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The thesis projects aimed to explore the therapeutic value of antisense approaches targeting immunoglobulin (Ig) transcripts in the treatment of multiple myeloma (MM) and other monoclonal gammopathies. This strategy consists in inducing an exon skipping using antisense oligonucleotides (ASO) to provoke the synthesis of truncated Ig and apoptosis of tumor plasma cells (Patent WO 2017/089359). The toxic effect V domain-less Ig is the consequence of an uncontrolled amplification of ER stress and the UPR (Unfolded Protein Response). We have shown that treatments with ASO directed against monoclonal Ig (mo-Ig) pre-mRNAs induced strong toxicity on myeloma cell lines and regression of tumor xenografts after intratumoral ASO injections. Although improvements in terms of in vivobiodistribution of ASOs are necessary, this approach capable of specifically destroying the tumor clone could allow a personalized treatment of MM patients and spare healthy plasma cells. We have also observed a drastic decrease in Ig production after treatment of stimulated human B cells or myeloma cells with a generic ASO targeting the exon CH1γ that can be used in all patients expressing IgG. In parallel, we explored the relationship between protein stress and RNA surveillance in plasma cells. In contrast with previously published data from non-lymphoid cells, we have demonstrated a cooperation between the mechanism of NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay) and UPR in plasma cells, favored by the low activation of the PERK pathway of the UPR. Therefore, these works have shed new light on the impact of truncated Ig in antibody-secreting cells and, on the close link between the proteic stress associated with massive Ig synthesis and plasma cell survival.; Les projets développés au cours de cette thèse ont pour objectif d’explorer l’intérêt thérapeutique d’approches antisens ciblant les transcrits d’immunoglobulines (Ig) dans le traitement du myélome multiple (MM) et d’autres gammapathies monoclonales. Cette stratégie consiste à provoquer un saut d’exon à l’aide d’oligonucléotides antisens (ASO) pour induire la synthèse d’Ig tronquées et l’apoptose des plasmocytes tumoraux (Brevet WO 2017/089359). L’effet toxique des Ig sans domaine V résulte d’une amplification incontrôlée du stress du RE et de la réponse UPR (« Unfolded Protein Response »). Nous avons montré que des traitements à l’aide d’ASO dirigés contre les ARN pré-messagers de l’Ig monoclonale induisaient une forte toxicité dans des lignées de myélome et une régression tumorale dans un modèle de xénogreffe avec des injections intratumorales d’ASO. Bien que des améliorations en terme de biodistribution in vivo de ces ASO soient nécessaires, cette approche capable de cibler spécifiquement le clone tumoral en épargnant les plasmocytes sains pourrait permettre un traitement personnalisé des patients atteints de MM. De surcroît, nous avons également observé une diminution drastique de la production d’Ig à la suite d’un traitement par un ASO générique ciblant l’exon CH1γ, aussi bien dans les LB humains stimulés ou dans des lignées de myélome; cet ASO pouvant être utilisé chez tous les patients exprimant une IgG. En parallèle, nous avons exploré les liens entre stress protéique et surveillance des ARN dans les plasmocytes. Contrairement aux données de la littérature concernant des cellules non-lymphoïdes, nous avons mis en évidence une coopération entre le mécanisme de NMD (« Nonsense-Mediated mRNA Decay ») et l’UPR (« Unfolded Protein Response ») dans les plasmocytes, qui est rendue possible grâce par une faible activation de la voie PERK de l’UPR. Cette thèse a pour but de mieux comprendre l’impact des Ig tronquées dans les cellules sécrétrices d’anticorps et le lien étroit entre survie des plasmocytes et stress protéique associé à la synthèse massive d’Ig.

The thesis projects aimed to explore the therapeutic value of antisense approaches targeting immunoglobulin (Ig) transcripts in the treatment of multiple myeloma (MM) and other monoclonal gammopathies. This strategy consists in inducing an exon skipping using antisense oligonucleotides (ASO) to provoke the synthesis of truncated Ig and apoptosis of tumor plasma cells (Patent WO 2017/089359). The toxic effect V domain-less Ig is the consequence of an uncontrolled amplification of ER stress and the UPR (Unfolded Protein Response). We have shown that treatments with ASO directed against monoclonal Ig (mo-Ig) pre-mRNAs induced strong toxicity on myeloma cell lines and regression of tumor xenografts after intratumoral ASO injections. Although improvements in terms of in vivobiodistribution of ASOs are necessary, this approach capable of specifically destroying the tumor clone could allow a personalized treatment of MM patients and spare healthy plasma cells. We have also observed a drastic decrease in Ig production after treatment of stimulated human B cells or myeloma cells with a generic ASO targeting the exon CH1γ that can be used in all patients expressing IgG. In parallel, we explored the relationship between protein stress and RNA surveillance in plasma cells. In contrast with previously published data from non-lymphoid cells, we have demonstrated a cooperation between the mechanism of NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay) and UPR in plasma cells, favored by the low activation of the PERK pathway of the UPR. Therefore, these works have shed new light on the impact of truncated Ig in antibody-secreting cells and, on the close link between the proteic stress associated with massive Ig synthesis and plasma cell survival., Les projets développés au cours de cette thèse ont pour objectif d’explorer l’intérêt thérapeutique d’approches antisens ciblant les transcrits d’immunoglobulines (Ig) dans le traitement du myélome multiple (MM) et d’autres gammapathies monoclonales. Cette stratégie consiste à provoquer un saut d’exon à l’aide d’oligonucléotides antisens (ASO) pour induire la synthèse d’Ig tronquées et l’apoptose des plasmocytes tumoraux (Brevet WO 2017/089359). L’effet toxique des Ig sans domaine V résulte d’une amplification incontrôlée du stress du RE et de la réponse UPR (« Unfolded Protein Response »). Nous avons montré que des traitements à l’aide d’ASO dirigés contre les ARN pré-messagers de l’Ig monoclonale induisaient une forte toxicité dans des lignées de myélome et une régression tumorale dans un modèle de xénogreffe avec des injections intratumorales d’ASO. Bien que des améliorations en terme de biodistribution in vivo de ces ASO soient nécessaires, cette approche capable de cibler spécifiquement le clone tumoral en épargnant les plasmocytes sains pourrait permettre un traitement personnalisé des patients atteints de MM. De surcroît, nous avons également observé une diminution drastique de la production d’Ig à la suite d’un traitement par un ASO générique ciblant l’exon CH1γ, aussi bien dans les LB humains stimulés ou dans des lignées de myélome; cet ASO pouvant être utilisé chez tous les patients exprimant une IgG. En parallèle, nous avons exploré les liens entre stress protéique et surveillance des ARN dans les plasmocytes. Contrairement aux données de la littérature concernant des cellules non-lymphoïdes, nous avons mis en évidence une coopération entre le mécanisme de NMD (« Nonsense-Mediated mRNA Decay ») et l’UPR (« Unfolded Protein Response ») dans les plasmocytes, qui est rendue possible grâce par une faible activation de la voie PERK de l’UPR. Cette thèse a pour but de mieux comprendre l’impact des Ig tronquées dans les cellules sécrétrices d’anticorps et le lien étroit entre survie des plasmocytes et stress protéique associé à la synthèse massive d’Ig.

After transcription, the pre mRNA will undergo different maturation step before getting out of the nucleus for translation. One of these step of maturation is the splicing. It allows to concatenate the coding sequences of the mRNA (the exons) and induces the exclusion of the non coding sequences (the introns).Genetics mutations can lead to splicing defects. These defects could be intron retention, exon skipping and exonisation of intronic sequences called pseudo exons.My thesis work was to evaluate the exon skipping therapy to correct these exonisation. I focuses on two diseases: core myopathy and Lowe syndrome.For the first one, my interest was on a mutation in the 101 th intron of RYR1 gene. This mutation creates a splicing donor site wich unveils a cryptic acceptor site. This leads to the inclusion of a 99 nucleotides pseudo exon. This inclusion induces a decrease of the quantity of the calcium channel RyR1 in the patient cells. This channel allows the excitation-contraction coupling, and therefore the muscular contraction. Defects in this channel lead to different myopathies (eg. core myopathy). The patient present at birth a major neonatal hypotonia, scoliosis and respiratory defects. He has never walked. I designed oligonucleotides (AON), transfected them in the cultured patient cells and showed by RT PCR that exon skipping was possible. In order to optimise the efficiency and to evaluate the rescue at a protein level and at a fonctionnal level, I devellopped a lentivirus which express a U7 Sm OPT cassette with the choosen AONs. After cell transduction, I have shown that exon skipping allowed the rescue of the protein and of its functionnality. This approach could permit a genetic correction for the patientFor the second case, I have tried to correct an OCRL mutation. This upstream creates a splicing donor site and unveils an acceptor site 66 nucleotides before. This leads to the inclusion of a pseudo exon which induces a severe decrease of OCRL transcripts level due to a "non sense mediated mRNA Decay". OCRL is a phosphatidyl inositol 5 Phosphatase, which regulates the Ptd Ins(4,5)P2 pool in the cell. OCRL defects induces a multi systemic disease the Lowe syndrome. I obtained patient cutaneous fibroblasts. I transfected these cells with choosen AONs to correct the splicing defect. I integrated the AONs sequence into a U7 lentiviral cassette. I transduced the cultured patient cells and observed a rescue of the protein with a rescue of its activity. This approach could, theoritically permit a correction in the patient.These two studies are the first proof of concept of splicing modulation therapy for congenital myopathy and for Lowe syndrome. This work offers a lot of perspective for the tratment of these genetic illness, Après la transcription, le pré ARNm subit des étapes de maturation avant de sortir du noyau pour être traduit. Une des étapes de maturation est l'épissage. Il permet de souder les séquences codantes de l'ARNm entre elles (les exons) et d'exclure les régions non codantes (les introns).Des mutations génétiques sont à l'origine de défaut d'épissage. Elles peuvent conduire à des rétentions d'intron, des sauts d'exon et des inclusions de séquences introniques appelées pseudo exons.Ma thèse a porté sur l'utilisation du saut d'exon pour corriger ces inclusions. Je me suis intéressé à deux pathologies : la myopathie à cores et le syndrome de LowePour le premier cas, je me suis intéressé à une mutation dans l'intron 101 du gène RyR1. Cette mutation est à l'origine de la création d'un site donneur d'épissage qui active un site accepteur provoquant l'inclusion d'un pseudo exon de 99 nucléotides. Cette inclusion induit une baisse de la quantité du canal calcique RyR1 dans les cellules du patient. Ce canal permet le couplage entre l'excitation et la contraction musculaire. Ses défauts conduisent à diverses myopathies dont la myopathie à cores. Le patient présentait une hypotonie néonatale, une scoliose et des défauts respiratoires, et n'a jamais acquis la marche. J'ai dessiné des oligonucléotides, je les ai transfectés dans les cellules du patient en culture et ainsi montré par RT PCR que le saut du pseudo exon était possible. Afin d'optimiser l'efficacité pour pouvoir évaluer la restauration au niveau protéique et fonctionnel, j'ai développé un lentivirus exprimant une cassette U7 SmOPT avec les AON choisis. Après transduction des cellules, j'ai pu montrer que le saut du pseudo exon permettait le retour de la protéine et de sa fonctionnalité, cette approche pourrait donc permettre une correction chez le patient.Pour le deuxième cas, j'ai tenté de corriger une mutation du gène OCRL. Cette mutation crée un site donneur d'épissage dans l'intron 4 du gène OCRL et active un site accepteur d'épissage 66 nucléotides en amont. L'inclusion du pseudo exon induit la chute du taux de transcrit OCRL par un mécanisme de "Non sense mediated mRNA Decay". OCRL est une phosphatidyl inositol 5 Phosphatase permettant de réguler la quantité de Ptd Ins(4,5)P2 dans la cellule. Les défauts dans OCRL sont responsables d'une pathologie multisystémique, le syndrome de Lowe. J'ai pu obtenir des fibroblastes cutanés du patient. J'ai transfecté ces cellules avec des AONs choisis pour permettre un saut de l'exon pathogène. J'ai ensuite intégré la séquence des AONs efficaces dans un lentivirus U7. J'ai transduit les cellules du patient en culture et observé un retour de la protéine et un retour de l'activité enzymatique, cette approche pourrait donc théoriquement permettre une correction chez le patient.Ces deux travaux sont les premières preuves de principes de thérapie par modulation de l'épissage pour les myopathies congénitales et pour le syndrome de Lowe. Ils ouvrent la voie à des perspectives de traitement pour ces maladies génétiques.

After transcription, the pre mRNA will undergo different maturation step before getting out of the nucleus for translation. One of these step of maturation is the splicing. It allows to concatenate the coding sequences of the mRNA (the exons) and induces the exclusion of the non coding sequences (the introns).Genetics mutations can lead to splicing defects. These defects could be intron retention, exon skipping and exonisation of intronic sequences called pseudo exons.My thesis work was to evaluate the exon skipping therapy to correct these exonisation. I focuses on two diseases: core myopathy and Lowe syndrome.For the first one, my interest was on a mutation in the 101 th intron of RYR1 gene. This mutation creates a splicing donor site wich unveils a cryptic acceptor site. This leads to the inclusion of a 99 nucleotides pseudo exon. This inclusion induces a decrease of the quantity of the calcium channel RyR1 in the patient cells. This channel allows the excitation-contraction coupling, and therefore the muscular contraction. Defects in this channel lead to different myopathies (eg. core myopathy). The patient present at birth a major neonatal hypotonia, scoliosis and respiratory defects. He has never walked. I designed oligonucleotides (AON), transfected them in the cultured patient cells and showed by RT PCR that exon skipping was possible. In order to optimise the efficiency and to evaluate the rescue at a protein level and at a fonctionnal level, I devellopped a lentivirus which express a U7 Sm OPT cassette with the choosen AONs. After cell transduction, I have shown that exon skipping allowed the rescue of the protein and of its functionnality. This approach could permit a genetic correction for the patientFor the second case, I have tried to correct an OCRL mutation. This upstream creates a splicing donor site and unveils an acceptor site 66 nucleotides before. This leads to the inclusion of a pseudo exon which induces a severe decrease of OCRL transcripts level due to a "non sense mediated mRNA Decay". OCRL is a phosphatidyl inositol 5 Phosphatase, which regulates the Ptd Ins(4,5)P2 pool in the cell. OCRL defects induces a multi systemic disease the Lowe syndrome. I obtained patient cutaneous fibroblasts. I transfected these cells with choosen AONs to correct the splicing defect. I integrated the AONs sequence into a U7 lentiviral cassette. I transduced the cultured patient cells and observed a rescue of the protein with a rescue of its activity. This approach could, theoritically permit a correction in the patient.These two studies are the first proof of concept of splicing modulation therapy for congenital myopathy and for Lowe syndrome. This work offers a lot of perspective for the tratment of these genetic illness, Après la transcription, le pré ARNm subit des étapes de maturation avant de sortir du noyau pour être traduit. Une des étapes de maturation est l'épissage. Il permet de souder les séquences codantes de l'ARNm entre elles (les exons) et d'exclure les régions non codantes (les introns).Des mutations génétiques sont à l'origine de défaut d'épissage. Elles peuvent conduire à des rétentions d'intron, des sauts d'exon et des inclusions de séquences introniques appelées pseudo exons.Ma thèse a porté sur l'utilisation du saut d'exon pour corriger ces inclusions. Je me suis intéressé à deux pathologies : la myopathie à cores et le syndrome de LowePour le premier cas, je me suis intéressé à une mutation dans l'intron 101 du gène RyR1. Cette mutation est à l'origine de la création d'un site donneur d'épissage qui active un site accepteur provoquant l'inclusion d'un pseudo exon de 99 nucléotides. Cette inclusion induit une baisse de la quantité du canal calcique RyR1 dans les cellules du patient. Ce canal permet le couplage entre l'excitation et la contraction musculaire. Ses défauts conduisent à diverses myopathies dont la myopathie à cores. Le patient présentait une hypotonie néonatale, une scoliose et des défauts respiratoires, et n'a jamais acquis la marche. J'ai dessiné des oligonucléotides, je les ai transfectés dans les cellules du patient en culture et ainsi montré par RT PCR que le saut du pseudo exon était possible. Afin d'optimiser l'efficacité pour pouvoir évaluer la restauration au niveau protéique et fonctionnel, j'ai développé un lentivirus exprimant une cassette U7 SmOPT avec les AON choisis. Après transduction des cellules, j'ai pu montrer que le saut du pseudo exon permettait le retour de la protéine et de sa fonctionnalité, cette approche pourrait donc permettre une correction chez le patient.Pour le deuxième cas, j'ai tenté de corriger une mutation du gène OCRL. Cette mutation crée un site donneur d'épissage dans l'intron 4 du gène OCRL et active un site accepteur d'épissage 66 nucléotides en amont. L'inclusion du pseudo exon induit la chute du taux de transcrit OCRL par un mécanisme de "Non sense mediated mRNA Decay". OCRL est une phosphatidyl inositol 5 Phosphatase permettant de réguler la quantité de Ptd Ins(4,5)P2 dans la cellule. Les défauts dans OCRL sont responsables d'une pathologie multisystémique, le syndrome de Lowe. J'ai pu obtenir des fibroblastes cutanés du patient. J'ai transfecté ces cellules avec des AONs choisis pour permettre un saut de l'exon pathogène. J'ai ensuite intégré la séquence des AONs efficaces dans un lentivirus U7. J'ai transduit les cellules du patient en culture et observé un retour de la protéine et un retour de l'activité enzymatique, cette approche pourrait donc théoriquement permettre une correction chez le patient.Ces deux travaux sont les premières preuves de principes de thérapie par modulation de l'épissage pour les myopathies congénitales et pour le syndrome de Lowe. Ils ouvrent la voie à des perspectives de traitement pour ces maladies génétiques.

SummaryDuchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary disease caused by mutations that disrupt the dystrophin mRNA reading frame. In some cases, forced exclusion (skipping) of a single exon can restore the reading frame, giving rise to a shorter, but still functional, protein. In this study, we constructed lentiviral vectors expressing antisense oligonucleotides in order to induce an efficient exon skipping and to correct the initial frameshift caused by the DMD deletion of CD133+ stem cells. The intramuscular and intra-arterial delivery of genetically corrected CD133 expressing myogenic progenitors isolated from the blood and muscle of DMD patients results in a significant recovery of muscle morphology, function, and dystrophin expression in scid/mdx mice. These data demonstrate that autologous engrafting of blood or muscle-derived CD133+ cells, previously genetically modified to reexpress a functional dystrophin, represents a promising approach for DMD.