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Astrobiology is an interdisciplinary field studying life in the Universe. Among its subjects, it questions the limits of life and the habitability of extraterrestrial environments. Close to these limits, terrestrial extremophiles thriving in extreme environments such as hydrothermal vents and the Dead Sea indicate that liquid water remains a sine qua non condition for life. Hence, its research within the Solar System and beyond is of particular astrobiological importance, rising interest in the subglacial oceans of icy moons as well as Martian brines.Subglacial oceans contain, by far, most of the liquid water in the Solar System and several such as Enceladus could also have abyssal hydrothermal vents. On Earth, hydrothermal vents are autonomous, complex and productive biotopes in spite of their characteristic extreme pressure and temperature conditions. Hence, they represent essential model of putative life on the icy moons. However, such analogy is limited by differences of physical and chemical conditions. In particular, pressure in the abysses of Europa could exceed those encountered in the terrestrial abyssal hydrothermal vents. Is life compatible with such conditions?With a first project, we studied effects of high pressure (HP) at a molecular scale using the B DNA polymerase (DNApol) of hyperthermophilic abyssal archaeon Pyrococcus abyssi as a main model. By using various fluorescent probes and a fluorimeter coupled with a HP-cell, we monitored effects of pressure ranging from 0.1 to 100MPa on the activity of this enzyme and we compared its sensitivity to HP to other thermostable DNApols. We demonstrate that HP directly inhibits activity of DNApols and that this inhibition can be largely compensated by an increase of temperature. The implications for astrobiology and pressure-adaptation of deep-sea organisms are discussedAnother environment of the Solar System closer to the Earth could have liquid water: Martian brines. Whether transitory on the surface or more perennial in the subsurface, these brines are characterized by high salinity and abundancy of chaotropic ions such as Mg2+, Ca2+ and ClO42-. On Earth, hypersaline environments such as the Dead Sea or abyssal brine basins are inhabited by specialized halophilic microorganisms. The most extreme halophiles are archaea from the Halobacteria class displaying specific traits, such as intracellular accumulation of KCl and protein acidification, and represent essential astrobiological models.In this second project, we compared properties of the whole proteomes, rather than model isolated proteins, between five strains of hyperhalophilic archaea isolated from various environments. This comparison was made using various methods, such as statistical analysis of protein sequences, quantification of intracellular ions or neutron scattering, and allowed the development of a method for characterizing salt-dependency of proteome. We revealed significative differences in intrinsic properties of proteomes and intracellular environment related to the link between environmental and molecular adaptations in halophiles. Proteome response to salts that are abundant in Martian brines also presented astrobiological implications for the search of biomarkers on Mars., Au carrefour des disciplines, l’exobiologie a pour objet la vie dans l’Univers. Parmi ses thématiques, la question des limites du vivant se pose avec celle de l’habitabilité des environnements extraterrestres. Proches de ces limites, les extrêmophiles terrestres peuplant les environnements extrêmes telles les cheminées hydrothermales ou la Mer Morte, indiquent que la présence d’eau liquide reste une condition nécessaire à la vie. Sa recherche dans le Système Solaire et au-delà demeure donc une priorité en exobiologie, justifiant l’intérêt porté aux océans subglaciaires des lunes glacées ainsi qu’aux saumures Martiennes.Les océans subglaciaires renferment, de loin, la majeure partie de l’eau liquide dans le Système Solaire et certaines, comme Encelade, pourraient présenter des cheminées hydrothermales dans leurs abysses. Sur Terre, les cheminées hydrothermales sont des biotopes indépendants de la surface, complexes et productifs malgré les conditions de pression et de température extrêmes qui les caractérisent. Ils constituent donc des modèles de premier ordre pour une hypothétique vie sur les lunes glacées. Des différences potentielles de conditions physico-chimiques viennent cependant limiter cette analogie. En particulier, la pression dans les abysses d’Europe pourrait excéder celle rencontrée au niveau des cheminées hydrothermales terrestres. La vie est-elle compatible avec de telles conditions ?Dans un premier projet, nous avons étudié les effets des hautes pressions (HP) à une échelle moléculaire en utilisant comme principal modèle l’ADN polymérase (ADNpol) B de l’archée hyperthermophile abyssale Pyrococcus abyssi. En utilisant des rapporteurs fluorescents de diverses natures et un fluorimètre couplé à une enceinte HP, nous avons étudié les effets des pressions allant de 0,1 à 100MPa sur l’activité de cette enzyme et comparé sa sensibilité aux HP à celles d’autres ADNpols thermostables. Nous démontrons que les HP inhibent directement l’activité des ADNpols et que cette inhibition peut être largement compensée par une augmentation de la température. Les implications exobiologiques et concernant l’adaptation aux HP chez les organismes abyssaux sont par ailleurs discutées.Plus proche de la Terre, un autre type d’environnement pourrait abriter de l’eau liquide dans le Système Solaire : les saumures Martiennes. Présentes de manière transitoire à la surface et de façon plus pérenne dans les environnements souterrains, ces saumures se caractérisent par une salinité importante et l’abondance de composés chaotropes comme les ions Mg2+, Ca2+ et ClO42-. Sur Terre, les environnements hypersalins comme la Mer Morte ou les bassins de saumures abyssaux sont peuplés par des microorganismes spécialisés appelés halophiles. Les plus extrêmes d’entre eux sont des archées de la classe Halobacteria qui présentent des traits caractéristiques, comme l’accumulation intracellulaire de KCl et l’acidification des protéines, et constituent des modèles de choix en exobiologie.Dans un deuxième projet, nous avons comparé les propriétés du protéome entier, et non de protéines modèles isolées, entre cinq archées hyperhalophiles issues d’environnements différents. Cette comparaison a été réalisée en utilisant diverses méthodes, analyse statistique des séquences, protéomique, dosage des ions intracellulaires ou encore diffusion des neutrons, et a notamment permis le développement d’une méthode biophysique de caractérisation de la dépendance au sel du protéome. Nous avons révélé des différences significatives de propriétés intrinsèques du protéome et de l’environnement intracellulaire entre les cinq souches qui soulignent le lien entre l’adaptation à l’environnement et l’adaptation moléculaire chez les halophiles. La réponse du protéome à des sels caractéristiques des saumures Martiennes présente également des implications exobiologiques concernant la recherche de traces de vie sur Mars.

Proteasomes are large ATP-dependent proteases implicated in degradation of key regulatory cellular proteins and abnormal cellular proteins. The current work is the first characterization of two AAA-ATPase proteasomal regulatory proteins PAN A and PAN B in halophilic archaea. The first part of the manuscript characterizes the mode of regulation of the two PANs in the extremely halophilic archaoen Halobacterium salinarium. Our experiments show the existence of two isoforms of each PAN proteins in the cells. The two isoforms differ in their N-terminal regions and result probably from the use of two alternative transcription start sites. Primer extension methods demonstrate the existence of heterogeneity in PAN's mRNA as revealed by mapping of the 5' non coding regions. The second part of the manuscript shed lights on oligomerisation and association of the PAN proteins in cellulo. Fractionation of cell free extracts on sucrose gradients indicates a weak degree of oligomerisation of the PANs and the absence of stable complexes with the proteasome 20 S. The last part of this work focuses on the regulation of PAN A and PAN B gene expression in response to stress including heat shock and salt shock. Our results clearly show that the two proteasome activating proteins are not regulated in a similar way in response to environmental stress, Les protéasomes sont de larges protéases ATP-dépendante impliquées dans la dégradation des protéines régulatrices et des protéines anormales dans la cellule. Cette thèse porte sur l'étude de deux AAA-ATPases : Pans A et Pans B régulatrices du protéasome chez les archaea halophiles. Une partie de ce manuscrit est consacrée à la caractérisation du mode de régulation des deux Pans chez l'Archaea halophile extrême Halobacterium salinarium. Les expériences montrent l'existence de deux isoformes des protéines Pans dans les cellules. Les modifications portent sur la région N-ter des deux protéines et mettent probablement en jeu l'utilisation alternative de deux départs de traduction. La cartographie des régions 5' non codantes des transcrits révèle l'existence d'une hétérogénéité au niveau des ARNm des pans. Le travail s'intéresse ensuite aux états d'oligomérisation et d'association in cellulo des protéines PANs. Des études de fractionnement par ultracentrifugation sur gradient de sucrose indiquent un état de faible oligomérisation des PANs et l'absence de complexes stables avec le protéasome 20S. La dernière partie du travail porte sur la régulation de l'expression des gènes panA et panB au cours de la réponse aux stress salin et thermique. Ce travail montre que les deux protéines Pans, activatrices potentielles du protéasome, ne sont pas régulées de façon identique en réponse à un stress environnemental.

The cell is a crowded environment in which interactions between macromolecules, even weak interactions, determine their solubility and the assembly of the labile complexes that operate biological functions. The weak interactions between proteins in solution that define their non-ideal behaviour also control their crystallisation.To which extent do protein – solvent interactions influence protein – protein interactions ? In the present thesis, these two kinds of interaction have been put in relation for the malate dehydrogenase (Hm MalDH) from Haloarcula marismortui. This halophilic protein is very acidic and is solvated by large amounts of water and salt.We have developed a new method for the determination of the second virial coefficient A2 by modelling the sedimentation velocity profiles in analytical ultracentrifugation. It allows to study complex solvent compositions with small amounts of protein.The protein – protein interactions of Hm MalDH in various salt solvents were characterised by smallangle scattering of neutrons or X-rays. The A2 and the solution structure factors were analysed with DLVO-like interaction potentials. The repulsive interactions arise mainly from the excluded-volume term and to a lesser extent from the electrostatic term. The attractive interactions appear to be qualitatively correlated to positive or negative values of the preferential salt biding parameters. These results also allow to explain the molecular adaptation of halophilic proteins that require a solvation rich in salt in order to remain soluble.The crystallisation by dilution of Hm MalDH in various mixture of salt – MPD (2-methy-2,4-pentanediol) is correlated with a slow evolution from repulsive to moderately attractive protein – protein interactions. MPD modifies the protein – protein interactions by adding an attractive term that arises from the repulsion of MPD by the charges on the protein., La cellule est un milieu très concentré où les interactions entre macromolécules, même faibles, jouent un grand rôle dans leur solubilité et dans l'assemblage des complexes labiles assurant les fonctions biologiques. Les interactions faibles entre protéines déterminant la non-idéalité de leurs solutions vont aussi gouverner leur cristallisation.Dans quelle mesure les interactions protéine – solvant influencent-elles les interactions protéine – protéine ? Nous avons mis en relation ces deux types d'interactions pour la malate déshydrogénase (Hm MalDH) de Haloarcula marismortui, protéine halophile très acide qui a des solvatations variées et très riches en eau et en sel.Nous avons développé une nouvelle méthode de détermination du second coefficient du viriel A2 par la modélisation des profils de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, qui permet l'étude de solvants complexes.Les interactions protéine – protéine de la Hm MalDH en divers sels ont été caractérisées par diffusion de neutrons ou de rayons X aux petits angles. Les A2 et les facteurs de structure en solution ont été modélisés par des potentiels d'interaction de type DLVO. Les interactions répulsives sont principalement dues au terme de volume exclu et dans une moindre mesure au terme électrostatique. Les interactions attractives sont qualitativement corrélées à des valeurs positives ou négatives des paramètres d'interaction préférentielle avec le sel. Ces résultats permettent d'expliquer l'adaptation moléculaire des protéines halophiles qui doivent ainsi avoir une solvatation riche en sel pour rester soluble à haut sel.La cristallisation par dilution de la Hm MalDH dans des mélanges sel – MPD (méthyl-2-pentanediol-2,4) résulte d'une lente évolution des interactions protéine – protéine, de répulsives à modérément attractives. Le MPD modifie les interactions protéine – protéine en divers sels en ajoutant une attraction qui est liée à la répulsion du MPD par les charges de la protéine.

Studies of the microbial communities from deep sea hydrothermal vents and oil reservoirs have been for a long time exclusively limited to the use of cultural techniques which described only a restricted part of the diversity. To circumvent this limitation we used cultural techniques in conjunction with molecular methods to investigate microbial communities of continental oil reservoirs in the East Paris Basin and of hydrothermal fluids collected on the Mid Atlantic Ridge. Our approach combined total 16S rDNA sequencing and in situ hybridization without any cultural step, enrichments of differents metabolic types at high temperature and phylogenic characterisation of strains isolated from hydrothermal environment. The study of oil reservoirs water production lead to the description of archaeal sequences affiliated with the methanogenic, halophilic or hypermetrophilic, Methanosarcinales and Thermosoccales orders. Bacterial sequences are mostly affiliated, in two of our samples, to thermophilic or mesophilic sulfate- or thiosulfate-reducing bacteria belonging to the Thermotogales and λ-Proteobacteria phylum and to the low G+C Gram-positive bacteria. Sequences affiliated to the genus Arnobacter, probably involved in the sulfur cycle inside/or in the vicinity of the oil reservoir, were also detected in another sample. Finally a last sample was dominated by sequences related to the aerobic genus Herbaspirillum, that may come from contaminations occuring during the secondary oil recovery process.Deep hydrothermal fluids were sampled by a special collector, the Vent Cap. Enrichments of heterotrophic and autotrophic sulphur-reducers, sulfate and thiosulfate reducers and methanogenes at 65 and 80°C were positive in most of our samples. Archaeal and bacterial 16S rDNA analyses revealed a wide sequences diversity. λ-Protobacteria dominated the bacterial clones libraries and have been detected in high proportions by in situ hybridization with Desulfurobacteriales. Archaeal sequences associated to genera commonly isolated in the deep hydrothermal environment, as Thermococcales, Methanococcales and Archaeoglobales were also detected. Combined use of molecular and cultural methods allows us to overcome the limitations inherent to each techniques and yield to the description of the relations between the different microbial communities in their environments.; L'étude des communautés de micro-organismes des sources hydrothermales profondes et des réservoirs pétroliers a longtemps été limitée par l'utilisation exclusive de méthodes culturales ne permettant d'accéder qu'à une part restreinte de la diversité microbienne. Afin de dépasser cette restriction, nous avons utilisé les approches culturales en combinaison avec des approches moléculaires pour étudier les communautés microbiennes de deux réservoirs pétroliers du bassin parisien et des fluides hydrothermaux profonds collectés sur la dorsale médio-Atlantique. Ces approches ont consisté d'une part en une analyse phylogénétique des gènes codant pour l'ARNr 16S par amplification et hybridation in situ en s'affranchissant de toute étape de culture, d'autre part dans l'enrichissement de différents types métaboliques à haute température, et enfin dans le positionnement phylogénétiqe de souches isolées d'environnements hydrothermaux.L'étude réalisée à partir d'échantillons d'eau de production de deux réservoirs pétroliers a conduit à la description de séquences d'Archaea méthanogènes, halophiles ou hyperthermophiles affiliés aux Methanosarcinales ou aux Thermococcales. Pour deux échantillons, les séquences de Bacteria étaient associées à des Thermotogales, des Proteobacteria delta et des Firmicutes à bas G+C% généralement impliqués dans des processus thermophiles et mésophiles de sulfato- ou thiosulfato-réduction. Des séquences associées au genre Arcobacter pouvant intervenir dans le cycle des composés soufrés au sein du réservoir ont été détectées dans un troisième échantillon. Enfin un dernier échantillon au sein duquel les séquences associées au genre Herbaspirillum, provenant probablement d'une contamination liée aux processus d'extraction secondaires des hydrocarbures, étaient dominantes. Des fluides hydrothermaux ont été échantillonnés à l'aide d'un collecteur original, le "Vent Cap". Des enrichissements de différents types métaboliques (soufre-réducteurs autotrophes et hétérotrophes, sulfato- et thiosulfato-réducteurs, et méthanogènes) à 65 et 80°C ont été positifs dans la majorité de nos échantillons. L'amplification et le séquençage des ADNr 16S bactériens et archaéens a conduit à la détection d'une grande diversité de séquences. Les Proteobacteria epsilon dominent généralement les banques de séquences bactériennes et sont détectées avec les Desulfurobacteriales en forte proportion par hybridation in situ. Des séquences d'Archaea communément isolées en milieu hydrothermal profond, telles que les Thermococcales, les Methanococcales et les Archaeoglobales ont également été détectées. L'utilisation combinée de différentes méthodes moléculaires et de méthodes culturales nous a permis de dépasser les limitations inhérentes à chacune de ces méthodes et de proposer une image des relations s'établissant entre les différentes communautés de micro-organismes présents dans ces deux environnements.

Studies of the microbial communities from deep sea hydrothermal vents and oil reservoirs have been for a long time exclusively limited to the use of cultural techniques which described only a restricted part of the diversity. To circumvent this limitation we used cultural techniques in conjunction with molecular methods to investigate microbial communities of continental oil reservoirs in the East Paris Basin and of hydrothermal fluids collected on the Mid Atlantic Ridge. Our approach combined total 16S rDNA sequencing and in situ hybridization without any cultural step, enrichments of differents metabolic types at high temperature and phylogenic characterisation of strains isolated from hydrothermal environment. The study of oil reservoirs water production lead to the description of archaeal sequences affiliated with the methanogenic, halophilic or hypermetrophilic, Methanosarcinales and Thermosoccales orders. Bacterial sequences are mostly affiliated, in two of our samples, to thermophilic or mesophilic sulfate- or thiosulfate-reducing bacteria belonging to the Thermotogales and λ-Proteobacteria phylum and to the low G+C Gram-positive bacteria. Sequences affiliated to the genus Arnobacter, probably involved in the sulfur cycle inside/or in the vicinity of the oil reservoir, were also detected in another sample. Finally a last sample was dominated by sequences related to the aerobic genus Herbaspirillum, that may come from contaminations occuring during the secondary oil recovery process.Deep hydrothermal fluids were sampled by a special collector, the Vent Cap. Enrichments of heterotrophic and autotrophic sulphur-reducers, sulfate and thiosulfate reducers and methanogenes at 65 and 80°C were positive in most of our samples. Archaeal and bacterial 16S rDNA analyses revealed a wide sequences diversity. λ-Protobacteria dominated the bacterial clones libraries and have been detected in high proportions by in situ hybridization with Desulfurobacteriales. Archaeal sequences associated to genera commonly isolated in the deep hydrothermal environment, as Thermococcales, Methanococcales and Archaeoglobales were also detected. Combined use of molecular and cultural methods allows us to overcome the limitations inherent to each techniques and yield to the description of the relations between the different microbial communities in their environments.; L'étude des communautés de micro-organismes des sources hydrothermales profondes et des réservoirs pétroliers a longtemps été limitée par l'utilisation exclusive de méthodes culturales ne permettant d'accéder qu'à une part restreinte de la diversité microbienne. Afin de dépasser cette restriction, nous avons utilisé les approches culturales en combinaison avec des approches moléculaires pour étudier les communautés microbiennes de deux réservoirs pétroliers du bassin parisien et des fluides hydrothermaux profonds collectés sur la dorsale médio-Atlantique. Ces approches ont consisté d'une part en une analyse phylogénétique des gènes codant pour l'ARNr 16S par amplification et hybridation in situ en s'affranchissant de toute étape de culture, d'autre part dans l'enrichissement de différents types métaboliques à haute température, et enfin dans le positionnement phylogénétiqe de souches isolées d'environnements hydrothermaux.L'étude réalisée à partir d'échantillons d'eau de production de deux réservoirs pétroliers a conduit à la description de séquences d'Archaea méthanogènes, halophiles ou hyperthermophiles affiliés aux Methanosarcinales ou aux Thermococcales. Pour deux échantillons, les séquences de Bacteria étaient associées à des Thermotogales, des Proteobacteria delta et des Firmicutes à bas G+C% généralement impliqués dans des processus thermophiles et mésophiles de sulfato- ou thiosulfato-réduction. Des séquences associées au genre Arcobacter pouvant intervenir dans le cycle des composés soufrés au sein du réservoir ont été détectées dans un troisième échantillon. Enfin un dernier échantillon au sein duquel les séquences associées au genre Herbaspirillum, provenant probablement d'une contamination liée aux processus d'extraction secondaires des hydrocarbures, étaient dominantes. Des fluides hydrothermaux ont été échantillonnés à l'aide d'un collecteur original, le "Vent Cap". Des enrichissements de différents types métaboliques (soufre-réducteurs autotrophes et hétérotrophes, sulfato- et thiosulfato-réducteurs, et méthanogènes) à 65 et 80°C ont été positifs dans la majorité de nos échantillons. L'amplification et le séquençage des ADNr 16S bactériens et archaéens a conduit à la détection d'une grande diversité de séquences. Les Proteobacteria epsilon dominent généralement les banques de séquences bactériennes et sont détectées avec les Desulfurobacteriales en forte proportion par hybridation in situ. Des séquences d'Archaea communément isolées en milieu hydrothermal profond, telles que les Thermococcales, les Methanococcales et les Archaeoglobales ont également été détectées. L'utilisation combinée de différentes méthodes moléculaires et de méthodes culturales nous a permis de dépasser les limitations inhérentes à chacune de ces méthodes et de proposer une image des relations s'établissant entre les différentes communautés de micro-organismes présents dans ces deux environnements.