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New gene formation is one of the major sources of evolutionary innovations for organisms. Beyond their mutational effects, transposable elements can be source of new genes. During my thesis, I have studied Harbinger DNA transposons, which I have characterized in teleost fish genomes. Moreover, I have identified four new genes derived from Harbinger transposons in vertebrates by bioinformatical screening. Three of them were formed at the base of jawed vertebrates around 500 million years ago, and another at the base of sarcopterygians around 430 million years ago. Using the zebrafish model, we have observed that these genes are expressed during early development and in adult tissues, with a co-expression in male brain. They are also activated in human brain, particularly during fetal development. In order to study Harbinger-derived genes function, their inactivation was performed using CRISPR/Cas9 and morpholino antisense oligonucleotide techniques. The inactivation of MSANTD2 gene, which has been associated with neurodevelopmental diseases such as autism spectrum disorder and schizophrenia, produced embryos with delayed development as well as tail and nervous system malformations, specifically with brain ventricles and neuronal pattern defects. Thus, this thesis has highlighted the recurrent and concomitant molecular domestications of Harbinger transposons, which have led to a new gene family in vertebrates. The study of one its member, MSANTD2, contributes to a better understanding of genetic innovations having driven the evolution of the nervous system in vertebrates., La formation de nouveaux gènes est une source majeure d’innovation pour les organismes. Au-delà de leurs effets mutagènes, les éléments transposables peuvent être source de nouveaux gènes. Lors de cette thèse, j’ai étudié les transposons à ADN Harbinger, que j’ai pu caractériser chez les poissons téléostéens. J’ai de plus identifié chez les vertébrés par criblage bioinformatique quatre nouveaux gènes dérivés de transposons Harbinger, trois formés à la base des vertébrés à mâchoires il y a environ 500 millions d’années et un chez les sarcoptérygiens il y a environ 430 millions d’années. Chez le poisson-zèbre, ces gènes sont exprimés pendant le développement précoce et dans les tissus adultes, avec une co-expression dans le cerveau mâle. Ils sont également activés dans le cerveau humain, en particulier pendant le développement fœtal. Afin d’étudier la fonction des gènes dérivés de transposons Harbinger, leur inactivation a été réalisée par CRISPR/Cas9 et oligonucléotides antisense de type morpholino. L’inactivation du gène MSANTD2, qui a été associé à des maladies neurodéveloppementales comme les troubles du spectre de l’autisme et la schizophrénie, produit des embryons présentant des retards de développement et des malformations de la queue et du système nerveux, en particulier des défauts de formation des ventricules du cerveau et de patterns neuronaux. Ainsi, cette thèse a permis de mettre en évidence des domestications moléculaires récurrentes de transposons Harbinger qui ont abouti à la formation d’une nouvelle famille de gènes chez les vertébrés. L’étude d’un des membres, MSANTD2, contribue à une meilleure compréhension des innovations génétiques qui ont déterminé l’évolution précoce du système nerveux des vertébrés.

Variants of FLNC gene have been implicated in the development of cardiomyopathies (CM), however the pathophysiological mechanisms are not fully understood. This work involved the genetic characterization of a clinical cohort and then the development of a cell model and a Drosophila model to confirm the pathogenicity of missense variants and to assess the functional consequences of FLNC mutants. The study of 1150 patients with CM found the prevalence of FLNC gene to be between 1 and 8%. In addition, the truncating variants were preferentially associated with dilated CMs (DCM) with an increased rhythmic risk, and the missense variants (regionalized in the ROD2 of the protein) with hypertrophic CMs (MHC). In Drosophila, loss of function of the ortholog of FLNC gene (RNA interference) showed cardiac dilation and a decrease of the fractionnal shortening in adults, associated with disorganization of the sarcomeres and the actin network. The 3 selected missense variants, identified in MHCs, and introduced by CRISPR / Cas9 in Drosophila did not show any significant functional or histological effect. Study of lines producting a truncated protein revealed that the C-terminal domain of filamine was not required for heart function in Drosophila. A CRISPR / Cas9 edited hiPSC clone carrying a homozygous deletion of the exon 42 splice site that results in exon phase skiping was differentiated into cardiomyocytes. The amplified cardiomyocytes formed beating cardiac pseudo-tissues, and their analysis showed a change in rhythmic phenotype corresponding to DCM patients pattern. In conclusion, this work made it possible to show the importance of the FLNC gene in the development of CM and to develop 2 new complementary models to study the mechanisms of pathogenicity and develop targeted therapies., Des variants du gène FLNC ont été impliqués dans le développement de cardiomyopathies (CM), toutefois les mécanismes de physiopathologie ne sont pas entièrement élucidés. Ce travail a comporté la caractérisation génétique d’une cohorte clinique puis le développement d’un modèle cellulaire et d’un modèle Drosophile pour confirmer la pathogénicité de variants faux sens et d’évaluer les conséquences fonctionnelles des mutants FLNC. L’étude de 1150 patients atteints de CM a permis d’établir la prévalence du gène FLNC entre 1 et 8 %. De plus, les variants tronquants ont été associés préférentiellement à des CM dilatées (CMD) avec un risque rythmique accru et les variants faux sens (régionalisés dans le ROD2 de la protéine) à des CM hypertrophiques (CMH). Chez la drosophile, la perte de fonction de l’orthologue du gène FLNC (ARN interférence) a montré une dilatation cardiaque et une diminution de la fraction d’éjection chez l’adulte, associées à une désorganisation des sarcomères et du réseau d’actine. Les 3 variants faux sens sélectionnés, identifiés dans des CMH, et introduits par CRISPR/Cas9 dans des Drosophiles n’ont pas montré d’effet fonctionnel ou histologique significatif. L’étude de lignées produisant une protéine tronquée a permis d’établir que le domaine C-terminal de la filamine n’était pas requis pour la fonction cardiaque chez la Drosophile. Un clone hiPSC édité par CRISPR/Cas9 portant une délétion homozygote du site d’épissage de l’exon 42 qui aboutit à un saut en phase de l’exon a été différencié en cardiomyocytes. Les cardiomyocytes amplifiés ont permis de former des pseudo-tissus cardiaques battant dont l’analyse a montré une modification du phénotype rythmique qui correspondrait à un phénotype de CMD. En conclusion, ce travail a permis de montrer l’importance du gène FLNC dans le développement des CM et de développer 2 nouveaux modèles pour étudier les mécanismes de pathogénicité et développer des thérapeutiques ciblées.

L’état de la chromatine et les éléments de régulation des gènes tels que les promoteurs permettent la régulation de l’expression génique. Actuellement, des techniques ciblées tels que l’immunoprécipitation de la chromatine (CHIP) sont principalement utilisées pour l’étude de la biologie de la chromatine. La purification des protéines associées au niveau des éléments de régulation des gènes de façon non biaisée permettrait de mieux comprendre leur activation ou leur répression au cours du développement ou lors de maladies. De plus, les protéines identifiées seraient susceptibles d'apporter de nouvelles connaissances pour le diagnostic ou la thérapie de ces maladies. Ces 10 dernières années différentes techniques de purification d’un locus unique ont été développées. En effet, pour enrichir un locus unique de 3kbp soit 0.0001% du génome humain, le taux d’enrichissement doit être de 1 million de fois pour obtenir un mélange quasi-homogène. Les techniques actuellement publiées utilisent majoritairement des systèmes CRISPR/deadCas9. La protéine dCas9 est une grosse protéine (>150kDa). Son efficacité de liaison pourrait par conséquent être fortement influencée par la structure de la chromatine. En outre, la liaison de la protéine dCas9 pourrait concurrencer la liaison d’interacteurs biologiques endogènes. La compréhension de l’impact de ce type de système sur la composition locale de chromatine est un point clé pour évaluer l’efficacité de ces techniques. D’autres systèmes basés sur l’utilisation de sondes de captures ont été développés. Ces techniques, comme celles utilisant dCas9 ne comportent qu’une seule étape de purification par affinité ce qui ne permet pas d’obtenir un taux d’enrichissement suffisant pour la caractérisation d’un locus unique. Dans une première partie, l’impact de la protéine dCas9 sur la composition locale de la chromatine est étudiée au niveau d’un locus spécifique. Dans une seconde partie, une nouvelle technique de purification d’un locus unique basée sur l’utilisation de sondes de capture est développée. Il s’agit d’une adaptation de la technologie PICh (Proteomics of isolated chromatin segments) rendue très sensible et quantitative, et avec un taux d’enrichissement augmenté grâce à l’ajout d’une seconde étape de purification par affinité.

Heat shock proteins (HSPs) are reported to play an important role in erythropoiesis. The expression of HSP genes is mainly controlled by Heat shock factor 1 (HSF1), a highly conserved transcription factor. So far, a detailed understanding of the function of HSF1 in erythropoiesis remains uncharacterized. This study has employed zebrafish as a relevant model to investigate the role of Hsf1 during embryonic erythropoiesis. We established hsf1-disrupted zebrafish lines using the CRISPR/Cas9 technology and performed phenotypic analyses throughout embryogenesis. We found that Hsf1 deficient embryos had a decreased number of primitive erythrocytes, while erythrocyte number in adults was unchanged. In Hsf1 deficient embryos, expression of embryonic a and b-globin genes was reduced as well as gata1 expression. In addition, the morphology of erythrocytes suggested an inhibition of erythrocyte maturation. On the other hand, no significant changes were observed in myeloid cells.Altogether our results support a key role for Hsf1 in erythrocyte maturation in vivo., Il a été démontré que les protéines de choc thermique (HSP) jouent un rôle important dans l'érythropoïèse. Or, l'expression des gènes HSP est contrôlée par le facteur de choc thermique 1 (HSF1), un facteur de transcription hautement conservé. Jusqu'à présent, une compréhension détaillée de la fonction d’HSF1 dans l'érythropoïèse reste à établir. Dans notre étude, nous avons utilisé le poisson zèbre, modèle animal pertinent, pour étudier le rôle du gène hsf1 pendant l'érythropoïèse embryonnaire. Nous avons établi des lignées de poisson-zèbre invalidées pour le gène hsf1 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 et nous avons effectué des analyses phénotypiques tout au long de l'embryogenèse. Nous avons constaté que les embryons déficients en Hsf1 ont un nombre réduit d'érythrocytes primitifs, alors que le nombre d'érythrocytes chez les poissons zèbres adultes reste inchangé. L'expression des gènes embryonnaires des chaînes a et b-globines est réduite ainsi que l'expression de gata1. De plus, la morphologie des érythrocytes révèle une inhibition de la maturation des érythrocytes. En revanche, aucun changement significatif n'a été observé dans les cellules myéloïdes.Nos résultats montrent que le gène hsf1 est un régulateur positif de la maturation des érythrocytes in vivo.

Le syndrome néphrotique (SN) est caractérisé par une fuite massive de protéines dans les urines due à une altération du filtre glomérulaire, dont le podocyte est un composant essentiel. L’atteinte rénale peut être associée à des anomalies neurologiques comme dans le syndrome de Galloway-Mowat (GAMOS). L’étude de formes familiales rares de SN a permis d’identifier des mutations dans de nombreux gènes codant des protéines exprimées par le podocyte. Cependant, dans environ la moitié des cas familiaux de SN, le gène impliqué dans la maladie reste inconnu, et il n’existe à ce jour aucun traitement, mis à part la dialyse et la transplantation rénale. Au cours de ce travail, j’ai participé à deux projets de recherche, l’un portant sur l’étude de deux mutations identifiées dans deux gènes candidats chez des patients avec un SN syndromique en utilisant le modèle de la Drosophile, l’autre portant sur l’étude des conséquences fonctionnelles des mutations du complexe KEOPS, identifiées chez des patients avec GAMOS, dans des modèles in vitro et in vivo. Pour la première partie de mon travail, j’ai travaillé sur deux variants homozygotes identifiés dans les gènes ADD3 et KAT2B chez des enfants présentant un SN associé à une microcéphalie et une cardiomyopathie. Le premier gène code l’adducine-γ, un important régulateur du cytosquelette d’actine, et le second pour la lysine acétyltransférase KAT2B responsable de l’acétylation des histones. Mon projet avait pour but d’évaluer la pathogénicité des mutations pour définir leur contribution au phénotype des patients en utilisant le modèle de la Drosophile. J’ai réalisé des expériences d’extinction de l’expression de ces deux gènes, séparément puis simultanément, suivi par des expériences de « sauvetage » pour étudier le phénotype des néphrocytes, équivalents chez la Drosophile des podocytes. Les résultats obtenus ont montré que la mutation d’ADD3 seule n’affecte pas les néphrocytes, alors que la mutation de KAT2B entraîne des défauts des néphrocytes. De plus, la suppression simultanée dans les néphrocytes de l’expression des gènes ADD3 et KAT2B altère de façon synergique les néphrocytes et l’expression de la mutation d’ADD3 ne permet pas de restaurer le phénotype sauvage. L’ensemble de nos résultats suggère que les mutations dans les deux gènes sont nécessaires à l’apparition de l’atteinte rénale chez ces patients. Pour la seconde partie de ce travail, j’ai étudié le complexe KEOPS, un complexe protéique composé de 5 sous-unités qui associé à l’enzyme YRDC est responsable de la biosynthèse de la modification t6A sur les ARN de transfert (ARNt) jouant un rôle primordial dans la fidélité de la traduction. Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la nouvelle sous-unité GON7, une protéine intrinsèquement désordonnée, sur la stabilité du complexe KEOPS, en particulier sur la sous-unité LAGE3 qui interagit directement avec GON7. Nous avons montré que les protéines GON7 et LAGE3 ont une demi-vie plus courte lorsqu’elles sont exprimées individuellement alors que leur demi-vie augmente lorsqu’elles sont co-exprimées, suggérant que l’interaction stabilise les deux protéines. En parallèle, j’ai développé des modèles murins de « knock-in » (KI) en insérant une mutation dans le gène Osgep ou dans le gène Lage3 par CRISPR/Cas9 afin d’étudier l’effet des mutations sur le développement de l’atteinte rénale et neurologique. Les résultats obtenus à ce jour indiquent que les souris KI ne présentent aucun signe clinique (absence de protéinurie) et histologique évident d’atteinte rénale ou cérébrale, suggérant que le modèle murin ne reproduit pas les atteintes observées chez les patients avec GAMOS. Cependant, des études plus approfondies sont en cours afin de valider l’absence totale de phénotype rénal et cérébral.

Chromosomal translocations are associated with a wide range of cancers. These chromosomal rearrangements are implicated in tumorigenesis by different mechanisms: either they lead to oncogene upregulation or tumor suppressor downregulation. However, the direct link between the appearance of one chromosomal translocation and tumor formation is not always clear. For example, several cancer translocations have been found in PBMCs or in cord blood cells from healthy individuals, suggesting that translocation formation alone is not always sufficient to drive oncogenesis. Most of previous research works on cancer translocation relied on studies using overexpression of the fusion protein. These approaches do not reproduce the chromosome arm translocation nor the chromosomal context of the fusion gene (endogenous promotor, chromatin status etc…) or do not recapitulate a potential haplo-insufficiency of the translocated cells. Because the DNA molecule is organized non-randomly in the nucleus, chromosomal rearrangements are also likely to impact the epigenetic, replication and transcriptional status of the whole rearranged chromosome in addition to the newly juxtaposed gene segments. Using CRISPR/Cas9 technology, we can recapitulate chromosomal translocation in situ, after inducing 2 concurrent double-strand breaks. In this work, we focus on t(2,5)(p23,q35) leading to NPM1-ALK fusion protein frequently found in Anaplasic Large Cell Lymphoma (ALCL). We could recapitulate t(2;5) in cell lines but more importantly in human primary T cells from healthy donors. We showed significant modifications on Replication Timing in model cell lines compare to isogenic non-translocated cells (using Repli-seq analysis). Importantly, these changes might have a direct impact on tumor cell homeostasis. In parallel, we also highlighted the formation of specific fusion circular RNAs expressed from the fusion gene also found in tumor cells. These circular RNAs could give rise to new diagnostic/prognostic biomarkers in the future. This work will lead to a better understanding of the consequences of cancer translocation in human cells and could give new directions for therapeutics in future.; Les translocations chromosomiques sont associées à un grand nombre de cancers. Les translocations chromosomiques sont impliquées dans la tumorigenèse par différents mécanismes : elles conduisent soit à une dérégulation d’un oncogène, soit à la formation d’un nouvel oncogène de fusion. Cependant, le lien direct entre l'apparition d'une translocation chromosomique et la formation d'une tumeur n'est pas totalement établi. Par exemple, plusieurs translocations associées au cancer ont été détectées dans le sang d’individus sains voire dans le sang de cordon des bébés avec une prévalence bien supérieure à celle de la maladie. Ceci suggère que la seule formation de la translocation ne suffit pas toujours à induire l’oncogenèse. La plupart des travaux de recherche antérieurs reposaient sur la surexpression de la protéine de fusion, oncogène supposé. Ces approches présentent de nombreuses limites, la translocation chromosomique est alors absente de même que le contexte chromosomique natif du gène de fusion (promoteur endogène, statut de la chromatine, etc.) ou les éventuels effets d’haplo-insuffisance qui ne sont pas récapitulés. La molécule d’ADN étant organisée de manière non aléatoire dans le noyau, les réarrangements chromosomiques sont également susceptibles d’affecter le statut épigénétique, la réplication et la transcription du chromosome dérivatif entier, en plus des segments d’ADN nouvellement juxtaposés. Or la technologie CRISPR/Cas9, permet de reproduire la translocation chromosomique in situ, après avoir induit deux cassures double-brin simultanées. Ce travail de thèse a porté spécifiquement sur la translocation t(2,5) (p23, q35) qui induit l’expression de la protéine de fusion NPM1-ALK fréquemment rencontrée dans le lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL). Nous avons reproduit la t(2,5) à la fois dans des lignées cellulaires mais aussi dans des cellules T primaires à la fin de ma thèse. Nous avons pu montrer des modifications significatives du timing de réplication des cellules qui portent la translocation en comparaison des cellules isogéniques de départ (par la méthode du Répli-seq) pouvant avoir un impact sur l’homéostasie des cellules tumorales. En parallèle, nous avons mis en évidence la formation d'ARN circulaires de fusion spécifiques, exprimés à partir du gène de fusion, spécifiques des lignées tumorales. Ces ARN circulaires pourraient donner naissance à de nouveaux biomarqueurs diagnostic/pronostic dans le futur. Ces travaux permettront de mieux comprendre les conséquences des translocations chromosomiques oncogéniques dans les cellules humaines et pourraient mener vers de nouvelles orientations thérapeutiques à l’avenir.

Une mutation intronique du gène C9orf72 est une cause prépondérante de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte. Cependant, la fonction de C9orf72 demeure incertaine. Heureusement, les modèles animaux sont une excellente façon d’en faire l’étude in vivo dans des systèmes complexes. Conséquemment, pour étudier la fonction et l’expression de C9orf72, nous avons tenté de développer 3 lignées de poissons-zèbres pour lesquelles des étiquettes 12xhistidines ou eGFP devaient être insérés par CRISPR/Cas9 près du N et C terminal de C9orf72. Surprenamment, ces modifications furent mal tolérées durant le développement, empêchant l’obtention de sujets F0 adultes en mesure de transmettre un tag inséré. Pour étudier l’effet d’une invalidation persistante de C9orf72 chez le poisson, une lignée présentant une délétion près du N-terminal menant à un knock-out fonctionnel de C9orf72 a été développée des poissons injectés pour l’insertion de 12xHistidine. Nos résultats préliminaires suggèrent un phénotype au niveau de la mobilité et de la mortalité. De plus, deux lignées de poissons transgéniques exprimant le gène C9orf72 humain, seul ou marqué au eGFP, ont été développées par Tol2 pour étudier la localisation de C9orf72 et l’effet de sa surexpression. Ces lignées, une fois validées et caractérisées, permettront d’ouvrir de nouvelles perspectives pour caractériser la fonction et l’expression de C9orf72 ainsi que la modélisation de la SLA. Il semble donc que la perte d'un allèle ou une haplo-insuffisance du gène C9orf72 est mal tolérée, mais que la transgenèse, par addition d'un troisième allèle, permettrait l'étude de C9orf72 in vivo., An intronic mutation in the gene C9orf72 is the most prevailing cause of Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), an adult onset neurodegenerative disease of the motoneurons. Despite this, the function of C9orf72 remains uncertain. As animal models are an excellent way to study gene function and expression in vivo in complex systems, by using the CRISPR/Cas9 system we attempted to generate 3 lines of zebrafishes for which 12xhistidines or eGFP tags were inserted near either the N or C terminal of C9orf72. Surprisingly, these modifications were ill tolerated during the development, preventing us from obtaining F0 specimens able to pass on the inserted tag for any of our lines. To study the effects of a persistent knock-out of C9orf72 in the zebrafish, a line with deletions near the N-terminal, resulting in a functional knock-out of C9orf72, was obtained from the fishes injected for the 12xHistidine insertion. Preliminary results indicate a higher mortality rate and decrease mobility phenotypes. Additionally, two transgenic zebrafish lines expressing human C9orf72 alone or with eGFP were generated, using Tol2 in order to study C9orf72 localisation and the effect of its overexpression namely on morphology, development and the central nervous system. These lines, once validated and characterised will open new avenues to determine the role and subcellular localization of C9orf72, as well as for modeling ALS. Thus, it appears that the loss of an allele or haploinsufficiency of the C9orf72 gene is ill tolerated, but that transgenesis, by addition of a third allele, may allow for in vivo study of C9orf72.

Furanocoumarins are phenolic compounds involved in defense against herbivores. These molecules are mainly described in four botanical families. Rutaceae, one of those families, includes Citrus species. Furanocoumarins are phototoxic compounds, which can be problematic for their use in cosmetics or in phytotherapy. Furanocoumarin ingestion via citrus juice consumption, may inhibit human enzymes of detoxification, such as human CYP3A4. This can lead to drug overdoses known as the “Grapefruit Juice Effect”. This work consisted in the development of tools that will allow to generate new varieties of pomelo that no longer produce furanocoumarins by targeted genome edition. We have covered the essential steps for the implementation of a global strategy: i) reproducible methods have been developed for the production of protoplasts and cell cultures of Star Ruby grapefruit; ii) conditions for protoplast transformation by electroporation have also been developed; iii) finally, to specifically inhibit the furanocoumarin biosynthetic pathway, we chose to implement a genome editing approach using a CRISPR / Cas9 methodology. The development of the method was carried out with a gene encoding umbelliferon 6-dimethylallyltransferase. The results obtained indicate that the strategy is feasible. To strengthen the CRISPR / Cas9 strategy, we implemented a method to identify additional target genes. Using a data mining approach of available genomic and transcriptomic databases we identified 18 candidate sequences potentially involved in the furanocoumarin biosynthetic pathway. Heterologous expression of the corresponding proteins and their functional characterization made it possible to show that CYP706J12 is able to metabolize herniarin (a coumarin). This result provides elements to hypothesize about the convergent evolution of coumarin and furanocoumarin synthesis in higher plants., Les furocoumarines sont des composés phénoliques impliqués dans la défense contre les herbivores. Ces molécules sont majoritairement décrites dans quatre familles botaniques, notamment les Rutaceae, dont font partie les agrumes. Ces molécules sont phototoxiques ce qui peut poser des problèmes pour leur utilisation comme par exemple en cosmétique ou en phytothérapie. D’autre part, en cas d’ingestion par exemple via la consommation de jus de certains agrumes, elles ont responsables de l’inhibition d’enzymes de détoxication comme le CYP3A4 humain. Cela peut conduire à des surdosages médicamenteux connus sous le nom d’Effet Pomelo. Ce travail de thèse a consisté à réfléchir et à développer, des outils qui permettront de générer de manière ciblée des variétés de pomelo qui ne produisent plus de furocoumarines. Nous avons abordé l’ensemble des étapes essentielles pour la mise en place d’une stratégie global : i) des méthodes reproductibles ont été développées pour la production de protoplastes et de cultures cellulaires de pomelo Star Ruby ; ii) des conditions de transformation de protoplastes par électroporation ont également été mises au point ; iii) finalement, pour inhiber de manière spécifique la voie de biosynthèse des furocoumarines, nous avons choisi de mettre en œuvre une approche d’édition de génome en utilisant une méthodologie CRISPR/Cas9. La mise au point de la méthode a été réalisée avec un gène codant pour une umbelliferone 6-dimethylallyl transférase. Les résultats obtenus indiquent que la stratégie est envisageable. Pour renforcer la stratégie CRISPR/Cas9, nous avons mis en œuvre une démarche d’identification de gènes cibles additionnels. En utilisant une approche de data mining de bases de données génomiques et transcriptomiques nous avons identifié 18 séquences candidates, potentiellement impliquées dans la voie de biosynthèse des furocoumarines. L’expression hétérologue des protéines correspondantes et leur caractérisation fonctionnelle a permis de montrer que CYP706J12 est en mesure de métaboliser l’hérniarine, une coumarine. Ce résultat apporte des éléments pour émettre des hypothèses sur l’évolution convergente de la synthèse des coumarines et des furocoumarines chez les végétaux supérieurs.

Avec peu de nouveaux traitements, la leucémie myéloïde aiguë (LMA) demeure un cancer à mauvais pronostic. Depuis peu, des thérapies basées sur le transfert adoptif de lymphocytes T autologues modifiés avec un « Chimeric-Antigen Receptor » (CAR), récepteur artificiel redirigeant leur capacité cytotoxique vers les cellules tumorales, révolutionnent le traitement des tumeurs malignes d’origine B. CD33 est une des seules cibles démontrées comme efficace en essai clinique pour l’immunothérapie de la LMA. Cependant, la myélotoxicité est un problème majeur causé par la présence de CD33 sur les cellules souches hématopoïétiques (HSC) normales. De façon intéressante, CD33 ne semble pas indispensable puisque des patients et des modèles animaux déficients en CD33 ont été reportés, sans phénotype évident. Nous émettons l’hypothèse qu’une stratégie de « knock-out/knock-in » de CD33KO/CAR-CD33 dans des HSC serait un traitement efficace et sécuritaire pour la LMA qui contournerait le problème de myélotoxicité. Les CAR HSC présenteraient plusieurs avantages sur les CAR-T, telles qu’une meilleure persistance in vivo, une diminution de l’épuisement des T et de leur toxicité dues à la génération continue et progressive des cellules effectrices. Nos résultats montrent qu’un CAR anti-CD33 est efficace contre des lignées cellulaires de LMA, lorsqu’exprimé dans des T primaires, même lorsque placé sous le contrôle d’un promoteur T-spécifique restreignant l’expression du CAR à la progéniture T. Nous avons aussi démontré l’efficacité des ARN guides et la spécificité du CAR par la résistance à la lyse de clones LMA CD33-. Notre stratégie sera maintenant testée dans les HSC et in vivo., With very few new treatments introduced in the past decades, acute myeloid leukemia (AML) remains a cancer with poor prognosis. Recently, a revolutionary immunotherapy for B-cell malignancies has been approved, named CAR-T cells. It is based on adoptive T-cell therapy but the cells are genetically engineered to express a “chimeric antigen receptor” (CAR), a surface protein used to redirect T cell’s natural cytotoxic activity against tumors. CD33 is one of the few clinically validated targets for AML immunotherapy. However, myelotoxicity is a major concern because this antigen is also present on normal hematopoietic stem cells (HSC). Interestingly, CD33 was dispensable in humans and in several animal models without any apparent consequences. We hypothesized that a HSC graft, engineered with a knock-out/knock-in of CD33/CAR-CD33, would be a safe and effective therapy for AML patients. This strategy would benefit from the clinical potential of CD33 without the associated myelotoxicity. Because of the continuous renewal of effector cells, CAR-HSC would have several advantages over the CAR-T cells such as long-term in vivo persistence and reduced cellular exhaustion. Cytokine release syndrome could also be diminished in CAR-HSC settings by the slow generation of CAR-T. In this study, we showed that the anti-CD33 CAR is effective and specific against AML cell lines even when its expression is mediated by a T-specific promotor. This promotor allows restriction of transgene expression to the T lineage progeny. We have designed efficient gRNA to target CD33 gene. The strategy will now be tested in HSC and in mice models.

CRISPR/Cas9 is a new genome modification tool that is affordable and easy to use. Its possible applications represent an important political challenge worldwide. This is a major scientific discovery, promising many health innovations. Economically speaking, countries have an interest in investing in CRISPR/Cas9 applied research through the associated promise of gains (patent protection). Despite this, the applications of CRISPR/Cas9 raise many ethical issues, particularly related to its use in humans. Two limits are highlighted: one between the manipulation of somatic cells and the manipulation of germ cells, the other between the treatment and the improvement of humans. From these two barriers flow all the ethical issues associated with CRISPR/Case9. From a European perspective, many different national legislations exist on the subject. In addition, several actions are planned in Europe and worldwide to develop regulations around the modification of the human genome. The main conclusions are that a moratorium should be put in place and that international legislation should be drafted on the subject. Although many difficulties are raised, legislating on the subject seems to be the best solution, bearing in mind that a law is not fixed in time and can evolve after it has been adopted.; CRISPR/Cas9 est un nouvel outil de modification du génome facile d’utilisation et peu coûteux. Ses applications possibles représentent un enjeu politique important dans le monde entier. Il s’agit d’une découverte scientifique majeure, promettant de nombreuses innovations en santé. Economiquement parlant, les pays ont intérêt à investir dans la recherche appliquée de CRISPR/Cas9 grâce aux promesses de gains qui lui sont associées (protection des brevets). Malgré cela, les applications de CRISPR/Cas9 soulèvent de nombreuses questions d’ordre éthique, liées en particulier à son utilisation chez l’Homme. Deux limites sont mises en avant : une entre la manipulation des cellules somatiques et la manipulation des cellules germinale, l’autre entre le traitement et l’amélioration de l’Homme. De ces deux barrières découlent toutes les questions éthiques associées à CRISPR/Cas9. D’un point de vue européen, de nombreuses législations nationales différentes existent sur le sujet. Par ailleurs, plusieurs actions sont envisagées en Europe et dans le monde pour faire évoluer la réglementation autour de la modification du génome humain. Les principales conclusions tendent à la mise en place d’un moratoire et l’élaboration d’une législation internationale sur le sujet. Bien que de nombreuses difficultés soient soulevées, légiférer sur le sujet semble être la meilleure des solutions, en gardant en tête qu’une loi n’est pas figée dans le temps et qu’elle peut évoluer après avoir été adoptée.

Gene therapy is a promising therapeutic strategy for the monogenic diseases treatment. If the first approaches, called additive, have relied on the use of viral vectors, a growing share is now turning to gene editing. Less than a decade after its characterization, the CRISPR-Cas9 system has moved gene editing to a clinical stage. However, in the same period of time, several questions have been raised regarding the genotoxicity that can be induced by Cas9. An emerging literature points to the risk of genotoxicity at the targeted site. The thesis work presented here is part of this theme. The first part of the study aimed to describe the genotoxicity induced by a single double-stranded break made by Cas9. Characterization of the effects was done both at the nucleotide level, by monitoring the HDR / InDels balance, but also at the chromosome scale. The monitoring of chromosomal integrity has brought to light a new risk of genotoxicity that was not characterized. A sensitive and specific detection system for this risk has been developed to further characterize it. The second objective was to address the limitations of unwanted genotoxicity by developing a safer and more efficient gene editing method through the use of a single single-stranded breakage by Cas9D10A-nickase., La thérapie génique est une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement des maladies monogéniques. Si les premières approches, dites additives, ont reposées sur l’utilisation de vecteurs viraux, une part grandissante se tourne désormais vers l’édition génique. Celle-ci est permise par la mise au point de nouvelles générations d’endonucléases, et en particulier le système CRISPR-Cas9. Moins d’une décennie après sa caractérisation, le système CRISPR-Cas9 a permis de faire passer l’édition génique à un stade clinique. Toutefois, dans le même laps de temps, plusieurs interrogations ont été soulevées vis-à-vis de la génotoxicité pouvant être induite par la Cas9. Une littérature émergente pointe le risque de génotoxicité au site ciblé. Le travail de thèse présentée ici s’inscrit dans cette thématique. La première partie de l’étude a eu pour objectif de décrire la génotoxicité induite par une unique cassure double-brin faite par la Cas9. La caractérisation des effets a été faite à la fois à l’échelle nucléotidique, par le suivi de la balance HDR / InDels, mais également à l’échelle du chromosome. Le suivi de l’intégrité chromosomique a permis de mettre en lumière un nouveau risque de génotoxicité encore non-caractérisé. Un système de détection sensible et spécifique de ce risque a été mis au point pour continuer de le caractériser. Le second objectif a été de répondre aux limites soulevées par la génotoxicité non-voulus, en mettant au point une méthode d’édition génique plus sûre et aussi efficace, via l’utilisation d’une unique cassure simple-brin par la Cas9D10A -nickase.

Use of new biotechnology tools for xenotransplantation. Xenotransplantation is a seductive approach that has been tried many times for over a century in order to circumvent the lack of human organs or tissues for transplantation. Performing genetic alterations in the mammalian organs or tissues is one of the strategies implemented to limit rejection by the hosts. However, a considerable number of genes are involved in the mechanisms of tissue rejection and the production of genetically modified animals meeting the necessary criteria is rather complex. The emergence of powerful biotechnology tools (such as the CRISPR/Cas9 system) has opened new avenues to research in this area. An abundant literature exists which reviews the different approaches and current or planned attempts, using either cells and tissues, or organs from genetically modified animals., La xénotransplantation est une approche séduisante, tentée à de nombreuses reprises depuis plus d’un siècle, pour subvenir au manque d’organes ou de tissus humains pour les transplantations. Modifier génétiquement les tissus de donneurs de greffon de mammifères d’élevage, en particulier, est une des stratégies mises en oeuvre afin de limiter le rejet par l’hôte. Cependant, un nombre considérable de gènes est impliqué dans les mécanismes de rejet. Ainsi, la production d’animaux génétiquement modifiés répondant aux critères nécessaires est très complexe. L’émergence d’outils performants de biotechnologie (comme l’outil CRISPR/Cas9) a redonné un nouveau souffle aux recherches dans ce domaine. Une abondante littérature existe qui fait le point sur les différentes approches et les tentatives en cours ou en prévision, utilisant soit des cellules et des tissus, soit des organes issus de ces animaux génétiquement modifiés., Jolivet Geneviève. Utilisation des nouveaux outils de biotechnologie pour la xénotransplantation. In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 172, 2019. pp. 89-93.

Chromosomal translocations are associated with a wide range of cancers. These chromosomal rearrangements are implicated in tumorigenesis by different mechanisms: either they lead to oncogene upregulation or tumor suppressor downregulation. However, the direct link between the appearance of one chromosomal translocation and tumor formation is not always clear. For example, several cancer translocations have been found in PBMCs or in cord blood cells from healthy individuals, suggesting that translocation formation alone is not always sufficient to drive oncogenesis. Most of previous research works on cancer translocation relied on studies using overexpression of the fusion protein. These approaches do not reproduce the chromosome arm translocation nor the chromosomal context of the fusion gene (endogenous promotor, chromatin status etc…) or do not recapitulate a potential haplo-insufficiency of the translocated cells. Because the DNA molecule is organized non-randomly in the nucleus, chromosomal rearrangements are also likely to impact the epigenetic, replication and transcriptional status of the whole rearranged chromosome in addition to the newly juxtaposed gene segments. Using CRISPR/Cas9 technology, we can recapitulate chromosomal translocation in situ, after inducing 2 concurrent double-strand breaks. In this work, we focus on t(2,5)(p23,q35) leading to NPM1-ALK fusion protein frequently found in Anaplasic Large Cell Lymphoma (ALCL). We could recapitulate t(2;5) in cell lines but more importantly in human primary T cells from healthy donors. We showed significant modifications on Replication Timing in model cell lines compare to isogenic non-translocated cells (using Repli-seq analysis). Importantly, these changes might have a direct impact on tumor cell homeostasis. In parallel, we also highlighted the formation of specific fusion circular RNAs expressed from the fusion gene also found in tumor cells. These circular RNAs could give rise to new diagnostic/prognostic biomarkers in the future. This work will lead to a better understanding of the consequences of cancer translocation in human cells and could give new directions for therapeutics in future., Les translocations chromosomiques sont associées à un grand nombre de cancers. Les translocations chromosomiques sont impliquées dans la tumorigenèse par différents mécanismes : elles conduisent soit à une dérégulation d’un oncogène, soit à la formation d’un nouvel oncogène de fusion. Cependant, le lien direct entre l'apparition d'une translocation chromosomique et la formation d'une tumeur n'est pas totalement établi. Par exemple, plusieurs translocations associées au cancer ont été détectées dans le sang d’individus sains voire dans le sang de cordon des bébés avec une prévalence bien supérieure à celle de la maladie. Ceci suggère que la seule formation de la translocation ne suffit pas toujours à induire l’oncogenèse. La plupart des travaux de recherche antérieurs reposaient sur la surexpression de la protéine de fusion, oncogène supposé. Ces approches présentent de nombreuses limites, la translocation chromosomique est alors absente de même que le contexte chromosomique natif du gène de fusion (promoteur endogène, statut de la chromatine, etc.) ou les éventuels effets d’haplo-insuffisance qui ne sont pas récapitulés. La molécule d’ADN étant organisée de manière non aléatoire dans le noyau, les réarrangements chromosomiques sont également susceptibles d’affecter le statut épigénétique, la réplication et la transcription du chromosome dérivatif entier, en plus des segments d’ADN nouvellement juxtaposés. Or la technologie CRISPR/Cas9, permet de reproduire la translocation chromosomique in situ, après avoir induit deux cassures double-brin simultanées. Ce travail de thèse a porté spécifiquement sur la translocation t(2,5) (p23, q35) qui induit l’expression de la protéine de fusion NPM1-ALK fréquemment rencontrée dans le lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL). Nous avons reproduit la t(2,5) à la fois dans des lignées cellulaires mais aussi dans des cellules T primaires à la fin de ma thèse. Nous avons pu montrer des modifications significatives du timing de réplication des cellules qui portent la translocation en comparaison des cellules isogéniques de départ (par la méthode du Répli-seq) pouvant avoir un impact sur l’homéostasie des cellules tumorales. En parallèle, nous avons mis en évidence la formation d'ARN circulaires de fusion spécifiques, exprimés à partir du gène de fusion, spécifiques des lignées tumorales. Ces ARN circulaires pourraient donner naissance à de nouveaux biomarqueurs diagnostic/pronostic dans le futur. Ces travaux permettront de mieux comprendre les conséquences des translocations chromosomiques oncogéniques dans les cellules humaines et pourraient mener vers de nouvelles orientations thérapeutiques à l’avenir.

Primary hyperoxaluria type 1 (or PH1) is an inherited metabolic disorder related to the deficiency of the hepatic AGT enzyme (alanine:glyoxylate aminotransferase), which is encoded by the AGXT gene. In PH1 patients, this deficiency leads to oxalate overexcretion by liver, followed by urine filtration and complexation with calcium to form massive calcium-oxalate nephrolithiasis potentially leading to chronic renal failure. The only available curative treatment is combined hepatorenal allogeneic engraftment, which is currently limited by the availability of transplant donors, significant morbidity and mortality, and the need for long-term immunosuppressive treatment. The aim of our research project is to develop gene therapy for PH1, consisting in engraftment of genetically corrected autologous liver cells. Considering that adult hepatocytes are hardly available and expandable in vitro, we chose to explore the use of induced pluripotent stem cells (iPSCs) to produce human liver cells for application in regenerative medicine. We derived and characterized iPSC lines from PH1 patient fibroblasts after transient expression of reprogramming factors delivered by Sendai virus vectors. We developed two additive gene therapy strategies by inserting a minigene encoding an optimized AGXT cDNA sequence using (1) a lentiviral vector designed for liver-specific expression and (2) homologous recombination process at the AAVS1 locus favoured by the targeted DNA cutting system “CRISPR/Cas9”. Finally, we highlighted therapeutic cassette expression after hepatic differentiation of genetically corrected iPSCs. These results pave the way for regenerative medicine for PH1 by transplantation of genetically modified autologous hepatocyte-like cells derived from patient-specific iPSCs., L’hyperoxalurie primitive de type 1 (ou HP1) est une maladie héréditaire du métabolisme liée à un déficit en enzyme hépatocytaire AGT (alanine:glyoxylate aminotransférase), codée par le gène AGXT. Ce déficit entraîne, chez les patients atteints d’HP1, une excrétion hépatique accrue d’oxalate ; celui-ci est ensuite éliminé dans les urines où il se complexe avec le calcium pour former des néphrolithiases oxalo-calciques massives, pouvant conduire à une insuffisance rénale chronique. Le seul traitement curatif disponible pour cette pathologie est la greffe allogénique combinée hépatorénale, actuellement limitée par la disponibilité des donneurs de greffons, une morbi-mortalité significative et la nécessité d’un traitement immunosuppresseur au long cours. L’objectif du projet de recherche est de développer une thérapie génique de l’HP1 par greffe de cellules hépatiques autologues génétiquement corrigées. La faible disponibilité et la difficulté d’amplification in vitro des hépatocytes adultes nous a conduit à explorer la piste des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) pour produire des cellules hépatiques humaines utilisables en médecine régénérative. Nous avons dérivé et caractérisé des lignées de cellules iPSCs à partir de fibroblastes de patients atteints d’HP1, après expression transitoire des facteurs de reprogrammation par des vecteurs Sendai. Nous avons développé deux stratégies de thérapie génique additive par insertion d’un minigène codant une séquence optimisée de l’ADNc AGXT au moyen (1) d’un vecteur lentiviral à expression hépato-spécifique et (2) d’un processus de recombinaison homologue au locus AAVS1 facilité par le système de clivage ciblé de l’ADN « CRISPR/Cas9 ». Enfin, nous avons mis en évidence l’expression de la cassette thérapeutique après différenciation hépatocytaire des iPSCs génétiquement corrigées. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives de médecine régénérative pour l’HP1 par transplantation de cellules hépatocytaires autologues génétiquement corrigées dérivées d’iPSCs de patients.

Two-pore domain potassium channels (K2P) are major regulators of cell excitability, playing a central role in the establishment and maintenance of the resting potential of animal cells. Despite their fundamental role, little is known about the cellular processes that control K2P channels function in vivo. In particular, we know only few factors that directly control thenumber, activity, and localization of K2P on the cell surface.During my thesis, I used state-of-the art genome engineering technologies combined with genetic approaches to characterize the C. elegans potassium channel EGL-23. For this, I realized a phenotypic suppressor screen of the egg-laying defective mutant egl-23(n601) and a visual screen on an egl-23 translational fluorescent reporter. Using whole genome sequencing, I was able to clone for new genes involved in EGL-23 regulation; Les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) sont des régulateurs principaux de l’excitabilité cellulaire car ils jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos des cellules animales. Malgré leur rôle fondamental, peu d’informations sont connues sur les processus cellulaires qui contrôlent la fonction des canaux K2P in vivo. En particulier, nous ne connaissons que quelques facteurs qui contrôlent directement le nombre, l’activité et la localisation des K2P à la surface des cellules.Durant ma thèse, j’ai utilisé des stratégies d’ingénierie du génome que j’ai associé à des approches génétiques afin de caractériser le canal potassique EGL-23. Pour cela, j’ai réalisé un crible suppresseur du phénotype de défaut de ponte du mutant egl-23(n601) et un crible visuel sur le rapporteur fluorescent traductionnel egl-23::TagRFP-T. Grâce au reséquençagecomplet du génome, j’ai pu cloner 4 gènes impliqués dans la régulation du canal EGL-23.

For the last 20 years, important knowledge were acquired regarding the implication of the DNA damage response (DDR) in the development, maturation and function of the immune system. The lab DGSI has shown that DNA repair deficiencies can lead to immune disorders and in some cases to cancer predisposition. The first part of this thesis is based on the study of a patient exhibiting an immune deficiency and developmental problems. An homozygous misense mutation affecting the catalytic site of the protein MYSM1 was identified for this patient. MYSM1 is a metalloprotease, targeting monoubiquitinated histone H2A on lysine 119 (H2AK119ub), a marker of transcription silencing. Based on murine models, MYSM1 was described as a transcriptional derepresser of genes implicated in hematopoietic stem cells homeostasis and lymphocytes differentiation. The MYSM1 deficient patient suffered from a complete absence of B cells, a T cell lymhopenia, some hematopoietic defects and developmental abnormalities. As observed in the murine model, those symptoms could be explained by a transcriptional deregulation of factors implicated in the immuno-hematopoietic development. However, patient's fibroblasts are hypersensitive to certain genotoxic compounds. Hence, the DDR seems to be impaired in the patient cells, which is not described in murine models, and suggests an implication of MYSM1 in the DDR. A second part of the thesis focuses on ZNF699, wich is a zinc finger protein. An homozygous insertion of one nucleotide, leading to a frameshift, was identified in the gene coding for ZNF699 in a patient suffering from medullar aplasia, accelerated aging and short telomeres. Cells from this patient are also hypersensitive to some gentoxic compounds, suggesting the implication of ZNF699 in the DDR. The aim of this work is to understand the role of these two factors MYSM1 and ZNF699 in each patient pathology, and decipher their respective implication in the DDR.; Au cours des 20 dernières années, d'importantes connaissances ont été acquises concernant les implications de la réponse aux dommages de l'ADN (DDR) dans le développement, la maturation et la fonction du système immunitaire. Le laboratoire DGSI a contribué à cette aventure en montrant que, en effet, des défauts dans la DDR peuvent entraîner des déficits immunitaires et, dans certains cas, une prédisposition au cancer. La première partie de la thèse est basée sur l'analyse d'un patient présentant un déficit immunitaire et des anomalies du développement. Une mutation faux-sens homozygote affectant le site catalytique de la déubiquitinase d'histone MYSM1 a pu être identifiée chez ce dernier. MYSM1 est une métallo-protéase, ciblant la forme monoubiquitinée de l'histone H2A en position K119 (H2AK119ub), un marqueur de la chromatine associé à la répression transcriptionnelle. Il a été décrit, à partir de modèles murins, que MYSM1 participe à la dérépression transcriptionnelle de gènes impliqués dans l'homéostasie des cellules souches hématopoïétiques, l'hématopoïèse et la différenciation des lymphocytes. Le patient déficient en MYSM1 présente une absence totale de lymphocytes B, une lymphopénie T, une hématopoïèse défectueuse et des anomalies du développement. Comme chez les souris KO MYSM1, la plupart de ces caractéristiques pourraient être dues à la dérégulation transcriptionnelle de facteurs impliqués dans le développement immuno-hématologique. Cependant, les fibroblastes du patient présentent une hypersensibilité à des agents génotoxiques. Ces résultats indiquent que la réponse aux dommages de l'ADN est compromise dans les cellules du patient, un phénotype non décrit dans les études de souris KO, et suggèrent un rôle de MYSM1 dans la DDR. Une deuxième partie de la thèse porte sur le facteur ZNF699. Une insertion homozygote d'un nucléotide, conduisant à un décalage du cadre de lecture, a été identifiée dans le gène codant ZNF699, un facteur à doigts de zinc, chez un patient atteint d'insuffisance médullaire associée à un vieillissement accéléré et des télomères courts. Les cellules de ce patient présentent une hypersensibilité à des agents génotoxiques, suggérant une fonction de ZNF699 dans la réparation de l'ADN. L'objectif de cette thèse est de comprendre l'implication des facteurs MYSM1 et ZNF699 dans la pathologie respective de chaque patient, ainsi que l'implication de ces facteurs dans les mécanismes de réponses aux dommages de l'ADN (DDR).

Infertility is currently considered by the World Health Organization (WHO) as a major health concern affecting more than 50 million couples worldwide. In western countries, the majority of infertile couples seek assisted reproductive technologies (ART) to achieve a pregnancy. Despite the success of these techniques, almost half of these couples fail to obtain a child. Part of these failures are explained by the alteration of gametogenesis. In humans, spermatogenesis involves hundreds of genes specifically expressed in the testis. The abundance of these genes suggests that spermatogenic defects are associated with a strong genetic component. Recently, technical advances have led to the identification of numerous causative genes, but the vast majority of male infertility cases remain idiopathic. The aim of the present thesis is to identify new genetic causes responsible for male infertility and to elucidate the physiopathological mechanisms associated with these anomalies.During my thesis, I participated with the team GETI (genetics, epigenetics and therapies of infertility) in the genetic exploration of two phenotypes of male infertility related to post-meiotic defects of spermatogenesis: a rare form of non-obstructive azoospermia and the phenotype of multiple morphological abnormalities of the sperm flagella (MMAF). I have also played a key role in creation and analysis of transgenic mice to better characterize the pathogeny of the identified genetic causes in Human.Genetic analyses performed on two infertile brothers born form consanguineous parents and presenting an-idiopathic non-obstructive azoospermia associated with a post-meiotic arrest of spermatogenesis allowed us to identify a homozygous variant in the SPINK2 gene that encodes a serine-protease inhibitor. Phenotypic analysis of Spink2-/- adult male mice showed that they are infertile and perfectly mimic the sperm and testicular phenotypes observed in our patients. We showed that Spink2 protein is expressed from the round spermatid stage and localized in the acrosome, a lysosomal-like vesicle rich in proteases that play a key role during fertilization. When Spink2 is absent, the deregulated proteolytic activity of the targeted proteases such as acrosin leads to the fragmentation of the Golgi apparatus and arrest of spermiogenesis at the round spermatid stage. We also showed that sperm from heterozygous human and mice present a high level of morphological abnormalities and a decrease of progressive motility leading to a variable subfertility. These results showed for the first time that oligo-teratozoospermia and azoospermia could present a pathological continuum due to the same pathogeny.We also performed exome sequencing in a cohort of 78 non related MMAF subjects and identified in 49 cases deleterious bi-allelic mutations in a total of 11 candidate genes including DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 and FSIP2 giving a genetic diagnosis yield of 63%. These results confirm the genetic heterogeneity of MMAF and the efficiency of high throughput sequencing in genetic exploration of this phenotype. We also demonstrated the pathogenic implication of certain candidate genes (n=4) using knock-out mice created by the new technology of genome editing, CRISPR/Cas9.Overall, this work demonstrates the interest and effectiveness of combining exome sequencing and CRISPR/Cas9 system to study spermatogenesis disorders and male infertility., L’infertilité est considérée actuellement par l’organisation mondiale de la santé (OMS) comme une préoccupation majeure de santé affectant plus de 50 millions de couples dans le monde. Dans les pays occidentaux, la majorité des couples infertiles ont recours aux techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP) pour obtenir une grossesse. Malgré le succès de ces techniques, près de la moitié des couples qui ont recours à l’AMP sortent du parcours de soin sans enfant. Une partie de ces échecs est expliquée par l’altération de la gamétogenèse. Chez l’homme, la spermatogenèse fait interagir des centaines de gènes spécifiquement exprimés dans le testicule. L’abondance de ces gènes suggère que les troubles de la spermatogenèse présentent une forte composante génétique. Récemment, les avancées techniques ont favorisé l’identification de gènes responsables de ces anomalies mais la grande majorité des cas d’infertilité masculine reste classée comme idiopathique. L’objectif de la thèse est d’identifier de nouvelles causes génétiques responsables d’infertilité masculine et d’élucider les mécanismes physiopathologiques associés à ces anomalies.Au cours de ma thèse j’ai participé avec l’équipe GETI (génétique, épigénétique et thérapies de l’infertilité) à l’exploration génétique et moléculaire de deux phénotypes distincts d’anomalies spermatiques liés à des défauts post-méiotiques de la spermatogenèse : une forme rare d’azoospermie non obstructive (ANO) et le phénotype d’anomalies morphologiques multiples du flagelle spermatique (AMMF). Enfin j’ai joué un rôle important dans la création et l’analyse de modèles murins pour caractériser la pathogénie de ces anomalies.L’analyse génétique de deux frères infertiles nés de parents consanguins et présentant une ANO idiopathique associée à un arrêt post-méiotique de la spermatogenèse nous a permis d’identifier un variant homozygote délétère dans le gène SPINK2 qui code pour un inhibiteur de sérine-protéases. L’étude des souris KO pour ce gène nous a permis d’observer que les souris mâles adultes sont infertiles et miment parfaitement les phénotypes spermatique et testiculaire observés chez nos patients. Nous avons montré que la protéine codée par ce gène est exprimée dans l’acrosome à partir du stade de spermatide ronde. En l’absence de Spink2, l’activité protéolytique non-neutralisée des protéases cibles qui transitent par le Golgi cause sa fragmentation et bloque la spermiogénèse au stade de spermatide ronde. Nous avons également pu observer que les spermatozoïdes provenant de patients et de souris hétérozygotes présentent un taux élevé d’anomalies morphologiques et une baisse de la mobilité progressive conduisant à une hypofertilité à expressivité variable. Ces résultats montrent pour la première fois que l’oligo-tératozoospermie et l’azoospermie peuvent constituer un continuum pathologique dû à une même pathogénie.Nous avons également réalisé le séquençage exomique complet d’une cohorte de 78 individus AMMF non apparentés et avons identifié chez 49 sujets des mutations bi-alléliques délétères dans 11 gènes candidats dont DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 et FSIP2, soit un rendement diagnostique de 63%. Ces résultats confirment l’hétérogénéité génétique du phénotype MMAF et l’efficacité diagnostique du séquençage haut débit dans son exploration. Nous avons également validé l’implication de certains gènes candidats (n=4) dans ce phénotype chez le modèle murin knock-out créé par la nouvelle technologie d’édition du génome, CRISPR/Cas9.Dans son ensemble, ce travail montre l’intérêt et l’efficacité de la combinaison du séquençage exomique et de la technique de CRISPR/Cas9 pour étudier les troubles de la spermatogenèse et l’infertilité masculine.

A CRISPR/Cas9 strategy to inihibit the production of Furanocouarins in Citrus plants. Forum /Edition des Génomes de Plantes

miR-202, un microARN clé pour le succès reproducteur des femelles chez le poisson médaka. Journées d'Animation Scientifique du département Phase (JAS Phase 2018)

Le développement de nouvelles technologies comme CRISPR/Cas9 facilite la création de mutations ciblées dans le génome des cellules souches embryonnaires humaines. Cette technologie, découverte et caractérisée en 2012, ne cesse de se développer. Au départ, il existait uniquement la Cas9 sauvage qui crée une cassure double-brin à bouts francs dans la cellule. Très vite, la méthode de la Cas9_D10A (double nickase) s’est développée pour palier au manque de spécificité de la précédente méthode. Enfin la nucléase Cpf1 a été ensuite découverte et est utilisée pour effectuer des modifications génétiques. La nucléase Cpf1 est plus spécifique et efficace que les précédentes méthodes. Je rapporte dans ce mémoire la création d’une lignée de cellules souches embryonnaires humaines dont le gène de pluripotence OCT4 est fusionné au gène Katushka par la méthode de la « double nickase » de la technologie CRISPR/Cas9. Pour cela j’ai construit le vecteur permettant de créer la cassure double brin dans le locus du gène OCT4 et j’ai modifié la matrice de réparation contenant le gène Katushka ainsi que la cassette de sélection à un antibiotique. L’analyse des clones cellulaires se fait en deux étapes. Cela implique, premièrement la sélection des clones résistants à l’antibiotique et l’identification des clones correctement ciblés, deuxièmement l’analyse de l’expression de la protéine fluorescente par microscopie et cytométrie en flux, avant et après l’excision de la cassette de sélection. Enfin, je présente en perspective les expériences à réaliser pour arriver à obtenir des cellules souches embryonnaires humaines exprimant un marqueur fluorescent de la pluripotence dite « naïve ». Ces expériences demanderont de réaliser une nouvelle intégration d’un gène de fluorescence dans le locus d’un gène spécifique de l’état naïf. Cette modification génomique fera également intervenir la technologie CRISPR/Cas9.

A CRISPR/Cas9 strategy to inihibit the production of Furanocouarins in Citrus plants. Forum /Edition des Génomes de Plantes

Nucleosome positioning along eukaryotic genomes is crucial as it influences DNA accessibility for DNA binding proteins involved in DNA replication, transcription and repair. It is now accepted that both nucleosome preferences for some DNA sequences and remodeling factors play an important role in nucleosome positioning in vivo. However their relative importance remains a matter of debate. To investigate the role played by DNA sequence in nucleosome positioning in a cellular context we developped a strategy to assemble tandem DNA repeats of a nucleosome positioning sequence directly into Saccharomyces cerevisiae’s genome. This method is assisted by CRISPR/Cas9 and overlapping oligonucleotides and it turned out to be very efficient as it allowed to synthetize about 15 kilobases of tandem DNA repeats inside a yeast chromosome. Using this apporoach we obtained three yeast strains differing by the DNA linker length separating two consecutive monomeres of the 601 nucleosome positioning sequence. We chose three lengths of linker (20, 50 and 90 pb) for two reasons. First, they are compatible with the formation of a 30 nm chromatin fiber in vitro, and second, nucleosome repeat length of 167, 197 and 237 pb are found in eukaryotic genomes. We then verified if nucleosomes are effectively positioned according to the theoretic DNA linker lengths we designed in the “601” repeated region. To that goal we performed MNase-seq analysis to deduce nucleosomes dyads positions in the repeats. Interestingly our results show that the 601 sequence is not able to dictate strong nucleosomes positioning differing from the natural nucleosome repeat length of about 165 pb along the repeats in an in vivo context. We further investigated positions of dyads in the same three strains after inactivating the gene coding for the chromatin remodeler Chd1, which could potentially be responsible of the nucleosomes organization in the repeated area. Our results show no effect of Chd1, indicating that the “601” sequence has no positionning effect in vivo or that other trans-acting factors are implicated in nucleosome positioning in the engineered repeats. Finally, this work provides a new fast and simple approach for synthetic DNA repeats construction inside the yeast genome and could easily be applied for other synthetic chromatin engineering approaches., Le positionnement des nucléosomes le long des génomes eucaryotes est crucial étant donné qu’il affecte l’accessibilité de l’ADN à des protéines impliquées dans la transcription, la réplication, ou encore la réparation de l’ADN. Si il est aujourd’hui admis que les remodeleurs de chromatine ainsi que les préférences des nucléosomes pour certains motifs d’ADN constituent les deux principaux déterminants du positionnement des nucléosomes in vivo, leur importance relative fait encore l’objet de controverses. Dans le cadre de cette problématique nous avons développé une stratégie d’assemblage de répétitions de la séquence 601 positionnante de nucléosome directement dans le génome de Saccharomyces cerevisiae. Cette technique assistée par la technologie CRISPR/Cas9 et des oligonucléotides chevauchants s’est révélée très efficace et a permis d’assembler des répétitions sur une étendue d’environ 15 kilobases. Nous avons ainsi pu isoler trois souches se caractérisant par trois longueurs d’ADN de liaison de respectivement 20, 50 et 90 paires de bases séparant deux 601 consécutifs tout le long des répétitions. Ces longueurs d’ADN de liaison ont été choisies du fait de leur compatibilité avec les modèles de la fibre de 30 nm étudiés in vitro et parce qu’elles sont fréquemment observées chez les eucaryotes. Nous avons ensuite regardé si ces répétitions de la séquence 601 suffisent à dicter la succession des nucléosomes de S. cerevisiae selon le pas de chromatine attendu. Pour cela, nous avons eu recours à une approche de MNase-seq afin d’analyser les positions des dyades des nucléosomes dans les répétitions. Les résultats de ces analyses révèlent de façon intéressante l’incapacité de la séquence 601 à positionner le nucléosome dans ce contexte cellulaire et cela malgré l’étendue de la région de 601 répétés constituée. Nous avons également analysé le positionnement des nucléosomes chez ces trois mêmes souches suite à l’inactivation de Chd1, l’un des deux principaux architectes du paysage nucléosomal chez la levure, afin de s’affranchir de son potentiel effet sur le positionnement des nucléosomes dans la région 601. Nos résultats montrent que l’absence de Chd1 ne permet pas de rétablir un positionnement des nucléosomes sur les monomères de 601, suggérant que le 601 n’est pas positionnant in vivo ou que la région répétée est sous l’influence d’autres facteurs de remodelage. D’un point de vue méthodologique, notre technique de construction de répétitions in vivo permet d’envisager des approches simplifiées de biologie synthétique pour la construction de librairies de répétitions dans le génome de S. cerevisiae.

Primary hyperoxaluria type 1 (or PH1) is an inherited metabolic disorder related to the deficiency of the hepatic AGT enzyme (alanine:glyoxylate aminotransferase), which is encoded by the AGXT gene. In PH1 patients, this deficiency leads to oxalate overexcretion by liver, followed by urine filtration and complexation with calcium to form massive calcium-oxalate nephrolithiasis potentially leading to chronic renal failure. The only available curative treatment is combined hepatorenal allogeneic engraftment, which is currently limited by the availability of transplant donors, significant morbidity and mortality, and the need for long-term immunosuppressive treatment. The aim of our research project is to develop gene therapy for PH1, consisting in engraftment of genetically corrected autologous liver cells. Considering that adult hepatocytes are hardly available and expandable in vitro, we chose to explore the use of induced pluripotent stem cells (iPSCs) to produce human liver cells for application in regenerative medicine. We derived and characterized iPSC lines from PH1 patient fibroblasts after transient expression of reprogramming factors delivered by Sendai virus vectors. We developed two additive gene therapy strategies by inserting a minigene encoding an optimized AGXT cDNA sequence using (1) a lentiviral vector designed for liver-specific expression and (2) homologous recombination process at the AAVS1 locus favoured by the targeted DNA cutting system “CRISPR/Cas9”. Finally, we highlighted therapeutic cassette expression after hepatic differentiation of genetically corrected iPSCs. These results pave the way for regenerative medicine for PH1 by transplantation of genetically modified autologous hepatocyte-like cells derived from patient-specific iPSCs., L’hyperoxalurie primitive de type 1 (ou HP1) est une maladie héréditaire du métabolisme liée à un déficit en enzyme hépatocytaire AGT (alanine:glyoxylate aminotransférase), codée par le gène AGXT. Ce déficit entraîne, chez les patients atteints d’HP1, une excrétion hépatique accrue d’oxalate ; celui-ci est ensuite éliminé dans les urines où il se complexe avec le calcium pour former des néphrolithiases oxalo-calciques massives, pouvant conduire à une insuffisance rénale chronique. Le seul traitement curatif disponible pour cette pathologie est la greffe allogénique combinée hépatorénale, actuellement limitée par la disponibilité des donneurs de greffons, une morbi-mortalité significative et la nécessité d’un traitement immunosuppresseur au long cours. L’objectif du projet de recherche est de développer une thérapie génique de l’HP1 par greffe de cellules hépatiques autologues génétiquement corrigées. La faible disponibilité et la difficulté d’amplification in vitro des hépatocytes adultes nous a conduit à explorer la piste des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) pour produire des cellules hépatiques humaines utilisables en médecine régénérative. Nous avons dérivé et caractérisé des lignées de cellules iPSCs à partir de fibroblastes de patients atteints d’HP1, après expression transitoire des facteurs de reprogrammation par des vecteurs Sendai. Nous avons développé deux stratégies de thérapie génique additive par insertion d’un minigène codant une séquence optimisée de l’ADNc AGXT au moyen (1) d’un vecteur lentiviral à expression hépato-spécifique et (2) d’un processus de recombinaison homologue au locus AAVS1 facilité par le système de clivage ciblé de l’ADN « CRISPR/Cas9 ». Enfin, nous avons mis en évidence l’expression de la cassette thérapeutique après différenciation hépatocytaire des iPSCs génétiquement corrigées. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives de médecine régénérative pour l’HP1 par transplantation de cellules hépatocytaires autologues génétiquement corrigées dérivées d’iPSCs de patients.

Topaz1, un gène crucial pour la reproduction chez le poisson medaka. Journées d'Animation Scientifique du département Phase (JAS Phase 2018)

The salinity of irrigation water and soils is one of the main abiotic constraints in agriculture. Among the 130 mha of rice grown around the world, about 30% are in areas where salinity is too high to allow for good yields. In order to better understand the role of Na+ transport systems in the compartmentalization of Na+ in the plant to maintain a high K+/Na+ ratio in sensitive tissues during salt stress, I focused on two transporters from the HKT family, OsHKT1;1 and OsHKT1;3, in rice, the model cereal species. My main project combined a “promoter::GUS” strategy to specify the expression pattern of both genes, and a reverse genetics approach by producing loss-of-function mutants using the CRISPR-CAS9 technology, which was confirmed to be an efficient tool for generating indel mutations after targeted DNA breaks, stably transmitted in rice. Histochemical tests of GUS activity showed predominant expression of OsHKT1;1 and OsHKT1;3 in vascular tissues (xylem parenchyma and/or phloem), mainly in the aerial parts. Phenotypic analysis of "CRISPR" plants revealed changes in leaf Na+ accumulation profiles in mutants: lack of Na+ accumulation in leaf sheaths for oshkt1;1 plants and altered distribution of Na+ between old and young leaves in oshkt1;3 plants, leading to an increase in the leaf blade Na+ content in both types of mutants. Overall, these results suggest that OsHKT1 and OsHKT1.3 contribute to the desalination of young leaf blades during salt stress, via different mechanisms, controlling transports of Na+ through the xylem and phloem. In addition to this study, I collaborated with a group of geneticists who identified a strong association between ecotypic differences in root Na+ and K+/Na+ ratio, and a region of chromosome 4 of rice including the OsHKT1;1 gene. By comparing electrophysiologically the two major variants of OsHKT1;1, differences in Na+ transport capacities that could explain the root trait were observed. All the data obtained underline the interest of analyzing all HKT genes of rice in the mechanisms of plant tolerance to salinity.; La salinité de l'eau d'irrigation et des sols est l'une des principales contraintes abiotiques en agriculture. Parmi les 130 mha de riz cultivés dans le monde, 30% environ se trouvent dans des zones où la salinité est trop élevée pour permettre de bons rendements. Dans l'objectif de mieux comprendre le rôle des systèmes de transport de Na+ dans la compartimentation de Na+ dans la plante permettant de maintenir un rapport K+/Na+ élevé dans les tissus sensibles lors d’un stress salin, je me suis intéressé à deux transporteurs de la famille HKT, OsHKT1;1 et OsHKT1;3, chez le riz, la plante modèle des céréales. Mon principal projet a allié une stratégie "promoteur::GUS" pour préciser les patrons d'expression in planta des deux gènes, et une approche de génétique inverse en produisant des mutants pertes de fonction à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9, qui s’est confirmée être un outil efficace pour générer des mutations indèles après cassure ciblée de l’ADN, transmissibles de façon stable chez le riz. Les tests histochimiques de l’activité GUS ont montré une expression prédominante d’OsHKT1;1 et d’OsHKT1;3 dans les tissus vasculaires (parenchyme xylémien et/ou phloème), essentiellement au niveau des parties aériennes. L’analyse phénotypique des plantes "CRISPR" a mis en évidence des modifications des profils d’accumulation de Na+ dans les feuilles chez les mutants: défaut d’accumulation de Na+ dans les gaines foliaires pour les plantes oshkt1;1 et répartition altérée de Na+ entre les vieilles et les jeunes feuilles chez les plantes oshkt1;3, conduisant à une augmentation de la teneur en Na+ dans les limbes des jeunes feuilles chez les 2 types de mutants. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent qu’OsHKT1;1 et OsHKT1;3 participent au dessalage des jeunes limbes foliaires lors d’un stress salin, via des mécanismes différents, contrôlant les transports xylémiques et phloémiens de Na+. En plus de cette étude, j’ai collaboré avec un groupe de généticiens, qui avait identifié une forte association entre des différences écotypiques de contenu racinaire en Na+ et de rapport K+/Na+, et une région du chromosome 4 du riz comprenant le gène OsHKT1;1. En comparant fonctionnellement par électrophysiologie les deux variants majeurs d’OsHKT1;1, des différences de capacités de transport de Na+ susceptibles d’expliquer le trait racinaire ont été observées. L’ensemble des données obtenues souligne l’intérêt d’analyser tous des gènes HKT de riz dans les mécanismes de tolérance de la plante à la salinité

Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD) is one of the most common genetic myopathies characterized by a progressive and asymmetric weakening of a specific group of skeletal muscles, typically facial, shoulder girdle and upper arms muscles. FSHD is a multifactorial disease that results from the combination of genetic and epigenetic events mapped at the 4q35 locus. These genetic and epigenetic alterations lead to chromatin relaxation and the subsequent overexpression of the majority of 4q35 genes, notably DUX4, the major actor in FSHD pathology. These genomic alterations lead to molecular and cellular defects observed in vitro. Cultured-FSHD myoblasts show a distinct transcription profile, they exhibit morphological differentiation defects and are sensitive to oxidative stress. Several aspects of the disease remain poorly understood, and the elaboration of an appropriate therapeutic strategy is limited by the complexity of this myopathy. However, the discovery of genome editing tools and their successful therapeutic applications in vitro and in animal models of several human diseases, including myopathies, open doors to potential therapeutic strategies for FSHD.This work highlighted the involvement of DNA damage and oxidative stress in the pathophysiology of FSHD, by revealing their constitutive presence in FSHD myoblasts, their link to DUX4 expression and their participation in morphological defects of FSHD myotubes observed in vitro. The second part of this work was aimed at developing genome- and epigenome-editing tools capable of specifically targeting one of the genetic events causing FSHD, a pathogenic variant 4qA161 that contains an insulator and a nuclear matrix attachment site (FR-MAR). These engineered tools will be then used to develop in vitro therapeutic strategies, with the intention of restoring the insulator activity of FR-MAR and the chromatin organization of 4q35 locus.; La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale (FSHD) fait partie des maladies musculaires génétiques les plus fréquentes. Elle se caractérise par une dégénérescence progressive et asymétrique d’un groupe spécifique de muscles striés squelettiques, dont principalement les muscles faciaux, scapulaires et huméraux. D’un point de vue génétique, la FSHD est une maladie multifactorielle qui résulte d’évènements génétiques situés sur la région sub-télomérique du chromosome 4, ainsi que d’évènements épigénétiques altérant l’organisation chromatinienne du locus 4q35. Ces anomalies provoquent une relaxation chromatinienne et une surexpression de la majorité des gènes du locus 4q35, dont DUX4, gène majeur impliqué dans la FSHD. Les répercussions de l’ensemble de ces altérations se traduisent notamment par une dérégulation de la signature transcriptionnelle des myoblastes primaires issus des patients FSHD, et par des anomalies de leur différenciation myogénique in vitro et leur hypersensibilité au stress oxydant. Plusieurs aspects de la maladie demeurent incompris, et la complexité de cette myopathie rend difficile le choix d’une stratégie thérapeutique optimale. Cependant, la découverte des outils de l’édition du génome et la multiplication de leurs applications à visée thérapeutique dans le cadre de maladies humaines, notamment les myopathies, ouvre de nouvelles perspectives pour la FSHD qui reste, jusque-là, incurable.Le travail de thèse a concerné, dans un premier temps, l’implication des dommages de l’ADN et du stress oxydant dans la pathophysiologie de la FSHD. Nous avons mis en évidence l’omniprésence de ces caractéristiques cellulaires dans les myoblastes FSHD, leur lien à l’expression aberrante de DUX4 et leur participation à la morphologie défectueuse des myotubes FSHD in vitro. Dans un second temps, le travail de thèse a consisté à concevoir et à développer des outils de l’édition génomique et épigénomique, capables de cibler spécifiquement un des évènements génétiques causal de la FSHD, le variant pathogénique 4qA161 touchant un site d’attachement à la matrice nucléaire, FR-MAR. A partir de ces outils développés, deux stratégies de corrections génomique et épigénomique à visée thérapeutique peuvent être alors envisagées in vitro, ayant pour but ultime de rétablir la fonction d’insulation de FR-MAR et la conformation chromatinienne de la région 4q35.

National audience

Afin d’étudier le rôle de la voie de signalisation de l’hormone Fsh au cours de l’initiationde la gamétogenèse chez les poissons, une lignée de poissons zèbres transgéniques déficientepour le récepteur de la Fsh (Fshr) a été généré par la technique CRISPR/Cas 9. Nous avonsdémontré que les mutations générées dans deux familles indépendantes étaient différentesmais transmises de manière stable des générations F1 à F2. Les individus hétérozygotes F1 etF2 montrent un sexe ratio nettement biaisé en faveur des femelles alors que les individus F2homozygotes se différencient en mâles. Ces observations suggèrent que le récepteur de la Fshserait défavorable à la différenciation ovarienne en fonction du dosage génique mais aussinon-indispensable à la différenciation des cellules de Sertoli. D’autre part, l’inversion sexuelledes individus homozygotes en mâles indique que Fshr pourrait être nécessaire à la survie, à lamultiplication, et/ou à la différenciation des ovocytes primaires prévitellogéniques dès lestade alevin.

Gene therapy is a promising therapeutic strategy for the monogenic diseases treatment. If the first approaches, called additive, have relied on the use of viral vectors, a growing share is now turning to gene editing. Less than a decade after its characterization, the CRISPR-Cas9 system has moved gene editing to a clinical stage. However, in the same period of time, several questions have been raised regarding the genotoxicity that can be induced by Cas9. An emerging literature points to the risk of genotoxicity at the targeted site. The thesis work presented here is part of this theme. The first part of the study aimed to describe the genotoxicity induced by a single double-stranded break made by Cas9. Characterization of the effects was done both at the nucleotide level, by monitoring the HDR / InDels balance, but also at the chromosome scale. The monitoring of chromosomal integrity has brought to light a new risk of genotoxicity that was not characterized. A sensitive and specific detection system for this risk has been developed to further characterize it. The second objective was to address the limitations of unwanted genotoxicity by developing a safer and more efficient gene editing method through the use of a single single-stranded breakage by Cas9D10A-nickase., La thérapie génique est une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement des maladies monogéniques. Si les premières approches, dites additives, ont reposées sur l’utilisation de vecteurs viraux, une part grandissante se tourne désormais vers l’édition génique. Celle-ci est permise par la mise au point de nouvelles générations d’endonucléases, et en particulier le système CRISPR-Cas9. Moins d’une décennie après sa caractérisation, le système CRISPR-Cas9 a permis de faire passer l’édition génique à un stade clinique. Toutefois, dans le même laps de temps, plusieurs interrogations ont été soulevées vis-à-vis de la génotoxicité pouvant être induite par la Cas9. Une littérature émergente pointe le risque de génotoxicité au site ciblé. Le travail de thèse présentée ici s’inscrit dans cette thématique. La première partie de l’étude a eu pour objectif de décrire la génotoxicité induite par une unique cassure double-brin faite par la Cas9. La caractérisation des effets a été faite à la fois à l’échelle nucléotidique, par le suivi de la balance HDR / InDels, mais également à l’échelle du chromosome. Le suivi de l’intégrité chromosomique a permis de mettre en lumière un nouveau risque de génotoxicité encore non-caractérisé. Un système de détection sensible et spécifique de ce risque a été mis au point pour continuer de le caractériser. Le second objectif a été de répondre aux limites soulevées par la génotoxicité non-voulus, en mettant au point une méthode d’édition génique plus sûre et aussi efficace, via l’utilisation d’une unique cassure simple-brin par la Cas9D10A -nickase.

Mycoplasmas are small pathogenic bacteria that are characterized by reduced genomes of about 1 Mbp with a low G+C content. The interest of the scientific community towards these species has been recently renewed by successful synthesis of their genome and transplantation experiments. These new genetic tools opened the way to further applications and developments for large-scale genome engineering programmes. CRISPR/Cas systems are natural systems that provide bacteria and archaea with an adaptive defense mechanism against invading nucleic acids. The CRISPR system from Streptococcus pyogenes includes an endonuclease (SpCas9) and two CRISPR RNAs (crRNA et tracrRNA) which role are to drive Cas9 to a target sequence. Target recognition depends on a specific pairing of the crRNA and the presence of a motif named protospacer adjacent motif (PAM). After recognition, Cas9 cleaves the targeted DNA. From the natural S. pyogenes system, a simplified genetic tool including Cas9 and a guide RNA (gRNA) was developed for many organisms . The first goal of my thesis was to combine the synthetic biology methods of genome cloning in yeast and back transplantation into recipient cells with a CRISPR/Cas9 tool for efficient engineering of mycoplasma genomes cloned in yeast. We succeeded in removing genes and genomic regions in three different species, Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum and M. pneumoniae. Then, in order to develop a system optimized for mycoplasma genome editing, we characterized a natural CRISPR/Cas9 system derived from Mycoplasma gallisepticum (Mg). Using a combination of in silico and in vivo approaches, MgCas9 PAM sequence was characterized as NNNAAAA. We then started to develop a minimal CRISPR/Cas system from M. gallisepticum for direct genome editing in mollicutes. Thus we introduced MgCas9 encoding gene in Mmc and tried to activate it with a newly designed gRNA, a chimeric molecule between the crRNA and the tracrRNA of M. gallisepticum, without success yet., Les mycoplasmes sont des bactéries pathogènes, dotées de petits génomes d’environ 1Mbp, avec une faible teneur en G+C. L'intérêt de la communauté scientifique pour ces bactéries a été récemment renouvelé par des avancées dans les domaines de la synthèse et de la transplantation de génomes. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à l'ingénierie génomique à grande échelle des mycoplasmes. Les systèmes CRISPR/Cas sont des systèmes de défense adaptatifs procaryotes contre les acides nucléiques invasifs. Le système CRISPR de Streptococcus pyogenes est composé d’une endonucléase (SpCas9) et de deux CRISPR ARNs (crRNA et tracrRNA) qui dirigent Cas9 vers sa séquence d’ADN cible. La reconnaissance de l’ADN cible se fait par appariement du crRNA et de la présence en aval d’une séquence nommée protospacer adjacent motif (PAM). Apres cette reconnaissance, Cas9 coupe l’ADN cible. A partir de ce système, un outil génétique simplifié composé de Cas9 et d’un ARN guide (gRNA) a été développé pour de nombreux organismes. Le premier objectif de ma thèse était de combiner les méthodes de biologie synthétique de clonage et de la transplantation de génomes avec les outils CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie des génomes de mycoplasmes clonés dans la levure. Nous avons réussi à utiliser cette approche pour enlever des gènes et des régions génomiques dans trois espèces: Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum et M. pneumoniae. Afin de développer un système plus adapté aux mycoplasmes, nous avons ensuite caractérisé le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mg). En utilisant une combinaison d'approches in silico et in vivo, la séquence PAM de MgCas9 a été caractérisée comme NNNAAAA. Nous avons alors entrepris de développer un système CRISPR/Cas minimal de M. gallisepticum pour une utilisation directe dans les cellules de mollicutes: le gène codant MgCas9 a été introduit dans le génome de Mmc, mais son activation avec un gRNA chimère entre le crRNA et le tracrRNA de M. gallisepticum n’a pas été obtenue pour le moment.