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Enfermer le porteur de l’information génétique dans le noyau a obligée la cellule a créé un système de transport complexe, qui permet l’export d’un ARNm du noyau au cytoplasme. Le mécanisme général de l’export des ARNm est encore mal connu, même si les facteurs principaux ont été découverts il y a longtemps. De récents progrès en microscopie nous ont permis d’étudier directement le comportement des ARNm durant le processus d’export. Durant ma maitrise, nous avons été capables de localiser et suivre des ARNm en temps réel pour la première fois chez Saccharomyces cerevisiae. Nous avons créé un gène rapporteur en mettant le gène GLT1 sous le contrôle du promoteur GAL1. Nous avons aussi marqué l’ARNm de GLT1 avec plusieurs boucles PP7. L’ARNm sera visible après l’attachement de plusieurs protéines PP7-GFP aux boucles. En utilisant la technique d’imagerie en cellules vivantes, nous sommes capable de visualiser et suivre chaque ARNm, depuis son relâchement du site de transcription jusqu’à l’export. Une fois relâché du site de transcription, l’ARNm diffuse librement dans le nucléoplasme, mais une fois à la périphérie nucléaire, il commence à « scanner » l’enveloppe nucléaire avant d’être exporté. Nous avons trouvé que le « scanning » dépend de la présence des Myosin Like Proteins (Mlp1p et Mlp2p), protéines qui forment le panier nucléaire, car suite à la délétion de MLP1 et MLP2, les ARNm n’étaient plus capable de « scanner ». Nous avons également trouvé que la partie C-terminale de Mlp1p était nécessaire au « scanning ». De plus, suite à la délétion du gène TOM1, gène codant pour une ubiquitine ligase, les ARNm ont un comportement similaire aux ARNm d’une souche ∆mlp1/mlp2, suggérant que le « scanning » permet à Tom1p d’ubiquitiner Yra1p, ce qui causera son relâchement de l’ARNm. Également, nous avons montré que les ARNm endogènes MDN1 et CBL2 scannent aussi la périphérie nucléaire. Ensemble, nos résultats suggèrent que le scanning est un processus par lequel passent tout les ARNm nucléaire lorsqu’ils se retrouvent à la périphérie du noyau, pour initier plusieurs étapes de réarrangements nécessaires à leurs export. De plus, nous avons examiné le rôle de Yhr127p, une protéine nouvellement identifiée qui se lie à l’ARN. Après avoir marqué cette protéine avec la GFP, nous avons montré qu’elle forme des foci dans le noyau et que ces derniers vont disparaitre suite à l’arrêt de la transcription. La délétion de YHR127 à conduit à une augmentation de la transcription de quelques gènes spécifiques, mais n’affecte pas la capacité de la cellule à exporter les ARNm. Nos résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle dans la régulation de la transcription et/ou dans la stabilité de l’ARNm., In eukaryotic cells, the processes of RNA and protein synthesis are spatially separated into two distinct compartments. With this division, a complex pathway of nucleocytoplasmic RNA export has evolved, which to date remains poorly understood. Recent advances in single-molecule microscopy have enabled direct studies focused on investigating the dynamics and kinetics of RNA export. In this Master thesis, we present the first real time visualization of mRNA export in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We first generated a GLT1 reporter under the control of the inducible GAL1 promoter, in which the GLT1 mRNA was tagged with an array of PP7 repeats and detected by exogenous PP7-GFP binding protein. Using a single-molecule live cell imaging approach, we were able to visualize and track the behavior of individual mRNAs from the site of transcription to the point of export. Interestingly, we found that once released from the transcription site, single mRNAs diffuse freely in the nucleoplasm, but once they reach the nuclear periphery, they scan the periphery before being exported to the cytoplasm. This scanning behavior was dependent on Myosin Like Proteins (Mlp1p and Mlp2p), which form the basket of the Nuclear Pore Complex (NPC), as mRNAs were not retained at the periphery and were rapidly released into the nucleoplasm in mlp1p/mlp2p double mutant cells. Specifically, we found that the C-terminal part of Mlp1p was important for scanning. Furthermore, mRNAs from cells depleted of the E3 ubiquitin ligase TOM1 had a similar phenotype to mRNAs in mlp1p/mlp2p double mutant cells, suggesting a role for scanning in the Tom1p-mediated release of Yra1p from the RNA. Lastly, we confirmed that endogenous MDN1 and CBL2 mRNAs also exhibit scanning behaviour. Taken together, our results suggest that mRNAs scanning the nuclear periphery is a general behaviour for all mRNAs to initiate the mRNA export process, allowing mRNP arrangement required for export to occur at the nuclear periphery. In addition, we investigated the role of YHR127, a newly identified RNA binding protein, in RNA biogenesis. Notably, we show that GFP-tagged YHR127p formed distinct foci in the nucleus, which were lost upon transcription arrest. Deletion of YHR127 led to an increase in transcript levels of specific genes, but not to a global accumulation of mRNAs in the nucleus, suggesting a role for this protein in regulating transcription and/or mRNA stability.

Production of functional messenger RNA (mRNA) requires a complex mechanism that couples transcription with maturation and export of the mRNA. In addition to this mechanism, chromatin needs to be unwound to allow the transcription machinery access the DNA, this unwinding being also highly regulated. Thus, production of a functional mRNA requires a huge number of factors implicated in these different processes. Among these proteins Spt6 and Iws1 are participating in the mechanism of transcription, chromatin unwinding, and maturation and export of the mRNA. The work carried out during this thesis has enabled the biochemical, structural and functional characterization of these proteins, their complex and their interaction with other effectors of transcription. This work has specifically enabled the molecular and functional characterization (i) of the recruitment of Spt6 by RNA polymerase II and (ii) of the formation of the Spt6/Iws1 complex. Moreover, this work has identified putative new partners of Spt6, not ably the elongation factor TFIIS. Thus, our work has highlighted the essential and complex role of Spt6 and Iws1 during the production of functional mRNA, and has also enabled future studies of the complexes formed by these two proteins with other transcriptional factors., Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels.

Production of functional messenger RNA (mRNA) requires a complex mechanism that couples transcription with maturation and export of the mRNA. In addition to this mechanism, chromatin needs to be unwound to allow the transcription machinery access the DNA, this unwinding being also highly regulated. Thus, production of a functional mRNA requires a huge number of factors implicated in these different processes. Among these proteins Spt6 and Iws1 are participating in the mechanism of transcription, chromatin unwinding, and maturation and export of the mRNA. The work carried out during this thesis has enabled the biochemical, structural and functional characterization of these proteins, their complex and their interaction with other effectors of transcription. This work has specifically enabled the molecular and functional characterization (i) of the recruitment of Spt6 by RNA polymerase II and (ii) of the formation of the Spt6/Iws1 complex. Moreover, this work has identified putative new partners of Spt6, not ably the elongation factor TFIIS. Thus, our work has highlighted the essential and complex role of Spt6 and Iws1 during the production of functional mRNA, and has also enabled future studies of the complexes formed by these two proteins with other transcriptional factors.; Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels.