Search

L'homéostasie cellulaire implique une régulation fine de la production ainsi que de l'élimination des protéines. La dérégulation de cette homéostasie entraîne des effets néfastes touchant de nombreuses voies de signalisation et de métabolisme et pouvant conduire à diverses maladies telles que le cancer ou la neurodégénérescence. De ce fait, la dégradation des protéines est un processus hautement contrôlé effectué par le système ubiquitine-protéasome (UPS) qui permet le ciblage, l’étiquetage et la dégradation des protéines mal repliées, endommagées ou en fin de vie. Le protéasome est un complexe multiprotéique vital présent dans toutes les cellules eucaryotes dont la biogenèse, la fonction de dégradation et la régulation dans le cytoplasme sont bien connues. Cependant, la fonction du protéasome dans le noyau, notamment en réponse au stress, est encore peu comprise. Les cellules ont développé de nombreux mécanismes adaptatifs en réponse à la variation de l'apport en nutriments comme l’augmentation de la dégradation et le recyclage des protéines. Chez l’humain, le protéasome est dégradé dans le cytoplasme par autophagie lors d’une privation de nutriments mais les mécanismes de régulation du protéasome nucléaire en réponse au stress métabolique restent peu connus. Nous avons trouvé que le protéasome 26S et la sous-unité régulatrice PSME3 forment des foyers nucléaires dans différents types cellulaires de mammifère en réponse à une privation en nutriments. Les foyers, nommés SIPAN pour Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, ne sont colocalisés avec aucune structure ou corps nucléaires connus. La formation des SIPAN est réversible lors d’une réintégration des nutriments, suggérant une réponse spécifique liée à un stress métabolique. La manipulation de la quantité d’acides aminés intracellulaire a révélé que les acides aminés non-essentiels jouent un rôle important dans la formation et la résolution des SIPAN. Une analyse métabolomique a permis de trouver des voies reliées au métabolisme des nucléotides et des acides aminés qui pourraient fournir des facteurs clés pour la dissipation des foyers du protéasome. Le fort dynamisme des SIPAN, la présence d’événements de fusion et leur instabilité vis-à-vis des conditions cellulaires suggèrent que les SIPAN résultent d’une séparation de phase liquide-liquide (LLPS). De plus, nous avons trouvé que l’ubiquitine conjuguée est présente dans les SIPAN et que l’ubiquitination et la déubiquitination semblent être impliquées dans la formation et la résolution, respectivement. Nous avons ensuite découvert que la perte du récepteur à l’ubiquitine RAD23B empêche la formation des SIPAN. En effet, les domaines de liaison au protéasome UBL et de liaison à l’ubiquitine UBA1/UBA2 sont nécessaires pour la formation des SIPAN. De manière intéressante, la perte de RAD23B ou du complexe régulateur PSME3 retarde l’induction de l’apoptose et promeut la survie cellulaire. Enfin, en utilisant un inducteur de l’apoptose, nous avons observé l’apparition de ces foyers du protéasome dans le noyau des cellules dont certaines caractéristiques sont similaires aux SIPAN. Notre étude aborde une question très importante dans la compréhension des rôles et du dynamisme du protéasome nucléaire, en particulier dans l'adaptation au stress, qui peut réguler le niveau des protéines nucléaires. De façon générale, cela nous aidera à mieux comprendre le rôle du protéasome dans l’homéostasie nucléaire et son implication dans les maladies humaines., Cellular homeostasis involves specific regulation of the production as well as the elimination of proteins. The deregulation of this equilibrium leads to harmful effects affecting many signaling and metabolic pathways and can lead to various diseases, such as cancer or neurodegeneration. Hence, protein degradation is a highly controlled process performed by the ubiquitin-proteasome system (UPS) that allows targeting, labeling and degradation of misfolded, damaged, or end-of-life proteins. The proteasome is a vital multiprotein complex found in all eukaryotic cells whose biogenesis, degradative function, and regulation in the cytoplasm are well known. However, the function of the proteasome in the nucleus, particularly in response to stress, is still poorly understood. Cells have evolved many adaptive mechanisms in response to varying nutrient supply such as increased protein degradation and recycling. In humans, the proteasome is degraded in the cytoplasm by autophagy during nutrient deprivation, but the regulatory mechanisms of the nuclear proteasome in response to metabolic stress remain poorly understood. We have found that the 26S proteasome and regulatory subunit PSME3 form nuclear foci in different mammalian cell types in response to nutrient deprivation. These foci, called SIPAN for Starvation-Induced Proteasome Assemblies in the Nucleus, do not colocalize with any known nuclear structures or bodies. The formation of SIPAN is reversible upon nutrient replenishment, suggesting a specific response to metabolic stress. Manipulation of the intracellular amino acid pool revealed that non-essential amino acids play important roles in the formation and resolution of SIPAN. A metabolomics study has identified pathways related to nucleotide and amino acid metabolism that may provide key factors for the dissipation of the proteasome foci. The strong dynamism of SIPAN, the presence of fusion events and their instability towards cellular conditions suggest that SIPAN result from liquid-liquid phase separation (LLPS). Additionally, we have found that conjugated ubiquitin is present in SIPAN and that ubiquitination and deubiquitination appear to be involved in their formation and resolution, respectively. We then discovered that the depletion of the ubiquitin receptor RAD23B prevents the formation of SIPAN. Indeed, the UBL proteasome binding domain and UBA1/UBA2 ubiquitin binding domains are required for SIPAN formation. Interestingly, the depletion of RAD23B or the proteasome regulatory particle PSME3 delays the induction of apoptosis and promotes cell survival. Finally, we found that an apoptosis-inducing agent promotes proteasome foci formation in the nucleus of cells, and these organelles share similarities with SIPAN. Our study addresses a very important question in understanding the roles and dynamism of the proteasome in the nucleus, specifically during stress adaptation, which can regulate the level of nuclear proteins. In general, this will help us to better understand the role of the proteasome in nuclear homeostasis and its involvement in human diseases.

L'inhibiteur de l'apoptose lié au chromosome X (XIAP) est une protéine antiapoptotique exprimée de manière ubiquitaire et est un puissant inhibiteur de l'apoptose en bloquant les formes actives des caspases-3, -7 et -9. D’autres fonctions de XIAP reposent sur son activité d'ubiquitine ligase impliquée dans la régulation d'importantes voies de signalisation et la transduction du signal des récepteurs de type NOD ; NOD1 et NOD2, jouant un rôle central dans l'immunité innée. Les mutations hémizygotes résultant en une perte de fonction du gène XIAP sont responsables de la survenue d’une maladie auto-inflammatoire dont le phénotype clinique englobe plusieurs de ces caractéristiques : une lymphohistiocytose hémophagocytaire (HLH), un syndrome d’activation macrophagique (MAS), une maladie inflammatoire de l'intestin mimant la maladie de Crohn. Bien que certaines études antérieures montrent que la suppression de XIAP induit l'activation de l'inflammasome NLRP3, les mécanismes physiopathologiques par lesquels ce déficit induit un syndrome autoinflammatoire ne sont pas définis. Ce projet vise à créer et caractériser une lignée cellulaire monocyte/macrophage THP-1 avec délétion de XIAP pour étudier les mécanismes moléculaires responsable de l'auto-inflammation dans les macrophages en utilisant le système CRISPR-Cas12. J'ai pu montrer que le déficit en XIAP est responsable de l’activation de l'inflammasome NLRP3 et d’un état auto-inflammatoire macrophagique indépendant de l'activité ubiquitine ligase de XIAP. Il m’a aussi été possible d'élucider la rétroaction positive de l’IL-1𝛽 et NF-κB sur l'inflammation. L'étude de ce modèle cellulaire nous permettra une meilleure compréhension des processus régulant l’activation de l'inflammasome et l’apoptose dans les macrophages déficients en XIAP., The X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein is an anti-apoptotic protein. It is ubiquitously expressed and is a potent inhibitor of programmed apoptosis by blocking the activated forms of caspases-3, -7, and -9. Additional functions of XIAP rely on its ubiquitin ligase activity involved in regulating important signaling pathways. Among other important functions is the role of XIAP in the signal transduction of the NOD-like receptors; NOD1 and NOD2, which play a pivotal role in innate immunity. Hemizygous loss of function mutations in XIAP leads to XIAP deficiency. It can be considered as an autoinflammatory disease since the clinical phenotype encompasses several auto-inflammatory features: Haemophagocytic Lymphohistiocytic syndrome (HLH), macrophage activation syndrom (MAS), an inflammatory bowel disease, mimicking Crohn's disease. Interestingly, while some earlier reports have shown that deletion of XIAP induces NLRP3 inflammasome activation, the precise mechanisms by which XIAP deficiency induces an autoinflammatory syndrome are not defined. This project aims to create and characterize a THP1 monocyte / macrophage cell line with a deletion of XIAP to show the state of hyperinflammation in macrophages using the CRISPR-Cas12 system to study the role of different domains of the gene. I have shown that XIAP deficiency triggers the NLRP3 inflammasome in THP-1 macrophages independently of its ubiquitin ligase activity. In addition, it was possible to elucidate the role of the IL-1𝛽 and NF-κB backloop on inflammation. Studying this cell model will help us refine a better understanding of the dynamics of inflammasome and apoptosis in macrophages with XIAP deficiency.

Ce travail a été soutenu par un financement de l’Icrad, un programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (ERANET), convention de subvention n° 862605.; International audience; African swine fever (ASF) is a highly pathogenic disease causing haemorrhagic fever in domestic and wild swine. It is responsible for numerous epizootics, particularly in Europe and Asia, causing major economic losses for the pig industry. African Swine Fever virus (ASFV) is the etiological agent responsible for this disease. It is a very large double-stranded DNA virus, encoding for over 150 proteins. Various studies have shown that there is a close relationship between the ability of some viral proteins to inhibit the type I interferon (IFNI) response and the attenuation and virulence processes of ASFV. This review describes the mechanisms of inhibition of the IFN-I response by ASFV proteins, which provide a molecular explanation of howASFV escapes the innate immune response.; La peste porcine africaine (PPA) est une maladie hautement pathogène causant une fièvre hémorragique chez les suidés domestiques et sauvages. Elle est responsable de nombreuses épizooties notamment en Europe et en Asie, causant de grandes pertes économiques pour la filière porcine. Le virus de la peste porcine africaine (ASFV) est l’agent étiologique responsable de cette maladie. C’est un virus avec un génome à ADN double brin de grande taille, codant pour plus de 150 protéines. Différents travaux ont montré qu’il existe une étroite relation entre la capacité de certaines protéines virales à inhiber la réponse interféron de type I (IFN-I) et les processus d’atténuation et de virulence pour l’ASFV. Cette revue décrit les mécanismes d’inhibition de la réponse IFN-I par les protéines d’ASFV permettant d’expliquer sur le plan moléculaire l’échappement à la réponse immunitaire innée.

In France, 380,000 new cancer diagnoses are made each year and 60% of these cancers are treated by radiotherapy, which uses ionizing radiation to destroy tumor cells. Radiation therapy causes undesirable radiotoxic effects on healthy tissues located in the radiation field. However, only 5 to 15% of patients develop these radiation-induced complications, which suggests the existence of individual radiosensitivity of healthy tissues. It is therefore important to investigate the genetic basis of this individual radiosensitivity and to characterize markers and biological tests predictive of this individual radiosensitivity. Pioneering research in the host laboratory has shown that quantification of radiation-induced apoptosis of conventional effector memory T4-lymphocytes (convT4-lymphocytes EM) from irradiated human peripheral blood allows population stratification. More recently, the host laboratory showed a genetic association of several polymorphisms in the TRAIL gene (TNFSF10) with apoptosis of convT4-lymphocytes EM (Schmitz et al, Baijer et al). However, the population of effector memory T-CD4 lymphocytes contains subpopulations of Th effectors, identifiable by flow cytometry, whose sensitivity to ionizing radiation is uncharacterized and which could specify a cellular basis for individual radiosensitivity. The first objective of my thesis work is to understand the effects of ionizing radiation on circulating and post-activation convT4-lymphocytes subpopulations. The second objective is to clarify the genetic association of TRAIL gene polymorphisms with radiation-induced apoptosis of convT4-lymphocytes EM subpopulations and to search for other genome-wide genetic polymorphisms associated with the radiation-induced apoptosis phenotype of convT4-lymphocytes EM. The results presented in my thesis show that the convT4-lymphocytes EM population exhibits heterogeneity in the radiation-induced apoptosis responses in response to irradiation and reveal in all individuals, a CCR6+CD127+ EM convT4-lymphocytes population that is resistant to radiation-induced apoptosis and a CCR6-EM population that is sensitive to radiation-induced apoptosis. Irradiation induces in convT4-lymphocytes a decrease in the expression of surface receptors CD62L, CCR6 and CD127 which is responsible for an increase in the proportion of radiosensitive convT4-lymphocytes populations: CD62L-CCR6-CD127-. We demonstrate that in-vitro stimulation protects LT-CD4 from radiation-induced apoptosis, and that an irradiation dose of 2 Gy does not impact LT-CD4 proliferation. At the genetic level, the study of the association of the polymorphism (rs1131532) of the TRAIL gene (TNSF10) was specified in the subpopulations of convT4-lymphocytes EM: Th1, Th2, non-polarized Th, Th9, Th17 and Th1-Th17. The presented results demonstrate the association of rs1131532 with the radiation-induced apoptosis phenotype of convT4-lymphocytes EM and show that this association is significant in the Th1, Th2 and Th9/Th17 effector population. Finally, the genome-wide association study (GWAS) with the radiation-induced apoptosis of convT4-lymphocytes EM identifies a suggestive signal on chromosomes 2, 7, 20 and 22, but does not reach the significance threshold.; En France, 380 000 nouveaux diagnostics de cancer sont posés chaque année et 60% de ces cancers sont traités par radiothérapie. La radiothérapie utilise les rayonnements ionisants pour détruire les cellules tumorales. La radiothérapie engendre des effets radiotoxiques indésirables sur les tissus sains situés dans le champ d’irradiation. Cependant, seulement 5 à 15% des patients développent ces complications radio-induites ce qui suggère l’existence une radiosensibilité individuelle des tissus sains. Il est donc important de rechercher les bases génétiques de cette radiosensibilité individuelle et de caractériser des marqueurs et des tests biologiques prédictifs de cette radiosensibilité individuelle. Les recherches pionnières réalisées par le laboratoire d’accueil ont montré que la quantification de l’apoptose radio-induite des lymphocytes-T-CD4 conventionnel effecteurs mémoires (LT-CD4conv EM) à partir du sang périphérique humain irradié permettait de stratifier la population. Plus récemment, le laboratoire d’accueil a montré une association génétique de plusieurs polymorphismes du gène TRAIL (TNFSF10) avec l’apoptose des LT-CD4conv EM (Schmitz et al, Baijer et al). Toutefois, la population de lymphocytes-T-CD4 effecteurs mémoires contient des sous-populations d’effecteurs Th, identifiables par cytométrie de flux, dont la sensibilité aux rayonnements ionisants n’est pas caractérisée et qui pourrait préciser une base cellulaire de la radiosensibilité individuelle. Le premier objectif de mon travail de thèse est de comprendre les effets des rayonnements ionisants sur les sous-populations de LT-CD4conv circulantes et après une activation. Le second objectif est d’une part, de préciser l’association génétique des polymorphismes du gène TRAIL à l’apoptose radio-induite des sous-populations de LT-CD4conv EM et, d’autre part, de rechercher d’autres polymorphismes génétiques sur l’ensemble du génome qui seraient associés à l'apoptose radio-induite des LT-CD4conv EM. Les résultats présentés de ma thèse montrent que la population LT-CD4conv EM présente, en réponse à l’irradiation, une hétérogénéité de sensibilité d’apoptose radio-induite et mettent en évidence chez tous les individus, une population de LT-CD4conv CCR6+CD127+ EM et CCR6-EM, respectivement résistante et sensible à l’apoptose radio-induite. L’irradiation induit dans les LT-CD4conv une diminution de l’expression des récepteurs de surface CD62L, CCR6 et CD127. Nous démontrons que la stimulation in-vitro protège les LT-CD4 de l’apoptose radio-induite, et qu’une dose d’irradiation de 2 Gy n’impacte pas la prolifération des LT-CD4. Au niveau génétique, l’étude de l’association du polymorphisme (rs1131532) du gène TRAIL (TNSF10) a été précisée dans les sous-populations de LT-CD4conv EM: Th1, Th2, Th non polarisé, Th9, et Th17 (CXCR3+). Enfin, l’étude d’association pan-génomique (GWAS) à l’apoptose radio-induite des LT-CD4conv EM identifie un signal suggestif sur les chromosomes 2, 7, 20 et 22, mais n’atteignant pas le seuil de significativité.

Le remodelage de la membrane plasmique de la cellule-hôte est une des stratégies d’évasion immunitaire utilisée par le VIH-1 pour persister chez un hôte. Une des protéines accessoires du VIH-1, la protéine virale U (Vpu), joue un rôle important dans ce processus en régulant négativement l’expression de plusieurs protéines de surface. Lors d’une étude de protéomique quantitative du protéome de la membrane plasmique des cellules T exprimant Vpu de manière inductible, nous avons identifié le cluster de différenciation 47 (CD47) comme une protéine potentiellement ciblée et régulée négativement par Vpu. CD47 est une protéine multifonctionnelle exprimée de manière ubiquitaire et impliquée dans plusieurs processus cellulaires, telle que l’inhibition de la phagocytose via son interaction avec la protéine régulatrice SIRPα (« signal-regulatory protein alpha »), un récepteur principalement exprimé par les cellules myéloïdes, telles que les macrophages. CD47 module aussi l’apoptose caspase-indépendante directement via son engagement induit par la thrombospondine 1 (TSP-1) ou des anticorps monoclonaux anti-CD47 spécifiques. Les macrophages sont des cellules cibles importantes du VIH-1 qui sont infectés depuis les phases initiales de l’infection malgré l’absence des virus macrophage (M)-tropiques. Plusieurs études ont suggéré que l’infection des macrophages pourrait être le résultat de la phagocytose des lymphocytes T CD4+ infectés. Dans ce contexte, nous avons examiné si la régulation négative de CD47 par Vpu durant l’infection de cellules T pouvait favoriser la phagocytose par les macrophages et ainsi contribuer à leur infection. Nous avons initialement confirmé que CD47 est régulée négativement par le VIH-1, de manière Vpu-dépendante en utilisant des souches virales de laboratoire ainsi que des souches transmises/fondatrices (T/F). De plus, la coculture des cellules T infectées avec des macrophages dérivés de monocytes (MDMs) a démontré que la régulation négative de CD47 par Vpu provoque la capture et la phagocytose des cellules T infectées par les MDMs. Bien que les MDMs soient peu susceptibles à l’infection par les virus T/F, des expériences de coculture de MDMs avec des cellules T infectées par un virus T/F ont montré l’infection des MDMs et la relâche de particules infectieuses. Sur le plan du mécanistique, nous avons démontré que la déplétion de CD47 médiée par Vpu nécessite le domaine transmembranaire (TMD) de la protéine, ainsi que les motifs double-sérine (DSGNES, qui permet le recrutement du complexe E3 ubiquitine ligase SCFβTrCP1/2) et de trafic (ExxxLV) de Vpu. En effet, Vpu forme un complexe avec CD47 via son TMD et cible CD47 pour la dégradation lysosomale, ce qui est cohérent avec un mode d’action par lequel Vpu perturbe le trafic et/ou le renouvellement de CD47 à la membrane plasmique. Pour mieux définir les implications fonctionnelles de la régulation négative de CD47 par Vpu, nous avons par la suite évalué si celle-ci a un effet sur l’apoptose. Ainsi, nous avons confirmé que l’anticorps monoclonal anti-CD47 (clone CC2C6) permet d’induire l’engagement de CD47 et provoquer l’apoptose de manière CD47-dépendante. De plus, nous avons démontré que Vpu inhibe la réponse de cellules T infectées à l’apoptose suite à l’engagement de CD47 par l’anticorps CC2C6. L’ensemble de nos résultats souligne une nouvelle fonction de Vpu dans l’infection des macrophages en augmentant la phagocytose de cellules T infectées via un processus qui implique la régulation négative de CD47 à la surface des lymphocytes. Cette découverte permettra de mettre en lumière de nouveaux mécanismes régissant la transmission intercellulaire du VIH-1 et l’établissement de l’infection dans les macrophages durant les phases précoces de l’infection, une étape clé favorisant une transmission virale systémique et potentiellement l’établissement de réservoirs viraux persistants. Nos résultats mettent en évidence également un nouveau mécanisme par lequel le VIH-1 module l’apoptose de cellules infectées pour optimiser sa réplication et sa dissémination. Une meilleure connaissance de ces processus est importante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutique et vaccinale contre l’infection par le VIH-1., Remodelling of the host cell plasma membrane is one of the strategies used by HIV to evade host immune responses. One of the accessory proteins of HIV-1, the viral protein U (Vpu), plays a key role in this process by downregulating the expression of several cell-surface molecules. In the context of plasma membrane profiling studies of T cells inducibly-expressing HIV-1 Vpu, we identified the cluster of differentiation 47 (CD47) as a putative target downregulated by Vpu. CD47 is a ubiquitously expressed multifunctional protein involved in many cellular processes, such as inhibition of phagocytosis via its interaction with the signal-regulatory protein alpha (SIRPα), a surface receptor mainly expressed by myeloid cells, such as macrophages. In addition, CD47 modulates caspase-independent apoptosis directly through its ligation induced by thrombospondin 1 (TSP-1) or specific anti-CD47 monoclonal antibodies (mAbs). Macrophages are important targets of HIV-1, they are infected at early stages of infection despites the absence of macrophage (M)-tropic viruses, and several studies suggested that the infection of macrophages might result from phagocytosis of HIV-1-infected CD4+ T lymphocytes. In this context, we investigated whether Vpu-mediated CD47 downregulation during infection of T cells promotes the phagocytosis by macrophages and contributes to their infection. We firstly confirmed that surface CD47 is downregulated by HIV-1, in a Vpu-dependent manner by using either laboratory adapted or transmitted/founder (T/F) strains. Furthermore, cocultures of HIV-1-infected T cells with monocyte-derived macrophages (MDMs) revealed that CD47 downregulation by Vpu promotes capture and phagocytosis of infected T cells by MDMs. Importantly, while MDMs were weakly susceptible to infection by cell-free T/F virus, coculture experiments of MDMs with T/F virus-infected T cells led to infection of MDMs and release of infectious particles. Mechanistically, Vpu-mediated depletion of CD47 was found to require the transmembrane domain (TMD), the SCFβTrCP1/2 E3 ubiquitin ligase-interacting diserine motif (DSGNES), as well as the trafficking motif (ExxxLV) of Vpu. Indeed, Vpu can form a physical complex with CD47 through its TMD and target CD47 for lysosomal degradation, consistent with a mechanism whereby Vpu alters the trafficking and/or turnover of CD47 at the plasma membrane. To better define the functional implications of the Vpu-mediated CD47 downregulation, we subsequently evaluated whether this would regulate apoptosis. We confirmed that anti-CD47 mAb CC2C6 was able to induce CD47 ligation and promote apoptosis in a CD47-dependent manner. Furthermore, we showed that Vpu inhibited the response of HIV-1-infected cells to apoptosis following CD47 ligation induced by CC2C6 mAb. Altogether, our results highlight a novel function of Vpu in promoting infection of macrophages by increasing the phagocytosis of HIV-1-infected T cells through a process that involves downregulation of surface CD47. This finding provides new insights into the mechanisms governing the intercellular transmission of HIV-1 and the establishment of infection in macrophages during early stages of infection, a key step for a systematic viral transmission and potentially the establishment of persistent viral reservoirs. Our results also identify a new mechanism by which HIV-1 modulates apoptosis of infected T cells to optimize its replication and dissemination. A better understanding of these processes is important for developing novel therapeutic and vaccine strategies against HIV-1 infection.

The goal of this thesis was to characterize the interactions between Zika virus (ZIKV) and its human host by studying several cellular responses, apoptosis, and Unfold protein responses UPR during in vitro infection of epithelial cells and to discuss the pathophysiological consequences in the modulation of viral infection. ZIKV is an arbovirus belonging to the genus flavivirus, transmitted primarily by Aedes mosquitoes and responsible for Zika virus disease. ZIKV was discovered in the 1950’s and was thought to cause sporadic disease in Africa, where infections were considered mild, manifesting only as mild flu-like symptoms (rash, fever, arthralgia). ZIKV suddenly gained international attention due to its emergence in Asia in 2007 followed by a very dramatic epidemic spread that affected several million people worldwide in less than 10 years, the vast majority in 2015-2016 in Brazil. It was also identified as a public health emergency by WHO in 2015 due to the increase in severe neurological sequelae such as Guillain-Barré syndrome in adults and previously unknown congenital syndromes (SCZ) such as microcephaly in newborns of mothers infected during pregnancy. The molecular mechanisms associated with epidemic emergence and pathogenicity of ZIKV had been only minimally studied before the 2015 Brazilian epidemic. The cytopathic effect induced by the virus in host cells plays a major role in pathogenesis, but is also beneficial, promoting the body’s elimination of the virus and the eventual resolution of infection. By characterizing programmed cell death during in vitro infection kinetics, I was able to show that apoptosis is delayed by ZIKV infection, allowing the virus to maintain a favorable anti-apoptotic state through the stabilization of the Bcl-2 protein. I also demonstrated that ZIKV was able to modulate the UPR in response to ER stress and interfere with the pro-apoptotic program driven by CHOP factor. These data demonstrate the important rôle of cellular hijacking during certain viral infections, and shed light on some of the mechanisms that could lead to the persistance of ZIKV infections and ZIKV disease symptoms. My findings additionally identify cellular pathways specific to ER stress and apoptosis as potential drug targets for the treatment of ZIKV infections., Le but de mon travail de thèse a été de caractériser les interactions entre le virus Zika (ZIKV) et son hôte humain en étudiant plusieurs réponses cellulaires, l'apoptose et l'UPR au cours de l'infection in vitro de cellules épithéliales et de discuter des conséquences physiopathologiques du contrôle que le virus semble exercer sur ces réponses. Le ZIKV est un arbovirus appartenant au genre flavivirus, transmis principalement par les moustiques Aedes et responsable de la maladie à virus Zika. ZIKV connu depuis les années 1950 était réputé responsable de cas sporadiques en Afrique et l'infection était considérée comme bénigne, ne se manifestant que par des symptômes pseudo-grippaux légers (éruptions cutanées, fièvre, arthralgie). ZIKV a subitement mobilisé l'attention internationale en raison de son émergence en Asie en 2007 suivie d'une propagation épidémique fulgurante ayant touché plusieurs millions de personnes de par le monde en moins de 10 ans dont la grande majorité en 2015-2016 au Brésil. Il a également été identifié comme urgence de santé publique par l'OMS en 2015 en raison de l'augmentation de formes neurologiques graves comme le syndrome de Guillain-Barré (GBS) chez les adultes et de syndromes congénitaux (SCZ) jusque-là ignorés comme la microcéphalie chez les nouveau-nés de mères infectées pendant la grossesse. Les mécanismes moléculaires de l'émergence épidémique et de la pathogénicité de ce virus n'avaient que très peu été étudiés avant l'épidémie brésilienne de 2015. L'effet cytopathique induit par le virus dans les cellules hôtes joue un rôle majeur dans la pathogenèse tout en étant ambigu car il conditionne la résolution de l'infection en permettant l'élimination du pathogène. En caractérisant la mort cellulaire programmée au cours de la cinétique d'infection j'ai pu montrer que celle-ci est retardée et que ZIKV est capable de maintenir un état anti-apoptotique qui lui est favorable en stabilisant la protéine Bcl-2. J'ai également mis en évidence que ZIKV était en mesure de moduler l'UPR en réponse au stress du RE et d'interférer avec le programme pro-apoptotique dirigé par le facteur CHOP. Ces données montrent l'importance du contrôle que le virus peut exercer sur les principales réponses cellulaires antivirales et apportent des pistes d'explication de certaines spécificités du virus ZIKV telles que la persistance virale observée dans certains tissus. Elles ouvrent des perspectives dans l'utilisation de ces propriétés virales singulières pour traiter des pathologies en lien avec le stress du RE et l'apoptose.

The goal of this thesis was to characterize the interactions between Zika virus (ZIKV) and its human host by studying several cellular responses, apoptosis, and Unfold protein responses UPR during in vitro infection of epithelial cells and to discuss the pathophysiological consequences in the modulation of viral infection. ZIKV is an arbovirus belonging to the genus flavivirus, transmitted primarily by Aedes mosquitoes and responsible for Zika virus disease. ZIKV was discovered in the 1950’s and was thought to cause sporadic disease in Africa, where infections were considered mild, manifesting only as mild flu-like symptoms (rash, fever, arthralgia). ZIKV suddenly gained international attention due to its emergence in Asia in 2007 followed by a very dramatic epidemic spread that affected several million people worldwide in less than 10 years, the vast majority in 2015-2016 in Brazil. It was also identified as a public health emergency by WHO in 2015 due to the increase in severe neurological sequelae such as Guillain-Barré syndrome in adults and previously unknown congenital syndromes (SCZ) such as microcephaly in newborns of mothers infected during pregnancy. The molecular mechanisms associated with epidemic emergence and pathogenicity of ZIKV had been only minimally studied before the 2015 Brazilian epidemic. The cytopathic effect induced by the virus in host cells plays a major role in pathogenesis, but is also beneficial, promoting the body’s elimination of the virus and the eventual resolution of infection. By characterizing programmed cell death during in vitro infection kinetics, I was able to show that apoptosis is delayed by ZIKV infection, allowing the virus to maintain a favorable anti-apoptotic state through the stabilization of the Bcl-2 protein. I also demonstrated that ZIKV was able to modulate the UPR in response to ER stress and interfere with the pro-apoptotic program driven by CHOP factor. These data demonstrate the important rôle of cellular hijacking during certain viral infections, and shed light on some of the mechanisms that could lead to the persistance of ZIKV infections and ZIKV disease symptoms. My findings additionally identify cellular pathways specific to ER stress and apoptosis as potential drug targets for the treatment of ZIKV infections., Le but de mon travail de thèse a été de caractériser les interactions entre le virus Zika (ZIKV) et son hôte humain en étudiant plusieurs réponses cellulaires, l'apoptose et l'UPR au cours de l'infection in vitro de cellules épithéliales et de discuter des conséquences physiopathologiques du contrôle que le virus semble exercer sur ces réponses. Le ZIKV est un arbovirus appartenant au genre flavivirus, transmis principalement par les moustiques Aedes et responsable de la maladie à virus Zika. ZIKV connu depuis les années 1950 était réputé responsable de cas sporadiques en Afrique et l'infection était considérée comme bénigne, ne se manifestant que par des symptômes pseudo-grippaux légers (éruptions cutanées, fièvre, arthralgie). ZIKV a subitement mobilisé l'attention internationale en raison de son émergence en Asie en 2007 suivie d'une propagation épidémique fulgurante ayant touché plusieurs millions de personnes de par le monde en moins de 10 ans dont la grande majorité en 2015-2016 au Brésil. Il a également été identifié comme urgence de santé publique par l'OMS en 2015 en raison de l'augmentation de formes neurologiques graves comme le syndrome de Guillain-Barré (GBS) chez les adultes et de syndromes congénitaux (SCZ) jusque-là ignorés comme la microcéphalie chez les nouveau-nés de mères infectées pendant la grossesse. Les mécanismes moléculaires de l'émergence épidémique et de la pathogénicité de ce virus n'avaient que très peu été étudiés avant l'épidémie brésilienne de 2015. L'effet cytopathique induit par le virus dans les cellules hôtes joue un rôle majeur dans la pathogenèse tout en étant ambigu car il conditionne la résolution de l'infection en permettant l'élimination du pathogène. En caractérisant la mort cellulaire programmée au cours de la cinétique d'infection j'ai pu montrer que celle-ci est retardée et que ZIKV est capable de maintenir un état anti-apoptotique qui lui est favorable en stabilisant la protéine Bcl-2. J'ai également mis en évidence que ZIKV était en mesure de moduler l'UPR en réponse au stress du RE et d'interférer avec le programme pro-apoptotique dirigé par le facteur CHOP. Ces données montrent l'importance du contrôle que le virus peut exercer sur les principales réponses cellulaires antivirales et apportent des pistes d'explication de certaines spécificités du virus ZIKV telles que la persistance virale observée dans certains tissus. Elles ouvrent des perspectives dans l'utilisation de ces propriétés virales singulières pour traiter des pathologies en lien avec le stress du RE et l'apoptose.

Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a rare and highly fatal haematological disorder, characterized by progressive invasion of bone marrow, circulating blood and peripheral organs by abnormal myeloid progenitors named blasts. Blasts are defined by differentiation blockade, and keep typical features of myeloid progenitors, like high proliferation rate and survival increased. AML treatment is based on chemotherapy combining Aracytin with anthracyclin, which mainly target proliferative cells. However, relapses are frequently observed, associated with chemoresistance. Interestingly, a clinical study links ER-stress-related transcription factor XBP1 expression to favourable outcome in AML. In order to precise the role of XBP1 on AML, we developed a tetracycline-inducible XBP1 model in leukemic cell lines. Our studies clearly demonstrate that the sustained activation of XBP1 expression induce apoptosis both in vitro and in vivo, whereas a moderate XBP1 expression sensitizes cells to chemotherapeutic treatments. Finally, a chronic activation of XBP1 in AML cells expression unlock myeloid differentiation both in vitro and in vivo. Using ChIP-sequencing, RNA-sequencing and micro-RNA sequencing data, we identified two specific-XBP1s-non-coding targets, miR-22 and miR148a-3p, which recapitulate XBP1-related phenotypes. XBP1 transcriptional activation of miR-22 significantly suppresses viability and sensitizes leukemic cell to chemotherapy, through SIRT1 protein knockdown. Moreover, chronic expression of miR-22 and miR148a-3p inhibit respectively C-MYB and HEX expression, two transcription factors related to repression of myeloid differentiation, leading to myeloid differentiation progression. Taking together, these results show XBP1 anti-leukemic effects, through its non-coding targets implication in molecular mechanisms., Les Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes, caractérisées par un l'expansion de blastes leucémiques, des progéniteurs myéloïdes bloqués à différents stades de leur différenciation, qui colonisent la moelle osseuse, puis le sang, pour enfin s'infiltrer dans différents tissus et former des métastases. Le traitement de référence de ces hémopathies repose sur une chimiothérapie classique associant de l'Aracytine à une anthracycline. Cependant, de fréquentes rechutes sont observées et sont marquées par une chimiorésistance des patients. De façon intéressante, une étude clinique menée par Schardt et collaborateur a révélé un lien entre l'activation de XBP1, un facteur de transcription exprimé dans le cadre du stress du Réticulum Endoplasmique, et un meilleur pronostic chez les patients atteint de LAM. Dans le but de préciser le rôle de XBP1 dans ces pathologies, nous avons développé un modèle permettant l'expression conditionnelle de XBP1, sous contrôle d'un promoteur sensible à la doxycycline, dans des lignées cellulaires de LAM. Nos résultats démontrent qu'une activation soutenue de XBP1 conduit à l'apoptose des cellules in vitro et in vivo. De plus, une activation plus modérée de XBP1 conduit à une chimiosensibilisation à l'Aracytine in vitro et in vivo. Enfin, une activation chronique de XBP1 déverrouille la différenciation myéloïde in vitro et in vivo. Par le biais d'analyses à grande échelle, nous avons identifiées deux cibles transcriptionnelles non-codantes de XBP1, miR-22-3p et miR-148a-3p, qui récapitulent à elles seules les phénotypes liés à l'expression de XBP1. L'expression de miR-22 induit l'apoptose et sensibilise à l'Aracytine via la diminution de l'expression de la protéine SIRT1. De plus, l'expression chronique de miR-22 et miR-148 inhibent respectivement l'expression de c-MYB et HEX, deux facteurs de transcription impliqués dans la répression de la différenciation myéloïde. L'ensemble de nos résultats démontrent non seulement une activité anti-leucémique du facteur de transcription XBP1, mais mettent également en lumière l'importance de ses cibles non codantes dans les mécanismes moléculaires sous-jacents.

Whole-body and complex structure regeneration is a widespread phenomenon in animals. While regenerative abilities vary greatly from one species to another, a number of mechanisms appear essential for regeneration in distantly related phylogenetic groups. In this review, we synthetize the knowledge gathered on the implication of three mechanisms that appear to be important for the initiation of regeneration in animals. Reactive Oxygen Species (ROS) are metabolic by-products involved in cell signalling, which are produced shortly after amputation in several species. ROS production may be responsible for triggering apoptosis, another recurring mechanism involved in regeneration initiation. In turn, apoptosis causes compensatory proliferation by setting off cellular division, thus contributing to the reconstitution of tissues. Inhibiting either ROS production, apoptosis or cellular proliferation impairs regeneration in a variety of model species.Un trio de mécanismes au cœur de l’initiationde la régénération chez les animaux.La régénération d’un membre ou du corps entier est un processus largement répandu chez les animaux. Même si les capacités régénératives varient d’une espèce à l’autre, trois mécanismes sont observés de façon récurrente lors de l’initiation de la régénération : la production de dérivés réactifs de l’oxygène (DRO), l’apoptose, et la prolifération cellulaire. De nombreux travaux ont mis en évidence le fait que ces trois mécanismes étaient nécessaires au bon déroulement de la régénération chez des espèces pourtant phylogénétiquement éloignées. Comprendre en détail les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la coordination de ces trois processus dans l’initiation de la régénération pourrait aider à développer des thérapies pro-régénératives.

Regional (myocardial) or systemic (cardiac arrest) ischaemia-reperfusion (IR) injuries are an omnipresent threat in perioperative medicice and intensive care, and are the leading cause of major morbidity and mortality. Numerous strategies have been developed to limit and/or prevent them. Despite evidence of the effectiveness of pharmacological preconditioning (PPc), particularly by volatile halogenated agents (VHAs), known as anaesthetic preconditioning (APc); various points of discordance in terms of effectiveness (inter-individual, nature of research (clinical or pre-clinical), types of surgery (cardiac or non-cardiac)) testify to the lack of understanding of its mechanisms, and on the other hand that the interest of its integration within a global cardioprotection management remains to be confirmed. Thus, in order to improve the understanding of the mechanisms involved in the presumed protective effect of PPc, we first undertook a fundamental and mechanistic approach aimed at identifying the effectors of the cardioprotection induced by PPc. We thus demonstrated that halogenated VHAs such as sevoflurane (SEV) were able to induce, in vitro, a protective signaling pathway involving reactive oxygen species (ROS), the survival protein kinase Akt and the anti-apoptotic protein Bcl-xL. Interestingly, we have reproduced the protective effect induced by SEV and supported by this signaling pathway in different cell models of myocardial origin including human cardiomyocytes differentiated from pluripotent embryonic stem cells. In addition, we have also shown that this protective signaling pathway induced by SEV can be stimulated by the antidiabetic agent Metformin (MET), justifying its use as a potential PPc agent to prevent IR damage. On the basis of these results, we sought to verify the clinical relevance of the protective effect of Metformin. We therefore hypothesised that, thanks to its pleiotropic and potentially cardioprotective effects, MET was able to protect against global and massive IR induced by cardiac arrest (CA). Retrospective analysis of more than 500 patients admitted to critical care for CA showed that MET was independently associated with improved post-CA survival at D28, providing the first clinical evidence of the protective effect of MET against the most severe IR encountered: CA.Given the increasing incidence of high-risk cardiovascular patients encountered in surgery and critical care in connection with the ageing population in developed countries, it therefore becomes necessary to pursue and deepen our experimental approach in order to improve the understanding of the mechanisms of PPc and to legitimize the clinical relevance of its protective effect with the aim of limiting the morbidity and mortality linked to IR.; Les lésions d'ischémie-reperfusion régionale (myocardique) ou d’emblée systémique (ACR) représentent une menace omniprésente en anesthésie-réanimation et sont à l’origine d’une morbi-mortalité majeure. De nombreuses stratégies ont été mises au point pour les limiter et/ou les prévenir. Malgré les preuves de l’efficacité du préconditionnement pharmacologique (PPc) notamment par les agents volatils halogénés (AVH), appelé préconditionnement anesthésique (APc) ; divers points de discordance en termes d’efficacité (inter-individuelle, nature de la recherche (clinique ou pré-clinique), types de chirurgie pratiquée (cardiaque ou non-cardiaque)) témoignent du manque de compréhension de ses mécanismes, et d’autre part que l’intérêt de son intégration au sein d’une prise en charge globale de cardioprotection reste encore à confirmer. Ainsi, afin d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans l’effet protecteur présumé du PPc, nous avons entrepris dans un premier temps une approche fondamentale et mécanistique visant à identifier les effecteurs de la cardioprotection induite par l’APc. Nous avons donc mis en évidence que les AVH tels que le sévoflurane (SEV) étaient capables d’induire, in vitro, une voie de signalisation protectrice impliquant les espèces réactives de l’oxygène (ROS), la protéine kinase de survie Akt et la protéine anti-apoptotique Bcl-xL. De manière intéressante, nous avons reproduit l’effet protecteur induit par le SEV et supporté par cette voie de signalisation au sein de différents modèles cellulaires d’origine myocardique dont des cardiomyocytes humains différenciés à partir de cellules souches embryonnaires pluripotentes. De plus, nous avons également démontré que cette voie de signalisation protectrice induite par le SEV pouvait être stimulée par l'agent antidiabétique Metformine (MET), justifiant son utilisation comme agent potentiel de PPc pour prévenir des lésions d’IR. Forts de ces résultats, nous avons cherché à vérifier la pertinence clinique de l’effet protecteur de la MET. Nous avons donc émis l’hypothèse que, grâce à ses effets pléïotropes et potentiellement cardioprotecteur, la MET était capable de protéger vis-à-vis de l’IR globale et massive induite par l’arrêt cardio-respiratoire (ACR). L’analyse rétrospective menée sur plus de 500 patients admis en soins critiques pour ACR a montré que la MET est associée de manière indépendante à une amélioration de la survie à J28 post-ACR apportant ainsi une première preuve clinique de l'effet protecteur de la MET contre l’IR la plus sévère rencontrée : l’ACR.Compte tenu de l’incidence croissante des patients à haut risque cardio-vasculaire rencontrés en chirurgie et en soins critiques en lien avec le vieillissement de la population dans les pays développés, il devient donc nécessaire de poursuivre et d’approfondir notre approche expérimentale afin d’améliorer la compréhension des mécanismes du PPc et de légitimer la pertinence clinique de son effet protecteur dans le but de limiter la morbi-mortalité liée à l’IR.

Bcl-2 proteins are main programmed cell death regulators also called apoptosis. Bcl2L10 or Nrh is an anti-apoptotic Bcl-2 playing a key function at the endoplasmic reticulum (ER) unlike other Bcl-2 which are mostly located at the mitochondria. Nrh interacts through its BH4 domain with the calcium channel IP3 receptor (IP3R) at the ER. The interaction’s inhibition induces higher drug sensitivity of cancer cells. Although Nrh expression level is low in normal tissues, it is found altered in cancer cells. Up-regulation of Nrh expression is correlated with poor prognosis in patients with breast cancer and acute myeloid leukemia (AML). A single nucleotide polymorphism (SNP) has been described in Nrh BH4 domain at position 11 (Leu11Arg). The variant R (Arginine, Nrh-R) is correlated with a better prognosis in AML and is a good predictive chemotherapy factor in rectal cancer. We have demonstrated that the Nrh-R variant has lost the ability to interact with the IP3R, to block active ER calcium efflux and to protect cells against ER stress-induced cell death (Thapsigargin) compared with Nrh-L. We have analyzed the SNP status in a large breast cancer cohort. Our data showed that patients with at least one Nrh-L allele displayed higher chemotherapy resistance than homozygotes Nrh-R patients. Furthermore, extensive analysis from databanks has allowed us to establish a list of therapeutic compounds which IC50 varied depending on the SNP status Nrh-L or Nrh-R. Additionally, a drug discovery program has been implemented to identify an inhibitor of Nrh L and its interaction with the IP3R. The purpose is to target Nrh-L and improve chemotherapy response., Les protéines Bcl-2 sont les principales régulatrices de l’apoptose. Bcl2L10 ou Nrh est un membre anti-apoptotique de la famille des protéines Bcl-2 jouant un rôle important au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Nrh interagit par son domaine BH4 avec le canal calcique IP3R au niveau du RE et l’inhibition de cette interaction induit une sensibilité accrue aux drogues des cellules cancéreuses. Bien que très peu exprimée dans les tissus sains, l’expression de Nrh est retrouvée altérée dans les cellules tumorales. L’altération de son expression est corrélée à un mauvais pronostic, en particulier dans les cancers du sein et les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Un polymorphisme nucléotidique (SNP) a été décrit au niveau de la position 11 (Leu11Arg) dans le BH4 de Nrh. La présence du variant R (Arginine, Nrh-R) a été corrélée à un bon pronostic dans les LAM. Nous avons montré que le variant Nrh-R avait perdu sa capacité à interagir avec IP3R, n’était plus capable de bloquer la sortie active du calcium réticulaire et protégeait moins bien de la mort induite par un stress RE par rapport à la forme Nrh-L. Nous avons analysé le statut de ce SNP dans une cohorte de tumeurs du sein. Nos résultats montrent que les tumeurs exprimant au moins un allèle Nrh-L sont plus résistantes aux chimiothérapies que les patients Nrh-R homozygotes. Par ailleurs, l’analyse des bases de données nous a permis d’établir une liste de composés dont les IC50 varient en fonction du SNP. Pour aller plus loin, nous avons mis en place un programme de « drug discovery » afin d’identifier un inhibiteur spécifique de Nrh-L. La finalité est de cibler Nrh-L et d’améliorer la réponse à la chimiothérapie.

Regional (myocardial) or systemic (cardiac arrest) ischaemia-reperfusion (IR) injuries are an omnipresent threat in perioperative medicice and intensive care, and are the leading cause of major morbidity and mortality. Numerous strategies have been developed to limit and/or prevent them. Despite evidence of the effectiveness of pharmacological preconditioning (PPc), particularly by volatile halogenated agents (VHAs), known as anaesthetic preconditioning (APc); various points of discordance in terms of effectiveness (inter-individual, nature of research (clinical or pre-clinical), types of surgery (cardiac or non-cardiac)) testify to the lack of understanding of its mechanisms, and on the other hand that the interest of its integration within a global cardioprotection management remains to be confirmed. Thus, in order to improve the understanding of the mechanisms involved in the presumed protective effect of PPc, we first undertook a fundamental and mechanistic approach aimed at identifying the effectors of the cardioprotection induced by PPc. We thus demonstrated that halogenated VHAs such as sevoflurane (SEV) were able to induce, in vitro, a protective signaling pathway involving reactive oxygen species (ROS), the survival protein kinase Akt and the anti-apoptotic protein Bcl-xL. Interestingly, we have reproduced the protective effect induced by SEV and supported by this signaling pathway in different cell models of myocardial origin including human cardiomyocytes differentiated from pluripotent embryonic stem cells. In addition, we have also shown that this protective signaling pathway induced by SEV can be stimulated by the antidiabetic agent Metformin (MET), justifying its use as a potential PPc agent to prevent IR damage. On the basis of these results, we sought to verify the clinical relevance of the protective effect of Metformin. We therefore hypothesised that, thanks to its pleiotropic and potentially cardioprotective effects, MET was able to protect against global and massive IR induced by cardiac arrest (CA). Retrospective analysis of more than 500 patients admitted to critical care for CA showed that MET was independently associated with improved post-CA survival at D28, providing the first clinical evidence of the protective effect of MET against the most severe IR encountered: CA.Given the increasing incidence of high-risk cardiovascular patients encountered in surgery and critical care in connection with the ageing population in developed countries, it therefore becomes necessary to pursue and deepen our experimental approach in order to improve the understanding of the mechanisms of PPc and to legitimize the clinical relevance of its protective effect with the aim of limiting the morbidity and mortality linked to IR., Les lésions d'ischémie-reperfusion régionale (myocardique) ou d’emblée systémique (ACR) représentent une menace omniprésente en anesthésie-réanimation et sont à l’origine d’une morbi-mortalité majeure. De nombreuses stratégies ont été mises au point pour les limiter et/ou les prévenir. Malgré les preuves de l’efficacité du préconditionnement pharmacologique (PPc) notamment par les agents volatils halogénés (AVH), appelé préconditionnement anesthésique (APc) ; divers points de discordance en termes d’efficacité (inter-individuelle, nature de la recherche (clinique ou pré-clinique), types de chirurgie pratiquée (cardiaque ou non-cardiaque)) témoignent du manque de compréhension de ses mécanismes, et d’autre part que l’intérêt de son intégration au sein d’une prise en charge globale de cardioprotection reste encore à confirmer. Ainsi, afin d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans l’effet protecteur présumé du PPc, nous avons entrepris dans un premier temps une approche fondamentale et mécanistique visant à identifier les effecteurs de la cardioprotection induite par l’APc. Nous avons donc mis en évidence que les AVH tels que le sévoflurane (SEV) étaient capables d’induire, in vitro, une voie de signalisation protectrice impliquant les espèces réactives de l’oxygène (ROS), la protéine kinase de survie Akt et la protéine anti-apoptotique Bcl-xL. De manière intéressante, nous avons reproduit l’effet protecteur induit par le SEV et supporté par cette voie de signalisation au sein de différents modèles cellulaires d’origine myocardique dont des cardiomyocytes humains différenciés à partir de cellules souches embryonnaires pluripotentes. De plus, nous avons également démontré que cette voie de signalisation protectrice induite par le SEV pouvait être stimulée par l'agent antidiabétique Metformine (MET), justifiant son utilisation comme agent potentiel de PPc pour prévenir des lésions d’IR. Forts de ces résultats, nous avons cherché à vérifier la pertinence clinique de l’effet protecteur de la MET. Nous avons donc émis l’hypothèse que, grâce à ses effets pléïotropes et potentiellement cardioprotecteur, la MET était capable de protéger vis-à-vis de l’IR globale et massive induite par l’arrêt cardio-respiratoire (ACR). L’analyse rétrospective menée sur plus de 500 patients admis en soins critiques pour ACR a montré que la MET est associée de manière indépendante à une amélioration de la survie à J28 post-ACR apportant ainsi une première preuve clinique de l'effet protecteur de la MET contre l’IR la plus sévère rencontrée : l’ACR.Compte tenu de l’incidence croissante des patients à haut risque cardio-vasculaire rencontrés en chirurgie et en soins critiques en lien avec le vieillissement de la population dans les pays développés, il devient donc nécessaire de poursuivre et d’approfondir notre approche expérimentale afin d’améliorer la compréhension des mécanismes du PPc et de légitimer la pertinence clinique de son effet protecteur dans le but de limiter la morbi-mortalité liée à l’IR.

RB1, the retinoblastoma susceptibility gene encodes the pRb protein which is inactivated in most cancers. pRb, is a transcriptional co factor able to negatively regulate cell proliferation and apoptosis in a negative or positive way depending on cell type. This last role appears particularly complex due to the great number of actors involved. Rbf1 is the Drosophila homolog of RB1. Although Rbf1 retains most of pRb described activities, their study is facilitated in Drosophila by the lower redundancy of Rbf1 partners. In Drosophila, overexpression of rbf1 has a pro-apoptotic effect in proliferating cells. Rbf1-induced apoptosis happens through downregulation of the expression of the only anti-apoptotic Bcl 2 family member, buffy, and release of the only pro-apoptotic Bcl 2 family member, Debcl. Those events lead to mitochondrial fission mediated by dDrp1 and result in an accumulation of reactive oxygen species (ROS) activating the JNK pathway and caspases.This PhD project focused on the mitochondrial fission step occurring during Rbf1-induced apoptosis. Using a genetic approach, I have shown that Tango11 can modulate Rbf1 activity. An important work on image processing and programming of an open-source Fiji macro, designed to optimize and automatize quantification of apoptotic signal, allowed me to validate Tango11 as a new actor of Rbf1-induced apoptosis. I was able to show that Tango11 localized at the mitochondria and is necessary for the mitochondrial recruitment of a phosphorylated form of dDrp1 involved in mitochondrial fission. The results obtained during this thesis and the strong evolutionary proximity between the mammalian Drp1 receptor Mff, and Tango11 suggest Tango11 is the main receptor of dDrp1 in Rbf1-induced apoptosis in Drosophila., RB1, le gène de susceptibilité au rétinoblatome code la protéine pRb qui est inactivée dans la plupart des cancers. pRb, est un co facteur de transcription qui contrôle négativement la prolifération cellulaire et régule négativement ou positivement l'apoptose en fonction du type cellulaire. Ce dernier rôle apparaît spécialement complexe, notamment à cause de la multiplicité des acteurs impliqués. La drosophile présente un homologue de RB1, appelé rbf1. Bien que Rbf1 conserve la plupart des activités décrites pour pRb, l'étude de ces activités chez la drosophile est facilitée par la moindre redondance des partenaires de Rbf1.Chez la drosophile, la surexpression de rbf1 est pro-apoptotique dans les cellules en prolifération. L'apoptose induite par Rbf1 passe par une répression de l'unique membre anti-apoptotique de la famille Bcl 2, buffy, libérant de son emprise l'unique membre pro-apoptotique de cette famille, Debcl. Ces évènements conduisent à une fission mitochondriale médiée par dDrp1 et aboutissent à une accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) activant la voie JNK et les caspases.Au cours de cette thèse, je me suis particulièrement intéressée à l'étape de fission mitochondriale. En utilisant une approche génétique, j'ai montré que Tango11 pouvait moduler l'activité de Rbf1. Un travail approfondi sur le traitement d'images issues de microscopie confocale à fluorescence et à la mise au point d'une macro Fiji destinée à l'optimisation et l'automatisation de la quantification du marquage apoptotique, m'ont permis de valider Tango11 comme nouvel acteur de l'apoptose induite par Rbf1. J'ai montré que Tango11 était localisé à la mitochondrie et est nécessaire au recrutement mitochondrial d'une forme phosphorylée de dDrp1 impliquée dans la fission mitochondriale. Les résultats obtenus au cours de cette thèse et la forte proximité évolutive entre le récepteur de Drp1 mammalien Mff, et Tango11 suggèrent que ce dernier est le récepteur principal de dDrp1 dans l'apoptose induite par Rbf1 chez la drosophile.

Bcl-2 proteins are main programmed cell death regulators also called apoptosis. Bcl2L10 or Nrh is an anti-apoptotic Bcl-2 playing a key function at the endoplasmic reticulum (ER) unlike other Bcl-2 which are mostly located at the mitochondria. Nrh interacts through its BH4 domain with the calcium channel IP3 receptor (IP3R) at the ER. The interaction’s inhibition induces higher drug sensitivity of cancer cells. Although Nrh expression level is low in normal tissues, it is found altered in cancer cells. Up-regulation of Nrh expression is correlated with poor prognosis in patients with breast cancer and acute myeloid leukemia (AML). A single nucleotide polymorphism (SNP) has been described in Nrh BH4 domain at position 11 (Leu11Arg). The variant R (Arginine, Nrh-R) is correlated with a better prognosis in AML and is a good predictive chemotherapy factor in rectal cancer. We have demonstrated that the Nrh-R variant has lost the ability to interact with the IP3R, to block active ER calcium efflux and to protect cells against ER stress-induced cell death (Thapsigargin) compared with Nrh-L. We have analyzed the SNP status in a large breast cancer cohort. Our data showed that patients with at least one Nrh-L allele displayed higher chemotherapy resistance than homozygotes Nrh-R patients. Furthermore, extensive analysis from databanks has allowed us to establish a list of therapeutic compounds which IC50 varied depending on the SNP status Nrh-L or Nrh-R. Additionally, a drug discovery program has been implemented to identify an inhibitor of Nrh L and its interaction with the IP3R. The purpose is to target Nrh-L and improve chemotherapy response., Les protéines Bcl-2 sont les principales régulatrices de l’apoptose. Bcl2L10 ou Nrh est un membre anti-apoptotique de la famille des protéines Bcl-2 jouant un rôle important au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Nrh interagit par son domaine BH4 avec le canal calcique IP3R au niveau du RE et l’inhibition de cette interaction induit une sensibilité accrue aux drogues des cellules cancéreuses. Bien que très peu exprimée dans les tissus sains, l’expression de Nrh est retrouvée altérée dans les cellules tumorales. L’altération de son expression est corrélée à un mauvais pronostic, en particulier dans les cancers du sein et les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Un polymorphisme nucléotidique (SNP) a été décrit au niveau de la position 11 (Leu11Arg) dans le BH4 de Nrh. La présence du variant R (Arginine, Nrh-R) a été corrélée à un bon pronostic dans les LAM. Nous avons montré que le variant Nrh-R avait perdu sa capacité à interagir avec IP3R, n’était plus capable de bloquer la sortie active du calcium réticulaire et protégeait moins bien de la mort induite par un stress RE par rapport à la forme Nrh-L. Nous avons analysé le statut de ce SNP dans une cohorte de tumeurs du sein. Nos résultats montrent que les tumeurs exprimant au moins un allèle Nrh-L sont plus résistantes aux chimiothérapies que les patients Nrh-R homozygotes. Par ailleurs, l’analyse des bases de données nous a permis d’établir une liste de composés dont les IC50 varient en fonction du SNP. Pour aller plus loin, nous avons mis en place un programme de « drug discovery » afin d’identifier un inhibiteur spécifique de Nrh-L. La finalité est de cibler Nrh-L et d’améliorer la réponse à la chimiothérapie.

Sideroflexins (SFXN) form a new family of mitochondrial proteins. Their functions are currently unknown. These proteins are evolutionary conserved and found from yeast to humans. Five SFXN exist in vertebrates. SFXN1, the first member of the family, was described in flexed-tail mouse that harbors a mutation in the SFXN1 gene. Other members of the sideroflexin family have been described later. Nevertheless since the discovery of SFXN1 few data on the putative functions of the sideroflexins exist. When the key word “sideroflexin” is typed in Pubmed database only thirteen articles are found. Interestingly most recent articles suggest the involvement of sideroflexins in neurodegenerative disorders and mitochondriopathies. We are thus interested in understanding the normal and pathologic functions of sideroflexins at the mitochondrial level. Sideroflexins present five putative transmembrane domains in their structure. These proteins are localized at the inner mitochondrial membrane. A putative function of transporter has been proposed for SFXNs. Fleming and colleagues suggest that SFXN1 was involved in the iron metabolism since flexed-tail mouse displays sideroblastic anemia that is characterized by iron deposition at the mitochondria in erythrocytes. This has not been experimentally proved and another mutation (affecting Madh5 gene) has been later associated with flexed-tail phenotype. SFXN have also been proposed as tricarboxylate transporters. However, their predicted structure is different from that of the other members belonging to the superfamily of anion transporters. Thus the functions of sideroflexins remain largely unknown. Mitochondria occupy a central place in the energetics metabolism and are also involved in various pathologies such as neurodegenerative disorders, cancers and mitochondriopathies. In neurodegenerative diseases such as Parkinson disease (PD), Alzheimer disease (AD) or Huntington disease (HD), defects in mitochondrial dynamics and mitochondrial respiration are observed. Moreover mutant proteins involved in these pathologies accumulate at the mitochondria. Recently involvement of SFXN1 and SFXN3 in AD and PD respectively has been proposed. Furthermore mutations in SFXN4 are thought to be causative of a mitochondriopathy. Defects in mitochondrial respiration are observed consecutive to a loss of function of SFXN4. In the study of Amorim et al, defects in mitochondrial respiration are not seen with synaptomes originating from sfxn3 KO mice. Nevertheless this could be explained by functional redundancy since all members of the sideroflexins are found in brain. Mutant proteins involved in neurodegenerative disorders tend to form aggregates inducing a stress of the endoplasmic reticulum (ER). Interestingly it has been recently shown that SFXN1 interacts with SCIRR69. SCIRR69 is a protein found at the ER and induced upon ER stress. Thus, considering that few data exist concerning SFXNs and that these proteins are associated with diseases where mitochondria are largely involved, we expect to give answers to some questions: What are the basal activities of SFXNs at the mitochondria? Are they important for mitochondrial respiration or do they regulate mitochondrial dynamics? Are they involved in response to diverse stress that converge to mitochondria (genotoxic or ER stress for example)?, Les sidéroflexines forment une famille de transporteurs mitochondriaux encore peu étudiés. Leur forte conservation chez les eucaryotes suggère un rôle important dans la régulation des fonctions mitochondriales, mais ce rôle est encore mal compris. Récemment, il a été montré qu’elles étaient impliquées dans la voie du métabolisme à un carbone et que leur dérégulation impactait l’homéostasie du fer et la respiration mitochondriale. En outre, de smutations de SFXN4 sont responsables d’une maladie mitochondriale rare, le syndrome COXPD18. Pour mieux comprendre les fonctions de SFXN, j’ai développé mes travaux de recherche selon deux axes prioritaires : 1) la recherche de partenaires de SFXN1 en cellules humaines ; 2) l’étude des activités des sidéroflexines de drosophile (dSfxn) vis-à-vis de l’apoptose, processus de mort cellulaire régulé par la mitochondrie.Notre recherche de partenaires physiques de SFXN1 révèle que cette protéine interagit avec des sous-unités de la chaîne respiratoire et les protéines TIM50, HSD10 et ATAD3A. Ces interactions pourraient expliquer les altérations de la respiration mitochondriale observées dans certaines études et permettent d’envisager un rôle des SFXN dans d’autres processus mitochondriaux tels que la synthèse des ARNt mitochondriaux et l’organisation mitochondriale, processus dans lesquels sont impliqués HSD10 et ATAD3A, respectivement.Chez la drosophile, j’ai pu montrer que la modulation des niveaux de dSfxn1/3 et dSfxn2 affectait l’apoptose induite par Rbf1, orthologue de Rb et Debcl, membre pro-apoptotique de la famille Bcl2. Enfin, j’ai généré des résultats suggérant un rôle essentiel de ces protéines dans la régulation de la physiologie neuronale. En effet, la déplétion des dSfxn dans les neurones in vivo chez la drosophile se traduit par une diminution de la longévité des drosophiles et unemodification de leur comportement locomoteur.

Proteins of the BCL-2 family play a major role in cellular homeostasis since they regulate apoptotic cell death through dynamic interactions between the anti- and pro-apoptotic members. Over-expression of anti-apoptotic members (BCL-2, BCL-xL, MCL-1...), and particulary MCL-1, participates in the development of tumors as well as in their resistance to chemotherapy or radiotherapy treatments. Synthetic inhibitors targeting this anti-apoptotic protein have therefore been developed, some of which being currently in clinical trials. In this context, our goal is to obtain natural inhibitors of the BCL-2 family, and more specifically of MCL-1. Natural products are playing a significant role in drug discovery and development processes. Since the 1940’s, 75% of the 175 small molecules used in cancer therapy are either natural products or derivatives of natural products. We have isolated and purified a new compound called NA1-115-7, evaluated its efficiency in vitro and characterized its mechanism of action before testing it in vivo, thanks to a nano-emulsion formulation.; Les protéines de la famille BCL-2 jouent un rôle majeur dans l'homéostasie cellulaire de par leur implication dans le processus apoptotique qui se fait à travers des interactions dynamiques entre les membres pro- et anti-apoptotiques composant cette famille. Parmi les membres anti-apoptotiques, MCL-1 est très fréquemment surexprimé dans les tumeurs où il est impliqué dans leur développement tout comme dans les résistances aux traitements de chimiothérapies ou de radiothérapies. Des inhibiteurs synthétiques ciblant cette protéine anti-apoptotique ont déjà été développés, certains étant même en évaluation clinique. Dans ce contexte, notre but était de développer un inhibiteur de MCL-1 naturel. Les produits naturels joue un rôle très important dans le développement de nouvelles molécules thérapeutiques. En effet, depuis les années 1940, 75% des 175 molécules utilisées dans le traitement du cancer sont soit des molécules naturelles, soit des dérivés de molécules naturelles. Nous avons donc isolé et purifié un nouveau composé, le NA1-115-7 puis nous avons évalué son efficacité in vitro, son mécanisme d'action et pour finir, nous l'avons testé in vivo grâce à l'utilisation de nano-émulsions.

The phenotypic heterogeneity observed in populations of isogenic cells is an immediate cause of non-genetic resistance to anticancer drugs which remains difficult to profile due to its transient nature. In a first part of this work, we have studied the molecular origins of the phenotypic heterogeneity observed in response to TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). For that, we have developed a method to isolate resistant cells before they initiate genetic induction by the treatment, and sensitive cells before they deteriorate their content during cell death. The method is composed of three single-cell technologies: predictive measurement of cell response by video-microscopy, isolation of each cell in situ by laser capture, followed by transcriptomic profiling. The prediction of therapeutic response makes it possible to isolate and profile all the cells, regardless of the outcome of their late pharmacological response (cell death for sensitive cells), and thus enabled us to identify the genes at the origin of the difference in efficacy of TRAIL. Then in a second part of this work, we studied the transient resistance induced during treatment with TRAIL. We were able to demonstrate the role of TAK-1 in the establishment of this transient resistance. It has been described that the apoptotic pathway triggered by TRAIL could also branch off onto the pathway of necroptosis, a highly immunogenic cell death. We were able to demonstrate an antagonistic communication of these pathways: the resistance induced during apoptosis of cells treated with TRAIL made it possible to sensitize the surviving cells to the necroptotic treatment. This work could suggest new therapeutic strategies in order to overcome the resistance inherent in these signaling pathways.; L'hétérogénéité phénotypique observée dans des populations de cellules isogéniques est une cause immédiate de résistance non-génétique aux anticancéreux qui reste difficile à définir en raison de sa nature transitoire. Dans une première partie, nous avons étudié l’origine moléculaire de l'hétérogénéité phénotypique de réponse au TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Pour cela nous avons développé une méthode permettant d’isoler les cellules résistantes avant qu’elles n’engagent une induction génétique par le traitement, et les cellules sensibles avant qu’elles ne détériorent leur contenu lors de la mort cellulaire. La méthode emploie trois technologies en cellule unique : une mesure prédictive de réponse cellulaire par vidéo-microscopie, une isolation de chaque cellule in situ par capture laser, suivi d’un profilage transcriptomique. La prédiction de réponse thérapeutique permet alors d’isoler et profiler toutes les cellules, quelle que soit l’issue de leur réponse pharmacologique tardive (mort cellulaire pour les sensibles), et ainsi nous a permis d’identifier les gènes à l’origine de la différence d’efficacité de TRAIL dans une population de cellules clonales. Puis dans un second projet, nous avons étudié la résistance transitoire induite lors de traitement par TRAIL. Nous avons pu mettre en évidence le rôle de TAK-1 dans la mise en place de cette résistance transitoire. Il a été décrit que la voie apoptotique déclenchée par TRAIL pouvait aussi bifurquer sur la voie de la nécroptose, une mort cellulaire fortement immunogène. Nous avons pu démontrer une communication antagoniste de ces voies : la résistance induite lors de l’apoptose des cellules traitées par TRAIL permettait de sensibiliser les cellules survivantes au traitement nécroptotique. Ces travaux pourraient permettre de suggérer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de pallier les résistances inhérentes à ces voies de signalisations.

Caspases are a family of cysteine proteases well known for their central roles during apoptosis and inflammation. They also intervene in non-apoptotic regulated cell death pathways and contribute to a large number of physiological mechanisms. The development of therapeutic approaches targeting caspases has generated strong industrial interest since the 1990s, prompting intense research on biological mechanisms, and the development of numerous synthetic inhibitors. Most of these inhibitors are derivatives of peptides or mimetics capable of interacting with the active site of caspases. However, the structural conservation between the different caspases is a challenge for the development of selective inhibitors. To date 5 caspase inhibitors, targeting either Caspase-1, -2 or multiple caspases, have been investigated in clinical settings, and there is still no marketing authorization. The Pan-caspase inhibitor emricasan reached clinical phase III and was proven to be safe but failed to demonstrate efficacy against NASH. Contrary to initial assumptions, selective Caspase-3 inhibitors have not reached the clinical level, while QPI-1007, a siRNA directed against Caspase-2, is currently undergoing a multicentric phase III clinical study for the treatment of ischemic optic neuropathies.Inhibition des caspases - De la biologie et thanatologie cellulaires au développement clinique de candidats médicaments.Les caspases sont une famille de cystéines protéases bien connues pour leurs rôles centraux au cours de l’apoptose et de l’inflammation. Elles interviennent aussi dans des voies de mort cellulaire régulées non-apoptotiques, et contribuent à de très nombreux mécanismes physiologiques. Le développement d’approches thérapeutiques ciblant les caspases a engendré un fort intérêt industriel dès les années 1990, suscitant d’intenses recherches sur les mécanismes biologiques, et conduisant à la mise au point de nombreux inhibiteurs synthétiques. La plupart de ces inhibiteurs sont des dérivés de peptides, ou mimétiques, capables d’interagir avec le site actif des caspases. Cependant, la conservation structurelle observée entre les différentes caspases est un défi pour le développement d’inhibiteurs sélectifs. À ce jour, cinq inhibiteurs de caspases ont été évalués pour leur efficacité clinique, mais aucune autorisation de mise sur le marché n’a été délivrée à ce jour. Contrairement aux présomptions initiales, les inhibiteurs sélectifs de la Caspase-3 n’ont pas atteint le stade d’essais cliniques, alors que le QPI-1007, un siARN dirigé contre la Caspase-2, a fait l’objet d’une étude clinique de phase III pour le traitement de neuropathies optiques ischémiques.

Le vieillissement est la conséquence de la dégradation progressive des fonctions de l’organisme menant à la mort. Les altérations accumulées au cours du vieillissement favorisent l’apparition de maladies liées à l’âge dont les maladies cardiovasculaires. La sénescence est le processus cellulaire sous-jacent au vieillissement et à l’origine du déclin de l’organisme. Les cellules sénescentes perdent leur capacité à proliférer mais elles restent métaboliquement actives en sécrétant un cocktail de molécules impliquées dans l’inflammation chronique et la progression des maladies liées à l’âge dont l’athérosclérose. L’angiopoiétine-like 2 (Angptl2) est une protéine pro-inflammatoire et anti-apoptotique directement impliquée dans le développement de l’athérosclérose et sécrétée par les cellules sénescentes. Dans cette optique, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle une inhibition de l’Angptl2 vasculaire serait propice à une atténuation de l’athérogenèse associée à la sénescence endothéliale. L’objectif a donc été d’étudier les effets bénéfiques d’une réduction de l’Angptl2 in vivo dans le développement de l’athérosclérose et la sénescence endothéliale chez des souris sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB100+/+). À l’aide d’un virus adeno-associé de sérotype 1 vecteur d’un petit ARN en épingle à cheveux dirigé contre l’Angptl2 (AAV1-shAngptl2), nous avons montré qu’un blocage de l’expression de l’Angptl2 vasculaire a diminué la taille des plaques d’athérome de 58% dans l’aorte thoracique des souris. Ces résultats s’expliquent par une diminution de la sénescence, du recrutement des monocytes et de l’inflammation dans l’endothélium ainsi qu’une diminution de l’inflammation et de l’infiltration des macrophages dans la média de la paroi artérielle. De plus, nous avons montré que dans les jours qui suivent l’administration du AAV1-shAngptl2, les cellules endothéliales sénescentes sont éliminées par apoptose ce qui favorise le recrutement de cellules endothéliales progénitrices destinées à renouveler l’endothélium, contribuant ainsi à une réduction de l’athérogenèse. Ces résultats démontrant le lien entre l’Angptl2 et la sénescence dans l’athérosclérose ont été validés par des données cliniques qui montrent que les niveaux d’expression vasculaire de l’Angptl2 corrèlent avec ceux du marqueur de sénescence p21 dans les artères mammaires de patients coronariens. Notre étude suggère donc que l’inhibition de l’Angptl2 vasculaire pourrait être une nouvelle approche sénolytique dans le but de réduire l’athérosclérose., Aging is associated with progressive deterioration of the organism functions leading to death. Accumulated alterations in aging favor the appearance of age-related diseases including cardiovascular diseases. Senescence is the cellular process underlying aging and the cause of organism decline. Senescent cells lose their ability to proliferate but remain metabolically active by secreting a cocktail of molecules involved in chronic inflammation and progression of age-related diseases such as atherosclerosis. Angiopoietin-like 2 (Angptl2) is a pro-inflammatory and an anti-apoptotic protein involved in the development of atherosclerosis and secreted by senescent cells. In this light, we hypothesized that an inhibition of vascular Angpt12 would be conducive to an attenuation of atherogenesis associated to endothelial senescence. The aim of my project was to study the beneficial effects of an in vivo reduction of Angptl2 in the development of atherosclerosis and endothelial senescence in severely dyslipidemic mice (LDLr - / -; hApoB100 + / +). Using a serotype 1 adeno-associated virus containing a short hairpin ARN against Angptl2 (AAV1-shAngptl2), we showed that blocking the expression of vascular Angptl2 decreased plaque size by 58% in the thoracic aorta of mice. These results are explained by a decrease in senescence, recruitment of monocytes and lower inflammation in the endothelium as well as a decrease in inflammation and infiltration of macrophages in the media of arterial wall. In addition, few days after the administration of AAV1-shAngptl2, we showed that senescent endothelial cells are eliminated by apoptosis, which in turn promotes the recruitment of endothelial progenitor cells in order to renew the endothelium, collectively contributing to a reduction of atherogenesis. These results demonstrate a link between Angptl2 and senescence in atherosclerosis, and they were validated by clinical data showing that vascular expression levels of Angptl2 correlates with the expression of the senescence marker p21 in the mammary arteries of patients with coronary artery disease. In conclusion, our study suggests that inhibition of vascular Angptl2 could be a new senolytic pathway to reduce atherosclerosis.

We discovered that the combination of small chemical compounds designed to inhibit Insulin-Degrading Enzyme (IDE) boosts dose-dependently the proteasome inhibitor carfilzomib-based cytotoxicity in many cancer cell lines. Alone, the compounds display no toxicity. In oncology, where there are still unmet medical needs, therapeutic combinations are real opportunities to increase drug efficacy and to reduce side effects. The therapeutic interest of our molecules has been demonstrated in a mouse model of multiple myeloma. Through this thesis work, we wanted to decipher the mechanism of action of this booster series. To do so, we used different strategies based on target profiling, proteome modulation and phenotype exploration. We analyzed, in kinetics and/or with dose response, different phenotypes like proteasome activity, aggresome quantification or pathways modulations, rationally selected on the basis of the mechanism of action of carfilzomib. We have developed and published a method to observe aggresomes that allows quantification of these formations by fluorescence microscopy at high throughput. A transcriptomic approach was performed to identify pathways in response to treatments. The only biological effect produced by the compounds alone that we observed is the modulation of genes involved in amino-acid metabolism pathways. The compounds were designed as inhibitors of insulin-degrading enzyme but several data support that other targets could be involved in the phenotype. To elucidate this, a preliminary proteomic approach was performed that allowed the identification of potential targets which need to be further validated. By multiple approaches, we were able to hypothesize on a potential mechanism of action of the apoptotic boost-induced by our chemical series with cytotoxic agents. Still, the causal chains of events remain to be fully described., Une série de composés synthétiques conçus pour inhiber l’Insulin-Degrading Enzyme (IDE) augmentent la puissance d’induction de l’apoptose par des inhibiteurs du protéasome, tel que carfilzomib, sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses de manière dose-dépendante. Utilisés seuls, les composés de cette série chimique ne présentent pas de toxicité. Dans le cancer, où le besoin médical est insatisfait, les combinaisons thérapeutiques sont des opportunités pour augmenter l’efficacité de la thérapie et réduire les effets indésirables. L’intérêt thérapeutique du développement de ces molécules a été démontré dans un modèle murin de myélome multiple. Par ces travaux de thèse nous avons voulu comprendre le mécanisme d’action de cette série chimique. Pour cela, nous avons utilisé différentes stratégies basées sur la modulation de cible(s), sur l’exploration de phénotypes et sur l’identification des modifications du protéome. Nous nous sommes intéressés à différents phénotypes, observables quantitativement et choisis de manière rationnelle par rapport au mécanisme d’action du carfilzomib, comme l’activité du protéasome, la quantité d’agrésomes et la modulation de voies de signalisation. Nous avons développé une méthode d’observation des agrésomes permettant leur quantification à haut débit en microscopie à fluorescence, et cela a fait l’objet d’une publication. Une approche transcriptomique nous a permis d’identifier des voies de signalisation en réponse aux traitements. Le seul effet cellulaire provoqué sans l’aide d’un autre composé que nous ayons pu mettre en évidence est la modulation de gènes impliqués dans le métabolisme des acides aminés. Les composés de cette série chimique ont été conçus pour inhiber l’enzyme IDE. Plusieurs données appuient l’implication de cette cible dans la physiopathologie du cancer. Cependant d’autres cibles pourraient être impliquées dans le boost apoptotique. Pour élucider cela, une approche préliminaire de protéomique a permis d’identifier des cibles potentielles, qu’il est nécessaire de valider. En multipliant les approches nous sommes en mesure d’émettre des hypothèses sur le mécanisme d’action de ces molécules boosters de l’apoptose induite par le carfilzomib, même si les chaînes causales complètes restent encore à décrire.

Over the past decades, physic-based anticancer therapies such as radiofrequencies, ultrasound, laser-assisted medicine, electroporation, photodynamic therapy and cold plasma have significantly increased. These novel approaches allow efficient eradication of cancer cells, either directly or via the stimulation of immune response, and are now proposed as vectorization methods for anti-cancer drugs delivery. More recently, there is a growing interest in the use for anti-cancer therapy based on reactive oxygen and nitrogen species (RONS)-enriched solutions exposed to cold plasma. Cancer cells can be selectively eradicated after being in contact with these plasma-activated liquids (PAL). Nevertheless, little is known about cellular mechanisms underlying cell death caused by PAL. In this light, we evaluate the therapeutic anti-cancer potential of different saline solutions exposed to cold plasma. In parallel, reversible electropermeabilization or electroporation (EP) is booming due to its development for clinical applications such as electrochemotherapy, which enhanced chemotherapeutic agents tumour delivery. We propose a novel approach based on the combination of PAL and EP with the aim of potentiate cytotoxic and genotoxic effects of PAL, via EP-induced tumour destabilization, and thus to achieve a more efficient eradication. First of all, we study the effect of phosphate buffered saline (PBS) and sodium chloride (NaCl) solutions exposed to a helium plasma jet, in vitro. Growth, viability and death, morphological changes and cell organization within multicellular tumour spheroids, a 3D avascularised tumour model, are evaluated. Two different cell lines are used: human colorectal cancer cells HCT-116 and peritoneal ovarian cancer cells SKOV-3. We show that PAL induce a specific cellular events cascade: intracellular ATP leakage, DNA damages and mitochondrial dysfunction, that lead to a rapid apoptosis of cells localized in the rim of spheroid (~6 hours after PAL treatment). Moreover, plasma-activated PBS display higher cytotoxicity and genotoxicity that plasma-activated NaCl, directly correlated with the amount of RONS generated in the PAL. Eradication efficiency of these PAL is limited to the peripheral cells. Several treatments were necessary to obtain spheroid total eradication. Thus, in the second part of the project, in order to alleviate penetration limits of PAL within spheroids, we propose to use reversible EP conditions. The combination of the two approaches lead to PAL cytotoxicity and genotoxicity potentiation, and induces cell death within whole spheroid. This potentiation is partly due to cellular junction's reorganization and autophagic cell death allowed by reversible EP. In vivo transposition of this new treatment modality, which can lead to solid tumour eradication, was initiated at the last part of the PhD on several tumour types, murine and human, and show variable tumour responses, depending on tumour model. The work carried out during this PhD contribute to, on the one hand, a better understanding of cell death mechanisms induced by PAL. On the other hand, we show for the first time that EP can be proposed as a way to potentiate PAL anti-cancer effects, thus leading to another cell death: the autophagy. This novel strategy, combination of PAL and EP, could complete anti-cancer therapies arsenal.; Au cours de ces dernières décennies, l'arsenal des thérapies anticancéreuses basées sur des principes physiques tels que les radiofréquences, les ultrasons, le laser, l'électroporation, la thérapie photo dynamique et les plasmas a considérablement augmenté. Ces approches permettent d'éradiquer les cellules cancéreuses, directement ou via la stimulation du système immunitaire. Elles sont aussi proposées en tant que méthodes de vectorisation pour délivrer des molécules d'intérêt thérapeutique. Plus récemment, est apparu un intérêt grandissant pour l'utilisation en thérapie anti-cancéreuse de liquides enrichis en espèces réactives de l'oxygène et de l'azote (RONS) via leur exposition au plasma froid. Les cellules cancéreuses peuvent ainsi être éradiquées, de façon sélective, après contact avec du liquide activé par plasma (PAL). Néanmoins, les mécanismes d'action de ces PAL sont encore peu connus à ce jour. C'est dans ce contexte que nous avons évalué le potentiel thérapeutique de différentes solutions salines exposées au jet de plasmas froids sur les cellules cancéreuses. Parallèlement, l'électroperméabilisation ou électroporation (EP) réversible connaît un essor important en raison du développement de ses applications cliniques notamment en électrochimiothérapie pour favoriser le transfert d'agent anti-cancéreux. Nous avons proposé une approche innovante reposant sur la combinaison des PAL et de l'EP, afin de potentialiser les effets cytotoxiques et génotoxiques des PAL, via la déstabilisation par l'EP de la tumeur, et obtenir ainsi une éradication plus efficace. Dans un premier temps, nous avons étudié l'effet du tampon phosphate salin (PBS) et du chlorure de sodium (NaCl) exposés au jet hélium de plasma froid, in vitro, sur la croissance, la viabilité/mort cellulaire et l'organisation structurelle de modèles 3D de tumeurs non-vascularisées (les sphéroïdes). Deux lignées cellulaires cancéreuses ont été utilisées : cellules de cancer colorectal humain HCT-116 et cellules de carcinose ovarienne péritonéale humaine SKOV-3. Nous avons mis en évidence que ces PAL induisent une cascade d'évènements cellulaires : fuite de l'ATP intracellulaire, dommages à l'ADN et dysfonction mitochondriale, provoquant la mort apoptotique des cellules des couches externes du sphéroïde dans les heures suivant le traitement (~6 heures). De plus, le PBS activé par plasma a montré une cytotoxicité et génotoxicité supérieure au NaCl, qui est corrélée avec la quantité de RONS présente dans les PAL. L'efficacité d'éradication des cellules cancéreuses de ces PAL se limitent aux cellules en périphérie des sphéroïdes. Il est nécessaire de faire plusieurs traitements pour avoir une éradication totale. Ainsi dans une deuxième partie, afin de pallier les problèmes de pénétration des PAL, nous avons proposé de les associer à l'EP réversible. La combinaison de ces deux approches a montré une potentialisation de la cytotoxicité et la génotoxicité des PAL, induisant la mort de toutes les cellules cancéreuses du sphéroïde. Cette augmentation de l'efficacité est en partie causée par des réarrangements des jonctions cellulaires suite à l'EP et à l'induction d'une mort cellulaire par autophagie.[...]