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Contrary to the vast majority of bacteria that possesses a unique chromosome, Vibrio cholerae, the pathogenic agent responsible for cholera disease, contains a genome divided into two replicons: a main chromosome (Chr1) and a secondary chromosome (Chr2). Secondary chromosomes appeared independently in many bacterial phylum and are often associated with pathogenic or symbiotic traits (i.e. Leptospira, Agrobacterium, Burkholderia). Secondary chromosomes result from the acquisition and domestication of large plasmids1. Indeed, some “megaplasmids” have cohabited with their host over a long evolutionary period and became an obligatory component of their host’s genome, essential for their normal metabolism. During their domestication, secondary chromosomes acquired different features allowing their maintenance through cell divisions ensuring their vertical transfer to subsequent generations. The study of multipartite genome bacteria allows questioning the selective benefit of an organism to possess several chromosomes. In addition, how can a horizontally acquired genetic element connect to a pre-established genetic network? One of the major steps in megaplasmid domestication is their integration into the host cell cycle. In V.cholerae, Chr2 replication is coordinated with that of Chr1. Chr1, which is 3 times larger than Chr2, is initiated first and when 2/3 has replicated, an initiation signal triggers the replication of Chr2 so that both chromosomes terminate replicating concomitantly. This initiation signal is emitted when the replication fork passes through a non-coding Chr1 locus named crtS (Chr2 Replication Triggering Site)2,3. However, the molecular mechanism behind this initiation signal is still very elusive. Our work aims to elucidate the mechanism of this novel bacterial replicative checkpoint. In order to tackle this problem we developed several cutting-edge approaches to study the mechanism at different levels: -Genomic scale: high resolution ChIPseq -Single cell: fluorescent microscopy -Molecular: CryoEM.; Contrairement à la grande majorité des bactéries qui possèdent un chromosome unique, Vibrio cholerae, l'agent pathogène responsable de la maladie du choléra, contient un génome divisé en deux réplicons : un chromosome principal (Chr1) et un chromosome secondaire (Chr2). Les chromosomes secondaires sont apparus indépendamment dans de nombreux phylum bactériens et sont souvent associés à des caractères pathogènes ou symbiotiques (par exemple Leptospira, Agrobacterium, Burkholderia). Les chromosomes secondaires résultent de l'acquisition et de la domestication de grands plasmides. En effet, certains "mégaplasmides" ont cohabité avec leur hôte au cours d'une longue période évolutive et sont devenus un composant essentiel du génome de leur hôte. Au cours de leur domestication, les chromosomes secondaires ont acquis différentes caractéristiques permettant leur maintien à travers les divisions cellulaires assurant leur transfert vertical aux générations suivantes. L'étude des bactéries à génome multipartite permet de s'interroger sur le bénéfice sélectif d'un organisme à posséder plusieurs chromosomes. Ou encore, comment un élément génétique acquis horizontalement peut-il se connecter à un réseau génétique préétabli ? L'une des principales étapes de la domestication des mégaplasmides est leur intégration dans le cycle cellulaire de l'hôte. Chez V.cholerae, la réplication de Chr2 est coordonnée avec celle de Chr1. Chr1, qui est 3 fois plus grand que Chr2, est initié en premier et lorsque les 2/3 se sont répliqués, un signal d'initiation déclenche la réplication de Chr2 de sorte que les deux chromosomes terminent leur réplication de façon concomitante. Ce signal d'initiation est émis lorsque la fourche de réplication passe par un locus non codant de Chr1 nommé crtS (Chr2 Replication Triggering Site)2,3. Cependant, le mécanisme moléculaire à l'origine de ce signal d'initiation est encore très difficile à élucider. Notre travail vise à élucider le mécanisme de ce nouveau point de contrôle bactérien. Afin de s'attaquer à ce problème, nous avons développé plusieurs approches de pointe pour étudier le mécanisme à différents niveaux : -Echelle génomique : ChIPseq à haute résolution -Single-cell : microscopie à fluorescence -Moléculaire : CryoEM.