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La pathogenèse de la sacculite anale demeure incomprise. Cette condition semble cependant être plus fréquente chez les chiens atopiques. La sacculite anale se traite principalement avec un antibiotique. Avec la montée de l’antibiorésistance, il est important de mieux comprendre sa pathogenèse afin de prévenir la maladie et trouver des traitements alternatifs aux antibiotiques. Cette étude visait donc à comparer le microbiote bactérien et les cytokines pro-inflammatoires dans les sacs anaux de chiens sains à ceux de chiens atopiques, afin de déterminer si des changements pourraient être à l’origine des sacculites anales chez les chiens atopiques. L’hypothèse de ce projet était que le microbiote bactérien et les cytokines pro-inflammatoires dans les sacs anaux des chiens sains diffèrent de ceux des chiens atopiques traités ou non traités. Les principaux objectifs de cette étude étaient donc de caractériser le microbiote bactérien (MB) des sacs anaux des chiens atopiques recevant ou non un traitement (oclacitinib, cetirizine ou immunothérapie allergénique) et de déterminer si la concentration de certaines cytokines pro-inflammatoires libérées dans les sacs anaux variait entre les chiens sains et les chiens atopiques non traités (CANT) et les chiens atopiques traités (CAT). Des écouvillons floqués ont été utilisés pour échantillonner le rectum et les sécrétions provenant des sacs anaux de 15 chiens sains, six CAT et 14 CANT pour l’analyse du microbiote bactérien. L’extraction de l’acide désoxyribonucléique a été effectuée avec le kit commercial DNeasy PowerSoil. Le séquençage de la région V4 du gène de l’acide ribonucléique ribosomique 16S a ensuite été réalisé avec la plateforme Illumina MiSeq. Pour l’analyse des cytokines, le contenu des sacs anaux de 15 chiens sains, 12 CANT et cinq CAT a été prélevé dans un microtube. Chaque microtube a été mélangé au vortex. Le surnageant a ensuite été prélevé. Les microtubes contenant le surnageant ont ensuite été congelés à -80°C jusqu’à leur analyse. La concentration de l’interféron gamma, des interleukines (IL)-2, 6, 8, 10 et 12/23p40, de la protéine chimiotactique 1 des monocytes, du facteur de croissance des nerfs bêta, du facteur de cellules souches, du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A a été mesurée avec le test multiplex de Luminex. L’appartenance à la communauté était différente entre les sacs anaux des chiens sains et des CANT, des chiens sains et des CAT et des CANT et des CAT (P = 0,002, P = 0,013 et P = 0,012, respectivement). La structure de la communauté était différente entre les chiens sains et les CANT (P = 0,003) et entre les CANT et les CAT (P = 0,017), mais pas entre les chiens sains et les CAT (P = 0,332). Toutes les cytokines pro-inflammatoires évaluées ont été détectées dans les sacs anaux de chiens sains, de CANT et de CAT. Il n’y avait aucune différence significative entre les groupes, excepté pour l’IL-8 et le TNF-α, où l’IL-8 était plus élevée dans les sacs anaux des CANT en comparaison avec ceux des CAT (P = 0,02), et le TNF-α était en concentration plus faible dans les sacs anaux des chiens sains comparativement aux sacs anaux des CAT (P = 0,04). Il y a une dysbiose dans les sacs anaux de chiens atopiques, ce qui pourrait expliquer pourquoi les chiens atopiques semblent prédisposés à développer des sacculites anales bactériennes. Les traitements (oclacitinib, cetirizine et immunothérapie allergénique) semblent également modifier la composition du microbiote bactérien dans les sacs anaux des chiens atopiques pour qu’elle se rapproche de celle des chiens sains. L'IL-8 pourrait également jouer un rôle dans le développement de la sacculite anale. D’autres études évaluant un plus large nombre de cytokines permettraient possiblement de mettre en évidence des cytokines ayant un rôle important lors de sacculite anale chez les chiens atopiques., The pathogenesis of anal sacculitis is not well understood. However, this condition appears to be more common in atopic dogs. Anal sacculitis is primarily treated with antibiotic therapies. With the rise of antimicrobial resistance, it is important to better understand the pathogenesis of anal sacculitis in order to prevent the disease and find alternative treatments to antibiotics. The present study aimed to compare the bacterial microbiota and pro-inflammatory cytokines in the anal sacs of healthy dogs with those of atopic dogs, in order to determine if there are changes that could explain anal sacculitis in atopic dogs. The hypothesis of this project was that the bacterial microbiota and proinflammatory cytokines in the anal sacs of healthy dogs differ from those of treated and untreated atopic dogs. The main objectives of this study were therefore to characterize the bacterial microbiota of the anal sacs of atopic dogs receiving or not a treatment (oclacitinib, cetirizine or allergen-specific immunotherapy) and to determine if the concentration of certain proinflammatory cytokines released in the anal sacs differed between healthy, untreated atopic dogs (UAD) and treated atopic dogs (TAD). Flocked swabs were used to sample the rectum and secretions from the anal sacs of 15 healthy dogs, six TAD and 14 UAD for bacterial microbiota analysis. Deoxyribonucleic acid extraction was performed with the commercial DNeasy PowerSoil kit. Sequencing of the V4 region of the 16S ribosomal ribonucleic acid gene was then performed with the Illumina MiSeq platform. For cytokine analysis, the contents of the anal sacs of 15 healthy dogs, 12 UAD, and five TAD were collected in a microtube. Each microtube was vortexed before the supernatant was collected. The microtubes containing the supernatant were then frozen at -80°C until analysis. The concentration of interferon gamma, interleukin (IL)-2, 6, 8, 10, and 12/23p40, monocyte chemotactic protein 1, nerve growth factor beta, stem cell factor, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and vascular endothelial growth factor-A were measured with the Luminex multiplex assay. Community membership was different between the anal sacs of healthy dogs and UAD, healthy dogs and TAD, and UAD and TAD (P = 0.002, P = 0.013, and P = 0.012, respectively). Community structure was different between healthy dogs and UAD (P = 0.003) and between UAD and TAD (P = 0.017), but not between healthy dogs and TAD (P = 0.332). All proinflammatory cytokines assessed were detected in the anal sacs of healthy dogs, UAD, and TAD. There were no significant differences between groups except for IL-8 and TNF-α. IL-8 was higher in UAD anal sacs compared to TAD anal sacs (P = 0.02) and TNF-α was in lower concentration in healthy dog anal sacs compared to TAD anal sacs (P = 0.04). There is a dysbiosis between the anal sacs of UAD and TAD which might explain why atopic dogs seem predisposed to bacterial anal sacculitis. Treatments received by atopic dogs (oclacitinib, cetirizine and allergen-specific immunotherapy) shift the microbiota of the anal sacs towards that of healthy dogs. IL-8 may also play a role in the development of anal sacculitis. Further studies on a larger number of cytokines may identify cytokines that are important in the pathogenesis of anal sacculitis in atopic dogs.

Plant virus ecology began to be explored at the end of the 19th century. Since then, major advances have revealed complex virus-host-vector interactions in a variety of environments. These advances have been accelerated by development of new technologies for virus detection and characterization, the latest of which being high-throughput sequencing (HTS). HTS technologies have proved to be effective for non-targeted characterization of all or nearly all viruses present in a sample without requiring prior information about virus identity, as would be needed for virus-targeted tests. Phytoviromic studies have thus made important advances, including characterization of the complex interactions between phytovirus dynamics and the structure of multi-species host communities, and documentation of the effects of anthropogenic ecosystem simplification on plant virus emergence and diversity. However, such studies must overcome challenges at every stage, from plant sampling to bioinformatics analysis. This review summarizes major advances in plant virus ecology, in association with technological developments, and presents key considerations for use of HTS in the study of the ecology of phytovirus communities.

Les leucémies myéloïdes aiguës (LMA) consistent en un groupe de cancers agressifs causés par une accumulation de mutations génétiques et épigénétiques survenant dans les cellules souches ou progénitrices de la moelle osseuse. Il s’agit d’un groupe de maladies très hétérogène, caractérisé par un grand nombre de combinaisons d’altérations qui perturbent à la fois les voies de signalisation qui y sont exprimées, leur sensibilité aux différents traitements et le pronostic des patients. Le déploiement des technologies de séquençage de nouvelle génération au courant de la dernière décennie a permis l’exploration à une échelle sans précédent du paysage mutationnel et transcriptomique de différents cancers, incluant les LMA. Dans le cadre de nos travaux, nous avons voulu tester l'hypothèse selon laquelle les LMA se déclinent en plusieurs sous-groupes génétiques caractérisés chacun par des mutations distinctes et une expression génique dérégulée, ainsi qu’une réponse différentielle à des molécules qui pourraient représenter de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons testé cette hypothèse au sein de la cohorte Leucegene, qui comprend un grand nombre de LMA primaires analysées par le séquençage du transcriptome, et nous avons analysé les différences entre les différents sous-groupes en les analysant un à la fois. Cette étude des différents sous-groupes nous a permis de disséquer le profil génomique, transcriptomique et les sensibilités aux petites molécules de sept sous-groupes génétiques, représentant environ la moitié des cas de LMA de l’adulte. Notre approche a permis de découvrir plusieurs nouvelles mutations spécifiques aux différents sous-groupes, dont certaines ont été validées dans des cohortes indépendantes. Nous avons également confirmé que les gènes différentiellement exprimés dans les sous-groupes sont plus informatifs que les signatures d'expression non supervisées pour identifier les biomarqueurs de la maladie. Nous avons ainsi identifié dans la majorité des sous-groupes des gènes représentant un biomarqueur d'intérêt, ayant une pertinence fonctionnelle ou pronostique. Ces données ont également mené à des criblages chimiques ciblés qui ont identifié de nouvelles vulnérabilités dépendant du contexte génétique. Au-delà de ces observations, nos travaux pourraient avoir une portée translationnelle tandis que le séquençage de nouvelle génération est de plus en plus utilisé en clinique. La combinaison avec d’autres modalités de séquençage et l’incorporation de technologies émergentes aideront à poursuivre la dissection génomique, transcriptomique et chimique de la LMA et l’approche utilisée pourra même éventuellement s’appliquer à d’autres types de cancers., Acute myeloid leukemias (AML) are a group of cancers caused by an accumulation of genetic and epigenetic mutations occurring in the stem or progenitor cells of the bone marrow. They represent a very heterogeneous group of diseases, characterized by a large number of combinations of alterations which disrupt to varying degrees key networks in these cells, their sensitivity to treatments and the prognosis of the patients. The deployment of next-generation sequencing technologies over the past decade has enabled exploration on an unprecedented scale of the mutational and transcriptomic landscape of various cancers, including AML. As part of our work, we tested the hypothesis according to which AMLs comprise several genetic subgroups, each characterized by distinct mutations and deregulated gene expression profiles, as well as a differential response to molecules that could represent novel therapies. We tested this hypothesis in the Leucegene cohort, which includes a large number of primary AMLs analyzed by transcriptome sequencing, which we explored one subgroup after the other, dissecting the genomic, transcriptomic or small molecule sensitivities profile of seven AML subgroups representing approximately half of adult AML cases. Our approach has allowed us to discover several new mutations specific to different subgroups, some of which have been validated in independent cohorts. We also confirmed that genes differentially expressed in subgroups are more informative than unsupervised expression signatures, and we identified genes representing potential biomarkers, or having a functional or prognostic relevance in the majority of subgroups. Generated data also led to targeted chemical screens performed on primary AML cells, which identified new context-dependent vulnerabilities. Beyond these observations, our work could have a translational scope while next-generation sequencing is paving its way in the clinic. The combination with other Omics and the incorporation of emerging technologies will help to further the multi-dimensional dissection of these groups and additional ones, as the presented approach could be applied to additional disease subsets and cancer types.

Rectal cancers represent 35% of colorectal cancers. Histologically, 90% of rectal cancers are adenocarcinomas, while rectal squamous cell carcinoma is very rare (0.3% of rectal cancers). Given its rarity, we have little data concerning its epidemiology, pathogenesis, prognosis and therapeutic management. The current treatment trend is to treat rectal squamous cell carcinoma by analogy with anal squamous cell carcinoma and not like rectal adenocarcinoma. We first started by doing an exhaustive literature review aiming at giving guidance for clinician. Then we performed genomic analysis of ten rectal squamous cell carcinoma samples from Geneva and Valis. The resulting molecular profile was compared with public data for anal squamous cell carcinoma and rectal adenocarcinoma. PIK3CA, PTEN, TP53, ATM, BCL6, SOX2 are the most commonly mutated genes, a profile that is similar to squamous anal carcinoma. PIK3CA is the most commonly affected signaling pathway. HPV16 was found (by PCR amplification) in all 10 cases. Conclusions: This report is the first comprehensive genomic characterization of rectal squamous cell carcinoma and provides evidence of genetic similarity to squamous anal carcinoma and consequently suggests the need for a similar therapeutic approach.

Spondyloarthritis (SpA) is a multifactorial disease with an estimated heritability of over 90%, mainly related to HLA-B27. All identified susceptibility factors, including HLA-B27, explain less than one third of the heritability. The involvement of rare variants could explain part of this missing heritability. The aim of this work was to identify rare variants associated with SpA via a combined family analysis and high-throughput sequencing approach. First, we sequenced a 1.4 Mb region significantly linked to SpA at 13q13 in 71 patients and 21 healthy controls from families with a high linkage score in this region. We identified a rare variant in the FREM2 gene present in 9 patients from a family with high linkage to the region and not found in other families or isolated cases of SpA. We then sequenced the exome of 48 patients from 20 multiplex families. Unfortunately, we did not observe any recurrent variants between families.We then focused on a second, previously known genetic linkage peak on chromosome 9. The study of the family most linked to this region, which includes 12 patients, led to the identification of several rare coding variants segregating with the disease. However, subsequent studies have shown equivalent allelic frequencies of these variants between cases and controls. Finally, whole genome sequencing of 413 patients from 76 multiplex families with 4 or more patients was performed. We identified 1203 rare, coding, non-synonymous variants shared by at least all affected family members. Genetic and functional validation analyses of these variants are underway, as is the analysis of non-coding variants. In conclusion, these different approaches suggest significant genetic heterogeneity in SpA and also highlight the difficulty of confirming the involvement of rare variants in complex diseases., La spondyloarthrite (SpA) est une maladie multifactorielle avec une héritabilité estimée à plus de 90%, principalement en lien avec le HLA-B27. L'ensemble des facteurs de susceptibilité identifiés, incluant HLA-B27, expliquent moins du tiers de l'héritabilité. L'implication de variants rares pourrait expliquer une partie de cette héritabilité manquante. L'objectif de ce travail était d'identifier des variants rares associés à la SpA via une approche combinant analyses familiales et séquençage haut-débit. D'abord, nous avons séquencé une région de 1,4 Mb significativement liée à la SpA en 13q13 chez 71 patients et 21 témoins sains appartenant à des familles avec un score de liaison élevée dans cette région. Nous avons identifié un variant rare dans le gène FREM2 présent chez 9 malades d'une famille fortement liée à la région et non retrouvé dans d'autres familles ou cas isolés de SpA. Nous avons ensuite séquencé l'exome de 48 malades venant de 20 familles multiplex. Malheureusement, nous n'avons pas observé de variants récurrents entre les familles. Puis, nous nous sommes concentrés sur un deuxième pic de liaison génétique, déjà connu, sur le chromosome 9. L'étude de la famille la plus liée à cette région, qui comprend 12 patients, a conduit à l'identification de plusieurs variants rares codants ségrégeant avec la maladie. Cependant les études ultérieures ont montré des fréquences alléliques de ces variants équivalentes entres les cas et les témoins. Enfin, le séquençage du génome entier de 413 patients issus de 76 familles multiplex avec 4 malades ou plus a été réalisé. Nous avons identifié 1203 variants rares, codants et non synonymes et partagés par au moins tous les membres atteints d'une famille. Les analyses de validation génétique et fonctionnelle de ces variants sont en cours, tout comme l'analyse des variants non-codants. En conclusion, ces différentes approches suggèrent une importante hétérogénéité génétique de la SpA et soulignent également la difficulté de confirmer l'implication de variants rares dans les maladies complexes.

Transposable elements (TEs) are ubiquitous components of eukaryotic genomes. They are mobile DNA sequences, which have the ability to multiply and move within the chromosomes of most living organisms. They belong to two classes: class I, retrotransposons and class II, transposons. Retrotransposons are predominant in plants.With the advancement of new sequencing technologies in the last decades, it is now possible to study the structural and functional impact of these elements in natural populations. Nevertheless, due to their repeated nature, the detection of polymorphisms associated with the activity of these elements is conceptually and technically challenging.During my PhD, I developed a pipeline (TRACKPOSON) allowing the detection of polymorphic insertions of transposable elements (in particular retrotransposons) in large datasets that I applied to the 3,000 available rice genomes.This study revealed a very dynamic transpositional landscape within the species. Based on these results, an association analysis (GWAS) was conducted to identify possible genetic factors related to transpositional activity. This analysis revealed the presence of a "master" copy of the element itself, a copy necessary for the activation of transposition in the family.The TE insertion polymorphisms for all 3000 genomes also enabled us to elucidate the origin of rice domestication. We were able to identify at least three distinct genetic origins of the cultivated species.In a second step, we studied the impact of insertions of these transposable elements on certain agronomic traits (TE-GWAS). We found that an insertion of the retrotransposon rn215-125 had a significant impact on grain width in Indica rice varieties. Using Nanopore long-read sequencing technology, we were able to characterize the region into which the insertion is located and propose that the allele conferring a wider grain is more likely to result from an introgression event from a donor yet to be identified, although our initial results suggest that it may be the wild relative O. rufipogon.The analyses conducted during my thesis show the strong contribution of transposable elements to genome dynamics in the population of 3000 rice varieties. Moreover, the constant evolution of sequencing technologies and the development of associated bioinformatics tools now open new perspectives for the analysis of structural variations and in particular the impact of transposable elements on the evolution of genomes within populations.Keywords : transposable elements, Oryza sativa, genomics, bioinformatics, big data, next generation sequencing technologies, genome-wide association studies (GWAS), Les éléments transposables (ET) sont des composants ubiquitaires des génomes eucaryotes. Ce sont des séquences d’ADN mobile, qui ont la capacité de se multiplier et de se déplacer au sein des chromosomes de la plupart des organismes vivants. Ils appartiennent à deux classes : la classe I, des rétrotransposons et la classe II, des transposons. Les rétrotransposons sont prédominants chez les plantes.Avec l’avancée des nouvelles technologies de séquençage ces dernières décennies, il est maintenant possible d’étudier l’impact structural et fonctionnel de ces éléments au sein de populations naturelles. Néanmoins par leur nature répétée, la détection des polymorphismes associés à l’activité de ces éléments est un défi conceptuel et technique.Au cours de ma thèse, j’ai développé un pipeline (TRACKPOSON) permettant la détection des insertions polymorphiques d’éléments transposables (en particulier les rétrotransposons) au sein de grand jeux de données que j’ai appliqué aux 3,000 génomes de riz disponibles.Cette étude a permis de mettre en évidence un paysage transpositionnel très dynamique au sein de l’espèce. A partir de ces résultats, afin d’identifier d’éventuels facteurs génétiques liés à l’activité transpositionnelle, une analyse d’association (GWAS) a été conduite. Celle-ci a permis de mettre en évidence la présence d’une copie « maître » de l’élément lui-même, copie nécessaire à l’activation de la transposition de la famille. Les données de polymorphismes d’insertion des ETs pour l’ensemble des 3000 génomes nous ont également permis d’élucider l’origine de la domestication du riz. Nous avons en effet pu mettre en évidence au moins trois origines génétiques distinctes de l’espèce cultivée.Dans un second temps, nous avons étudié l’impact des insertions de ces éléments transposables sur certains caractères agronomiques (TE-GWAS). Nous avons mis en évidence qu’une insertion du rétrotransposon rn215-125 avait un impact significatif sur la largeur des grains des variétés de riz Indica. Grâce à l’utilisation de la technologie de séquençage longues lectures Nanopore, nous avons pu caractériser la région dans laquelle se trouve l’insertion et proposons que l’allèle conférant un grain plus large proviendrait plutot d’un évènement d’introgression à partir d’un donneur qui reste à identifier, bien que nos premiers résultats suggèrent qu’il pourrait s’agir de l’espèce sauvage apparentée O. rufipogon.Les analyses conduites au cours de ma thèse permettent de mettre en évidence la forte contribution des éléments transposables sur la dynamique des génomes au sein de la population de 3000 variétés de riz. De plus, l’évolution constante des technologies de séquençage et le développement des outils bioinformatique associés, ouvrent maintenant de nouvelles perspectives pour l’analyse des variations structurales et en particulier l’impact des éléments transposables sur l’évolution des génomes au sein des populations.Mots-clés : éléments transposables, Oryza sativa, génomique, bio-informatique, grand jeux de données, nouvelles technologie de séquençage, étude génomique d’association (GWAS)

The objectives of this thesis fall within the broad issue of processing data from next generation sequencers, and more particularly short reads from second-generation sequencers. The aspects addressed in this issue mainly focus on the development of new methodologies based on unique molecular sequences called UMI used to label the initial DNA fragments and to improve the precision of the results.First of all, in the field of transcriptomics, a new method has been developed in order to improve the results of measuring gene expression on the one hand, and to detect fusion transcripts in tumors on the other hand. This method is based on an RT-MLPA coupled to an NGS sequencer. It makes it possible to amplify the RNA fragments from a tumor sample and to obtain the sequences of the analyzed fragments. The underlying analysis aims to analyze these sequences one by one in order, first, to assign each sequence to the corresponding sample, and secondly, to find the name of the gene it expresses. For this, RT-MiS has been developed. RT-MiS is a tool that is able to perform the entire analysis starting with the extraction and correction of the UMI from the sequences until the production of the results in the form of an gene expression matrix for each sample. RT-MiSalso includes a dedicated analysis interface allowing for the tool to be launched easily by the users. This interface automates the entire analysis process as much as possible and produces the results in the form of interactive figures and graphs making biological interpretation much easier.Then, in the field of genomics, a new somatic variant detection tool was developed. The UMI-VarCal tool is a UMI-based variant caller that implements a UMI analysis to efficiently call the variants in tumor samples. The utility of using the information from the UMI is highlighted by the improved accuracy of variant detection, especially when the frequency falls below 1%. UMI-VarCal applies a Poisson test to filter out non-variant positions and then applies a UMI analysis and two complementary filters to remove false positives. UMI-VarCal has been designed in a highly optimized manner allowing it to perform its analysis while remaining more efficient than other tools in terms of variant detection and execution time.Finally, and still in the field of variant detection, a new read simulator was developed. This tool called UMI-Gen is the first read simulator capable of generating sequences with UMI. In addition, UMI-Gen is capable of inserting somatic variants (SNV) or structural variants (CNV) into the simulated files. Furthermore, by analyzing a set of normal files, it is able to estimate the background noise in these samples and reproduce it in the simulated data. These files can be used later to evaluate different variant callers, especially those implementing a UMI analysis in their algorithm., Les objectifs de cette thèse s’inscrivent dans la large problématique du traitement des données issues de séquenceurs à très haut débit, et plus particulièrement des reads courts, issus de séquenceurs de deuxième génération. Les aspects abordés dans cette problématique se concentrent principalement sur le développement de nouvelles méthodologies se basant sur des séquences moléculaires uniques appelées UMI utilisées pour étiqueter les fragments d’ADN initiaux et permettant d’améliorer la précision des résultats obtenus.Tout d’abord, dans le domaine de la transcriptomique, une nouvelle méthode a été développée afin d’améliorer les résultats de mesure de l’expression génique d’une part, et de détecter les transcrits de fusion dans les tumeurs d’autre part. Cette méthode se base sur une RT-MLPA couplée à un séquenceur NGS. Elle permet d’amplifier les fragments d’ARN présents dans un échantillon tumoral et d’obtenir les séquences des fragments récoltés. L’analyse sous-jacente vise à analyser ces séquences une par une pour, dans un premier temps, attribuer chaque séquence à l’échantillon séquencé, et dans un deuxième temps, retrouver le nom du gène qu’il exprime. Pour cela, RT-MiS a été développé. RT-MiS est un outil permettant d’effectuer la totalité de l’analyse commençant par l’extraction et la correction des UMI des séquences jusqu’à la production des résultats sous forme de matrice d’expression par gène pour chaque échantillon. RT-MiS comporte aussi une interface d’analyse dédiée permettant de lancer l’outil facilement par les chercheurs. Cette interface permet d’automatiser le plus possible le processus d’analyse complet et de produire les résultats sous formes de figures et graphiques interactifs rendant l’interprétation biologique plus facile.Ensuite, dans le domaine de la génomique, un nouvel outil de détection de variants somatiques a été développé. L’outil UMI-VarCal est un variant caller basé sur les UMI et donc implémentant une analyse de ces derniers pour appeler efficacement les variants dans les échantillons tumoraux. L’utilité des UMI est mise en évidence par l’amélioration de la précision de détection des variants, surtout quand la fréquence tombe au-dessous de 1%. UMI-VarCal applique un test de Poisson pour filtrer les positions ne présentant pas des variants et puis se sert d’une analyse des UMI et de deux filtres complémentaires pour filtrer les faux positifs. UMI-VarCal a été conçu de façon très optimisée afin d’effectuer son analyse tout en restant plus efficace que les autres outils en termes de détectionde variants et de temps d’exécution.Finalement, et toujours dans le domaine de la détection des variants, un nouveau simulateur de reads a été développé. Cet outil appelé UMI-Gen est le premier simulateur de reads capable de générer des séquences avec des UMI. De plus, UMI-Gen est capable d’insérer des variants somatiques (SNV) ou des variants structuraux (CNV) dans les fichiers simulés. En outre, en analysant un ensemble de fichiers normaux, il est capable d’estimer le bruit de fond dans ces échantillons pour le reproduire dans les reads simulés. Ces fichiers peuvent être utilisés par la suite pour évaluer les variant callers, surtout ceuximplémentant une analyse UMI dans leur algorithme.

International audience; Arboviruses are viruses transmitted to humans and/or animals by hematophagous arthropods. They have a significant economic and public health impact. Given the number of arboviruses already identified and their great genetic variability, it is essential to have highly flexible tools for their monitoring. Arbovirus circulation within animal populations can be demonstrated by direct and/or indirect screening of a specific virus within vertebrate hosts and/or arthropod vectors. Viruses have great adaptive capacities that enable them to emerge into new geographic areas and/or cross species barriers. Over the decades, arbovirus monitoring has considerably evolved due to innovations in detection technologies. The objectives of this review are to list and assess (i) the current tools for direct or indirect screening for arboviruses, (ii) the new generation tools that best meet expectations in terms of optimal arbovirus monitoring and (iii) the potentials for improved arbovirus monitoring.; Les arbovirus sont des virus transmis à l'Homme et/ou à des animaux par des arthropodes hématophages. Ils sont importants en termes de santé publique mais également d'un point de vue économique. Au vu du nombre d'arbovirus déjà identifiés et de leur grande variabilité génétique, il est nécessaire, voire indispensable, d'avoir des outils ayant une grande flexibilité pour leur surveillance. La circulation des arbovirus au sein d'une population animale peut se démontrer par recherche directe du virus au sein de l'hôte et/ou du vecteur ou par recherche indirecte du virus en mettant en évidence une séroconversion chez l'hôte vertébré. Les virus ont des grandes capacités d'adaptation qui leur permettent d'émerger dans de nouvelles zones géographiques et/ou de franchir les barrières d'espèces. Au fil des décennies, la surveillance des arbovirus a considérablement évolué grâce à toutes les technologies innovantes qui ont vu le jour. Les objectifs de cette revue sont de faire l'état de l'art sur (i) les outils classiques pour la recherche directe ou indirecte des arbovirus, (ii) les outils de nouvelle génération qui répondent au mieux aux attentes en termes de surveillance optimale des arbovirus et (iii) les axes d'amélioration pour la surveillance des arbovirus.

The infectious bronchitis virus (IBV) and the turkey coronavirus (TCoV), are the two major avian Gammacoronaviruses. Both are genetically related except for their S gene. Despite their similarity, the genetic diversity within the two viruses is different. IBV exhibits a huge genetic diversity which has been suggested to be the result of a massive vaccination of chicken flocks that would have forced the evolution of IBV. In contrast, very few TCoV strains have been detected and no vaccination of turkeys was performed because no vaccine is available. The objective of this thesis project was to analyze the evolution of these two avian coronaviruses in their hosts during several passages by analysing the genetic variants present in the viral population using NGS with or without selection pressure for IBV.To this purpose, a bioinformatic pipeline that allows the detection of variants has been developed. Also, methods have been developed to improve viral RNA sequencing. The analysis of the viral populations during the different passages revealed rapid changes in consensus sequence of IBV and TCoV. For IBV, viral evolution was different depending on the immune status of the subjects, with a selection of seven variants in the unvaccinated subjects, against one in the vaccinated subjects. For TCoV, three series of ten passages were performed in which five modifications of consensus sequence were detected as soon as the first passage and were retrieved during passages 5 and 10. The changes were found in the different experimental replicates, indicating that these selections are not random. In conclusion, this work shows that the evolution of avian Gammacoronaviruses is rapid as soon as the first passage, in their natural host.; Les deux principaux Gammacoronavirus aviaires, sont le virus de la bronchite infectieuse (IBV) du poulet et le coronavirus de la dinde (TCoV), deux virus génétiquement très proches, à l’exception de leur gène S. Malgré leur ressemblance, la diversité génétique au sein des deux virus est très différente. L’IBV présente une grande diversité génétique qui a été supposée comme étant le résultat d’une vaccination intensive des élevages de poulets qui aurait forcé l’évolution de l’IBV. En contraste, très peu de souches de TCoV ont été détectées et aucun vaccin n’est disponible. L’objectif de ce projet de thèse était donc d’analyser au cours de plusieurs passages ces deux virus dans leurs hôtes en analysant les variants génétiques présents au sein des différentes populations virales avec ou sans pression de sélection pour l’IBV et ce par séquençage haut débit. Pour cela, le développement d’un outil permettant la détection de variants génétiques viraux a été réalisé. Par ailleurs, des méthodes ont été développées afin d’enrichir les échantillons en ARN viral dans le but de mieux les séquencer. L’analyse des populations virales au cours des différents passages a permis de constater des changements rapides de séquence consensus. Pour IBV, une évolution différente du virus a été observée en fonction du statut immunitaire des sujets, avec une sélection de sept variants chez les sujets non vaccinés, contre un chez les sujets vaccinés. Pour TCoV, trois séries de dix passages ont été réalisées au cours desquels cinq changements de séquence consensus ont été observés dès le premier passage et se sont maintenus au cours des passages 5 et 10. Ces changements ont été retrouvés dans les différentes répliques expérimentales, indiquant donc que ces sélections ne sont pas aléatoires. En conclusion ces travaux montrent que l’évolution des Gammacoronavirus aviaires est rapide, dès le premier passage, chez leur hôte naturel.

Introduction : l’adénocarcinome (ADK) du pancréas est un cancer de mauvais pronostic avec une survie à 5 ans de 9,3%, tous stades confondus. Son incidence est en augmentation. La chimiothérapie est un traitement clé du cancer du pancréas, quel que soit le stade de la maladie, mais n’est pas dénuée d’effets secondaires. La médecine personnalisée est un des objectifs de la cancérologie, c’est dans ce contexte que s’est développée la pharmacogénétique. De nombreux polymorphismes génétiques, ou SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), présents sur les gènes codant pour des enzymes du métabolisme des drogues ont été décrits. L’objectif était d’identifier si des polymorphismes germinaux des gènes candidats connus ou suspects d’être impliqués dans le métabolisme des chimiothérapies étaient associés à la toxicité ou à l’efficacité chez des patients avec un ADK du pancréas métastatique. Matériel et méthodes : des échantillons de sang périphériques de 317 patients issus de 2 études de la FFCD (Fédération Francophone de Cancérologie Digestive) comparant différents protocoles de chimiothérapie en 1ère ligne métastatique et d’une étude préliminaire de patients en 1ère ligne métastatique d’un ADK du pancréas ont été collectés. Une sélection de 231 polymorphismes au sein de 86 gènes impliqués dans le métabolisme des chimiothérapies a été génotypée par NGS (Next Generation Sequencing). L’objectif principal était d’évaluer la corrélation entre génotype et survenue de toxicités sévères. Les objectifs secondaires étaient de regarder l’influence du génotype sur la réponse au traitement en termes de survie globale métastatique (SGm) et survie sans progression métastatique (SSPm). Résultats : parmi les 231 polymorphismes étudiés, 11 SNPs ont été trouvés associés à la toxicité hématologique ou digestive de la chimiothérapie sur les gènes ERCC1 (rs3212948 ; p = 0,046), SLCO4A1 (rs3787537 ; p = 0,045), SLC19A1 (rs1051266 ; p = 0,031), SLC28A3 (rs7867504 ; p = 0,03), SLC28A1 (rs8187755 ; p = 0,018), CYP4F2 (rs2074900 ; p = 0,014), CYP4F8 (rs4646523 ; p = 0,019), FMO4 (rs2223477 ; p = 0,042), UGT2B7 (rs7662029 ; p = 0,045), CDA (rs602946 ; p = 0,035), DPYD (rs3918290 ; p = 0,018). Le SNP ERCC1-rs3212948 était également associé à la survie globale métastatique (C/C versus G/C + G/G ; HR 1,63 ; IC95% [1,10 - 2,4] ; p = 0,015). La médiane de survie était de 9 mois chez les patients C/C versus 13 mois chez les patients G/C + G/G. Discussion : les différents gènes codaient des enzymes du métabolisme des drogues (cytochromes, CDA, DPYD), des transporteurs (Solute Carrier) ou des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN (ERCC1). L’allèle G du SNP ERCC1-rs3212948 semblait associé à un meilleur pronostic dans les cancers du pancréas métastatiques traités par chimiothérapie. Ce SNP est décrit, dans les cancers du poumon et ORL, comme un facteur de risque de cancer, un facteur prédictif de la réponse aux sels de platine et à la radiothérapie, un facteur pronostique et un facteur de risque de toxicité à la chimiothérapie. Il existe de nombreuses études de pharmacogénétique dans la littérature mais elles sont hétérogènes, voire contradictoires. Conclusion : l’approche pharmacogénétique peut être une stratégie utile pour personnaliser et optimiser le traitement de chimiothérapie dans les ADK du pancréas métastatique. L’idéal serait une étude prospective.

It is paramount to identify patients whose cancer is associated with genetic susceptibility to the disease, since their long-term management depends on it. Anatomical and molecular pathologists play a key role in the process. Indeed, their diagnosis supports or even sometimes warrants germline genetic testing. For example, a colorectal cancer with mismatch repair protein expression loss suggests Lynch syndrome, while a rare type of renal cell carcinoma with fumarate hydratase expression loss is highly evocative of hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma syndrome. Similarly, the presence of the T790M EGFR variant before treatment in a non-small cell lung carcinoma warrants further testing as the variant is likely of germline origin. Patients with suspected genetic susceptibility to cancer are referred to the nearest clinical cancer genetics clinic. The cancer geneticist, assisted by a genetic counselor, then collects detailed personal and familial information, sometimes feeds them into bioinformatics tools or clinico-pathological scores, decides whether germline genetic analysis is justified, determines which genes should be analysed, and prescribes testing. Germline testing is carried out on a blood sample by expert laboratories using next generation sequencing on panels of cancer susceptibility genes. The cancer geneticists then returns the result to the patient. When a pathogenic variant is identified, the patient’s management ismodified, with recommendations ranging from intensified surveillance to risk-reducing surgery. Treatment is sometimes adapted to the pathogenic variant. In addition, relatives can undergo genetic testing, should they wish to know whether they carry the familial variant. In the near future, we expect clinical cancer genetics to move towards strengthened partnerships with molecular pathologists and medical oncologists. Somatic genetic analyses are now routine, at least in metastatic cancer, and a proportion of the tumoral variants identified are actually of germline origin. As for the oncologists, the development of mainstreaming programs where they are allowed to prescribe germline testing under the supervision of a cancer genetics team is unavoidable., Les patients dont le cancer est associé à une prédisposition génétique doivent être identifiés, puisque leur prise en charge à long terme en dépend. Les anatomopathologistes jouent un rôle clé dans l’initiation de cette démarche. En effet, un diagnostic précis oriente les investigations oncogénétiques, voire les justifie s’il s’agit par exemple d’un cancer colorectal avec perte d’expression de protéines codées par les gènes de mésappariements de l’ADN ou d’un type rare de cancer du rein perdant l’expression de la fumarate hydratase. Les analyses génétiques tumorales représentent aussi une porte d’entrée pour l’Oncogénétique, par exemple cancer bronchopulmonaire avec variant tumoral EGFR T790M pré-traitement. En cas de suspicion de prédisposition génétique, le patient est adressé en consultation d’Oncogénétique. Le médecin accompagné d’un conseiller en génétique y collecte les informations personnelles et familiales, les intègre à un processus décisionnel impliquant des outils bioinformatiques et des scores clinico- pathologiques, et prescrit les analyses constitutionnelles. Le laboratoire d’Oncogénétique réalise ensuite l’analyse sous forme de panel de gènes avec des machines de séquençage haut débit. Le résultat est rendu quelques semaines plus tard par l’Oncogénéticien. L’observation d’un variant pathogène résulte en des recommandations de prise en charge à long terme, dépistage et chirurgie de réduction de risque. Les avancées de la médecine permettent aussi dorénavant d’adapter parfois les traitements au résultat. En outre, l’identification d’un variant pathogène permet ensuite aux apparentés de bénéficier de tests génétiques. L’évolution à court terme de l’Oncogénétique se caractérisera par un partenariat renforcé avec les anatomopathologistes et pathologistes moléculaires, puisque la généralisation des analyses génétiques tumorales à visée thérapeutique révèlera de manière incidentale des variants pathogènes constitutionnels. Par ailleurs la mise en place de circuits de « mainstreaming » avec les oncologues, dans lesquels ces derniers prescrivent des analyses constitutionnelles dans un cadre précis et sous la supervision d’un Oncogénéticien, est inéluctable.

International audience; It is paramount to identify patients whose cancer is associated with genetic susceptibility to the disease, since their long-term management depends on it. Anatomical and molecular pathologists play a key role in the process. Indeed, their diagnosis supports or even sometimes warrants germline genetic testing. For example, a colorectal cancer with mismatch repair protein expression loss suggests Lynch syndrome, while a rare type of renal cell carcinoma with fumarate hydratase expression loss is highly evocative of hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma syndrome. Similarly, the presence of the T790M EGFR variant before treatment in a non-small cell lung carcinoma warrants further testing as the variant is likely of germline origin. Patients with suspected genetic susceptibility to cancer are referred to the nearest clinical cancer genetics clinic. The cancer geneticist, assisted by a genetic counselor, then collects detailed personal and familial information, sometimes feeds them into bioinformatics tools or clinico-pathological scores, decides whether germline genetic analysis is justified, determines which genes should be analysed, and prescribes testing. Germline testing is carried out on a blood sample by expert laboratories using next generation sequencing on panels of cancer susceptibility genes. The cancer geneticists then returns the result to the patient. When a pathogenic variant is identified, the patient’s management ismodified, with recommendations ranging from intensified surveillance to risk-reducing surgery. Treatment is sometimes adapted to the pathogenic variant. In addition, relatives can undergo genetic testing, should they wish to know whether they carry the familial variant. In the near future, we expect clinical cancer genetics to move towards strengthened partnerships with molecular pathologists and medical oncologists. Somatic genetic analyses are now routine, at least in metastatic cancer, and a proportion of the tumoral variants identified are actually of germline origin. As for the oncologists, the development of mainstreaming programs where they are allowed to prescribe germline testing under the supervision of a cancer genetics team is unavoidable.; Les patients dont le cancer est associé à une prédisposition génétique doivent être identifiés, puisque leur prise en charge à long terme en dépend. Les anatomopathologistes jouent un rôle clé dans l’initiation de cette démarche. En effet, un diagnostic précis oriente les investigations oncogénétiques, voire les justifie s’il s’agit par exemple d’un cancer colorectal avec perte d’expression de protéines codées par les gènes de mésappariements de l’ADN ou d’un type rare de cancer du rein perdant l’expression de la fumarate hydratase. Les analyses génétiques tumorales représentent aussi une porte d’entrée pour l’Oncogénétique, par exemple cancer bronchopulmonaire avec variant tumoral EGFR T790M pré-traitement. En cas de suspicion de prédisposition génétique, le patient est adressé en consultation d’Oncogénétique. Le médecin accompagné d’un conseiller en génétique y collecte les informations personnelles et familiales, les intègre à un processus décisionnel impliquant des outils bioinformatiques et des scores clinico- pathologiques, et prescrit les analyses constitutionnelles. Le laboratoire d’Oncogénétique réalise ensuite l’analyse sous forme de panel de gènes avec des machines de séquençage haut débit. Le résultat est rendu quelques semaines plus tard par l’Oncogénéticien. L’observation d’un variant pathogène résulte en des recommandations de prise en charge à long terme, dépistage et chirurgie de réduction de risque. Les avancées de la médecine permettent aussi dorénavant d’adapter parfois les traitements au résultat. En outre, l’identification d’un variant pathogène permet ensuite aux apparentés de bénéficier de tests génétiques. L’évolution à court terme de l’Oncogénétique se caractérisera par un partenariat renforcé avec les anatomopathologistes et pathologistes moléculaires, puisque la généralisation des analyses génétiques tumorales à visée thérapeutique révèlera de manière incidentale des variants pathogènes constitutionnels. Par ailleurs la mise en place de circuits de « mainstreaming » avec les oncologues, dans lesquels ces derniers prescrivent des analyses constitutionnelles dans un cadre précis et sous la supervision d’un Oncogénéticien, est inéluctable.

The thesis project aimed at developing computational strategies to exploit the information generated by deep mutational scanning (DMS) technologies to predict the structures of protein assemblies. In that scope, I explored how to improve the agreement between the models simulated by molecular docking and experimental constraints. From the literature, two reference complexes whose structures have been solved experimentally and for which DMS data were published could be used for the methodological development: the parD3-parE3 and dockerin-cohesin complexes. For each of the many mutants generated by DMS, an experimental score quantifying the affinity of the complex could be extracted from the available data. For the simulations, a number of protocols based on the Rosetta software were tested and optimized to predict the effect of mutations on interface stability. A compromise was found between efficiency and precision, allowing for a fair estimation of the effect of mutations on native complex structures. The agreement between the predicted and the experimental data was quantified using two different metrics, either the correlation between the predicted and experimental binding scores or the area under the ROC (Receiver Operating Characteristic) curve, defining how efficiently the predictor could sort out the most impacting mutations. Applied to a set of 1000 decoys of complexes generated by docking, both metrics were assessed for their ability to discriminate correct from wrong models. For both reference systems, the second metrics based on ROC curves was found most useful. This methodology was further applied to an antibody-antigen complex which was studied by DMS in the group of B. Maillère. My PhD work was also dedicated to the processing of the raw data from DMS experiments which were generated by our collaborators, O. Pereira-Ramos and L. Martin, in order to design a high affinity peptide for the protein Asf1 and to screen interaction surfaces between Asf1 and its binding partners. Last, throughout my PhD I had the opportunity to participate in all targets submitted to the docking community by the organizers of CAPRI, an international challenge for the assessment of methods for the structural prediction of protein interactions. The manuscript details all the strategies which were set up to tackle these challenges for which our team eventually ranked first by generating the highest number of both correct and precise models.; L’objectif de cette thèse a été de développer des stratégies computationnelles permettant d’exploiter les informations issues des technologies de mutagenèse à haut débit (deep mutational scanning, DMS) pour prédire le mode d’assemblage des protéines. Pour cela, j’ai cherché à améliorer l’accord entre les modèles simulés par les techniques d’amarrage moléculaire et les contraintes expérimentales. Deux complexes de référence dont les structures ont été résolues expérimentalement et pour lesquels les données de DMS ont été publiées ont été utilisés pour la mise au point de ces méthodes, les complexes parD3-parE3 et dockerin-cohesin. Pour chacun des nombreux mutants générés par DMS, une mesure expérimentale de score de liaison quantifiant l’affinité des partenaires en complexe a pu être extraite. Pour la modélisation, différents protocoles basés sur le logiciel Rosetta ont été explorés pour prédire l’effet des mutations sur la stabilité des interfaces. Un compromis entre efficacité et précision a été identifié, permettant d’estimer de façon satisfaisante l’effet des mutations sur les structures natives des complexes. L’accord entre prédiction et données expérimentales a été quantifié en utilisant deux métriques, la corrélation entre les scores d’affinité prédits et mesurés et l’aire sous la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) définissant l’efficacité du prédicteur à classer correctement les mutations ayant le plus fort impact. Appliquées sur un ensemble de 1000 modèles de complexes issus des simulations d’amarrage, ces deux métriques ont été évaluées dans leur capacité à discriminer les modèles corrects des modèles faux. Pour les deux systèmes étudiés, la deuxième métrique apparaît comme la mieux adaptée. La méthodologie a ensuite été appliquée à un cas de complexe antigène-anticorps dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de B. Maillère. Mon travail de thèse a également été consacré au traitement des données de DMS générées avec nos collaborateurs O. Pereira-Ramos et L. Martin dans un cas de design de peptides à haute affinité pour la protéine Asf1 et pour le criblage des surfaces d’interaction de cette protéine avec ses partenaires. Enfin, j’ai participé tout au long de mon doctorat aux différentes cibles proposées par les organisateurs du 7ème concours CAPRI, concours international pour l’évaluation des méthodes de prédiction des structures de complexes protéiques. Le manuscrit détaille l’ensemble des stratégies mises en oeuvre qui ont permis à notre équipe de se classer en tête de ce concours en générant le plus grand nombre de modèles corrects et précis.

Introduction: neurological symptoms in mitochondrial diseases (MD) have been reported as the most frequent in pediatric patients. A biochemical deficiency of the mitochondrial respiratory chain (MRC) does not allow to distinguish with certainty between primary mitochondrial diseases (PMD) and secondary mitochondrial dysfunction (SMD). Our primary objective was to define how PMD were involved in early epilepsies. Our secondary objective was to search for a difference in clinical or paraclinical presentation between patients with PMD and SMD, and according to overall PMD probability. Material and methods: we included patients with epilepsy onset before 2 years and for whom at least one tissular biopsy was sent to the National Center for Mitochondrial Diseases of the Nice University Hospital, from 2007 to 2017. Patients with certain diagnosis were divided between PMD, SMD and other diagnoses without biochemical deficiency. All the patients were then divided between 3 groups of PMD probability (high, intermediate, low). Results: among 62 included patients, 20 had an established diagnosis (6 PMD, 8 SMD and 6 other diagnoses without biochemical deficiency). Survival probability was significantly higher in the SMD group. We did not find any statistically significant difference in clinical or paraclinical parameters between PMD and SMD groups. We observed a trend for a higher frequency of classical biochemical findings and MRI findings in the PMD group. We found a significantly different death rate between PMD probability groups. We did not find a specific pattern of respiratory chain complexes deficiency. Conclusion: classical biochemical findings are possibly more frequent in the PMD group than in the SMD group in patients with epilepsy onset before 2 years, and therefore might guide genetic explorations. WES takes a growing importance in diagnosis for these patients. Patient referral toward reference centers and collaborative work between centers is mandatory for optimal care.; Introduction : l’atteinte neurologique dans les maladies mitochondriales (MM) a été rapportée comme étant la plus fréquente chez les patients pédiatriques. La mise en évidence d’un déficit biochimique de la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM) ne permet pas formellement de différencier MM et déficits secondaires de la CRM (DSC). L’objectif principal était de définir la place des MM parmi les causes d’épilepsie précoce. L’objectif secondaire était de rechercher une différence en termes de présentation clinique et paraclinique entre les patients porteurs de MM et de DSC, et selon la probabilité de MM. Matériels et méthodes : nous avons inclus les patients présentant une épilepsie avant 2 ans, pour lesquels au moins un prélèvement tissulaire exploitable avait été adressé au service de génétique médicale du CHU de Nice pour suspicion de MM, entre 2007 et 2017. Les patients avec diagnostic de certitude étaient répartis entre MM, DSC et autres diagnostics sans déficit. Tous les patients étaient ensuite répartis en 3 groupes de probabilité de MM (forte, intermédiaire, faible). Résultats : sur 62 patients identifiés, 20 patients avaient eu un diagnostic de certitude (6 MM, 8 DSC et 6 autres diagnostics sans déficit). La probabilité de survie était significativement plus élevée dans le groupe DSC. Nous n’avons pas retrouvé de différence statistiquement significative en termes de présentation clinique ou paraclinique entre les groupes MM et DSC. Il existait une tendance à une fréquence plus élevée d’anomalies biologiques classiques et d’imagerie dans le groupe MM. Le taux de décès était significativement différent entre les groupes de probabilité de MM. Il n’existait pas de pattern spécifique des déficits biochimiques retrouvés au niveau des complexes de la CRM. Conclusion : les signes biochimiques classiques sont possiblement plus fréquents dans le groupe MM que dans le groupe DSC chez les patients porteurs d’une épilepsie débutant avant 2 ans, ce qui pourrait orienter les explorations génétiques. Le séquençage d’exome prend une grande place dans la prise en charge diagnostique. L’adressage des patients vers les différents centres de références et le travail des centres en collaboration est indispensable.

Ntroduction: Mosaic cutaneous dyschromia is strongly evocative of an underlying genetic mosaicism. These post-zygotic events are challenging for conventional diagnostic tools. Thus, genetic basis of mosaic cutaneous dyschromia still remained poorly understood. Materials and Methods: The M.U.S.T.A.R.D. cohort gathers DNA from skin biopsies of patients with mosaic cutaneous dyschromia. After a specialised phenotype analysis, they are referred to either trio exome sequencing (ES) at 200X, or targeted ultra-deep sequencing (60,000X) of candidate genes. Data are analysed with a tailored pipeline, allowing detection of both low-rate nucleotidic variations or chromosomal events. Results: From 2013 to 2019, 101 patients were included. ES was performed for 56, with identification of mosaic SNV in 12 patients in 7 new genes, including 4 new genes (RHOA, DOCK1, GNA13, TFE3), and mosaic chromosomal anomalies in 17 patients. A targeted sequencing of these genes was performed for 40 more patients, with a confirmed mosaic SNV in 17, and a global diagnostic yield of 55% (46/84). Conclusion: This work highlights the importance of a versatile bioinformatic approach combined to a clinical expertise, to decipher the chromosomal and molecular aetiologies of developmental anomalies with mosaic cutaneous dyschromia. It also pinpoints the role of the Rho GTPase pathway, which will help enhancing our understanding of mosaic cutaneous dyschromia, and may ultimately result in better patients’ care., Introduction : Les dyschromies cutanées en mosaïque ont fait suspecter de longue date l’implication d’un mosaïcisme génétique sous-jacent. Ces évènements post-zygotiques sont cependant difficilement détectables par les techniques conventionnelles. Ainsi, les bases génétiques des dyschromies en mosaïque étaient restées mal connues. Matériel et méthodes : la cohorte M.U.S.T.A.R.D rassemble des échantillons d’ADN de biopsies cutanées de patients porteurs d’un mosaïcisme pigmentaire. Après une analyse phénotypique spécialisée, ces échantillons sont étudiés en séquençage à forte profondeur, d’exome (ES) en trio, ou ciblé. Les données sont analysées à l’aide d’un pipeline dédié, permettant la détection de variations ponctuelles en mosaïque (mSNV) mais également de diverses anomalies chromosomiques en mosaïque. Résultats : De 2013 à 2019, 101 patients ont été inclus. Un ES a été réalisé pour 56 patients, identifiant un mSNV chez 12 patients, dans 7 gènes dont 4 nouveaux (RHOA, DOCK1, GNA13, TFE3), et une anomalie chromosomique chez 17 patients. Une étude ciblée de ces gènes chez 40 autres patients était positive pour 17, soit un rendement diagnostique global à 55% (46/84). Conclusion : Ce travail illustre l’importance d’une approche bioinformatique polyvalente, combinée à une expertise clinique, pour la détermination des causes génétiques des dyschromies cutanées en mosaïque. Il a également mis en évidence le rôle de la voie de signalisation dépendant des Rho GTPases, faisant progresser notre compréhension de la physiopathologie des dyschromies en mosaïque, une étape nécessaire à l’amélioration de la prise en charge de ces patients porteurs de maladies rares et complexes.

Depuis ces dernières années, nous assistons à une révolution technologique en génétique moléculaire avec l’avènement du séquençage de nouvelle génération (NGS). Lors des consultations médicales de génétique à l’hôpital, le patient est confronté à la question difficile de la recherche et de la divulgation des données dites additionnelles, qui ne sont pas en lien avec sa pathologie, la donnée primaire. Il peut s’agir de données incidentes (la découverte est fortuite) ou de données secondaires, c’est-à-dire des données recherchées activement dans une liste de gènes définie. Comment s’assurer de l’autonomie suffisante des patients face à cette question? Quel est le rôle de l’équipe soignante? Peut-on harmoniser les pratiques relativement à ces données? Nous proposons une stratégie de l’échelle variable appliquée à la génétique qui consiste à adapter le degré d’autonomie exigé en fonction de l’impact médical et du niveau de fiabilité des données génétiques transmises au patient. Nous apportons également des éléments pour favoriser l’autonomie du patient. Il nous paraît nécessaire de dissocier distinctement la donnée primaire des données additionnelles, de développer les moyens visant à délivrer une information adéquate au patient et enfin d’accompagner le patient dans sa démarche par un soutien psychologique et de respecter un délai de réflexion. De manière ultime, il appartient à l’équipe médicale d’évaluer au cas par cas du bienfondé de la recherche de ces données et de leur révélation au patient., In recent years, we have witnessed a technological revolution in molecular genetics with the advent of next-generation sequencing (NGS). During medical genetics consultations in hospitals, patients are confronted with the difficult question of research and disclosure of so-called additional data, which are not related to their pathology, the primary data. This may be incidental data (the discovery is incidental) or secondary data, i.e., data actively searched for in a defined list of genes. How can we ensure that patients are sufficiently autonomous in dealing with this issue? What is the role of the healthcare team? Can we harmonize practices with respect to these data? We propose a variable scale strategy applied to genetics that consists in adapting the degree of autonomy required according to the medical impact and the level of reliability of the genetic data transmitted to the patient. We also provide elements to promote patient autonomy. We believe it is necessary to separate primary from additional data, to develop the means to provide adequate information to patients, and finally to support patients in their process with psychological support and to respecting a certain period of reflection. Ultimately, it is the responsibility of the medical team to assess, on a case-by-case basis, the appropriateness of seeking this data and disclosing it to the patient.

Breast and ovarian cancers appear in 5 to 10% of cases in a context of genetic predisposition, of which only a small proportion is explained by the presence of a pathogenic variant on the BRCA1, BRCA2 and PALB2 genes. High throughput sequencing can explore this missing heredity, but represents a new challenge both in computing, statistics and biology. Three approaches using this new technology have been used to investigate new predisposition factors. First, the risks associated with 34 known or suspected genes involved in predispositions were estimated from the analysis of 5,131 index cases and the development of a new statistical approach. Also, the participation of mosaic neo-mutations in the syndrome was explored from 1,750 index cases from the previous study, with a software developed specifically for detecting poorly represented variants: outLyzer. Finally, the exploration by sequencing of the missing heredity was extended to a panel of 201 genes involved in cancer, from 118 patients selected for the early onset of their disease, a highly suggestive element of a predisposition factor. The results of this work validated the relevance of the PALB2, RAD51C and RAD51D study for patient management, and also suggested an underestimated involvement of mosaic variants. However, there are still very likely other highly penetrating genetic factors to be discovered, but whose risk modulation is based on an oligogenic model., Les cancers du sein et de l’ovaire apparaissent dans 5 à 10% dans un contexte de prédisposition génétique, dont seule une faible part est expliquée par la présence d’un variant pathogène sur les gènes BRCA1, BRCA2 et PALB2. Le séquençage à haut-débit permet d’explorer cette hérédité manquante, mais représente un nouveau défi à la fois informatique, statistique et biologique. Trois approches utilisant cette nouvelle technologie ont été employées pour rechercher de nouveaux facteurs de prédisposition. En premier lieu, les risques associés à 34 gènes connus ou suspectés d’être impliqués dans les prédispositions ont été estimés à partir de l’analyse de 5 131 cas index et le développement d’une nouvelle approche statistique. Aussi la participation des néo-mutations en mosaïque dans le syndrome a été explorée à partir de 1 750 cas index issus de l’étude précédente, avec un logiciel de détection des variants faiblement représentés développé spécifiquement: outLyzer. Enfin, l’exploration par séquençage de l’hérédité manquante a été étendue à un panel de 201 gènes impliqués dans le cancer, à partir de 118 patientes sélectionnées pour la précocité d’apparition de leur maladie, élément fortement évocateur d’un facteur de prédisposition. Les résultats de ces travaux ont permis de valider la pertinence de l’étude de PALB2, RAD51C et RAD51D pour la prise en charge des patients, et suggèrent aussi une implication sous-estimée des variants en mosaïque. Cependant il reste encore très probablement d’autres facteurs génétiques fortement pénétrants à découvrir mais dont la modulation du risque répond à un modèle oligogénique.

Breast and ovarian cancers appear in 5 to 10% of cases in a context of genetic predisposition, of which only a small proportion is explained by the presence of a pathogenic variant on the BRCA1, BRCA2 and PALB2 genes. High throughput sequencing can explore this missing heredity, but represents a new challenge both in computing, statistics and biology. Three approaches using this new technology have been used to investigate new predisposition factors. First, the risks associated with 34 known or suspected genes involved in predispositions were estimated from the analysis of 5,131 index cases and the development of a new statistical approach. Also, the participation of mosaic neo-mutations in the syndrome was explored from 1,750 index cases from the previous study, with a software developed specifically for detecting poorly represented variants: outLyzer. Finally, the exploration by sequencing of the missing heredity was extended to a panel of 201 genes involved in cancer, from 118 patients selected for the early onset of their disease, a highly suggestive element of a predisposition factor. The results of this work validated the relevance of the PALB2, RAD51C and RAD51D study for patient management, and also suggested an underestimated involvement of mosaic variants. However, there are still very likely other highly penetrating genetic factors to be discovered, but whose risk modulation is based on an oligogenic model.; Les cancers du sein et de l’ovaire apparaissent dans 5 à 10% dans un contexte de prédisposition génétique, dont seule une faible part est expliquée par la présence d’un variant pathogène sur les gènes BRCA1, BRCA2 et PALB2. Le séquençage à haut-débit permet d’explorer cette hérédité manquante, mais représente un nouveau défi à la fois informatique, statistique et biologique. Trois approches utilisant cette nouvelle technologie ont été employées pour rechercher de nouveaux facteurs de prédisposition. En premier lieu, les risques associés à 34 gènes connus ou suspectés d’être impliqués dans les prédispositions ont été estimés à partir de l’analyse de 5 131 cas index et le développement d’une nouvelle approche statistique. Aussi la participation des néo-mutations en mosaïque dans le syndrome a été explorée à partir de 1 750 cas index issus de l’étude précédente, avec un logiciel de détection des variants faiblement représentés développé spécifiquement: outLyzer. Enfin, l’exploration par séquençage de l’hérédité manquante a été étendue à un panel de 201 gènes impliqués dans le cancer, à partir de 118 patientes sélectionnées pour la précocité d’apparition de leur maladie, élément fortement évocateur d’un facteur de prédisposition. Les résultats de ces travaux ont permis de valider la pertinence de l’étude de PALB2, RAD51C et RAD51D pour la prise en charge des patients, et suggèrent aussi une implication sous-estimée des variants en mosaïque. Cependant il reste encore très probablement d’autres facteurs génétiques fortement pénétrants à découvrir mais dont la modulation du risque répond à un modèle oligogénique.

Diatoms are microscopic unicellular algae which are excellent indicators of the ecological status of the environment in which they live. In the Water Framework Directive (WFD), diatom communities are used to assess the quality of rivers. For this purpose, quality indices based on the susceptibility of species to pollution are calculated from the composition and relative abundance of diatom taxa. Species identification is typically carried out under a microscope, which, in addition to being complex, can be time-consuming and costly when many samples are processed.A newly developed method allows species to be identified, not on the basis of their morphological variability, but on the basis of their genetic variability using short DNA sequences (or DNA barcodes). Combined with high-throughput sequencing technologies, this molecular approach, called metabarcoding, allows to identify all the species present in an environmental sample and to process several hundred samples in parallel. These advantages make metabarcoding an alternative method to those based on morphological identification, which is interesting for the WFD. Although several studies have demonstrated the ability of this approach to correctly identify diatom species found in environmental samples, the lack of reliability in the quantification of the species relative abundances limits the reliability of calculated quality indices and the use of metabarcoding as a tool for biomonitoring. The objectives of this thesis were (i) to identify and optimize the biases impacting the relative quantification of diatoms in metabarcoding; (ii) to apply the molecular approach at a larger scale on environmental samples from river networks in order to compare quality assessments obtained by morphological and molecular approaches.First, we quantified the bias associated with DNA extraction using pure diatom cultures and environmental samples. Although the choice of the extraction method affects the quality and the quantity of extracted DNA, as the relative abundances of some species identified with metabarcoding, the community composition and water quality index values are not significantly affected. Thus, we decided to use the GenElute method for other works realized during the thesis, as this method produces the largest quantities of DNA at a lower cost. In a second step, using qPCR experiments carried out on pure diatom cultures, we showed that the rbcL gene copy number (used as DNA barcode) is correlated to the cell biovolume, which results in an overestimation of large biovolume species with the metabarcoding. On the basis of this correlation, a correction factor was proposed and applied to metabarcoding data obtained from artificial diatom communities and environmental samples, allowing to obtain species relative abundances similar to those obtained with the morphological approach and to improve the reliability of water quality index values. Finally, the application of the molecular approach at the scale of the WFD rivers monitoring networks of Mayotte and France has enabled us to show that metabarcoding is a faster and cheaper alternative to the morphological approach, while allowing a good water quality assessment of streams.Our work confirms that the molecular approach can be used to assess the quality of rivers. However, further studies will have to be performed before considering a routine application and its implementation in the WFD, particularly in terms of standardization of the methods used in the molecular approach., Les diatomées sont des algues unicellulaires microscopiques qui sont d’excellents indicateurs de l’état écologique du milieu dans lequel elles se trouvent. Dans le cadre de la Directive Cadre sur l’Eau (DCE), les communautés de diatomées sont utilisées pour évaluer la qualité des cours d’eau. Pour cela, des indices de qualité basés sur la sensibilité des espèces à la pollution sont calculés à partir de la composition et de l’abondance relative des taxa de diatomées. L’identification des espèces est généralement réalisée au microscope, ce qui, en plus d’être complexe, peut être assez long et coûteux lorsqu’il s’agit de traiter de nombreux échantillons.Une nouvelle méthode développée récemment permet d’identifier les espèces, non plus sur la base de leur variabilité morphologique, mais sur la base de leur variabilité génétique en utilisant de courtes séquences ADN (ou barcodes ADN). Combinée aux technologies de séquençage à haut débit, cette approche moléculaire, appelée metabarcoding, permet d’identifier l’ensemble des espèces présentes au sein d’un échantillon environnemental et de traiter plusieurs centaines d’échantillons en parallèle. Ces avantages font du metabarcoding une alternative à la méthode d’identification morphologique, intéressante dans le cadre de la DCE. Bien que plusieurs études aient montré la capacité de cette approche à identifier correctement les espèces de diatomées retrouvées dans des échantillons environnementaux, le manque de fiabilité dans la quantification des abondances relatives des espèces limite le calcul d’indices fiable et l’utilisation du metabarcoding comme outil pour la bioindication. Les objectifs de ce travail de thèse ont donc été (i) d’identifier et d’optimiser les biais impactant la quantification relative des diatomées en metabarcoding ; (ii) d’appliquer l’approche moléculaire à large échelle, sur des échantillons environnementaux de réseaux de cours d’eau afin de comparer les évaluations de qualité obtenues par les approches morphologique et moléculaire.Dans un premier temps, nous avons évalué les biais de quantification liés à l’extraction de l’ADN sur des cultures pures de diatomées et des échantillons environnementaux. Bien que le choix de la méthode d’extraction affecte la qualité et la quantité des ADN extraits, ainsi que les abondances relatives de certaines espèces obtenues en metabarcoding, la composition de la communauté ainsi que les notes de qualités ne sont pas significativement affectées. Nous avons donc décidé d’utiliser pour la suite des travaux la méthode GenElute qui produit les plus grandes quantités d’ADN pour un moindre coût. Dans un deuxième temps, grâce à des expériences de qPCR réalisées sur des cultures pures de diatomées, nous avons montré que le nombre de copies du gène rbcL (utilisé comme barcode ADN) est proportionnel au biovolume des cellules, ce qui a pour conséquence une surestimation des espèces à gros biovolumes en metabarcoding. A partir de cette corrélation, un facteur de correction a été proposé et appliqué sur les données de metabarcoding issues de communautés artificielles et d’échantillons environnementaux, permettant d’obtenir des abondances relatives d’espèces comparables à celles obtenues en microscopie et d’améliorer la fiabilité des notes de qualité. Finalement, l’application de l’approche moléculaire à l’échelle des réseaux DCE de surveillance des cours d’eau de Mayotte et de France métropolitaine a permis de montrer que le metabarcoding est une alternative plus rapide et plus économique que l’approche morphologique, tout en permettant une bonne évaluation de la qualité des cours d’eau.Nos travaux confirment que l’approche moléculaire peut être utilisée pour évaluer la qualité des cours d’eau. Cependant d’autres études devront être réalisées avant d’envisager une application en routine et une implémentation dans la DCE, notamment en termes de standardisation et de normalisation des méthodes utilisées dans l’approche moléculaire.

The prevalence of intellectual disability is estimated between 1% and 3% of the population. In France, mild intellectual disability affects between 10 and 20 per 1,000 people and severe intellectual disability between from 3 to 4 per 1,000 people. Intellectual disability is part of a heterogeneous group of syndromic and nonsyndromic pathologies with limitation in intellectual functioning and adaptive behavior appearing before the age of 18 and causing a disability. The causes of intellectual disability affect neurogenesis and / or neuronal functions. About 50% of intellectual disabilities are still undetermined. Genetic etiologies explain a large number of intellectual disabilities and more particularly the severe forms. New technologies, such as Array- Based Comparative Genomic Hybridization and next generation sequencing, have increased the diagnostic yield to 55-70% in moderate to severe intellectualdisability. Thanks to these techniques, we have been able to identify and characterize two new genes involved in severe autosomal recessive syndrome: the WDR73 gene responsible for Galloway Mowat syndrome which associates severe intellectual disability with corticosteroid-resistant nephrotic syndrome, and the UBA5 gene, involved in the ufmylation process in early encephalopathy., La prévalence de la déficience intellectuelle est estimée entre 1 à 3% de la population. En France, la déficience intellectuelle légère concerne entre 10 et 20 pour 1 000 personnes et la déficience intellectuelle sévère entre 3 à 4 pour 1 000 personnes. La déficience intellectuelle fait partie d’un groupe hétérogène de pathologies syndromiques et non syndromiques ayant en commun la limitation importante du fonctionnement intellectuel et du comportement adaptatif, apparaissant avant 18 ans et entrainant un handicap. Les causes de la déficience intellectuelle affectent la neurogénèse et/ou le fonctionnement neuronal. Environ 50% des déficiences intellectuelles sont encore à l’heure actuelle d’étiologie indéterminée. Les étiologies génétiques expliquent un grand nombre de déficiences intellectuelles et plus particulièrement les formes sévères. Les nouvellestechnologies, telles que les analyses chromosomiques sur puce à ADN et le séquençage à haut débit de l’ADN, ont permis d’augmenter le rendement diagnostique à 55-70% dans les déficiences intellectuelles modérées à sévères. C’est grâce à ces techniques que nous avons pu identifier puis caractériser deux nouveaux gènes impliqués dans des déficiences intellectuelles sévères syndromiques autosomiques récessives: le gène WDR73 responsable du syndrome de Galloway Mowat associant un déficience intellectuelle sévère et un syndrome néphrotique cortico-résistant et le gèneUBA5, impliqué dans le processus d’ufmylation, dans une encéphalopathie précoce.

In this thesis, we are interested in the problem of on-line pattern matching in highly similar sequences, On-line Pattern Matching on Highly Similar Sequences, outcoming from Next Generation Sequencing technologies (NGS). These sequences only differ by a very small amount. There is thus a strong need for efficient algorithms for performing fast pattern matching in such specific sets of sequences. We develop new algorithms to process this problem. This thesis is partitioned into five parts. In the first part, we present a state of the art on the most popular algorithms of finding problem and the related indexes. Then, in the three following parts, we develop three algorithms directly dedicated to the on-line search for patterns in a set of highly similar sequences. Finally, in the fifth part, we conduct an experimental study on these algorithms. This study shows that our algorithms are efficient in practice in terms of computation time., Dans cette thèse, nous nous intéressons au problème de recherche incrémentale de motifs dans des séquences fortement similaires (On-line Pattern Matching on Highly Similar Sequences), issues de technologies de séquençage à haut débit (SHD). Ces séquences ne diffèrent que par de très petites quantités de variations et présentent un niveau de similarité très élevé. Il y a donc un fort besoin d'algorithmes efficaces pour effectuer la recherche rapide de motifs dans de tels ensembles de séquences spécifiques. Nous développons de nouveaux algorithmes pour traiter ce problème. Cette thèse est répartie en cinq parties. Dans la première partie, nous présentons un état de l'art sur les algorithmes les plus connus du problème de recherche de motifs et les index associés. Puis, dans les trois parties suivantes, nous développons trois algorithmes directement dédiés à la recherche incrémentale de motifs dans un ensemble de séquences fortement similaires. Enfin, dans la cinquième partie, nous effectuons une étude expérimentale sur ces algorithmes. Cette étude a montré que nos algorithmes sont efficaces en pratique en terme de temps de calcul

The prevalence of intellectual disability is estimated between 1% and 3% of the population. In France, mild intellectual disability affects between 10 and 20 per 1,000 people and severe intellectual disability between from 3 to 4 per 1,000 people. Intellectual disability is part of a heterogeneous group of syndromic and nonsyndromic pathologies with limitation in intellectual functioning and adaptive behavior appearing before the age of 18 and causing a disability. The causes of intellectual disability affect neurogenesis and / or neuronal functions. About 50% of intellectual disabilities are still undetermined. Genetic etiologies explain a large number of intellectual disabilities and more particularly the severe forms. New technologies, such as Array- Based Comparative Genomic Hybridization and next generation sequencing, have increased the diagnostic yield to 55-70% in moderate to severe intellectualdisability. Thanks to these techniques, we have been able to identify and characterize two new genes involved in severe autosomal recessive syndrome: the WDR73 gene responsible for Galloway Mowat syndrome which associates severe intellectual disability with corticosteroid-resistant nephrotic syndrome, and the UBA5 gene, involved in the ufmylation process in early encephalopathy.; La prévalence de la déficience intellectuelle est estimée entre 1 à 3% de la population. En France, la déficience intellectuelle légère concerne entre 10 et 20 pour 1 000 personnes et la déficience intellectuelle sévère entre 3 à 4 pour 1 000 personnes. La déficience intellectuelle fait partie d’un groupe hétérogène de pathologies syndromiques et non syndromiques ayant en commun la limitation importante du fonctionnement intellectuel et du comportement adaptatif, apparaissant avant 18 ans et entrainant un handicap. Les causes de la déficience intellectuelle affectent la neurogénèse et/ou le fonctionnement neuronal. Environ 50% des déficiences intellectuelles sont encore à l’heure actuelle d’étiologie indéterminée. Les étiologies génétiques expliquent un grand nombre de déficiences intellectuelles et plus particulièrement les formes sévères. Les nouvellestechnologies, telles que les analyses chromosomiques sur puce à ADN et le séquençage à haut débit de l’ADN, ont permis d’augmenter le rendement diagnostique à 55-70% dans les déficiences intellectuelles modérées à sévères. C’est grâce à ces techniques que nous avons pu identifier puis caractériser deux nouveaux gènes impliqués dans des déficiences intellectuelles sévères syndromiques autosomiques récessives: le gène WDR73 responsable du syndrome de Galloway Mowat associant un déficience intellectuelle sévère et un syndrome néphrotique cortico-résistant et le gèneUBA5, impliqué dans le processus d’ufmylation, dans une encéphalopathie précoce.

In this thesis, we are interested in the problem of on-line pattern matching in highly similar sequences, On-line Pattern Matching on Highly Similar Sequences, outcoming from Next Generation Sequencing technologies (NGS). These sequences only differ by a very small amount. There is thus a strong need for efficient algorithms for performing fast pattern matching in such specific sets of sequences. We develop new algorithms to process this problem. This thesis is partitioned into five parts. In the first part, we present a state of the art on the most popular algorithms of finding problem and the related indexes. Then, in the three following parts, we develop three algorithms directly dedicated to the on-line search for patterns in a set of highly similar sequences. Finally, in the fifth part, we conduct an experimental study on these algorithms. This study shows that our algorithms are efficient in practice in terms of computation time.; Dans cette thèse, nous nous intéressons au problème de recherche incrémentale de motifs dans des séquences fortement similaires (On-line Pattern Matching on Highly Similar Sequences), issues de technologies de séquençage à haut débit (SHD). Ces séquences ne diffèrent que par de très petites quantités de variations et présentent un niveau de similarité très élevé. Il y a donc un fort besoin d'algorithmes efficaces pour effectuer la recherche rapide de motifs dans de tels ensembles de séquences spécifiques. Nous développons de nouveaux algorithmes pour traiter ce problème. Cette thèse est répartie en cinq parties. Dans la première partie, nous présentons un état de l'art sur les algorithmes les plus connus du problème de recherche de motifs et les index associés. Puis, dans les trois parties suivantes, nous développons trois algorithmes directement dédiés à la recherche incrémentale de motifs dans un ensemble de séquences fortement similaires. Enfin, dans la cinquième partie, nous effectuons une étude expérimentale sur ces algorithmes. Cette étude a montré que nos algorithmes sont efficaces en pratique en terme de temps de calcul

L'hypothyroïdie congénitale par dysgénésie thyroïdienne (HCDT, ectopie dans plus de 80 %) a une prévalence de 1 cas sur 4000 naissances vivantes. L’HCDT est la conséquence d'une défaillance de la thyroïde embryonnaire à se différencier, à se maintenir ou à migrer vers sa localisation anatomique (partie antérieure du cou), qui aboutit à une absence totale de la thyroïde (athyréose) ou à une ectopie thyroïdienne (linguale ou sublinguale). Les HCDT sont principalement non-syndromiques (soit 98% des cas sont non-familiale), ont un taux de discordance de 92% chez les jumeaux monozygotes, et ont une prédominance féminine et ethnique (i.e., Caucasienne). La majorité des cas d’HCDT n’a pas de cause connue, mais est associée à un déficit sévère en hormones thyroïdiennes (hypothyroïdie). Des mutations germinales dans les facteurs de transcription liés à la thyroïde (NKX2.1, FOXE1, PAX8, NKX2.5) ont été identifiées dans seulement 3% des patients atteints d’HCDT sporadiques et l’analyse de liaisons exclue ces gènes dans les rares familles multiplex avec HCDT. Nous supposons que le manque de transmission familiale claire d’HCDT peut résulter de la nécessité d’au moins deux « hits » génétiques différents dans des gènes importants pour le développement thyroïdien. Pour répondre au mieux nos questions de recherche, nous avons utilisé deux approches différentes: 1) une approche gène candidat, FOXE1, seul gène impliqué dans l’ectopie dans le modèle murin et 2) une approche en utilisant les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) afin de trouver des variants génétiques pouvant expliquer cette pathologie au sein d’une cohorte de patients avec HCDT. Pour la première approche, une étude cas-contrôles a été réalisée sur le promoteur de FOXE1. Il a récemment été découvert qu’une région du promoteur de FOXE1 est différentiellement méthylée au niveau de deux dinucléotides CpG consécutifs, définissant une zone cruciale de contrôle de l’expression de FOXE1. L’analyse d’association basée sur les haplotypes a révélé qu’un haplotype (Hap1: ACCCCCCdel1C) est associé avec le HCDT chez les Caucasiens (p = 5x10-03). Une réduction significative de l’activité luciférase est observée pour Hap1 (réduction de 68%, p, Congenital hypothyroidism by thyroid dysgenesis (CHTD) is a common disorder with prevalence at birth of 1 in 4000 live births. CHTD is the consequence of a failure of embryonic thyroid to differentiate or to migrate to its anatomical location (front of the neck), which leads to a total lack of thyroid (athyreosis) or an ectopic thyroid (lingual or sublingual). The most common category is ectopic thyroid diagnosis (up 85%). Most cases of CHTD have no known cause, but are associated with severe deficiency of thyroid hormones (hypothyroidism). The clinical diagnosis of hypothyroidism is usually possible only when permanent brain damage is already present. On the other hand, biochemical screening on the second day of life allows initiating replacement therapy from the second week of life, pre-empting severe intellectual deficit associated with the congenital hypothyroidism. Even with early treatment (an average of 9 days), loss of IQ, which is not exclusively due to the severity of hypothyroidism, can still be observed. Molecular markers may identify patients at risk for intellectual deficit (by e.g., genes involved in neuronal migration and the thyroid during development). These patients might benefit from early intervention to stimulate their neurocognitive development. Cases of CHTD are mainly non-syndromic and sporadic (in 98% of cases, there is no other affected in the family), have a discordant rate of 92% in monozygotic twins, and a female and ethnic (Caucasian) dominance. Germline mutations in thyroid-related transcription factors have been identified in only 3% of patients with sporadic CHTD, and linkage analysis has excluded these genes in rare multiplex families with CHTD. In addition, non-penetrating mutations among close relatives (for Nkx2.5 gene) suggest that modifying genes as germline variants de novo copy number (CNV) and / or somatic mutations are associated with CHTD. To respond to this research questions, we used two different approaches: 1) a candidate gene approach studying FOXE1, the only gene involved in ectopic thyroid in the mouse model and, 2) an approach using next generation sequencing techniques (NGS) to find genetic variants that could explain this pathology using a cohort of mostly sporadic CHTD. Variants and genes discovered by these two different approaches have been validated and their functional impact on the thyroid gland was evaluated by several experiments.

Purpose. Waldenstrom macroglobulinemia (WM) is a B-cell malignancy characterized by bone marrow infiltration of clonal lymphoplasmacytic cells, which produce a monoclonal immunoglobulin M (IgM). MYD88L265P mutation may be considered as a founder event because of it high frequency in WM. Whole-genome sequencing has revealed CXCR4 mutations (CXCR4Mut) in WM. CXCR4 is a G-protein-coupled receptor that promotes migration and activation of several pathways including RAS, Akt and NFKB. CXCR4 mutation has proved to be of critical importance in WM, in part due to its role as a mechanism of resistance to several agents of targeted therapy. We have therefore sought to unravel the different aspects of CXCR4 mutations in WM using next generation sequencing, and SNP (single nucleotide polymorphism) arrays and to study the clinical impact.Experimental Design. Bone marrow samples of 98 patients with WM (mean age: 67 years) were analyzed. Tumoral DNA was extracted following CD19 B cell selection. Paired samples (tumor/T lymphocytes) were used as an intra-individual reference. CXCR4 mutation was analyzed by ultra deep targeted NGS (next generation sequencing) (all exons) allowing study of the clonal architecture in WM cells and/or sanger sequencing (SaS) (exon 2). Mutational spectrum of 8 candidate genes involved in Toll Like Receptor, RAS and B Cell Receptor (BCR) pathway along with MYD88L265P, CD79A (ITAM domain), CD79B( ITAM domain), CARD11 (exon 5-9), N RAS (exon 2-3), K RAS (exons 2-3), BRAF6 (exon 15), PTEN( exon 5-7), was also analysed in an integrative study. Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix chips) was performed in 53 patients to decipher genomic signature of CXCR4Mut. Flow cytometry was performed to assess CXCR4 and CD49d (VLA4) expression (n=53).Results. We found all mutations to be heterozygous, somatic and located in the C-terminal domain of CXCR4 in 24.5% of the WM. CXCR4 mutations led to a truncated receptor protein. Among the 17 variants, 12 new variants were identified in WM. The most frequent mutation was the CXCR4 C1013G (S338X) mutation (5/98) followed by CXCR4C1013A (S338X) (3/98). Interestingly, CXCR4Mut was associated to higher expression of CXCR4 protein by flow cytometry, independently of the type of CXCR4 mutation (n=53) (p=0.003). No impact on the expression profile of the integrin VLA4 (CD49d) which directly interacts with CXCR4 was observed. Sub clonal CXCR4 mutations identified using NGS were identified in 4/14 cases. CXCR4 mutations pertain to the same clone as to MYD88 L265P mutations, but were mutually exclusive to CD79A/ CD79B mutations (BCR pathway). We identified a genomic signature in CXCR4Mut WM traducing a more complex genome. CXCR4 mutations were also associated with gain of chromosome 4 (p=0.002), gain of Xq (p=0.002) and deletion 6q (p=0.038) and a higher number of genomic abnormalities (5.8 versus 2.8 per patient, p=0.046). We thought to identify clinical-biologic characteristics of WM with CXCR4Mut features. CXCR4 mutations were associated with higher IgM monoclonal component (p=0.006) and thrombocytopenia (p=0.018). However, no impact in overall survival was observed according to CXCR4 mutational status. Conclusions. Our study panned out new CXCR4 mutations in WM, and identified a specific signature associated to CXCR4Mut, characterized with complex genomic aberrations among MYD88L265P WM. The study of CXCR4 mutations showed existence of intraclonal (variation in co-expression of MYD88 and CXCR4 mutations) and interclonal (BCR and CXCR4 mutations in MYD88L265P WM) heterogeneity. Our results suggest the existence of various genomic subgroups in WM.; Contexte: La maladie de Waldenstrom (MW) est un syndrome lymphoprolifératif B caractérisé par une infiltration de la moelle osseuse par des lymphoplasmocytes et un pic monoclonal de type IgM. La mutation MYD88L265P est considérée comme un événement fondateur dans cette hémopathie. Les études par séquençage complet du génome ont identifié des mutations du gène CXCR4 (CXCR4 Muté) dans la MW. CXCR4 est un récepteur couplé aux protéines G qui participe aux processus de migration cellulaire et d’activation de différentes cascades de signalisation parmi lesquelles figurent RAS, Akt et NFKB. Les mutations de CXCR4 joueraient un rôle important dans la physiopathologie de la MW et dans les mécanismes de chimiorésistance de certaines thérapeutiques ciblées. Notre objectif a été d’étudier le profil génomique des MW avec mutations CXCR4 par séquençage à haut débit ciblé et par puces à SNP (single nucleotide polymorphism) et d’évaluer leur impact clinique. Matériel et Méthodes. Les échantillons de moelle osseuse de 98 MW ont été analysés. L’ADN tumoral a été extrait après sélection des cellules B. Des échantillons appariés (tumeur/ lymphocytes T) ont été utilisés comme référence intra-individuelle. Les mutations de CXCR4 ont été étudiées en séquençage ciblé à haut débit (NGS) ce qui a permis d’évaluer l’architecture clonale dans les cellules tumorales de MW et /ou par séquençage Sanger (exon 2). Le spectre mutationnel de 8 gènes candidats impliqués dans les voies des Toll Like Receptor, RAS et du BCR a été étudié : MYD88L265P, CD79A (domaine ITAM), CD79B (domaine ITAM), CARD11 (exon 5-9), N RAS (exon 2-3), K RAS (exons 2-3), BRAF6 (exon 15), PTEN (exon 5-7). L’analyse des profils génomiques a été réalisée en puces à SNP (Genome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix chips) dans une cohorte de 53 patients. L’expression de CXCR4 et du CD49d (VLA4) ont été étudiées en cytométrie de flux (n=53). Résultats. Nous avons identifié une mutation de CXCR4 dans 24.5% des MW. Toutes mutations sont hétérozygotes, acquises et localisées dans le domaine C terminal de la protéine. Parmi les 17 variants observés, nous identifions 12 nouvelles mutations dans la MW. Les mutations les plus fréquentes sont le variant C1013G (S338X) (5/98) et la mutation C1013A (S338X) (3/98). Les mutations de CXCR4 muté sont associées à une plus forte expression de la protéine CXCR4 en cytométrie de flux, indépendamment du type de mutations de CXCR4 (n=53) (p=0.003). Aucun impact en terme de niveau d’expression de l’intégrine VLA4 (CD49d), qui interagit directement avec CXCR4, n’est observé. Des mutations sous clonales de CXCR4 sont identifiées en NGS dans 4/14 cas. Les mutations de CXCR4 sont présentes dans le même clone que MYD88 L265P, mais sont mutuellement exclusives des mutations de la voie du BCR (CD79A / CD79B). Nous avons ensuite identifié une signature génomique plus complexe dans le groupe des MW CXCR4 muté. Les mutations de CXCR4 sont associées aux gains du chromosome 4 (p=0.002), aux gains en Xq (p=0.002), aux délétions 6q (p=0.038) et présentent un nombre d’anomalies plus élevées (5.8 versus 2.8 per patient, p=0.046). Nous avons ensuite cherché à caractériser le profil clinico biologique des patients MW avec mutation CXCR4 muté. Les mutations de CXCR4 sont associées à un pic monoclonal IgM plus élevé (p=0.006) et à une thrombopénie (p=0.018). Aucun impact en terme de survie globale n’a été observé dans notre cohorte selon le statut mutationnel de CXCR4. Conclusion. Notre étude a permis de décrire de nouvelles mutations de CXCR4 dans la MW et d’identifier une signature génomique plus complexe associée dans les MW CXCR4 muté parmi les MW MYD88L265P. Cette analyse des mutations de CXCR4 a d’autre part montré l’existence d’une hétérogénéité intra-clonal (dans le clone muté MYD88 et CXCR4) et interclonal (mutations du BCR et de CXCR4 dans le groupe des WM mutés MYD88L265P). Nos résultats suggèrent donc l’existence de différents sous groupes génomiques dans la MW.

During my PhD, I developed and implemented new methods and tools using the latest technologies of the Next Generation Sequencing, bioinformatics tools and the « reciprocal allele-specific RNA interference » (rasRNAi) method with the aim of identifying genetic and non-genetic factors responsible for the resistance of the mosquito Anopheles gambiae to the mouse malaria parasites Plasmodium berghei. I have implemented a strategy for identifying polymorphisms in the resistant and susceptible lines to (1) select genetic markers for future genetic analysis and (2) list the polymorphicgenes. I contributed to the development of a new allele-specific dsRNA probe for the rasRNAi method by identifying how mosquitoes process the injected dsRNA by the analysis of sequenced small RNAs from the injected dsRNA. I developed a pipeline to identify the microbiota composition in susceptible and resistant lines in order to compare them.; Au cours de ma thèse, j’ai développé et mis en place de nouvelles méthodes utilisant les récentes technologies du séquençage à très haut débit, des outils bioinformatiques et du «reciprocal allele-specifique RNA interference » (rasRNAi) dans l’objectif d’identifier les facteurs génétiques et non génétiques responsables de la résistance du moustique Anopheles gambiae aux parasites du paludisme murin Plasmodium berghei. J’ai mis en place une stratégie d’identification des polymorphismes dans les lignées résistantes et sensibles afin de sélectionner des marqueurs génétiques pour de futures analyses génétiques et lister les gènes polymorphiques. J’ai contribué à l’élaboration de nouvelles sondes ARN double-brin (dsRNAs) allèle spécifique pour la méthode du rasRNAi en identifiant le processus de découpage du dsRNA injecté chez des moustiques par l’analyse des petits ARNs séquencés issus du dsRNA injecté. J’ai élaboré un pipeline pour identifier la composition du microbiote des lignées sensibles et résistantes dans le but de les comparer.

Hereditary cerebellar ataxias are a group of neurodegenerative or neurodevelopemental diseases responsible of major disability. We found thanks to exome sequencing mutations in the WWOX gene in two consaguineous families presenting with cerebellar ataxia, epilepsy and mental retardation. This gene was until recently only recognized to be a tumor suppressor.With a 57 ataxia genes targeted capture strategy, next generation sequencing in 155 patients found 20,6% of positive diagnosis, including several new mutations in ANO10 and SYNE1. Multi center studies allow to extend clinical knowledge with severes phenotypes especially in ARCA1.We validate a clinico-biological algorithm for recesssive ataxias diagnosis published by Anheim in the in New England Journal of Medicine, 2012 in a blinded manner., Les ataxies cérébelleuses héréditaires sont un ensemble de pathologies neurodégénératives ou neuro-développementales rares responsables d’un handicap fonctionnel important. Nous décrivons la découverte dans deux familles consanguines avec une ataxie cérébelleuse, une épilepsie et un retard mental deux mutations homozygotes dans le gène WWOX à l’aide du séquençage de l’exome d’un des patients de chaque famille. Ce gène était connu comme un gène suppresseur de tumeur. Par une stratégie de capture ciblée de 57 gènes d’ataxies cérébelleuses sur une série de 155 patients, nous avons posé un diagnostic dans 20,6% des cas dont des mutations d’ANO10 et SYNE1. Des études multicentriques ont permis d’étendre les connaissances sur ces maladies et montrer l’existence de phénotypes sévères dans ARCA1.A partir de cette série, nous avons validé en aveugle la pertinence d’un algorithme diagnostique clinico-biologique proposé par l’article de Anheim dans le New England Journal of Medicine en 2012.

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce). . Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ. À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts., The association between arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and plant roots is one of the most widespread symbioses involving plants, and thus has an important role in terrestrial ecosystems. In exchange for carbohydrates, AMF improve plant fitness by enhancing mineral nutrient uptake, especially in particular phosphate and nitrate. Although this symbiosisDespite the fact that these symbioses contribute provides to important services toin ecosystems, the species richness, community structure and functional diversity of AMF is not well understood due to a lack of reliable molecular tools. The intra-isolate genetic polymorphism of nuclear DNA observed in AMF, combined with a lack of genomic data in a broad range of phylogenetic groups, has made it difficult to develop molecular markers and to determine evolutionary relatedness at high levels of resolution (i.e. between genetically-similar species and/or isolates). For these reasons, it seems a good alternative to use a different genetic system by targeting the mitochondrial genome, which have been shown to be homogeneous within AMF isolates. However, given the peculiar lifestyle of these organisms, a better understanding of the mitochondrial evolutionary processes and dynamics were is necessary in order to validate the usefulness of such markers in diversity and population genetics studies. In that regard, the objectives of my PhD project were to investigate: i) the divergence between closely related species and isolates, ii) mitochondrial genomes plasticity, iii) mitochondrial heritability and potential segregation mechanisms and iv) in situ mitochondrial intra-isolate allelic diversity. With Using comparative mitochondrial genomics using and next generation sequencing (NGS) sequencing, we found substantial sequence variation in intergenic regions caused by the invasion of mobile genetic elements. This variation gives risecontributes to rapid mitochondrial genome evolution among closely related isolates and species, which makes it possible to design reliable intra- and inter-specific markers. Also, an extensive gene similarity network-based approach allowed us to provide strong evidence of inter-haplotype recombination in AMF, leading to a reshuffled mitochondrial genome. These findings suggest the coexistence of distinct mtDNA haplotypes in natural populations and raise questions as to whether AMF single spore cultivations artificially underestimates mitochondrial genetic diversity in natural population.. This apparent contradiction with the intra-isolate mtDNA homogeneity usually observed in these fungi, led to the investigation of mitochondrial heritability in the spore progeny resulting from crossed-cultures. Although an heteroplasmic state was observed in some daughter spores, we found that homoplasmy was the dominant state in all monosporal cultures, with an apparent bias towards one of the parental haplotypes. These results strongly support the presence of a putative mitochondrial segregation proteic machinery in AMF, whose complete set of genes were orthologous with those found in other fungi. Our findings suggest that segregation takes place either during spore formation or colony mycelium development. Finally, we performed a conventional PCR based approach with a high fidelity Taq polymerase, followed by downstream cloning and Sanger sequencing using the model organism Rhizophagus irregularis. We found in situ heteroplasmy along with substantial intra-isolate allelic variation within the mtDNA that persists in the transcriptome. Our study also suggest that genetic variation in Glomeromycota is higher than meets the eye and might be critically underestimated in most NGS based-AMF studies both in nuclei and mitochondria.

Hereditary cerebellar ataxias are a group of neurodegenerative or neurodevelopemental diseases responsible of major disability. We found thanks to exome sequencing mutations in the WWOX gene in two consaguineous families presenting with cerebellar ataxia, epilepsy and mental retardation. This gene was until recently only recognized to be a tumor suppressor.With a 57 ataxia genes targeted capture strategy, next generation sequencing in 155 patients found 20,6% of positive diagnosis, including several new mutations in ANO10 and SYNE1. Multi center studies allow to extend clinical knowledge with severes phenotypes especially in ARCA1.We validate a clinico-biological algorithm for recesssive ataxias diagnosis published by Anheim in the in New England Journal of Medicine, 2012 in a blinded manner., Les ataxies cérébelleuses héréditaires sont un ensemble de pathologies neurodégénératives ou neuro-développementales rares responsables d’un handicap fonctionnel important. Nous décrivons la découverte dans deux familles consanguines avec une ataxie cérébelleuse, une épilepsie et un retard mental deux mutations homozygotes dans le gène WWOX à l’aide du séquençage de l’exome d’un des patients de chaque famille. Ce gène était connu comme un gène suppresseur de tumeur. Par une stratégie de capture ciblée de 57 gènes d’ataxies cérébelleuses sur une série de 155 patients, nous avons posé un diagnostic dans 20,6% des cas dont des mutations d’ANO10 et SYNE1. Des études multicentriques ont permis d’étendre les connaissances sur ces maladies et montrer l’existence de phénotypes sévères dans ARCA1.A partir de cette série, nous avons validé en aveugle la pertinence d’un algorithme diagnostique clinico-biologique proposé par l’article de Anheim dans le New England Journal of Medicine en 2012.

We introduce a set of latent factor models dedicated to landscape genomics and ecological association tests. It includes statistical methods for correcting principal component maps for effects of spatial autocorrelation (spFA); methods for estimating ancestry coefficients from large genotypic matrices and evaluating the number of ancestral populations (sNMF); and methods for identifying genetic polymorphisms that exhibit high correlation with some environmental gradient or with the variables used as proxies for ecological pressures (LFMM). We also developed a set of open source softwares associated with the methods, based on optimized C programs that can scale with the dimension of very large data sets, to run analyses of population structure and genome scans for local adaptation.; Nous introduisons un ensemble de modèles à facteurs latents dédié à la génomique du paysage et aux tests d'associations écologiques. Cela comprend des méthodes statistiques pour corriger des effets d'autocorrélation spatiale sur les cartes de composantes principales en génétique des populations (spFA), des méthodes pour estimer rapidement et efficacement les coefficients de métissage individuel à partir de matrices de génotypes de grande taille et évaluer le nombre de populations ancestrales (sNMF) et des méthodes pour identifier les polymorphismes génétiques qui montrent de fortes corrélations avec des gradients environnementaux ou avec des variables utilisées comme des indicateurs pour des pressions écologiques (LFMM). Nous avons aussi développé un ensemble de logiciels libres associés à ces méthodes, basés sur des programmes optimisés en C qui peuvent passer à l'échelle avec la dimension de très grand jeu de données, afin d'effectuer des analyses de structures de population et des cribles génomiques pour l'adaptation locale.

La leucémie myéloïde aigüe (LMA) est la forme de leucémie la plus fréquente chez l’adulte au Canada. Bien que de nombreux réarrangements chromosomiques récurrents aient été identifiés chez les patients LMA, près de la moitié des cas présentent un caryotype normal (LMA-CN). L’étude de la LMA-CN in vitro est rendue difficile par le fait que la survie des cellules primaires de patients est défectueuse sur le long terme et que les lignées cellulaires leucémiques ont un caryotype hautement anormal. En 2009, Munker et son équipe ont établi une nouvelle lignée cellulaire, CG-SH, ayant la particularité d’avoir un caryotype normal. L’objectif principal de ce projet d’étude est de caractériser plus en détail ce nouveau modèle d’étude. Nous avons identifié l’ensemble des variants génétiques présents dans CG-SH grâce au séquençage du génome entier. Les variants susceptibles de participer à la leucémogénèse ont été isolés, tels que des insertions détectées dans EZH2 et GATA2, et de nombreux variants faux-sens détectés dans des gènes pertinents pour la LMA. Nous avons montré que les cellules CG-SH sont sensibles à l’effet prolifératif d’une combinaison de cytokines, qui agissent sur le comportement des cellules en modifiant l’expression des gènes associés à la régulation de la prolifération, de l’apoptose et de la différentiation. De plus, les cytokines diminuent le taux de nécrose des cellules en culture sur le court terme. La présente étude a permis d’approfondir notre connaissance sur les caractéristiques moléculaires de la lignée cellulaire CG-SH, un nouveau modèle d’étude in vitro de la LMA-CN., Acute myeloid leukemia (AML) is the most frequent form of leukemia in the adult population in Canada. Although many recurrent chromosomal rearrangements have been identified in AML, almost half of all adult patients will present with a normal karyotype (NK-AML). The in vitro study of NK-AML is difficult because the long-term survival of primary patient samples is deficient and AML cell lines have a highly abnormal karyotype. In 2009, Munker and collegues established a new cell line, CG-SH, with the advantage of having a normal karyotype. The main goal of this research project is to further characterize this new model system. We identified all the genetic variants present in the CG-SH cells using whole genome sequencing. We also isolated the variants that are susceptible to participate to leukemogenesis, including the insertions detected in EZH2 and GATA2, and several missense mutations occurring in relevant genes for AML. We found that a combination of cytokines promotes the proliferation of CG-SH cells, and that cytokines act on the cells behavior through expression changes of the genes involved in the regulation of proliferation, apoptosis and differentiation. Moreover, cytokines trigger a decrease of the necrotic rate of CG-SH on the short-term. The current study allowed us to better appreciate molecular characteristics of the CG-SH cell line, a new model to study NK-AML in vitro.

We introduce a set of latent factor models dedicated to landscape genomics and ecological association tests. It includes statistical methods for correcting principal component maps for effects of spatial autocorrelation (spFA); methods for estimating ancestry coefficients from large genotypic matrices and evaluating the number of ancestral populations (sNMF); and methods for identifying genetic polymorphisms that exhibit high correlation with some environmental gradient or with the variables used as proxies for ecological pressures (LFMM). We also developed a set of open source softwares associated with the methods, based on optimized C programs that can scale with the dimension of very large data sets, to run analyses of population structure and genome scans for local adaptation., Nous introduisons un ensemble de modèles à facteurs latents dédié à la génomique du paysage et aux tests d'associations écologiques. Cela comprend des méthodes statistiques pour corriger des effets d'autocorrélation spatiale sur les cartes de composantes principales en génétique des populations (spFA), des méthodes pour estimer rapidement et efficacement les coefficients de métissage individuel à partir de matrices de génotypes de grande taille et évaluer le nombre de populations ancestrales (sNMF) et des méthodes pour identifier les polymorphismes génétiques qui montrent de fortes corrélations avec des gradients environnementaux ou avec des variables utilisées comme des indicateurs pour des pressions écologiques (LFMM). Nous avons aussi développé un ensemble de logiciels libres associés à ces méthodes, basés sur des programmes optimisés en C qui peuvent passer à l'échelle avec la dimension de très grand jeu de données, afin d'effectuer des analyses de structures de population et des cribles génomiques pour l'adaptation locale.

The characterization of microbial community structure via SSU rRNA gene profiling has been greatly advanced in recent years by the introduction of NGS amplicons, leading to a better representation of sample diversity at a lower cost. This progress in method development has provided a new window into the composition of microbial communities and sparked interest in the members of the rare biosphere. Concurrently, the processing of such amount of data has become an important bottleneck for the effectiveness of microbial ecology studies, and a multitude of analysis platforms have been developed for the handling of these data. As implemented, these tools have a steep learning curve for the biologist who is not computationally inclined, as they require extensive user intervention and consume many CPU hours due to dataset analysis and complexity, which can present a significant barrier to researchers. Moreover, although phylogenetic affiliation has been shown to be more accurate for the taxonomic assignment of NGS reads, the existing tools assign taxonomy by either a similarity search or a probabilistic approach, with the phylogenies being restricted to samples' comparison. Beyond the taxonomic assignment, the new sequencing technologies also arise the problem of the quality of the generated sequences and its impact on the richness estimation. In this work, we aimed to define a strategy for the bioinformatic analysis of high-throughput sequences in order to depict the microbial diversity, taking into account both the limitations imposed by current computer resources (hardware and software), and the advantage of the phylogenetic methods over the other taxonomic annotation approaches. This work has led to the development of a pipeline offering a set of analyzes ranging from raw sequences processing to the visualization of the results, while replacing the environmental sequences in an evolutionary framework. The developed approach was optimized for managing large volumes of data, and has been compared in term of the accuracy of taxonomic assignment to the approaches commonly used in the field of microbial ecology. This pipeline was then used to the developement of a dedicated web server for high-throughput sequencing analysis, that relies on a computing cluster and performs large-scale phylogeny-based analyses of rRNA genes with no need for specialized informatics expertise, and uses the phylogenies for both the taxonomy assessment and the delineation of monophyletic groups to highlight clades of interest.; Les avancées des nouvelles techniques de séquençage (NGS) ont permis dans le cadre des études en écologie microbienne de passer de l'analyse de quelques centaines de séquences par étude à des centaines de millions de séquences. Cette différence quantitative des données produites a induit des différences qualitatives quant aux études réalisées. En effet, avec le changement du type de données, les approches classiques d'analyse ne peuvent être appliquées et il est devenu nécessaire de définir de nouvelles stratégies en tenant compte des contraintes que posent ces données. Alors qu'il était possible d'insérer classiquement quelques dizaines de séquences issues des techniques de première génération dans des phylogénies expertisées, le nombre de séquences généré aujourd'hui par les NGS à chaque expérience rend cette tâche irréalisable et nécessite la mise en place de nouvelles stratégies et l'utilisation d'outils adaptés. Par ailleurs, les outils disponibles d'analyse de la diversité microbienne adaptés aux amplicons de nouvelle génération, implémentent des approches probabilistes et/ou de recherche de similitude pour l'identification des séquences environnementales. L'approche phylogénétique quant à elle, bien qu'elle soit la plus robuste, n'est pas utilisée pour l'annotation taxonomique de ce type de données du fait de ses besoins en temps et en ressources de calcul. Au-delà de l'approche d'annotation taxonomique, les nouvelles techniques de séquençage posent également le problème de la qualité des séquences produites et son impact sur l'estimation de la diversité. Ainsi, ce travail de thèse avait pour objectif la définition d'une stratégie d'analyse bioinformatique de données de séquençage massif dans le contexte de l'étude de la diversité microbienne, en tenant compte des limitations imposées par les ressources informatiques actuelles (matérielles et logicielles) d'un côté, et de l'avantage des méthodes phylogénétiques par rapport aux autres approches d'annotation taxonomique. Ce travail a donné lieu au développement d'une chaîne de traitement proposant une série d'analyses allant des séquences brutes jusqu'à la visualisation des résultats, tout en replaçant les séquences environnementales dans un contexte évolutif. L'approche développée a été optimisée pour la gestion de gros volumes de données, et a été comparée en terme de précision d'affiliation aux autres approches communément utilisées en écologie microbienne. Les tests et simulations ont montré qu'à partir d'une taille d'amplicons de 400 pb, l'affiliation phylogénétique avait les meilleurs résultats mais aussi, que la qualité de cette affiliation différait selon la région hypervariable ciblée. La chaîne de traitements mise en place a ensuite été par implémentée dans un contexte de calcul à haute performance, notamment sur un cluster de calcul, pour proposer un service web dédié à l'analyse de la diversité microbienne.

Usher syndrome is a genetic disorder combining sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP). Some patients will also exhibit vestibular areflexia (VA). Clinical and genetic heterogeneity is recognized as the 3 clinical subgroups, defined mainly on the degree of HL and VA, can be caused by mutations in one of the 10 known genes. It is important to use all accessible genetic tools to identify and characterize molecular origin in order to improve the knowledge of the physiopathological mechanisms causing Usher Syndrome.In this context, we have developed an exhaustive approach. In a first step, we have implemented the analysis and established the mutational spectrum of the 2 minor USH2 genes (GPR98 and DFNB31). In addition, we have developed several tools, in particular to study variants susceptible to alter splicing or lying in the promoter regions of the USH2 genes.Thanks to this work, the USH2 mutation detection rate has now been raised to 90%, similar to that of USH1.We have then designed a targeted exome of the Usher genes to be sequenced using the GS Junior system (Roche 454). The aim of the study was to test the feasibility of this new technics for a possible transfer to diagnostic facilities. Quality criteria and variant priorization were set up on a control cohort (previously studied in one of the USH gene). The study has then been extended on a patient cohort. Our results indicate that NGS Usher-exome can be used in molecular diagnostics but improvement of the reliability of the sequencing technology, bioinformatics tools and dedicated databases is essential.; Le syndrome de Usher est une maladie génétique associant surdité congénitale et rétinopathie pigmentaire (RP), auxquelles peuvent s'ajouter des troubles vestibulaires. Les différences phénotypiques, distinguées en 3 types cliniques, s'accompagnent d'une hétérogénéité génétique impliquant au moins 10 gènes. Identifier et caractériser les causes moléculaires grâce aux outils d'analyses génétiques disponibles permet d'améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques à l'origine des symptômes du syndrome de Usher. Dans ce cadre, nous nous sommes inscrits dans une recherche d'exhaustivité des études moléculaires. Dans un premier temps, nous avons ainsi mis en place l'analyse et défini le spectre mutationnel des gènes minoritairement impliqués dans le type II (GPR98 et DFNB31). Nous avons également développé différents outils, notamment pour l'analyse de variants altérant le mécanisme d'épissage ou touchant les régions promotrices des gènes USH2.Ces travaux permettent d'obtenir un taux de détection des altérations conduisant au syndrome de Usher type 2 de 90 %. Ce taux est maintenant similaire à celui observé pour le type 1, qui constituait jusqu'ici la référence.Nous avons, dans un second temps, développé le séquençage nouvelle génération (NGS) appliqué à l'exome Usher. L'objectif de cette analyse était de tester la faisabilité et l'efficacité de cette approche, en vue de son éventuelle utilisation en diagnostic moléculaire. La définition des critères de qualité et la mise en place de la priorisation des variants ont été réalisées sur un groupe contrôle. L'étude a ensuite été étendue sur une cohorte de patients. Les résultats obtenus montrent qu'une utilisation en diagnostic est possible mais restera dépendante de l'amélioration de la technique du séquençage, de son analyse et des outils bioinformatiques pour interpréter le volume de données ainsi généré.

Bien que les bases physiopathologiques de beaucoup de maladies musculaires soient dorénavant connues, les myopathies congénitales à cores (MCs), maladies génétiques qui se présentent dès la naissance avec un retard du développement moteur, une faiblesse musculaire et des complications respiratoires et/ou cardiaques parfois mortelles, demeurent mal comprises. Des mutations dans RYR1, SEPN1, TTN, ACTA1, CFL2 et MEGF10 ont été associées aux MCs, pourtant, dans plus de 50% des cas, le gène responsable reste à identifier. L’objectif de ma thèse a été de clarifier les mécanismes physiopathologiques des MCs par l’identification de nouveaux gènes ou de nouvelles mutations. Cette thèse a eu une dimension internationale concrétisée par la mise en place d’une cotutelle UPMC (France) et UdeM (Québec). J’ai développé deux axes de recherche complémentaires. D’une part j’ai étudié 21 familles informatives avec MC récessive, scoliose et atteinte respiratoire, en combinant clonage positionnel et étude de gènes candidats et en utilisant des outils variés allant du génotypage au séquençage de nouvelle génération (NGS). En parallèle, j’ai étudié 24 familles avec une MC autosomique récessive affectant les muscles cardiaque et squelettiques et dont le phénotype était semblable à celui observé chez des patients avec des délétions dans les 6 derniers exons de TTN. Ainsi pour l'analyse de cette deuxième cohorte, nous avons appliqué une stratégie de séquençage de gène candidat ciblée sur ces exons et de NGS pour le reste du gène. Pendant mon doctorat j'ai identifié les défauts génétiques de 8 des 45 familles étudiées (18 %), et caractérisé 3 nouvelles entités médicales, dont deux MCs dues à des nouvelles mutations de TTN. Ces résultats ont servi à l’identification de nouvelles interactions protéiques de la titine et contribuent à définir TTN comme une cause majeure de pathologies musculaires cardiaques et/ou squelettiques. Une troisième nouvelle forme de MC est provoquée par une mutation d'un coactivateur transcriptionnel peu connu et jamais associé à une maladie. Ces résultats ont révélé un nouvel acteur clef et une nouvelle voie de signalisation dans la physiopathologie du muscle, ont eu un bénéfice direct en termes de conseil génétique et ouvrent la voie pour le développement de thérapies., While the pathophysiological bases of many muscular diseases are nowadays well known, congenital core myopathies (CMs) remain poorly understood. CMs are genetic diseases which generally present at birth with delayed motor development, muscle weakness, and sometimes fatal respiratory or cardiological complications. Mutations in RYR1, SEPN1, ACTA1, TTN and MEGF10 have been associated with various CMs, yet for about 50% of CM cases the responsible gene has not been identified. The objective of my thesis was to clarify the pathophysiological mechanisms of new forms of CM through the identification of new genes or new mutations in known genes. This thesis had an international dimension as manifested by a UPMC (France) and UdeM (Québec) joint direction. I developed two complementary axes of research. First, I studied 21 informative families with a recessive CM with scoliosis and respiratory failure, for which I combined positional cloning and candidate gene studies, using various tools from genotyping to next generation sequencing (NGS). The second part of this work consisted on the analysis of 24 families with recessive CM affecting both cardiac and skeletal muscles. Their phenotype was similar to that previously observed in cases with deletions in the last 6 exons of the giant gene TTN. Thus we applied a candidate gene strategy through direct Sanger sequencing coupled with NGS for the analysis of this second cohort. During my PhD work I identified the molecular defect in 8 out of the 45 families included (18%), which led to the identification and characterization of 3 novel medical entities, including two new CMs due to novel defects of TTN. These results served to identify new titin protein interactions, and participate in the definition of TTN defects as a major cause of both cardiac and skeletal muscle conditions. A third new form of CM is due to mutations of a poorly-known transcriptional coactivator whose role in striated muscle physiology was unknown and which had never been associated to a human condition. Globally, these results unveiled a novel important protein and pathway in muscle pathophysiology, have direct health benefits (molecular diagnosis) and open the way for therapeutic investigations., Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France).

Information on food webs is central to understand ecosystem functioning. It also provides information of ecosystem stability by evaluating the resource availability and use. Obtaining information on the diet can be critical especially when dealing with elusive carnivores, which are difficult to observe. However, these large carnivores are keystone species that influence the ecosystem through trophic cascades and maintain biodiversity. Thus, precise knowledge of their diet is a prerequisite for designing conservation strategies of these endangered species. Direct and indirect monitoring as well as invasive and non-invasive approaches that have been used to study the diet are either biased or have a low resolution. The DNA-based analysis of feces is an alternative method that may provide better information. It can be implemented through a metabarcoding approach, which is the simultaneous identification of multiple species from a single environmental sample containing degraded DNA by using Next Generation Sequencing. In this case, the use of universal primers for vertebrates amplifying all potential prey also amplifies the predator DNA when it belongs to a close taxon (e.g. mammals). Thus, the PCR products obtained from feces extracts will mainly consist of predator sequences and may not represent the full diet. The use of oligonucleotides specifically blocking the amplification of the predator DNA may overcome this problem. We have developed such a method based on the concomitant use of a universal primer pair (12SV5, amplifying all vertebrates) and blocking oligonucleotides for identifying the prey DNA fragments from predators feces. Even if the method developed is not quantitative, it is robust and adequate for studying predator with a very large dietary range and has a better resolution than traditional methods for identifying prey at the genus or species level. This methodology has been applied to characterize the highly eclectic diet (mammals, birds, amphibians and fishes) of two Northern-Pakistani populations of leopard cat (Prionailurus bengalensis). With the same approach, we demonstrated the importance of the Human-leopard conflict in Pakistan, due to the almost exclusive consumption of domestic animals by the common leopard (Panthera pardus). We could also highlight relevant conservation issues for the highly endangered and cryptic snow leopard (Panthera uncia), based on the fact that it mainly fed on wild ungulates.; La caractérisation des réseaux trophiques est nécessaire pour comprendre le fonctionnement des écosystèmes et les mécanismes impliqués dans leur stabilité. Il est parfois difficile de déterminer les régimes alimentaires notamment pour des espèces discrètes et difficiles à observer comme les grands carnivores. Cependant, ces espèces jouent un rôle clé dans les écosystèmes dont elles influencent le fonctionnement et la biodiversité. Ainsi, connaitre le régime alimentaire des grands prédateurs avec précision est essentiel pour établir des stratégies de conservation. Diverses méthodes basées sur le monitoring, l'analyse d'échantillons invasifs ou non ont été utilisées pour étudier les régimes alimentaires. Elles sont généralement biaisées ou peu résolutives. Les méthodes basées sur l'identification des fragments d'ADN dans les fèces ont le potentiel de fournir une meilleure information, notamment dans le cadre d'une approche métabarcoding. Il s'agit de caractériser simultanément l'ensemble des espèces dont l'ADN est présent dans un échantillon environnemental, en utilisant les Nouvelles Techniques de Séquençage. Dans ce cas, les amorces universelles nécessaires pour amplifier toutes les proies potentielles amplifient également l'ADN du prédateur s'il y a proximité taxonomique (par exemple mammifères). Ainsi les produits PCR obtenus à partir des fèces sont essentiellement composés d'ADN du prédateur et ne reflètent pas l'ensemble du régime alimentaire. L'utilisation d'un oligonucléotide de blocage limitant spécifiquement l'amplification de l'ADN du prédateur peut résoudre ce problème. Nous avons développé une méthode de ce type basée sur l'utilisation d'amorces universelles pour les vertébrés (amplifiant la région 12SV5) et d'oligonucléotides de blocage. Bien que non quantitative, cette méthode s'est montrée robuste, adaptée à l'étude de prédateurs à très large spectre de proies, et très résolutive pour identifier les proies au niveau du genre et de l'espèce. Nous l'avons appliquée à l'étude du régime alimentaire du chat léopard (Prionailurus bengalensis) qui s'est avéré très diversifié (mammifères, oiseaux, amphibiens et poissons) dans les deux populations du Pakistan étudiées. Avec la même approche, nous avons démontré la réalité du conflit entre l'homme et le léopard commun (Panthera pardus) dont le régime est presque exclusivement composé d'animaux domestiques. Enfin, nous avons pu proposer des actions de conservations pertinentes après avoir montré que le régime de la très menacée panthère des neiges (Panthera uncia) est principalement composé d'ongulés sauvages.