis continues to be a major cause of morbidity and mortality worldwide, mainly in developing countries, despite being a curable disease. The rapid and accurate diagnosis of active TB is essential for rapid initiation of treatment and disease control. The development of new rapid diagnostic tests for active TB represents a real challenge for the optimization of the diagnosis.The main objective of our thesis work was to develop and evaluate real-time PCR approaches targeting the IS6110 insertion sequence for the detection of sputum MTB DNA. We first developed a real-time PCR targeting the IS6110 repeat sequence for the quantification of MTB DNA. The evaluation of the sensitivity optimization steps of the IS6110 PCR made it possible to specify the analytical performances and the sensitivity gain compared to a PCR targeting the single gene senX3. After a comparison of six lysis / extraction protocols, the Chelex® method proved to be the most efficient in the recovery of DNA. The diagnostic performance of optimized PCR was evaluated and compared with automated Xpert MTB / RIF PCR on a panel of 62 respiratory specimens.In a second step, we compared the diagnostic performance of the optimized IS6110 PCR, the Xpert MTB / RIF test and the highly marketed ultra-sensitive version of the Xpert MTB / RIF Ultra leader PCR assay for the detection of sputum MTB DNA. having a low bacillary load.Finally, from 203 LCR collected in the context of the diagnosis of aseptic meningitis in Burkina Faso, we evaluated the performance of the multiplexed real-time PCR (IS6110, HSV1, HSV2) combined with extraction by the Chelex® method for the detection of MTB and Herpes DNA.; La tuberculose continue d’être une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde, principalement dans les pays en voie de développement, bien qu’elle soit une maladie curable. Le diagnostic rapide et précis de la TB active est essentiel pour l’initiation rapide du traitement et le contrôle de la maladie. Le développement de nouveaux tests rapides de diagnostic de TB active représente un véritable challenge pour l’optimisation du diagnostic.L’objectif principal de nos travaux de thèse était de développer et d’évaluer des approches de PCR en temps réel ciblant la séquence d’insertion IS6110 pour la détection de l’ADN de MTB dans les expectorations.Nous avons tout d’abord développé une PCR en temps réel ciblant la séquence répétée IS6110 pour la quantification de l’ADN de MTB. L’évaluation des étapes d’optimisation de la sensibilité de la PCR IS6110 a permis de préciser les performances analytiques et le gain de sensibilité comparativement à une PCR ciblant le gène unique senX3. Au terme d’une comparaison de six protocoles de lyse/ extraction la méthode Chelex® s’est avérée être la plus efficace dans la récupération de l’ADN. La performance diagnostique de la PCR optimisée a été évaluée et comparée avec la PCR automatisée Xpert MTB/RIF sur un panel de 62 échantillons respiratoires.Dans un deuxième temps, nous avons comparé la performance diagnostique de la PCR IS6110 optimisée, le test Xpert MTB/RIF et la version ultrasensible récemment commercialisée du test PCR leader Xpert MTB/RIF Ultra pour la détection de l’ADN de MTB dans des expectorations ayant une faible charge bacillaire.Enfin, à partir de 203 LCR collectés dans le cadre du diagnostic de méningites aseptiques au Burkina Faso, nous avons évalué la performance de la PCR en temps réel multiplexe (IS6110, HSV1, HSV2) combinée à l’extraction par la méthode Chelex® pour la détection de l’ADN de MTB et d’Herpès.

Choisya ternata is an ornamental plant that suffers from root rot disease due to Phytophthora. This disease can lead to severe production losses (up to 80 %), which require intensive use of phytosanitary products. A better understanding of plants defenses in required in order to reduce the use of these products. Therefore, the objectives of this thesis are I) identifying Phytophthora spp. pathogens of C. ternata, II) studying roots defense actors and III) developing an alternative control approach. Phytophthora spp. identification by ITS region amplification and sequencing highlighted the presence of Phytophthora parasitica on Choisya. Furthermore, Phytophthora tropicalis was identified for the first time in France and on Choisya culture. Two C. ternata cultivars were used to study the plants root defense actors against P. parasitica, Aztec pearl (less susceptible to root rot) and Goldfinger (more susceptible to root rot). Arabinogalactan proteins (AGPs) are glycomolecules of the cell wall which constitutes a physical barrier to pathogens. Studies showed the role of AGPs in the plant-pathogen interaction and more specifically in the case of oomycetes. However, Choisya root AGPs role in the interaction with P. parasitica is not studied. Our results showed biochemical differences in the monosaccharide composition of Aztec pearl root AGPs and the other AGPs fractions (Aztec pearl leaves and Goldfinger roots and leaves). Contrary to other fractions Aztec pearl root AGPs did not increase P. parasitica mycelium growth. These results suggest that oomycete was not able to degrade this fraction and use it as energy source. When P. parasitica infects the plant, these AGPs may be able to slow the infection and reduce disease severity. Plants have also developed chemical molecules known as secondary metabolites (SM) capable of protecting them against attackers. Studies showed that C. ternata leaves are rich with SM as alkaloids that have many pharmacological activities. Nevertheless, roots alkaloids composition and role in plant protection are not studied. Our results showed that roots of the two cultivars are riche with furoquinoline alkaloids. Some these alkaloids were more concentrated in Aztec pearl. But after inoculation with P. parasitica zoospores, the difference was not detectable anymore. Moreover, the total alkaloids extract of Aztec pearl inhibited P. parasitica mycelium growth, unlike the extract of Goldfinger. Another strategy of plants protection is the use of beneficial soil microorganisms that limits pathogens development and stimulate plant defenses. These microorganisms are known as biological control agents (BCA) and are sometimes used in horticulture as an alternative control strategy. In our study, treatments of C. ternata by different BCA were evaluated by a developed real time PCR (qPCR) targeting ypt1 and by symptoms annotation. This evaluation showed that combined treatments by Glomus intraradices with Gliocladium catenulatum and G. intraradices with Trichoderma atroviridae (respectively mycorrhizal fungi and filamentous fungi) offer a better protection against P. parasitica.; Choisya ternata est une plante ornementale souvent touchée par la maladie de la pourriture racinaire provoquée par Phytophthora. Cette maladie peut induire de pertes allant jusqu’à 80 %, ce qui implique l’utilisation intensive de produits phytosanitaires. Afin de limiter l’utilisation de ces produits toxiques, une meilleure connaissance des acteurs de la défense des plantes est nécessaire. Pour cela, les objectifs de cette thèse sont I) d’identifier les espèces du genre Phytophthora pathogènes de C. ternata, II) d’étudier des acteurs de défense au niveau racinaire et III) de développer une approche de lutte alternative aux phytosanitaires. L’identification des espèces de Phytophthora par l’amplification et le séquençage de la région ITS, montre la présence de Phytophthora parasitica dans la production de C. ternata en pépinière. Ils mettent aussi en évidence, pour la première fois en France et chez Choisya, la présence de Phytophthora tropicalis. Deux cultivars de C. ternata sont utilisés pour étudier les acteurs de la défense racinaire contre P. parasitica, Aztec pearl (moins sensible à la pourriture racinaire) et Goldfinger (plus sensible). Les arabinogalactane-protéines (AGPs) sont des glycomolécules de la paroi cellulaire qui constitue une barrière physique face aux pathogènes. Des études ont montré le rôle des AGPs dans l’interaction plante-pathogène et plus particulièrement avec les oomycètes. Toutefois, le rôle des AGPs racinaires de Choisya dans l’interaction avec P. parasitica n’est pas étudié. Nos résultats montrent des différences biochimiques au niveau de la composition monosaccharidique des AGPs racinaires d’Aztec pearl en comparaison avec les AGPs de feuilles de ce cultivar et les AGPs de feuilles et de racines de Goldfinger. Contrairement aux autres fractions, ces AGPs n’ont pas augmenté la croissance du mycélium de P. parasitica. Ces résultats suggèrent que l’oomycète n’est pas capable de dégrader cette fraction pour l’utiliser comme une source d’énergie. Pendant l’infection de la plante par P. parasitica, ces AGPs peuvent freiner la pénétration du pathogène, et par conséquent diminuer la sévérité de la maladie. Les plantes ont aussi développé des molécules chimiques nommées métabolites secondaires (MS) capables de les protéger contre leurs agresseurs. Des études ont montré que la partie foliaire de Choisya est riche en MS tels que les alcaloïdes dont plusieurseffets pharmacologiques sont connus. Cependant, leur composition racinaire et leur rôle dans la protection de la plante contre P. parasitica ne sont pas élucidés. Nos résultats montrent que les racines des deux cultivars sont riches en alcaloïdes furoquinoliques. Certains alcaloïdes sont présents en plus grande quantité chez Aztec pearl, mais suite à l’inoculation de zoospores de P. parasitica cette différence n’est plus détectable. De plus, l’extrait contenant les alcaloïdes totaux d’Aztec pearl ont été capables d’inhiber la croissance du mycélium de l’oomycète, contrairement à l’extrait issu de Goldfinger. Ces résultats montrent le rôle potentiel des alcaloïdes furoquinoliques dans la protection de la plante contre cet oomycète.

New practices used to elaborate wine lead to an increase of wine spoilage due to microorganisms. That is why, new technics have to be developed to quantify these microorganisms accurately, quickly and with low costs. The main wine spoilages are due to acetic acid bacteria (AAB) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans and Ga. liquefaciens) and Brettanomyces bruxellensis development. AAB transforms ethanol to acetic acid while B. bruxellensis transforms hydroxycinnamic acids to ethyl phenols (EP) (unpleasant odor molecules). In order to detect these wine spoilage microrganisms, flow cytometry coupled to fluorescent in situ hybridization has been assessed. No reproducible results have been developed for AAB in red wine while for B. bruxellensis, the existing protocol has been improved with a possible quantification after 18 h compared to 48-72 h in the previous protocol. The real-time PCR was also used to quantify these microorganisms. A protocol has been developed for the AAB quantification in red wine (103 cells/mL) with the use of a microbiological internal control to validate the DNA yield after extraction. For B. bruxellensis, three commercial kits were analyzed in an interlaboratory study. Quantifications were significantly different to the enumerations by Petri dish, with dead cell quantifications. Moreover, we demonstrated that the effectiveness of sulfite is dependent of the B. bruxellensis population. It also appears from these experiments that cells in viable but not culturable state do not produce EP., Les nouvelles pratiques utilisées pour l’élaboration du vin amènent à une recrudescence des altérations microbiennes. C’est pourquoi, de nouvelles méthodes doivent être développées afin de quantifier ces microorganismes de façon précise, rapide et avec de faibles coûts. Les principales altérations du vin sont dues aux bactéries acétiques (BA) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans et Ga. liquefaciens) et à Brettanomyces bruxellensis. Par l’action d’enzymes, les 1ères transforment l’éthanol en acide acétique alors que B. bruxellensis transforme les acides hydroxycinnamiques en éthyles phénols (EP) (molécules odorantes désagréables). La cytométrie en flux couplée à la technique d’hybridation in situ en fluorescence a tout d’abord été étudiée. Aucun résultat reproductible n’a été développé pour les BA en vin rouge alors que pour B. bruxellensis, le protocole existant a été amélioré avec une quantification possible en 18 h. La PCR en temps réel a également été utilisées afin de quantifier ces microorganismes. Un protocole a été développé pour la quantification des BA en vin rouge (103 cellules/mL) avec l’utilisation d’un témoin interne microbiologique permettant de valider le rendement de l’extraction de l’ADN. Pour B. bruxellensis, trois kits commerciaux ont été analysés lors d’une étude interlaboratoires. Les quantifications se sont révélées significativement différentes des énumérations sur boite de Pétri avec une quantification des cellules mortes. De plus, il a été étudié et validé l’effet population de B. bruxellensis sur l’efficacité du SO2. Il ressort également de ces expérimentations que les cellules en état viable mais non cultivable ne produisent pas d’EP.

New practices used to elaborate wine lead to an increase of wine spoilage due to microorganisms. That is why, new technics have to be developed to quantify these microorganisms accurately, quickly and with low costs. The main wine spoilages are due to acetic acid bacteria (AAB) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans and Ga. liquefaciens) and Brettanomyces bruxellensis development. AAB transforms ethanol to acetic acid while B. bruxellensis transforms hydroxycinnamic acids to ethyl phenols (EP) (unpleasant odor molecules). In order to detect these wine spoilage microrganisms, flow cytometry coupled to fluorescent in situ hybridization has been assessed. No reproducible results have been developed for AAB in red wine while for B. bruxellensis, the existing protocol has been improved with a possible quantification after 18 h compared to 48-72 h in the previous protocol. The real-time PCR was also used to quantify these microorganisms. A protocol has been developed for the AAB quantification in red wine (103 cells/mL) with the use of a microbiological internal control to validate the DNA yield after extraction. For B. bruxellensis, three commercial kits were analyzed in an interlaboratory study. Quantifications were significantly different to the enumerations by Petri dish, with dead cell quantifications. Moreover, we demonstrated that the effectiveness of sulfite is dependent of the B. bruxellensis population. It also appears from these experiments that cells in viable but not culturable state do not produce EP., Les nouvelles pratiques utilisées pour l’élaboration du vin amènent à une recrudescence des altérations microbiennes. C’est pourquoi, de nouvelles méthodes doivent être développées afin de quantifier ces microorganismes de façon précise, rapide et avec de faibles coûts. Les principales altérations du vin sont dues aux bactéries acétiques (BA) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans et Ga. liquefaciens) et à Brettanomyces bruxellensis. Par l’action d’enzymes, les 1ères transforment l’éthanol en acide acétique alors que B. bruxellensis transforme les acides hydroxycinnamiques en éthyles phénols (EP) (molécules odorantes désagréables). La cytométrie en flux couplée à la technique d’hybridation in situ en fluorescence a tout d’abord été étudiée. Aucun résultat reproductible n’a été développé pour les BA en vin rouge alors que pour B. bruxellensis, le protocole existant a été amélioré avec une quantification possible en 18 h. La PCR en temps réel a également été utilisées afin de quantifier ces microorganismes. Un protocole a été développé pour la quantification des BA en vin rouge (103 cellules/mL) avec l’utilisation d’un témoin interne microbiologique permettant de valider le rendement de l’extraction de l’ADN. Pour B. bruxellensis, trois kits commerciaux ont été analysés lors d’une étude interlaboratoires. Les quantifications se sont révélées significativement différentes des énumérations sur boite de Pétri avec une quantification des cellules mortes. De plus, il a été étudié et validé l’effet population de B. bruxellensis sur l’efficacité du SO2. Il ressort également de ces expérimentations que les cellules en état viable mais non cultivable ne produisent pas d’EP.

Begomoviruses (family Geminiviridae) are frequently detected with half genome sized defective virus DNAs, and for some of them with satellite DNAs of similar size, i.e. alphasatellite and betasatellite. Both molecules rely on the virus for maintenance in plant. The alphasatellite was rarely proved to have an impact on the helper virus but the betasatellite was often shown to increase its virulence. Except some begomoviruses, like Cotton leaf curl virus (CLCuV) which rely on a betasatellite for a full symptomatic infection in its natural host plant, most of the begomoviruses which were frequently detected with satellites do not rely on them for infectivity. Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is one of the most damaging begomovirus worldwide. The Mediterranean IL and Mld strains, the most invasive ones, were never detected in association with satellites, although they were experimentally proved to readily assist them for replication and movement in plant. This was particularly true for betasatellites and resulted in a dramatic increase in the virulence of TYLCV.The potential of a TYLCV-satellite association was assessed by testing various factors involved in the maintenance of both molecules in tomato plants: (i) the relative intra-plant accumulation of TYLCV and satellites, (ii) the frequency of host cells co-infected with TYLCV and satellites, and (iii) the transmission efficiency of satellites by the natural whitefly vector of TYLCV, Bemisia tabaci. Three satellites previously isolated from okra in Burkina Faso, were shown here to be assisted by TYLCV in tomato plants: Cotton leaf curl Gezira betasatellite (CLCuGB), Cotton leaf curl Gezira alphasatellite (CLCuGA) and Okra leaf curl Burkina Faso alphasatellite (OLCBFA). The dynamic of TYLCV and satellite DNAs monitored between 11 and 150 days post-inoculation (dpi) by quantitative PCR revealed that satellites accumulated at a higher level than the virus, and that, in contrast with alphasatellites which have no impact, betasatellites affected TYLCV-Mld accumulation. Although the ratio of virus/satellite amounts varies over time, satellites were maintained in all test plants up to 150 dpi and were readily transmitted at 32 and 150 dpi. TYLCV-IL interacts differentially with CLCuGB as its accumulation was not affected in the coinfected plants.At 32 dpi, the TYLCV/satellite infection status of plant cells was determined by FISH and more than 50% of the monitored infected cells were co-infected with TYLCV and a satellite. The infection status was consistent with the frequency of satellite DNA in plants. Unexpectedly a substantial number of cells were positive only for betasatellite, suggesting that the coinfection with the virus could be dispensable for replication. This observation raises question on the functioning of virus/satellite association or multipartite viruses. As the multiplicity of infection (MOI) of begomoviruses and satellites is expected to be a determinant of the efficiency of virus/satellite cell coinfection, two equi-competitive TYLCV variants were prepared to determine this parameter for TYLCV. Finally, PCR primers designed for the generic detection of betasatellites were designed to be used as a diagnostic tool by the French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety (ANSES).Besides the agronomic concern of the possible maintenance of DNA satellites with TYLCV, the results of our study are expected to provide a new insight on the interactions between begomovirus and satellites, at the plant, cellular and molecular levels.; Les virus du genre Begomovirus (famille Geminiviridae) sont fréquemment détectés en association avec des ADN satellites appelées alphasatellite et betasatellite qui font la moitié de la taille du génome viral. L’alphasatellite est autonome pour sa réplication et dépend du virus pour son mouvement et son encapsidation tandis que le betasatellite est dépendant de ces fonctions virales. L’alphasatellite a rarement été montré comme ayant un impact sur le virus assistant, contrairement au betasatellite qui augmente la virulence de son virus assistant. En dehors des bégomovirus tels que le Cotton leaf curl virus (CLCuV) qui ont besoin d’un betasatellite pour initier une infection symptomatique dans leur hôte naturel, la plupart des bégomovirus peuvent causer des symptômes, même sans les satellites avec lesquels ils sont parfois détectés. Le Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), un des virus les plus dommageables dans le monde a rarement été détecté associé à des ADN satellites. Les souches méditerranéennes qui sont aussi les plus invasives, n’ont jamais été détectées avec des ADN satellites, bien qu’elles soient capables en conditions artificielles de les assister avec pour conséquence une considérable augmentation de la virulence en cas de co-inoculation avec un betasatellite. Le risque potentiel d’association de satellites avec le TYLCV-Mld a été évalué en testant divers facteurs potentiellement impliqués dans le maintien de l’association TYLCV-satellite: (i) l'accumulation relative intra-plante du TYLCV et des satellites, (ii) la fréquence de co-infection au niveau cellulaire du TYLCV et des satellites, et (iii) l'efficacité de transmission des satellites par le vecteur Bemisia tabaci. Trois satellites précédemment isolés sur coton au Burkina Faso ont été montrés comme pouvant être assistés par le TYLCV dans des plantes de tomate: Cotton leaf curl Gezira betasatellite (CLCuGB), Cotton leaf curl Gezira alphasatellite (CLCuGA) et Okra leaf curl Burkina Faso alphasatellite (OLCBFA). La quantification par PCR quantitative des ADN du TYLCV et des trois satellites entre 11 et 150 jours après inoculation (dpi) révèle qu’en général, les satellites ont une accumulation supérieure à celle du virus, et que, contrairement aux alphasatellites qui n’ont aucun impact, le betasatellite affecte l’accumulation du TYLCV-Mld. Bien que le rapport des quantités de virus/satellites varie au cours du temps, les satellites sont maintenus avec le TYLCV-Mld au temps tardif de 150 dpi et sont transmis par B. tabaci à 32 et 150 dpi. Le TYLCV-IL interagit différemment avec le CLCuGB car son accumulation n’est pas affectée dans les plantes coinfectées.L’estimation par la technique FISH à 18 et 32 dpi de la fréquence d’association des molécules au niveau cellulaire montre que plus de la moitié des cellules infectées sont coinfectées par le TYLCV et un satellite. Ce résultat est cohérent avec la fréquence observée d’ADN satellite dans les plantes. Cependant, on observe de manière inattendue un nombre important de cellules ne semblant contenir que le betasatellite, ce qui pose des questions sur le fonctionnement des associations virus/satellites. Comme la multiplicité d'infection (MOI) des bégomovirus et des satellites est attendue pour être un facteur déterminant de l’efficacité de la co-infection cellulaire, deux variants équi-competitifs de TYLCV ont été préparés afin de déterminer ce paramètre. Enfin, des amorces PCR permettant la détection générique de betasatellites ont été dessinées pour être utilisées dans le diagnostic par l'Agence française pour l'alimentation, l'environnement et la santé et sécurité au travail (ANSES). Outre les conséquences agronomiques d’un maintien possible des satellites avec le TYLCV, les résultats de cette étude donnent un aperçu novateur sur les interactions entre les bégomovirus et les satellites, au niveau de la plante, au niveau cellulaire et moléculaire.

Actinomycetes are ubiquitous bacteria and some can be potentially pathogen for Humans in the air of some working areas. It’s notably the case in composting plants where bacteria concentrations can reach high values. Workers exposure to these inhalable bioaerosols can be source of various diseases (hypersensitivity pneumonitis notably). Although this problem is admitted, bibliography reveals a lack of knowledge about risk assessment: currently, none global method for bioaerosols sampling and analysis is standardized. So much that neither dose-effects relationship for most of these bacteria, nor Threshold Limit Value exists. Traditional methods, that are used, have some drawbacks (concentrations underestimation notably) and most often, aren’t specific.It’s the reason why the aim of the thesis, here described, is the development and the evaluation of the biomolecular technique of real time PCR for the quantification of bacteria in these bioaerosols. First, this method was developed and improved by oligonucleotides design, by comparison of many DNA extraction protocols and by the construction of standard ranges. Then, the method was compared to traditional widely used methods such as cultivable bacteria counting by cultures and epifluorescence microscopy, both on cells culture samples and experimental bioaerosols. After this characterization, the analytic method was applied on environmental bioaerosols sampled on real exposure conditions (composting plants).The method that we have developed, based on DNA extraction and real-time PCR, allows the quantification of Thermoactinomyces vulgaris DNA (based on gyrB gene amplification), of Thermobifida fusca and T. alba (ecf gene) and of mesophilic streptomycetes (rDNA 23S). The results obtained by PCR are strongly correlated with those obtained by counting on agar but PCR method offers more advantages than cultures. As PCR quantifies any form of the bacteria (vegetative cells and spores), the method goes over the drawbacks of traditional methods, like underestimation. The method has a real advantage of specificity, it’s also repeatable and sensitive. Sampling campaigns realized on 5 composting plants implanted in France have permitted measuring mesophilic and thermophilic bacteria concentrations by culture and establishing Thermoactinomyces vulgaris, Thermobifida sp. and Streptomyces sp. ones by PCR. The study confirms that composting activities release bioaerosols. And according to the localization of the sampling, the values could be rather high. It also underlines some informations as particles size distribution of the bioaerosol or the adequacy between sampling apparatus and PCR analysis. The works carried out, from qPCR method development for actinomycetes group to its application on environmental samples, give a lot of datas concerning airborne actinomycetes quantification. It permit to validate the developed method and give the only currently available measures for T. vulgaris, Thermobifida sp., and mesophilic streptomycetes in the air of composting plants, Les actinomycètes sont des bactéries ubiquitaires et certains sont reconnus comme potentiellement pathogènes pour l’Homme, dans l’air de certains lieux de travail. C’est notamment le cas dans l’air des plates-formes de compostage où les concentrations peuvent atteindre des valeurs relativement élevées. L’exposition des salariés à ce type de bioaérosols peut être la cause de pathologies diverses (notamment des pneumopathies d’hypersensibilité). Bien que le problème soit reconnu, la bibliographie démontre un manque de connaissances à propos de l’évaluation du risque : aucune méthode globale de prélèvement et d’analyse n’est, à l’heure actuelle, standardisée pour l’étude de ces bioaérosols, si bien qu’il n’existe aucune relation dose-effets pour la plupart de ces agents ni même de valeur limite d’exposition professionnelle. Les méthodes traditionnellement utilisées ne sont pas sans inconvénient (sous-estimation de la concentration réelle notamment) et le plus souvent non-spécificiques. C’est pourquoi l’objectif de la thèse, ici décrite, est le développement et l’évaluation de la technique de biologie moléculaire qu’est la PCR temps réel pour la quantification de bactéries dans ces bioaérosols. La méthode a tout d’abord été développée et optimisée notamment par le dessin d’oligonucléotides, par la comparaison de protocoles d’extraction d’ADN et par la réalisation de gammes étalons. Elle a ensuite été comparée aux techniques plus traditionnelles, encore largement utilisées, que sont le dénombrement du bacteries cultivable par mise en culture et l’épifluorescence, à la fois sur des cultures de cellules et sur des bioaérosols expérimentaux. Ce n’est qu’après l’avoir caractérisé qu’elle a été appliquée sur des bioaérosols prélevés en conditions réelles d’exposition, sur des plates-formes de compostage.La méthode développée, basée sur une extraction d’ADN et une PCR temps réel, permet la quantification de l’ADN de Thermoactinomyces vulgaris (basée sur l’amplification du gène GyrB), de Thermobifida fusca et T. alba (gène ecf) et des streptomycètes mésophiles (ARNr 23S). La PCR permet l’obtention de résultats fortement corrélés à ceux issus du dénombrement sur milieux gélosés mais offre de réels avantages par rapport à la culture. Comme ces quantifications prennent en compte n’importe quelle forme de la bactérie (cellules végétatives et spores), la PCR dépasse les inconvénients de sous-estimation liés aux méthodes traditionnelles. La technique a un réel avantage de spécificité, elle est répétable et sensible. Les campagnes de prélèvements effectuées sur 5 plates-formes de compostage en France ont permis de mesurer les concentrations en bactéries mésophiles et thermophiles par culture et d’établir celles en Thermoactinomyces vulgaris, Thermobifida sp. et Streptomyces sp. par PCR. L’étude confirme que les activités de compostage sont génératrices de bioaérosols avec parfois des valeurs relativement élevées selon les points échantillonnés. Elle met également en exergue des informations comme la distribution granulométrique du bioaérosol ou l’adéquation entre le type de prélèvement effectué et l’analyse par PCR. Les travaux menés, du développement de la méthode qPCR appliquée au groupe des actinomycètes à son application sur des échantillons environnementaux, apportent de nombreuses données pour la quantification des actinomycètes aéroportés. Ils ont permis d’acquérir des éléments de validation concernant la méthode mise en place et ont livré les seules mesures de concentrations disponibles à l’heure actuelle, pour T. vulgaris, Thermobifida sp., et les streptomycètes mésophiles dans l’air des plates-formes de compostage

Résumé. Interface entre l’organisme et l’environnement, la peau est le plus grand organe qui assure une fonction « barrière » vis-à-vis des stress biotiques ou abiotiques. Elle est constituée de trois couches cellulaires superposées: l’hypoderme, le derme, et l’épiderme. L’épiderme renferme également quatre couches cellulaires distinctes: la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse et la couche cornée. Les kératinocytes issus de la couche basale, constituent le type cellulaire le plus abondant au sein de l’épiderme. Dans ce projet, nous avons analysé l’expression de nombreux gènes (gènes structuraux et gènes de défense) par PCR quantitative en temps réel, au sein des différentes couches épidermiques isolées d’explant de peau humaine saine par microdissection laser (Laser Capture Microdissection, LCM). Nous avons ensuite évalué les effets de bactéries du microbiome cutané sur l’expression de gènes de défense. La distribution des produits de ces gènes a également été examinée par une approche immunocytochimique. Les résultats majeurs obtenus sont décrits ci-après. 1) Nous avons optimisé le protocole de LCM pour isoler deux fractions épidermiques respectivement enrichies en kératinocytes de la couche basale et de la couche granuleuse (Percoco et al., 2012. Experimental Dermatology 21, 531-534). Cet outil prometteur est maintenant aisément applicable à la recherche en Dermatologie. 2) Nous avons montré, que dans une peau humaine saine, les gènes responsables de l’immunité innée, codant notamment pour les bêta-defensines humaines de type 2 et 3 (human beta-defensin, hBD), sont exprimés de façon différentielle au sein des couches épidermiques. 3) Nous avons observé que les trois bactéries Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas fluorescens sont capables de moduler positivement l’expression des gènes codant pour des beta-defensines (hBD2 et hBD3) et des cytokines pro-inflammatoires (IL-1 alpha et bêta et IL-6). 4) En utilisant des anticorps spécifiques, nous avons localisé les produits de ces gènes dans les différentes couches épidermiques, à l’échelle cellulaire par microscopie à épifluorescence, et à l’échelle ultrastructurale par microscopie électronique à transmission (Percoco et al., Soumis).; The skin is the largest organ of the body. It is a natural barrier between the environment and the organism that plays a key role in the protection of the body against abiotic or biotic stress. The skin is made up of three different cell layers, namely the hypodermis, the dermis and the epidermis. The epidermis is, in turn, composed of four different layers, the basal, the spinous, the granular and the horny layer. In the epidermis, keratinocytes is the major cell type known to originate from basal cells. In the present work, we have studied the expression of a number of genes (antimicrobial peptide genes and pro-inflammatory cytokine genes) in different layers of healthy human epidermis using quantitative real-time PCR coupled to Laser Capture Microdissection (LCM). Using the same approach, we have also investigated the effect of bacteria belonging the human epidermal microbiota on the expression of the same genes within the epidermal layers. In addition, the spatial distribution of gene products has also been examined using immunocytochemsitry. The major findings are: 1) We have developed an optimized LCM protocol for the isolation of human epidermal layers. We have been able to isolate two fractions highly enriched in keratinocytes from the basal and the granular layers (Percoco et al. 2012. Experimental Dermatology. 21, 531-534). Such a method can now be easily applied in dermatological research. 2) We have found that, in healthy human epidermis, innate immunity-related genes including human beta-defensin genes are differentially expressed within different layers. 3) We have found that the three bacteria Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus and Pseudomonas fluorescens induce a significant increase in the expression of beta-defensin (hBD2 and hBD3) and pro-inflammatory cytokines (IL-1 alpha, IL-1 beta and IL-6) genes. 4) We have localized the gene products within different cell layers using specific antibodies in conjunction with immunofluorescence and immunogold-electron microscopy (Percoco et al., Submitted).

Résumé. Interface entre l’organisme et l’environnement, la peau est le plus grand organe qui assure une fonction « barrière » vis-à-vis des stress biotiques ou abiotiques. Elle est constituée de trois couches cellulaires superposées: l’hypoderme, le derme, et l’épiderme. L’épiderme renferme également quatre couches cellulaires distinctes: la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse et la couche cornée. Les kératinocytes issus de la couche basale, constituent le type cellulaire le plus abondant au sein de l’épiderme. Dans ce projet, nous avons analysé l’expression de nombreux gènes (gènes structuraux et gènes de défense) par PCR quantitative en temps réel, au sein des différentes couches épidermiques isolées d’explant de peau humaine saine par microdissection laser (Laser Capture Microdissection, LCM). Nous avons ensuite évalué les effets de bactéries du microbiome cutané sur l’expression de gènes de défense. La distribution des produits de ces gènes a également été examinée par une approche immunocytochimique. Les résultats majeurs obtenus sont décrits ci-après. 1) Nous avons optimisé le protocole de LCM pour isoler deux fractions épidermiques respectivement enrichies en kératinocytes de la couche basale et de la couche granuleuse (Percoco et al., 2012. Experimental Dermatology 21, 531-534). Cet outil prometteur est maintenant aisément applicable à la recherche en Dermatologie. 2) Nous avons montré, que dans une peau humaine saine, les gènes responsables de l’immunité innée, codant notamment pour les bêta-defensines humaines de type 2 et 3 (human beta-defensin, hBD), sont exprimés de façon différentielle au sein des couches épidermiques. 3) Nous avons observé que les trois bactéries Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas fluorescens sont capables de moduler positivement l’expression des gènes codant pour des beta-defensines (hBD2 et hBD3) et des cytokines pro-inflammatoires (IL-1 alpha et bêta et IL-6). 4) En utilisant des anticorps spécifiques, nous avons localisé les produits de ces gènes dans les différentes couches épidermiques, à l’échelle cellulaire par microscopie à épifluorescence, et à l’échelle ultrastructurale par microscopie électronique à transmission (Percoco et al., Soumis)., The skin is the largest organ of the body. It is a natural barrier between the environment and the organism that plays a key role in the protection of the body against abiotic or biotic stress. The skin is made up of three different cell layers, namely the hypodermis, the dermis and the epidermis. The epidermis is, in turn, composed of four different layers, the basal, the spinous, the granular and the horny layer. In the epidermis, keratinocytes is the major cell type known to originate from basal cells. In the present work, we have studied the expression of a number of genes (antimicrobial peptide genes and pro-inflammatory cytokine genes) in different layers of healthy human epidermis using quantitative real-time PCR coupled to Laser Capture Microdissection (LCM). Using the same approach, we have also investigated the effect of bacteria belonging the human epidermal microbiota on the expression of the same genes within the epidermal layers. In addition, the spatial distribution of gene products has also been examined using immunocytochemsitry. The major findings are: 1) We have developed an optimized LCM protocol for the isolation of human epidermal layers. We have been able to isolate two fractions highly enriched in keratinocytes from the basal and the granular layers (Percoco et al. 2012. Experimental Dermatology. 21, 531-534). Such a method can now be easily applied in dermatological research. 2) We have found that, in healthy human epidermis, innate immunity-related genes including human beta-defensin genes are differentially expressed within different layers. 3) We have found that the three bacteria Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus and Pseudomonas fluorescens induce a significant increase in the expression of beta-defensin (hBD2 and hBD3) and pro-inflammatory cytokines (IL-1 alpha, IL-1 beta and IL-6) genes. 4) We have localized the gene products within different cell layers using specific antibodies in conjunction with immunofluorescence and immunogold-electron microscopy (Percoco et al., Submitted).

Le méthane entérique est formé par les Archea méthanogènes au cours de la dégradation microbienne des aliments dans le rumen, cequi implique que toute variation dans sa production est le résultat d'un changement dans la chaîne alimentaire microbienne. En effetla structure et/ou l'activité de la communauté microbienne fermentaire (bactéries et protozoaires) détermine la quantité et,partiellement, l'utilisation de l'hydrogène, substrat limitant de la méthanogenèse. Les microorganismes méthanogènes ne constituentqu'une petite partie de la biomasse et de la diversité microbienne dans le rumen. Aujourd'hui, l'absence de lien entre la productionde méthane et le nombre des méthanogènes est bien établie sauf lorsque des inhibiteurs spécifiques des Archaea sont employés (vaccin,additifs chimiques). Les variations dans la production de méthane, observées suite à des modifications de l'écosystème microbienou d'un des constituants de la ration, s'expliquent par des changements de diversité et/ou d'activité des Archaea par suite d'unemoindre disponibilité en hydrogène. En effet, les études récentes relient les variations observées dans la production de méthane à desvariations dans l'activité métabolique des méthanogènes et/ou à des changements fins dans leur diversité au niveau de l'espèce oumême de la souche. Ainsi, le développement des stratégies efficaces à long terme pour réduire les émissions de méthane, impliqueinévitablement la bonne compréhension des mécanismes impliqués en considérant l'écosystème microbien dans son ensemble., Enteric methane is formed during the microbial degradation of food in the rumen, and any variation in its production level is the result of a change in the microbial ecosystem. Indeed the structure and / or activity of the microbial community determine the production and, partially, the utilization of dihydrogen (the limiting substrate of methanogenesis). Methane is produced by a specialized group of microbes, the methanogens that represent only a small part of the microbial biomass and diversity in the rumen. There is no relationship between methane production and number of methanogens except where specific inhibitors of Archaea are used (vaccines, chemical additives); new studies suggest that the variations in methane production are more likely due to changes in the metabolic activity of methanogens and / or changes in their diversity at the species or even strain level. The development of long-term mitigation strategies requires a good understanding of the mechanisms involved in methanogenesis and needs to consider the microbial ecosystem as a whole.

National audience

Résumé Les infections respiratoires de l'enfant sont à 80 % d'origine virale. La culture cellulaire était la technique de référence pour le diagnostic de ces infections mais cette technique tend à être supplantée par les techniques de biologie moléculaire et notamment la PCR en temps réel en raison de son excellente sensibilité et sa bonne praticabilité. Cependant, en pratique courante et dans la plupart des laboratoires, le diagnostic des infections virales respiratoires reste réalisé à l'aide de techniques reposant sur la mise en évidence des antigènes viraux notamment en immunofluorescence. Des tests de diagnostic rapide ou « doctors–tests », praticables en dehors d'un laboratoire, sont actuellement disponibles sur le marché, leur sensibilité reste inférieure à celle des autres techniques mais la généralisation de l'usage de ces tests notamment en cabinet médical est probable dans les années à venir. De nouvelles techniques de diagnostic des infections respiratoires reposant sur l'utilisation de puce à ADN sont en cours de mise au point et semblent très prometteuses.

Shellfish industry is mostly realized in estuary zones, which are subjected to pollutions due to anthropic activities. The harmful effects of pollutants on animals inhabiting these estuarine zones are poorly known. Among these animals, Pacific oyster, Crassostrea gigas, may represent a model because they are sedentary and they filter water intensively. Among all physiological functions possibly disturbed by pollutants, defence mechanisms are poorly studied in bivalves. Moreover, animals presenting impaired defence mechanisms may be more sensitive to infectious diseases. In this context, effects of pollutants on hemocyte functions and on sensitiveness to diseases were tested in C. gigas. After adjusting the protocols for the monitoring of hemocyte parameters using flow cytometry, contamination experiments were conducted in vitro and in vivo. In vitro experiments allowed to demonstrate the effects of several pollutants on selected hemocyte parameters. In vivo contamination with a pesticide mixture induced a decrease of phagocytosis activity and a down-regulation of immune genes monitored by real-time PCR. In other experiments involving the same pesticide contamination followed by an injection of bacteria (Vibrio), mortality was higher and several immune genes were up-regulated in infected contaminated animals compared to infected non contaminated animals. In situ experiments allowed to define the defence status of different oyster populations (triploids, diploids from sea bed and hatchery diploids). This study is the first to explore a relationship between a modulation of hemocyte parameters and a dysfunctioning of response to bacteria in Pacific oyster, C. gigas., L'ostréiculture est principalement réalisée dans les estuaires, zones soumises à de nombreuses pollutions liées aux activités anthropiques. Parmi ces animaux, l'huître creuse, Crassostrea gigas, représente un modèle d'intérêt car elle est sédentaire et filtre de grandes quantités d'eau pour se nourrir. Parmi toutes les fonctions physiologiques pouvant être perturbées par les polluants, les mécanismes de défense sont peu étudiés chez les bivalves. Des animaux présentant des activités de défense altérées peuvent se montrer plus sensibles aux maladies infectieuses. Dans ce contexte, les effets de polluants sur les activités hémocytaires et la sensibilité aux maladies ont été testés chez C. gigas. Après mise au point de protocoles permettant de suivre des paramètres hémocytaires en cytométrie de flux, des expériences de contamination ont été conduites in vitro et in vivo. Les expériences in vitro ont démontré les effets de plusieurs polluants sur les paramètres hémocytaires. La contamination in vivo avec un mélange de pesticides a induit une diminution de l'activité de phagocytose et une sous-expression de gènes immunitaires mesurée par PCR en temps réel. Dans d'autres expériences impliquant la même contamination suivie d'une injection de bactéries, la mortalité était plus élevée et plusieurs gènes immunitaires étaient sur-exprimés chez les animaux contaminés infectés en comparaison aux animaux non contaminés infectés. Les expériences in situ ont permis de définir le statut de défense de différentes populations génétiques. Cette étude est la première à explorer une relation entre modulation des paramètres hémocytaires et dérèglement de la réponse aux bactéries chez C. gigas

Dissemination of Leishmania : a parasite sampled and picked up by the sandfly in the dermis of its vertebrate host. Study of an experimental model : Leishmania major and C57Bl/6 mouse. Parasites establish with their host a series of dynamic interactions, clinically visible or asymptomatic, on which depends their durability. Leishmania major is a protozoan parasite dependent on two hosts : (a) a hemophage and telmophage insect, the sandfly, and (b) a rodent. Following the inoculation, when and where do the Leishmania in their amastigote form migrate from the initial site ? In our laboratory, an infection model was developed based on current knowledge on hemophagia in telmophage sandflies. We prepared 1000 metacyclic promastigote Leishmania and inoculated them to C57Bl/6 mice via intradermal injections in the centre of the right pinna. This study, based on real-time/ quantitative PCR (qPCR) to quantify kinetoplastic DNA (kDNA), has shown that Leishmania were established in the centre of the inoculated pinna. On day 4 after the injection, we detected Leishmania kDNA in the periphery of that pinna and in the draining lymph node. The parasitic load grew regularly until day 28, then decreased between days 28 and 49. The maximum value recorded in the centre of the ear was 10,000 parasites on day 28, less in the periphery. The skin of the tail was the distant skin site where the detection of kinetoplastic kDNA was most consistent, starting on day 4. These results confirm the data on the kinetics of the parasitic load at the injection site. They also support the presence, within days after the inoculation, of a few parasites in asymptomatic distant cutaneous sites. The technique of qPCR to detect asymptomatic carriage has several applications both in Veterinary Medicine and in Public Health. The potential implications of these results on the parasite cycle are also emphasized., Qu’elles soient visibles cliniquement ou asymptomatiques, la pérennité des parasites est sous-tendue par les interactions dynamiques qu''ils établissent avec leurs hôtes. Leishmania major est un parasite protozoaire dépendant de deux autres organismes hôtes : (a) un insecte hématophage et telmophage, le phlébotome, (b) un rongeur. À partir de quand et où des leishmanies au stade amastigotes peuventelles émigrer du site initial où elles ont été inoculées ? Dans notre laboratoire, un modèle d’infection a été développé en tenant compte de ce qui est connu sur l''hématophagie par telmophagie des phlébotomes. 1000 leishmanies au stade promastigote métacyclique sont préparées et inoculées en face interne du pavillon auriculaire de souris C57Bl/ 6, par voie intradermique. Ce travail, fondé sur la quantification par PCR en temps réel (PCRq) de l’ADN kinétoplastique (ADNk), a permis de montrer que les leishmanies s’établissaient au centre de l’oreille (site de l’inoculation). Au quatrième jour après l''injection, nous avons détecté l’ADNk des leishmanies à la périphérie de cette même oreille et dans le ganglion drainant. La charge parasitaire dans le centre augmente régulièrement, jusqu’au jour 28, puis diminue entre les jours 28 et 49. Pour le centre de l’oreille, la valeur maximale a été ≈ 10 000 parasites au jour 28, elle est moindre pour le bord. La peau de la queue a été le site cutané distant où il a été possible le plus régulièrement de détecter de l’ADN kinétoplastique et ce, dès le quatrième jour. Outre la confirmation des données sur la cinétique de la charge parasitaire au site d’injection, nos résultats sont en faveur de l’existence, dans les jours qui suivent l’inoculation, de quelques parasites dans des sites cutanés asymptomatiques. Les applications de la PCRq dans le cadre du concept de portage asymptomatique concernent aussi bien la Médecine Vétérinaire que la Santé Publique. Les implications potentielles par rapport au cycle parasitaire sont soulignées., Marignac Geneviève, Lebastard Maï, Fall Ndeye Gamou, Nicolas Luc, Milon Geneviève. Exploration de la dissémination de Leishmania, un parasite délivré et prélevé par le phlébotome au niveau du derme de l'hôte Vertébré. In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 156 n°2, 2003. pp. 41-45.