Search

Le centrosome est le principal centre d'organisation des microtubules des cellules animales. Il se compose d'une paire de centrioles entourée d'une matrice de protéines appelée matériel péricentriolaire (PCM). Les anomalies de centrosomes sont associées à un grand nombre de pathologies humaines telles que la microcéphalie ou le cancer. Le but de ce travail est d'analyser le type et la fréquence des anomalies de centrosomes dans le cancer épithélial de l'ovaire (CEO) qui le cancer gynécologique le plus létal dans le monde. Nous avons commencé notre étude en analysant le nombre moyen de centrosome par noyau (Index Centrosome/Noyau = ICN) et par tumeur dans une cohorte de 100 patientes atteintes du cancer de l’ovaire. Nous avons constaté que 80 % des tumeurs contenaient un ICN élevé par rapport aux tissus sains suggérant qu’un nombre augmenté de centrosomes est présent dans les tumeurs ovariennes. De plus, nous avons également décrit différentes anomalies structurelles du centrosome qui semblent également être associées à un niveau d’ICN élevé. L’intégration aux données cliniques montrent que le niveau d’ICN a un impact avec la survie globale des patientes : un faible ICN semble être lié à une survie plus faible et à une rechute plus rapide. En utilisant des xénogreffes (PDXs) et des modèles cellulaires de cancer de l'ovaire permettant de manipuler le nombre de centrosomes, nous avons constaté qu'un ICN élevé pouvait avoir un impact positif sur la réponse à la chimiothérapie et inhiber la dissémination des cellules cancéreuses. Ces résultats montrent que l’augmentation du nombre de centrosomes peut impacter positivement la progression tumorale.

The T cell receptor (TCR) is assembled during the early development of T lymphocytes in the thymus after complexe genetic recombinations. The rearrangement of a functional TCR beta-chain (pre-TCR) triggers intracellular signaling pathways that cause the survival, expansion and maturation of thymocytes. The commitment of the TCR to the surface of mature T cells after antigen recognition also leads to proliferation allowing the development of effective immune responses. These cellular events go along with significant reorganization of the microtubule networks and a redistribution of molecular motors, such as dynein, which transport the cellular structures via this network. The molecular mechanisms and physiological consequences of the reorganization are poorly understood in T cells. Lis1 is a dynein regulator involved in neuronal migration and stem cells proliferation during neural development. Its role in lymphoid tissue is still unknown. In this study, we used mouse models specifically Lis1-deficient in T cells to study the molecular, cellular and physiological functions of this protein in T cells. We identifiy that Lis1 plays an essential role in the early development of T cells and in the homeostasis of mature cells. Lis1 deficiency does not affect beta-chain rearrangement or signaling events triggered by pre-TCR or TCR, but leads to the blockage of thymocyte cell division that have undergone beta-selection or mature T cells stimulated. Fine analysis of mitosis indicates that the deficiency of Lis1 strongly slows down the mitotic process, counteracts the cell changes leading to the metaphase and leads to asymmetric distribution of the genetic material in the daughter cells. Microtubule networks analysis shows that the absence of Lis1 induces centrosomes amplification and increase of multipolar cells during mitosis. Finally, we show that Lis1 promotes the dynein-dynactin interaction, indicating that Lis1 plays an important role in T cells to bind dynein to the cell structures it carries. In conclusion, we here described that Lis1 is important for the distribution of genetic material during double negative thymocyte and peripheral lymphocyte proliferation.; Les récepteurs d'antigènes des lymphocytes T (TCR) sont assemblés au cours du développement précoce de ces cellules dans le thymus suite à des recombinaisons complexes de gènes. Le réarrangement d'une chaine beta des TCR fonctionnelle (pré-TCR) déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui entrainent la survie, l'expansion et la maturation des thymocytes. Par ailleurs, l'engagement des TCR à la surface des lymphocytes T (LT) matures par des antigènes conduit également à des cycles de prolifération qui permettent le développement de réponses immunitaires efficaces. Ces évènements cellulaires s'accompagnent de remaniements importants du réseau de microtubules et une redistribution des moteurs moléculaires, tels que la dynéine, qui véhiculent les structures cellulaires sur ces réseaux. Les mécanismes moléculaires et les conséquences physiologiques de ces remaniements sont peu connus dans les LT. Lis1 est un régulateur de la dynéine qui est mis à contribution dans la migration neuronale et la prolifération des cellules souches au cours du développement neural. Son rôle au sein du tissu lymphoïde est peu connu. Dans ce travail, nous avons utilisé des modèles de souris spécifiquement déficients en Lis1 dans les LT afin d'étudier les fonctions moléculaires, cellulaires et physiologiques de cette protéine dans ces cellules. Nous montrons que Lis1 joue un rôle essentiel dans le développement précoce des LT et dans l'homéostasie des LT matures. La déficience en Lis1 n'affecte pas le réarrangement de la chaine beta ou les évènements de signalisation déclenchés par le pré-TCR ou le TCR. Cependant, la prolifération des thymocytes ayant passé la beta-sélection ou des LT matures dont le TCR a été engagé, est fortement impactée. L'analyse fine de la mitose indique que la déficience en Lis1 ralentit fortement le processus mitotique, contrarie les remaniements intracellulaires conduisant à la métaphase et entraîne la répartition asymétrique du matériel génétique dans les cellules filles. L'analyse des réseaux de microtubules montre que l'absence de Lis1 entraîne l'amplification du nombre de centrosomes et l'augmentation des cellules multipolaires au cours de la mitose. Enfin, nous montrons que Lis1 favorise l'interaction de la dynéine avec la dynactine, indiquant que Lis1 joue un rôle important dans les LT pour relier la dynéine aux structures cellulaires qu'elle véhicule. En conclusion, nous avons montré que Lis1 est importante dans la distribution du matériel génétique au cours de la prolifération des thymocytes doubles négatifs et des lymphocytes T périphériques.

The T cell receptor (TCR) is assembled during the early development of T lymphocytes in the thymus after complexe genetic recombinations. The rearrangement of a functional TCR beta-chain (pre-TCR) triggers intracellular signaling pathways that cause the survival, expansion and maturation of thymocytes. The commitment of the TCR to the surface of mature T cells after antigen recognition also leads to proliferation allowing the development of effective immune responses. These cellular events go along with significant reorganization of the microtubule networks and a redistribution of molecular motors, such as dynein, which transport the cellular structures via this network. The molecular mechanisms and physiological consequences of the reorganization are poorly understood in T cells. Lis1 is a dynein regulator involved in neuronal migration and stem cells proliferation during neural development. Its role in lymphoid tissue is still unknown. In this study, we used mouse models specifically Lis1-deficient in T cells to study the molecular, cellular and physiological functions of this protein in T cells. We identifiy that Lis1 plays an essential role in the early development of T cells and in the homeostasis of mature cells. Lis1 deficiency does not affect beta-chain rearrangement or signaling events triggered by pre-TCR or TCR, but leads to the blockage of thymocyte cell division that have undergone beta-selection or mature T cells stimulated. Fine analysis of mitosis indicates that the deficiency of Lis1 strongly slows down the mitotic process, counteracts the cell changes leading to the metaphase and leads to asymmetric distribution of the genetic material in the daughter cells. Microtubule networks analysis shows that the absence of Lis1 induces centrosomes amplification and increase of multipolar cells during mitosis. Finally, we show that Lis1 promotes the dynein-dynactin interaction, indicating that Lis1 plays an important role in T cells to bind dynein to the cell structures it carries. In conclusion, we here described that Lis1 is important for the distribution of genetic material during double negative thymocyte and peripheral lymphocyte proliferation., Les récepteurs d'antigènes des lymphocytes T (TCR) sont assemblés au cours du développement précoce de ces cellules dans le thymus suite à des recombinaisons complexes de gènes. Le réarrangement d'une chaine beta des TCR fonctionnelle (pré-TCR) déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui entrainent la survie, l'expansion et la maturation des thymocytes. Par ailleurs, l'engagement des TCR à la surface des lymphocytes T (LT) matures par des antigènes conduit également à des cycles de prolifération qui permettent le développement de réponses immunitaires efficaces. Ces évènements cellulaires s'accompagnent de remaniements importants du réseau de microtubules et une redistribution des moteurs moléculaires, tels que la dynéine, qui véhiculent les structures cellulaires sur ces réseaux. Les mécanismes moléculaires et les conséquences physiologiques de ces remaniements sont peu connus dans les LT. Lis1 est un régulateur de la dynéine qui est mis à contribution dans la migration neuronale et la prolifération des cellules souches au cours du développement neural. Son rôle au sein du tissu lymphoïde est peu connu. Dans ce travail, nous avons utilisé des modèles de souris spécifiquement déficients en Lis1 dans les LT afin d'étudier les fonctions moléculaires, cellulaires et physiologiques de cette protéine dans ces cellules. Nous montrons que Lis1 joue un rôle essentiel dans le développement précoce des LT et dans l'homéostasie des LT matures. La déficience en Lis1 n'affecte pas le réarrangement de la chaine beta ou les évènements de signalisation déclenchés par le pré-TCR ou le TCR. Cependant, la prolifération des thymocytes ayant passé la beta-sélection ou des LT matures dont le TCR a été engagé, est fortement impactée. L'analyse fine de la mitose indique que la déficience en Lis1 ralentit fortement le processus mitotique, contrarie les remaniements intracellulaires conduisant à la métaphase et entraîne la répartition asymétrique du matériel génétique dans les cellules filles. L'analyse des réseaux de microtubules montre que l'absence de Lis1 entraîne l'amplification du nombre de centrosomes et l'augmentation des cellules multipolaires au cours de la mitose. Enfin, nous montrons que Lis1 favorise l'interaction de la dynéine avec la dynactine, indiquant que Lis1 joue un rôle important dans les LT pour relier la dynéine aux structures cellulaires qu'elle véhicule. En conclusion, nous avons montré que Lis1 est importante dans la distribution du matériel génétique au cours de la prolifération des thymocytes doubles négatifs et des lymphocytes T périphériques.

L’organisation cellulaire repose sur une distribution organisée des macromolécules dans la cellule. Deux ARNm, cen et ik2, montrent une colocalisation parfaite aux centrosomes. Ces deux gènes font partie du même locus sur le chromosome 2L de Drosophila melanogaster et leur région 3’ non traduite (3’UTR) se chevauchent. Dans le mutant Cen, le transport de Ik2 est perturbé, mais dans le mutant Ik2, la localisation de cen n’est aucunement affectée. Ces résultats suggèrent que cen est le régulateur principal de la co-localisation de cen et ik2 aux centrosomes et que cette co-localisation se produit par un mécanisme impliquant la région complémentaire au niveau du 3’UTR des deux transcrits. La localisation de cen au niveau des centrosomes dans les cellules épithéliales de l’embryon est conservée dans différentes espèces de Drosophile : D. melanogater, D. simulans, D. virilis et D. mojavensis. Cependant, la localisation de ik2 n’est pas conservée dans D. virilis et D. mojavensis, deux espèces dont les gènes cen et ik2 sont dissociés dans le génome. Ces résultats suggèrent que la proximité de Cen et Ik2 dans le génome est importante afin d’avoir un événement de co-localisation de ces deux transcrits. J’ai généré différentes lignées de mouches transgéniques dans lesquelles un transgène contenant la séquence GFP fusionnée à différentes partie de Cen (partie codante, 3’UTR, Cod+3’UTR) qui sont sous le contrôle du promoteur UAS et qui sont gal4 inductibles. La région codante de l’ARNm cen était suffisante pour avoir un ciblage précis du transcrit aux centrosomes., Messenger RNA (mRNA) localization plays a key role in establishing cellular architecture and function. The centrocortin (cen) and IkB Kinase-like 2 (ik2) mRNAs are co-localized to centrosomes in embryonic epithelial cells. Interestingly, both of these genes are organized in a head-to-head configuration in the genome, with their 3’ untranslated regions (3’UTRs) overlapping on opposite DNA strands. Here we show that gene positioning of cen and ik2 is important for the co-localization of these transcripts during Drosophila embryogenesis. The localization of cen is conserved within the Drosophila phylogeny and ik2 cannot localize when it is separated from the cen locus. Also, loss of function mutants of cen show a complete loss of ik2 localization, proposing that cen is the main driver of the co-localization. Structure-function analysis revealed that the coding region of cen is necessary for its centrosomal targeting, suggesting that a cis-regulatory motif that drives its localization is located in the coding region. This study reveals for the first time the importance of gene positioning for RNA localization. We suggest a model where cen mRNA is the main driver of centrosomal localization, which may occur through post-transcriptional interaction/annealing of these mRNAs via their 3’UTRs.

Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rôle crucial dans l’organisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus récemment, le rôle des centrosomes dans la régulation de l’entrée en mitose a été mis en évidence. Les centrosomes semblent également contribuer à l’activation du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions de l’ADN en servant de point de rencontre pour les régulateurs du cycle cellulaire et les gènes de réponse aux dommages à l’ADN. L’amplification du nombre de centrosomes est une caractéristique des cellules tumorales mais de façon intéressante, elle constitue aussi une réponse des cellules aux dommages à l’ADN. Les mécanismes qui régulent l’homéostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l’ADN, le recrutement et/ou l’activation au niveau des centrosomes des kinases impliquées dans les voies de signalisation de ce point de contrôle ont été étudiés par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos résultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En réponse à l’activation du point de contrôle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqués dans la régulation de ce point de contrôle, une analyse comparative des protéomes de centrosomes purifiés a également été réalisée par spectrométrie de masse. Pour étudier plus particulièrement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons développer des outils moléculaires qui serviront à déterminer le rôle de la sous population de CHK2 localisée aux centrosomes 1) dans la régulation de l’entrée en mitose au cours d’un cycle normal 2) dans l’activation et la stabilité du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions l’ADN et 3) dans l’homéostasie et la dynamiques des centrosomes en réponse aux dommages à l’ADN. Cette étude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la réponse cellulaire au stress génotoxiques anti-cancereux et de révéler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2., Centrosomes function primarily as microtubule-organizing centres that play a crucial rôle in the equal segregation of chromosomes by organizing the bipolar spindle during mitosis. Recent studies have revealed the involvement of centrosomes in regulating G2/M transition during normal cell cycle progression. Moreover, increasing evidence suggests that centrosomes also play roles in the DNA damage response and cell cycle checkpoint signalling by serving as “meeting points” where DNA-damage-responsive genes and cell cycle regulators communicate. Numerical centrosome aberrations, or centrosome amplification, is a common feature of most human cancers that promotes aneuploidy and is involved in tumorigenesis as well as tumor progression. Interestingly, centrosome amplification and fragmentation have also been shown to constitute a cellular response to impaired DNA integrity that triggers cell death by mitotic failure. Although their roles are critical in tumorigenesis and the DNA damage response, the mechanisms that regulate centrosome homeostasis and dynamics remain poorly understood. To gain a better understanding of the role of the centrosomes in checkpoint regulation at G2/M transition in response to DNA damage; the recruitment and/or centrosomal activation of the kinases implicated in this checkpoint pathways were studied by indirect immunofluorescence on HeLaS3 cells or western blot on purified centrosomal fractions. Our results showed that the kinases CHK1, CHK2, ATM and ATR are activated at the centrosomes in cell synchronised in G2. However, after activation of the G2/M checkpoint, these activated kinases moved from centrosomes. Finally, to identify new centrosomal actors potentially involved in the regulation of this checkpoint, a comparative analysis of the proteome of purified centrosomes was also realized by mass spectrometry. To study more specifically the function of CHK2 at the centrosomes, we developped molecular tools wich will serve to determine the role of the sub-population of CHK2 localized at the centrosomes in 1) in regulating entry into mitosis during unperturbed cell cycle progression, 2) in checkpoint regulation at G2/M transition in response to DNA damage induced by ionizing radiations and genotoxic drugs and 3) in centrosomal homeostasis and dynamics by regulating centrosomal amplification, fragmentation and clustering during normal cell cycle progression and in response to genotoxic drugs. This study will further elucidate the importance of centrosomes in regulating the cell response to genotoxic stress induced by anti-cancer treatments and reveal potential new functions for the kinase CHK2 in unperturbed cell cycle progression and in response to DNA damage.

Chez les eucaryotes, le noyau renferme le matériel génétique de la cellule. Il est isolé dureste de la cellule par une double bicouche lipidique, l’enveloppe nucléaire (EN). Les échangesentre le noyau et le cytoplasme se font par l’intermédiaire des pores nucléaires ou NPCs (pourNuclear Pore Complexes).Les NPCs sont composés d’une trentaine de protéines appelées nucléoporines (ou Nups)organisées en sous complexes. Le complexe hNup107-160 est le sous complexe majeur , par sataille, des pores nucléaires. Ce complexe est conservé au cours de l’évolution, malgré une certainevariabilité entre espèces. Il est composé de neuf protéines distinctes (hNup160, hNup133,hNup107, hNup96, hNup85, hNup43, hNup37, hSec13 et hSeh1) et fait l’objet des études menéesau laboratoire.En interphase, le complexe hNup107-160, est localisé de façon symétrique sur les facescytoplasmique et nucléaire des pores nucléaire. A ce stade, il est impliqué dans l’export des ARNmessagers et dans la biogénèse de novo des NPCs.Chez les vertébrés, la mitose est dite ouverte et nécessite la rupture de l’EN et ledésassemblage des NPCs. En fin de mitose, il y a reformation de l’EN autour des chromosomesdes deux cellules filles. A cette étape, le complexe hNup107-160 est essentiel au réassemblagedes NPCs. Durant la mitose, une fraction du complexe hNup107-160 est localisé auxkinétochores, structures impliquées dans l’ancrage des microtubules aux centromères deschromosomes mitotiques. Il a été démontré dans le laboratoire, que le domaine N-terminal dehNup133 interagit avec CENP-F, une protéines des kinétochores, spécifiquement localisé à l’ENen prophase.Dans le cadre de mes travaux, je me suis intéressée d’une part, au rôle de la protéinehNup133 lors de la transition G2/M. Ainsi, j’ai entrepris la production et la caractérisationd’anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine N-terminal de hNup133, impliqué dansl’interaction avec CENP-F. J’ai aussi contribué à montrer que cette nucléoporine recrute CENP-Fà l’EN en prophase. Cette interaction participe à la localisation de NudE/EL et la dynéinedynactineà l’EN. De plus, ce réseau moléculaire, participe à l’ancrage des centrosomes à l’EN.Enfin, nous avons aussi démontré que ce réseau agit de façon indépendante des protéinesRanBP2/BiCD2, récemment impliquées dans le positionnement des centrosomes à l’EN enprophase.D’autre part, j’ai étudié la dynamique des membres du complexe hNup107-160 en mitose,en utilisant la méthode de la FCCS (Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy). Cettetechnique permet de suivre in vivo la diffusion simultanée de deux protéines étiquetées par desfluorochromes différents. Lors de cette étude, j’ai d’abord validé l’application de la FLCS(Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy) aux signaux de FCCS dans le but d’éliminer lepassage de signal de la GFP dans le détecteur de la mCherry. Une fois la technique validée pourl’interaction entre hNup107 et hNup133 en mitose et en interphase, j’ai entrepris l’analyse desinteractions entre hNup107 et les autres membres du complexe.