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Poleroviruses infect a wide range of economically important plants. They are transmitted in a circulative and non-propagative mode by an insect vector, the aphid. The virus particles are acquired by aphids when ingesting the sap from an infected plant and cross successively the epithelia of the midgut and the salivary gland cells by a transcytosis mechanism that relies on the presence of unknown receptors.The ephrin receptor (Eph) is a membrane protein which contains a domain able to bind in yeast to the structural proteins of poleroviruses. By developing methods based on RNA interference, we have shown that oral acquisition of double-stranded RNA targeting Eph in the aphid Myzus persicae can reproducibly reduce polerovirus internalization into the aphid's body. Such treated aphids transmit the virus to plants with a lower efficiency. Eph could therefore function as a receptor for poleroviruses in M. persicae., Les polérovirus infectent une large gamme de plantes d’intérêt économique. Ils sont transmis par un insecte vecteur, le puceron, selon le mode circulant non-multipliant. Le virus, acquis par le puceron lors de l’ingestion de sève sur une plante infectée, traverse l’épithélium des cellules intestinales puis celui des glandes salivaires par un mécanisme de transcytose impliquant des récepteurs encore inconnus. Le récepteur de l’éphrine (Eph) est une protéine membranaire dont un domaine est capable de se lier dans la levure aux protéines structurales des polérovirus. En développant des techniques basées sur l’ARN interférence, nous avons montré que l’acquisition orale d’ARN double brin ciblant Eph chez le puceron Myzus persicae permet de réduire de manière reproductible l’internalisation des polérovirus dans le corps du puceron. Les pucerons ainsi traités transmettent le virus avec une efficacité réduite. Eph pourrait donc assurer la fonction de récepteur des polérovirus chez M. persicae.

Le virus de la jaunisse du navet (TuYV) est un polérovirus restreint aux cellules du phloème. Son ARN génomique est protégé par des particules icosaédriques formées de deux protéines virales dont la protéine de capside (CP). Le sujet de la thèse consistait à étudier le mouvement du TuYV dans le système vasculaire. Le premier objectif était d’identifier la nature du complexe viral cheminant dans les tubes criblés : virions et/ou complexes ribonucléoprotéiques constitués de l’ARN associé à différentes protéines. Des mutants viraux ont été modifiés dans la CP pour empêcher la formation de virions. L’analyse de leur mouvement dans différentes espèces végétales, en absence ou en présence de CP de type sauvage apportées en trans, a permis de démontrer une étroite relation entre la formation de virions et le transport à longue distance. Le second objectif de cette étude portait sur l’identification de partenaires cellulaires de la protéine P4 du TuYV, une protéine putative de mouvement dont le rôle est peu connu. Deux protéines ont été identifiées par un criblage de banques d’ADNc d’A. thaliana par le système du double hybride dans la levure, et l’analyse de leur implication dans le cycle viral a été amorcée par des expériences de localisation subcellulaire et d’infection de mutants d’A. thaliana., Turnip yellows virus (TuYV) is a polerovirus restricted to phloem cells. The genomic RNA is protected in icosahedral particles composed of two proteins among which the major coat protein (CP). In this project, TuYV transport in the phloem was analysed. The first objective was to identify the nature of the viral complex involved in vascular movement: virions and/or ribonucleoprotein complexes formed of viral RNA associated with proteins. Mutant viruses were modified in the CP gene to inhibit formation of virions. By analyzing their movement in different host plants, in the absence or in the presence of the wild-type CP brought in trans, we demonstrated a strong relation between virion formation and virus long-distance movement. The second objective was to identify cellular partners of the TuYV-P4 protein, a putative movement protein which is host-specific. Two proteins were identified by screening a cDNA library of A. thaliana using the yeast two hybrid technique, and their function in the virus cycle was assessed by performing sub-cellular localizations and infection of A. thaliana KO mutants.

Poleroviruses infect a wide range of cultivated plants such as potatoes, sugar beet and plants of Cucurbitaceae family. These viruses are restricted to phloem tissue where they replicate in nucleated cells and translocate over long distances through sieve elements. Polerovirus capsid is composed of the major coat protein (CP) and of a minor component referred to as the readthrough (RT*) protein and exposed at the outside of the particles. CP and RT proteins are essential for virus movement and transmission by aphids. The aim of this study is to identify phloem proteins interacting with viral proteins and potentially involved in viral cycle, by screening an A. thaliana companion cell (CC) cDNA library with structural proteins or protein domains of CABYV. Four genes encoding for a heat shock protein (HSP), a profilin (PRF3), a glycosyl hydrolase and the protein ”Response to low sulfur ” (LSU3) were identified and interact with the C-terminal part of the RT protein (RTC‑ter) and with the RT* protein for the HSP. An additional gene encoding for the protein ALY, identified in the laboratory, by screening an aphid cDNA library with structural proteins of the Turnip yellows virus (another polerovirus) was studied. This protein has four orthologues in Arabidopsis, involved in the gene silencing mechanism against Tomato Bushy Stunt Virus. Here we show that CABYV and TuYV structural proteins interact with the four orthologues of Arabidopsis. Involvement of these candidate genes was not confirmed in Arabidopsis knock-out mutants. In functional experiments, ambiguous results were obtained with PRF3 arabidopsis mutants, and this lead me to study the interaction between PRF3 protein CABYV RT c-ter domain by FLIM, but no interaction was found so far. As all candidat interact with the RTC-ter domain, we studied more precisely the role of this domain in the viral cycle and the role of the complete RT protein. We studied the in vivo RT protein processing and its consequences on systemic movement of CABYV mutants. Using a collection of point mutations introduced in the central domain of the CABYV RT protein, we approached the site of the RT processing and proposed that this process is affected by the secondary structure around the cleavage site. We also reported for the first time the generation of a polerovirus mutant able to synthesize only the RT* protein and to incorporate it into the particle. This mutant was unable to move systemically. Conversely another mutant producing a full-length RT protein impaired in correct processing and incorporating a shorter version of the RT* protein showed very weak systemic infection. These data are strongly in favor of a role of both RT proteins in efficient CABYV movement. An inefficient virus transport was still maintained in the absence of RT proteins suggesting an RT-independent movement pathway. Based on these results, we propose a model for CABYV long-distance transport in which the complete RT protein, or its C-terminal part, acts in trans on wild-type virions to promote their efficient long-distance transport.; Les polérovirus infectent de nombreuses plantes d’intérêt économique telles que la pomme de terre, la betterave à sucre et les cucurbitacées. Ces virus icosaédriques renferment un ARN simple brin et leur capside est constituée d’une protéine majeure (CP) et d’un composant mineur (RT*) localisé à la surface des virions. Ces virus sont restreints aux cellules du phloème dans lesquelles ils se multiplient et se déplacent. Les protéines CP et RT sont essentielles à la dissémination du virus par le puceron vecteur et à son mouvement dans la plante. L’objectif de cette étude a consisté à identifier dans les cellules du phloème, les protéines associées aux virions susceptibles d’intervenir dans le cycle viral en criblant une banque d’ADNc de cellules compagnes (CC) d’A. thaliana avec les protéines de structure ou des domaines protéiques du CABYV. Quatre gènes codant pour une protéine Heat Shock (HSP), la profiline 3 (PRF3) une glysosyl hydrolase ; et la protéine « Response to low sulfur 3 » ont été identifiés. Tous ces gènes candidats interagissent avec le domaine RTC-ter du CABYV et avec la protéine RT* pour la protéine HSP. En plus de ces gènes candidats, je me suis intéressée à la protéine ALY, identifiée au laboratoire, au cours du criblage d’une banque d’ADNc de puceron entier avec les deux protéines de structure du Turnip yellows virus (un autre polérovirus). Cette protéine possède quatre orthologues chez Arabidopsis susceptibles d’être impliquées dans le mécanisme de gene silencing mis en place contre le Tomato Bushy Stunt Virus. Les protéines ALY sont donc des candidats intéressants et j’ai montré une interaction entre les protéines de structure du CABYV et du TuYV et les quatre orthologues d’Arabidopsis. L’implication de ces gènes candidats n’a pas pu être confirmée à ce jour dans des mutants knock-out d’arabidopsis. Les résultats complexes obtenus pour le candidat PRF3 au cours des analyses de validation fonctionnelle, m’a conduit à étudier l’interaction entre ce candidat et le domaine RTC-ter du CABYV in planta par FLIM mais aucune interaction n’a pu être confirmée à ce jour. Tous les candidats isolés lors du criblage de la banque d’ADNc de CC interagissant avec le domaine RTC-ter du CABYV, ce travail m’a conduit à analyser le rôle dans le cycle viral de ce domaine et de la protéine RT (sous sa forme complète ou dépourvue du domaine RTC-ter), en étudiant l’accumulation de ces mutants dans les plantes et le clivage de la protéine RT. Tout d’abord, afin de localiser précisément le site de clivage de la protéine RT, des mutants ponctuels dans la zone de clivage ont été réalisés ce qui a permis de montrer que la structure secondaire de la protéine est importante pour son clivage. Puis, afin d’analyser le rôle du domaine RTC-ter dans le cycle viral, j’ai obtenu par délétion, un mutant n’exprimant plus ce domaine. Ce mutant synthétise uniquement la protéine RT tronquée, forme des particules virales semblables au virus sauvage et est transmissible par puceron. Par contre, de façon surprenante, ce mutant est incapable d’envahir les feuilles non-inoculées d’une plante. Ce résultat suggère que les deux formes de la protéine RT (complète et tronquée) sont indispensables au mouvement à longue distance du virus et nous proposons un modèle dans lequel le domaine C-terminal de la protéine RT agit en trans sur la particule virale pour promouvoir le mouvement du CABYV à longue distance.

National audience

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National audience; Le Beet western yellows virus (BWYV) est un polerovirus (Luteoviridae) qui est transmis par Myzus persicae de manière circulante non-multipliante. Une fois ingérées, les particules virales doivent obligatoirement franchir l’épithélium de l’intestin moyen puis celui des glandes salivaires accessoires afin d’être transmises à une nouvelle plante hôte. Ces deux étapes de transcytose (endocytose/exocytose) des virions au travers du puceron-vecteur requièrent des interactions spécifiques entre les particules virales et des récepteurs localisés au niveau des deux épithéliums (intestin et glandes salivaires accessoires). Des expériences de far-Western blot ont été réalisées à partir de protéines (totales, membranaires et/ou solubles) extraites de Myzus persicae [1] et ont permis, après séquençage par spectrométrie de masse, l’identification de plusieurs candidats homologues à certaines protéines de Drosophila melanogaster dont Rack1 (Receptor for Activated C Kinase 1) et Gapdh3 (GlycerAldehyde-3-Phosphate DesHydrogenase). Bien qu’aucune de ces deux protéines ne soit probablement le récepteur membranaire (extracellulaire) du BWYV, elles interviendraient plus ou moins indirectement dans les mécanismes de transcytose et pourraient ainsi participer activement au passage du BWYV dans le corps du puceron-vecteur. Les tests d’interaction réalisés avec différents mutants du BWYV suggère que Rack1 interagit avec un motif spécifique de la protéine mineure de capside (la RT : ReadThrough) qui est impliquée dans l’efficacité d’endocytose des virions au niveau intestinal. Gapdh3, à l’inverse, interagit avec tous les virus mutés Ŕ même ceux délétés du domaine de readthrough (DRT) Ŕ vraisemblablement par le biais de la protéine majeure de capside (la CP). Afin de confirmer ces interactions observées par far-Western blot, nous avons utilisé un système split-ubiquitin de double hybride de levure, le « mbSUS ». Les protéines appâts (CP ou DRT) ont été fusionnées à la partie C-ter de l’ubiquitine (Cub), elle-même en fusion avec un facteur de transcription synthétique (PLV). Celui-ci est uniquement libéré par clivage lorsqu’il y a interaction de l’appât avec une proie fusionné à la partie N-ter de l’ubiquitine (Nub) ce qui permet l’action de protéases spécifiques reconnaissant l’ubiquitine (entière). La libération du facteur de transcription induit l’activation des gènes rapporteurs du système permettant, entre autre, la croissance des levures sur un milieu spécifique. Le génome d’Acyrthosiphon pisum étant maintenant disponible et les EST pour Myzus persicae assez nombreux, nous avons pu identifier chez M. persicae les gènes codant pour les protéines Rack1 et Gapdh3. Les séquences de ces deux gènes ont été fusionnées à la partie N-ter de l’ubiquitine (Nub) et serviront de proie dans les expériences de double hybride. Les expériences sont en cours, résultats sur le poster !

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Diplôme : Dr. d'Universite; Le Potato leafroll virus(PLRV, famille des Luteoviridae) est l'un des plus dommageables sur culture de pomme de terre à l'échelle mondiale. Ce virus est potentiellement très variable de par la nature de son génome (ARN), ce qui lui confère un potentiel d'adaptation élevé. Cependant, des travaux basés sur un faible jeu de données indiquent que la diversité génétique du PLRV est très restreinte. Afin de mettre en place des stratégies de lutte génétique durables contre ce virus, il est important d'en estimer le potentiel évolutif réel. Au cours de ce travail, la diversité génétique du virus a été étudiée par l'analyse de nouvelles séquences complètes et d'une région variable du génome du virus. Les résultats confirment que le PLRV est peu diversifié et génétiquement stable dans l'espace et dans le temps, même si des évènements majeurs (délétion, recombinaison et accroissement de zone codante) ont ponctué l'histoire évolutive du virus. Des passages en série réalisés par vecteurs ou par multiplication végétative sur plantes entières et sur cals ont identifié la transmission comme pression de sélection et comme facteur pouvant favoriser la dérive génétique et la fixation de mutations délétères, et montré que le PLRV peut varier davantage en cas de changement d'environnement. Le PLRV semble donc optimisé dans un milieu stable et homogène, mais il pourrait exprimer son potentiel évolutif lorsque les pressions de sélection changent.