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West Nile Virus (WNV) is an emerging neurotropic flavivirus for which there is no treatment nor vaccine. Transmitted to humans during the blood meal of the vector mosquito, the virus is inoculated into the skin where it infects the keratinocytes of the epidermis. The defensive arsenal of the human keratinocyte includes the synthesis of 9 antimicrobial peptides whose activity against WNV has never been studied so far. In this work, we evaluated the antiviral and immunomodulatory properties of human cathelicidin LL-37, human beta-defensin type 3 (hBD-3), and two S100 family peptides, psoriasin S100A7 and calprotectin S100A8/A9. Our results showed a direct antiviral activity of LL-37, at high concentration (10 µg/mL), resulting in a reduction of the viral load in the supernatant of the infected keratinocytes and of the infectious titer of a viral inoculum incubated in presence of the peptide. In contrast, hBD-3 treatment did not have a significant impact on WNV infection at the concentrations tested. In addition, a significant increase in the expression of several inflammatory markers at the transcriptomic and protein levels was observed in the presence of each of the two peptides compared to cells stimulated by a synthetic double-stranded RNA, poly (I:C), or infected with WNV in their absence. In the second part of this work, the experiments carried out with the S100A7 and S100A8/A9 peptides proved to be disappointing. Addition of the peptides during the infection of keratinocytes or the use of genetically modified cells to overexpress the peptides of interest showed no significant impact on the replication of WNV. Moreover, no virucidal effect of S100 peptides at a concentration of 10 µg/mL nor immunomodulatory properties was observed. In conclusion, these results suggest an indirect antiviral effect of LL-37 and hBD-3 by potentiation of the innate immune response of the keratinocyte to infection. These immunomodulatory properties would be added, for LL-37, to a direct action by altering the viral particle. In contrast, S100 family peptides do not appear to have a major antiviral role in the keratinocyte antiviral response to WNV infection. In general, this work underlines the still little-known antiviral potential of molecules produced by the skin and keratinocytes at the entry point and initial site of replication of WNV and arboviruses in the organism., Le Virus West Nile (WNV) est un flavivirus neurotrope émergent contre lequel il n’existe ni traitement ni vaccin. Transmis à l’Homme lors du repas sanguin du moustique vecteur, le virus est inoculé dans la peau où il infecte les kératinocytes de l’épiderme. L’arsenal défensif du kératinocyte humain inclut la synthèse de 9 peptides antimicrobiens dont l’activité contre le WNV n’a jusqu’ici jamais été étudiée. Au cours de ce travail, nous avons évalué les propriétés antivirales et immunomodulatrices de la cathélicidine humaine LL-37, de la bêta-défensine humaine de type 3 (hBD-3) et de deux peptides de la famille S100, la psoriasine S100A7 et la calprotectine S100A8/A9. Nos résultats ont montré une activité antivirale directe de la LL-37, à forte concentration (10 µg/mL), se traduisant par une réduction de la charge virale dans le surnageant des kératinocytes infectés et du titre infectieux d'un inoculum viral incubé en présence du peptide. En revanche, le traitement par hBD-3 n’a pas eu d’impact significatif sur l'infection par le WNV aux concentrations testées. Par ailleurs, une augmentation significative de l’expression de plusieurs marqueurs inflammatoires aux niveaux transcriptomique et protéique a été observée en présence de chacun des deux peptides par rapport aux cellules stimulées par un ARN bicaténaire de synthèse, le poly (I:C), ou infectées par le WNV en leur absence. Dans la seconde partie de ce travail, les expérimentations menées avec les peptides S100A7 et S100A8/A9 se sont révélées décevantes. L’apport exogène des peptides au cours de l’infection de kératinocytes ou le recours à des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer les peptides d’intérêt n’a montré aucun impact significatif sur la réplication du WNV. En complément, aucun effet virucide des peptides S100 à la concentration de 10 µg/mL ni immunomodulateur n’a été observé. En conclusion, ces résultats suggèrent un effet antiviral indirect de la LL-37 et d’hBD-3 par potentialisation de la réponse immunitaire innée du kératinocyte à l’infection. Ces propriétés immunomodulatrices viendraient s’ajouter, pour la LL-37, à une action directe par altération de la particule virale. En revanche, les peptides de la famille S100 ne semblent pas avoir de rôle antiviral majeur dans la réponse antivirale du kératinocyte à l’infection par le WNV. De façon générale, ce travail souligne les potentialités antivirales, encore méconnues, des molécules produites par la peau et les kératinocytes à la porte d'entrée et au site initial de réplication du WNV et des arbovirus dans l'organisme.

L’augmentation de l’incidence des infections bactériennes par des souches résistantes, multirésistantes, voire même ultrarésistantes, aux antibiotiques, combinés à la crise de découverte de nouvelles molécules depuis les années 1960 et du sous-investissement chronique de certains états dans la recherche publique, pourrait coûter la vie à 10 millions d’êtres humains par an d’ici 2050. L’écrasante majorité des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont des bactéries à Gram négatif. Ceci est notamment dû à la composition intrinsèque de leur enveloppe, leur permettant d’être insensibles à de nombreuses molécules pourtant létales pour d’autres types de bactéries. L’étude des composants et des mécanismes de biosynthèse de l’enveloppe, qui sont essentiels au maintien de l'intégrité des bactéries et peuvent être impliqués dans leur virulence, devrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le premier chapitre, nous allons tout d’abord faire un tour d’horizon des éléments composant l’enveloppe des bactéries à Gram négatif, des mécanismes de résistance aux antibiotiques et du danger que représentent les bactéries à Gram négatif. Mes résultats de recherches, présentés sous forme de quatre articles aux chapitres deux à cinq, sont précédés d’une mise en contexte des recherches propres aux deux laboratoires, portant d’une part sur les biofilms et la mobilité de Vibrio cholerae et d’autre part sur l’enveloppe de Escherichia coli. Dans le premier article, nous avons déterminé par quel mécanisme la polymyxine B en concentration sous-inhibitrice affecte la formation de biofilm chez Vibrio cholerae. Nous avons observé que la polymyxine B affecte principalement le flagelle par une action mécanique. La formation de biofilm nécessitant le flagelle dans ses premières étapes de formation, nous avons conclu que l’action de la polymyxine B prévenait ce changement d’état. Dans le second article, nous avons conçu un protocole d’évolution expérimentale qui nous a permis d’identifier des mutations dans différents gènes permettant à Vibrio cholerae de se déplacer plus rapidement en présence de concentration sous-inhibitrice de polymyxine B. Nous avons alors identifié chez plusieurs souches différentes mutations ayant probablement réduit ou anéanti la fonction des protéines IhfA, DacB, VacJ (MlaA) et MlaF. En nous basant sur la littérature, nous proposons que la perte de fonction de ces 5 protéines induisant l’augmentation de la mobilité en présence de polymyxine B puisse s’expliquer selon trois mécanismes, impliquant la stabilité de l’enveloppe, la sécrétion de vésicules de membrane ou une altération de l’expression de différents gènes. Dans le troisième article, nous avons étudié l’implication du stress oxydatif dans l’arrêt de la synthèse de la paroi qui est fatal au mutant ∆elyC de Escherichia coli. Nous avons alors démontré que la lyse du mutant ∆elyC est causée par la surproduction de radicaux hydroxyles dans son enveloppe. Cette molécule cause des dommages dans l’enveloppe suffisamment importants pour provoquer l’arrêt de synthèse de la paroi. Le mécanisme provoquant cette surproduction de radicaux toxiques reste encore à déterminer. Par le biais de l’étude de la fonction du facteur ElyC, nous avons découvert une nouvelle vulnérabilité dans l’homéostasie de l’enveloppe qu’il nous tarde de pouvoir exploiter. Dans le dernier article, nous avons étudié l’importance de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries dans le processus létal apparaissant en l’absence du facteur ElyC. Nous avons découvert que le mutant ∆elyC accumule un élément commun aux voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries, l’undécaprényl pyrophosphate. Nous avons également découvert que l’augmentation du recyclage de cette dernière via la surexpression du gène codant pour la protéine PgpB permettait de prévenir la lyse du mutant. Notre hypothèse est que l’absence de ElyC induit une mauvaise répartition de l’undécaprényl phosphate entre les voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries. La suractivité de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries induirait l’accumulation d’undécaprényl pyrophosphate provoquant l’inhibition de Pbp1b, empêchant l’ajout de nouvelles sous-unités à la paroi conduisant ainsi à la lyse du mutant ∆elyC. Ainsi l’ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre et d’identifier des vulnérabilités de l’enveloppe de Vibrio cholerae et Escherichia coli, de préciser certains mécanismes ainsi que d’entrevoir le rôle de divers facteurs impliqués dans l’homéostasie de leur enveloppe., The increased incidence of bacterial infections by resistant, multiresistant and even extensively drug-resistant strain, combined with the crisis of new molecules discovery since the 1960s and the chronic underinvestment of certain states in public research, could cost 10 million human lives per year by 2050. The overwhelming majority of resistant bacteria are the Gram-negative one. This is mainly due to the intrinsic composition of their envelope, allowing them to be insensitive to many molecules yet lethal for other types of bacteria. The study of envelope components and biosynthetic mechanisms, which are essential for the maintenance of bacterial integrity and could be involved in their virulence, should lead to the identification of new therapeutic targets. The first chapter gave an overview of the different elements composing Gram-negative bacteria envelope, mechanisms of resistance and the threat that Gram-negative bacteria represent. The presentation of my work, divided in four articles from chapter two to chapter five, was preceded by a contextualization of the research projects specific to both laboratories, on biofilm and motility of Vibrio cholerae on one hand and on Escherichia coli envelope from the other hand. In the first paper, we determined the mechanism by which a sub-inhibitory concentration of polymyxin B affects biofilm formation in Vibrio cholerae. We observed that polymyxin B mainly affected the flagellum by a mechanical action. Since biofilm formation requires the flagellum in the early stages of its formation, we concluded that the action of polymyxin B prevented this change in Vibrio cholerae lifestyle. In the second paper, we designed an experimental evolution protocol which allowed us to identify mutations in different genes that increase Vibrio cholerae motility in the presence of sub-inhibitory concentration of polymyxin B. We then identified that different mutations had altered ihfA, dacB, vacJ (mlaA) and mlaF genes in different mutants. These mutations have probably induced reduction or loss of function of the proteins for which they respectively code. Based on literature, we hypothesize that the loss function of these proteins inducing increase in mobility in the presence of polymyxin B could be explained by three 7 mechanisms involving envelope stability, secretion of membrane vesicles or altered expression of various genes. In the third paper, we investigated the involvement of oxidative stress in the fatal peptidoglycan synthesis arrest occurring in the ∆elyC mutant of Escherichia coli. We then demonstrated that lysis of the ∆elyC mutant is caused by the overproduction of hydroxyl radicals in its envelope. This molecule causes multiple and sufficiently important damages in the envelope to stop the synthesis of the wall. The mechanism causing this overproduction of toxic radicals has yet to be determined. By studying the function of the ElyC factor, we have discovered a new weakness in envelope homeostasis that we are eager to exploit. In the last paper, based on a previously formulated hypothesis, we investigated the importance of the enterobacterial common antigen synthesis pathway in the lethal process occurring in the absence of ElyC. We found that the ∆elyC mutant accumulates common element to the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, undecaprenyl pyrophosphate. We also observed that the ∆elyC mutant lysis phenotype could be suppressed by increasing undecaprenyl pyrophosphate recycling via the overexpression of the gene coding for the phosphatase PgpB. We propose that the absence of ElyC induces a misallocation of undecaprenyl phosphate between the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, in favors the latter pathway. Overactivation of the enterobacterial common antigen pathway would induce undecaprenyl phosphate accumulation, causing inhibition of Pbp1b, thus blocking addition of new subunits to the cell wall and leading to its lysis. Ultimately, all the original data generated by my research project has led to a better understanding of envelope vulnerabilities of Vibrio cholerae and Escherichia coli, to clarify certain mechanisms but also to glimpse the role of various factors involved in the homeostasis of their envelope., L'aumento dell’incidenza delle infezioni da batteri resistenti, multi-resistenti e anche estremamente resistenti agli antibiotici, combinata con la rarefazione della scoperta di nuove molecole fra gli anni 1960 e il sotto investimento cronico di certe nazioni nella ricerca pubblica, potrebbe costare la vita a 10 milioni di essere umano all'anno nel 2050. La stragrande maggioranza delle specie resistenti agli antibiotici sono batteri Gram- negativi. Questo è dovuto principalmente alla composizione intrinseca dei loro involucri che permette loro di essere insensibili a molte molecole che sono letali per altri tipi di batteri. Lo studio delle componenti e i meccanismi di sintesi dell’incurvo, che sono essenziali nell’integrità dei batteri e che possono essere coinvolti nella loro virulenza, dovrebbe permettere l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Nel primo capitolo, avremo una panoramica dei diversi elementi che compongono l'involucro dei batteri Gram-negativi, dei meccanismi di resistenza e della minaccia che i batteri Gram-negativi rappresentano. La presentazione del mio lavoro, diviso in quattro articoli dal capitolo due a cinque, sarà preceduta da una contestualizzazione dei progetti di ricerca specifici di ciascuno dei due laboratori, sul biofilm e la motilità di Vibrio cholerae da un lato e sull'involucro di Escherichia coli dall'altro. Nel primo articolo, abbiamo determinato il meccanismo con cui la polimixina B in concentrazione sub-inibitoria influenza la formazione de biofilm in Vibrio cholerae. Abbiamo osservato che la polimixina B danneggia principalmente il flagello attraverso un'azione meccanica. Poiché la formazione del biofilm richiede il flagello nelle prime fasi della sua formazione, abbiamo concluso che l'azione della polimixina B ha impedito questo cambiamento nello stile di vita di Vibrio cholerae. Nel secondo articolo, abbiamo messo a punto un protocollo di evoluzione sperimentale che ci ha permesso di identificare diversi geni che aumentano la motilità di Vibrio cholerae in presenza di una concentrazione sub-inibitoria di polimixina B. Abbiamo quindi identificato vari mutazioni in diversi varianti che hanno probabilmente provocato la riduzione o il soppresso della funzione delle proteine IhfA, DacB, VacJ (MlaA) e MlaF. Sulla base della letteratura, proponiamo che la perdita di funzione di queste proteine inducendo un aumento della 9 mobilità in presenza di polimixina B può essere spiegato attraverso tre meccanismi coinvolgendo la stabilità dell'involucro, la secrezione di vescicole di membrana o l’alterazione dell’espressione di diversi geni. Nel terzo articolo, abbiamo studiato il coinvolgimento dello stress ossidativo nell'arresto della sintesi del peptidoglicano che è fatale al mutante ∆elyC di Escherichia coli. Abbiamo poi dimostrato con numerosi esperimenti che la lisi del mutante ∆elyC è causata dalla sovrapproduzione di radicali idrossilici nel suo involucro. Questa molecola causa importanti danni nell’involucro provocando l’inibendo della sintesi del peptidoglicano. Il meccanismo che causa questa sovrapproduzione di radicali tossici deve ancora essere determinato. Studiando la funzione del fattore ElyC, abbiamo scoperto una nuova vulnerabilità nell'omeostasi dell’involucro che siamo in fretta di sfruttare. Nel nostro ultimo articolo, basandoci su un'ipotesi precedentemente formulata, abbiamo studiato l'importanza della via di sintesi dell'antigene comune agli enterobatteri nel processo letale che si svolge in assenza di ElyC. Abbiamo scoperto che il mutante ∆elyC accumula un elemento comune alle vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri, l'undecaprenil pirofosfato. Abbiamo anche scoperto che l'aumento del riciclaggio di quest'ultimo attraverso la sovraespressione del gene pgpB previene la lisi del mutante. Proponiamo che l'assenza di ElyC induce una allocazione diffetosa del undecaprenil fosfato tra le vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri. L'iperattivazione della via dell'antigene comune agli enterobatteri provoca l'accumulo di undecaprenil pirofosfato, causando l'inibizione di Pbp1b e dunque dell’aggiunta di nuove unità al peptidoglicano, provocandone quindi la lisi. Quindi, questo lavoro ha portato a una migliore comprensione o identificazione delle vulnerabilità dell'involucro di Vibrio cholerae ed Escherichia coli, a chiarire certi meccanismi essenziali ma anche a intravedere il ruolo di vari fattori coinvolti nell'omeostasi del loro involucro., Travaux de recherche effectués sous la supervision de la docteure Marylise Duperthuy (directrice) et de la docteure Catherine Paradis-Bleau (codirectrice).

Mitochondria and chloroplasts are eukaryotic organelles that originated from endosymbiotic events betweena bacteria and a host cell more than a billion years ago. Today, the vast majority of proteins present in theseorganelles are encoded in the nucleus. Targeting of cytosolic proteins to mitochondria and chloroplasts couldderive from a mechanism of bacterial resistance to the attacks of antimicrobial peptides, major actors of theinnate immunity system, present in all domains of life. This hypothesis is based on the striking similaritiesbetween these two mechanisms. During my PhD, I challenged this hypothesis. In a first part, I showed thata subset of antimicrobial peptides structuring in ↵-amphipathic helix and organelle targeting peptides havecommon physico-chemical properties, distinct from those shared by bacterial and eukaryotic secretory signalpeptides whose common evolutionary origin is well established. Furthermore, they can functionally complementeach other, supporting the hypothesis of their common origin (Garrido et al. 2020). The molecular transitionrequired for the emergence of a targeting peptide from an antimicrobial peptide involves 3 crucial steps : (i)the replacement of lysines with arginines, which decreases microbial activity and promotes addressing activity,(ii) the acquisition of a cleavage site and (iii) the acquisition of a loosely structured N-terminal domain forchloroplast specific targeting within photosynthetic eukaryotes (Caspari, Garrido et al. , submitted). In asecond part, I established the exhaustive catalog of peptidase homologous families involved in the degradationof taregting peptides across the tree of life. I showed that each of these peptidases was acquired via a horizontaltransfer event from a bacterium; and consistent with the hypothesis, many homologs from antimicrobialpeptide-resistant bacterial are closely related to the organelle peptidases (Garrido et al., submitted)., Les mitochondries et les chloroplastes sont des organites de cellules eucaryotes issus d’événements endosymbiotiques impliquant une bactérie et une cellule hôte il y a plus d’un milliard d’années. Aujourd’hui la très grande majorité des protéines présentes dans ces organites sont codées dans le noyau. Le ciblage des protéines cytosoliques vers les mitochondries et les chloroplastes pourrait dériver d’un mécanisme de résistance bactérienne aux attaques de peptides antimicrobiens, ces acteurs majeurs de l’immunité innée, présents dans tous les domaines du vivant. Cette hypothèse se base sur les similarités frappantes entre ces deux mécanismes. Au cours de mon doctorat, j’ai mis à l’épreuve cette hypothèse. Dans une première partie, j’ai pu montrer qu’un sous-ensemble de peptides antimicrobiens se structurant en hélice ↵-amphipathique et les peptides d’adressage possédaient des propriétés physico-chimiques communes, qui sont distinctes de celles partagées entre les peptides signaux de sécrétion bactériens et eucaryotes dont l’origine évolutive commune est bien établie. De plus, ils peuvent se complémenter fonctionnellement in vivo, confortant l’hypothèse de leur origine commune (Garrido et al. 2020). La transition moléculaire nécessaire pour passer d’un peptide antimicrobien à un peptide d’adressage comporte trois étapes cruciales : i) le remplacement des lysines par des arginines qui permet de diminuer l’activité microbienne et de favoriser l’activité d’adressage, ii) l’acquisition d’un site de clivage au sein des peptides d’adressage, iii) l’acquisition d’un domaine N-terminal peu structuré afin d’orienter l’adressage vers le chloroplaste et non vers la mitochondrie au sein des eucaryotes photosynthétiques (Caspari, Garrido et al., article soumis). Dans une deuxième partie, j’ai établi le catalogue exhaustif des familles d’homologues des peptidases impliquées dans la dégradation des peptides d’adressage dans l’arbre du vivant. J’ai pu démontrer que chacune de ces peptidases a été acquise via un évènement de transfert horizontal depuis une bactérie. En accord avec notre hypothèse, on retrouve de nombreux homologues de bactéries résistantes aux peptides antimicrobiens proches des peptidases des organites (Garrido et al., article soumis).

Vibrio cholerae est une Gamma protéobactérie, colonisant les environnements aquatiques marins mais aussi les rivières et les estuaires. V. cholerae est l'agent étiologique du choléra, maladie toujours considérée comme problème majeur de santé publique et causant d'importantes diarrhées aqueuses. Cette bactérie possède de multiples facteurs de virulence, dont la toxine cholérique et le pilus corégulé avec la toxine, responsables des symptômes typiques de la maladie. Cependant, V. cholerae possède d'autres facteurs de virulence, dont le Système de Sécrétion de Type VI (SST6) qui est un système permettant à la bactérie d'injecter des effecteurs bactériens dans les cellules voisines eucaryotes ou procaryotes. De ce fait, le SST6 est impliqué aussi bien dans la virulence chez l'Homme que dans la compétition inter-bactérienne. Lors de son cycle de vie, la bactérie est en contact étroit avec de nombreuses molécules antimicrobiennes provenant du système immunitaire de l’hôte, du microbiote intestinal mais aussi de l’environnement aquatique où des antibiotiques sont retrouvés en concentrations sous-létales. Ces molécules antimicrobiennes sont connues pour moduler les gènes de virulence des bactéries pathogènes. Ainsi, nos recherches se basent sur l’hypothèse que de faibles doses en antimicrobiens auraient la capacité de moduler le SST6 de Vibrio cholerae. Ainsi, afin de déterminer l’impact des antimicrobiens sur le SST6, des analyses de protéomique par spectrométrie de masse puis par Western blot dirigés contre des protéines du SST6 ont été réalisées sur des bactéries traitées avec différents antimicrobiens en concentrations sous-létales. Puis, les activités bactéricides du SST6 de Vibrio cholerae ont été analysées par des tests de compétitions inter bactériennes avec Escherichia coli et pour finir, nous avons évalué la capacité du SST6 à apporter à Vibrio cholerae une résistance aux antimicrobiens. Nos résultats démontrent que la présence d’antimicrobiens lors de la croissance bactérienne peut moduler l’abondance des protéines du SST6 dans les cellules et sécrétées, mais cette modulation ne se reflète pas sur les activités bactéricides de V. cholerae. Enfin, nous n’avons pas trouvé d’implication du SST6 dans la résistance aux antimicrobiens., Vibrio cholerae is a Gamma proteobacterium, colonizing marine aquatic environments, rivers and estuaries. V. cholerae is the etiological agent of cholera, a disease still considered as a major public health problem, which causes severe watery diarrhea. This bacterium has multiple virulence factors, including cholera toxin and toxin coregulated pilus, which are responsible for the typical symptoms of the disease. However, V. cholerae has accessory virulence factors, including the Type VI Secretion System (T6SS). The T6SS is a versatile weapon allowing bacteria to inject effectors into neighboring eukaryotic or prokaryotic cells. T6SS is involved in virulence in humans as well as in interbacterial competition. During its lifestyle, V. cholerae is in close contact with many antimicrobial molecules produced by the host immune system or the gut microbiota but also from aquatic environment where antibiotics are often found in sub-lethal concentrations. These antimicrobial molecules are known to modulate virulence genes of pathogenic bacteria. Thus, our research is based on the hypothesis that low doses of antimicrobials would have the ability to modulate Vibrio cholerae T6SS. In order to determine the impact of antimicrobials on the T6SS, proteomic analyzes by mass spectrometry and by Western blot directed against T6SS proteins have been carried out on bacteria grown with different antimicrobials at sub-lethal concentrations. Then, the bactericidal activities of Vibrio cholerae T6SS has been studied by inter bacterial competition using Escherichia coli as a prey. Finally, we evaluated the ability of T6SS to provide Vibrio cholerae antimicrobial resistance. Our results demonstrated that the presence of antimicrobials during bacterial growth can modulate the abundance of T6SS proteins in the bacterial cells and secreted. However, we were unable to clearly demonstrate that this modulation affected interbacterial competition involving Vibrio cholerae. Finally, we found no evidence that the T6SS is involved in antimicrobial resistance.

Cationic antimicrobial peptides (AMPs) are evolutionary small and amphipatic conserved molecules which are involved in the immune defense of a wide range of organisms, including bacteria, insects, plants and vertebrates. Beside their direct microbicidal activity against pathogens, most of them are known to exert immunomodulatory functions on innate and adaptive immune cells. Here we evaluated the immunomodulatory properties of an original cationic AMP, named P17, discovered and isolated by our team from the ant Tetramorium bicarinatum venom. We have focused on its efficiency to modulate human monocyte-derived macrophages (h-MDM) differentiation and its capacity to provide them an antifungal activity against the main opportunistic yeast Candida albicans (C. albicans). We showed that P17 directed h-MDM polarization toward an alternative phenotype characterized by mannose (MR) and dectin-1 C-type lectin receptors (CLRs) upregulation. Interestingly, we demonstrated that this upregulation of MR and Dectin-1 in P17-treated h-MDM requires AA mobilization and leukotriene B4 (LTB4) synthesis, essential for PPAR activation. We also demonstrated that this AA metabolite led to the PPARƴ nuclear receptor activation which is a key factor of macrophages alternative activation and the associated CLRs expression. In this study, we observed that P17-activated h-MDM exhibited an improved capacity to eliminate C. albicans. Indeed, these P17-polarized macrophages displayed an increased ability to recognize and phacocyte yeasts. Furthermore, the study of microbicidal mechanisms leading to C. albicans clearance revealed that P17-activated h-MDM produced reactive oxygen species (ROS) and inflammasome-dependant IL-1ß in high amounts. These mechanisms induction in P17-polarized h-MDM was dependent on the LTB4/ PPARƴ/Dectin-1-MR axis. Finally, these data were supported by in vivo experiments demonstrating that P17-treated mice infected with C. albicans developed less severe gastrointestinal infection related to a higher efficiency of their macrophages to engulf C. albicans, to produce ROS and to kill yeasts. Altogether, these results identify P17 as an original activator of the fungicidal response of macrophages that acts downstream the pathway leading to CLRs expression through PPARƴ activation.; Les peptides antimicrobiens (PAMs) cationiques sont des molécules amphipatiques conservées chez une grande diversité d'espèces vivantes. Ils participent ainsi à la défense immunitaire de nombreux organismes incluant les bactéries, les insectes, les plantes et les vertébrés. En plus de leur activité microbicide directe dirigée contre un large spectre de pathogènes, la plupart des PAMs cationiques sont désormais connus pour exercer des fonctions immunomodulatrices sur les réponses innée et adaptative. Notre équipe a récemment découvert et isolé un nouveau PAM à partir du venin de la fourmi Tetramorium bicarinatum, nommé P17. Dans ce travail, nous avons étudié les propriétés immunomodulatrices du P17 sur la réponse immunitaire innée médiée par les macrophages. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à sa capacité à moduler la différenciation de macrophages dérivés de monocytes humains (h-MDM) ainsi que leurs fonctions fongicides associées vis-à-vis d'une levure opportuniste majeure Candida albicans (C. albicans). Nous avons ainsi pu mettre en évidence que le P17 oriente la différenciation des h-MDM vers un phénotype alternatif caractérisé par la surexpression des récepteurs lectine de type C (CLRs) tels que Dectine-1 et le récepteur mannose (MR). De manière intéressante, nous avons mis en évidence que la surexpression de ces deux récepteurs à la surface des h-MDM activés par le P17 nécessite la mobilisation de l'acide arachidonique et la production de leucotriène B4 (LTB4). Nous avons également démontré que ce métabolite de l'AA conduit à l'activation du récepteur nucléaire PPARƴ, facteur clé de l'activation alternative des macrophages et de l'expression des CLRs associée à ce phénotype. Au cours de ce travail, nous avons démontré que les h-MDM polarisés par le P17 présentent une meilleure capacité à éliminer C. albicans. En effet, ces h-MDM activés par le P17 ont une capacité de reconnaissance, par les CLRs Dectine-1 et MR, et de phagocytose de C. albicans augmentée. De plus, l'étude des mécanismes microbicides conduisant à l'élimination de C. albicans révèle que les h-MDM activés par le P17 produisent de fortes quantités d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et d'IL-1ß via l'inflammasome. Ainsi, ce travail met en évidence que l'induction de l'activité fongicide des h-MDM par le P17 est dépendante de l'axe LTB4/ PPARƴ/Dectine-1-MR. Nous avons finalement confirmé ces données in vivo sur un modèle de candidose gastro-intestinale induite chez des souris traitées par voie intra-péritonéale par P17 ou non. Les résultats obtenus ont révélé que les souris traitées par P17 étaient plus résistantes à l'infection gastro-intestinale à C. albicans. La diminution de la charge fongique au niveau du cæcum des souris traitées par le P17 est associée à une meilleure efficacité de leurs macrophages à phagocyter C. albicans, à produire des ROS et à tuer C. albicans. Ainsi, ces résultats identifient le P17 comme un activateur original des propriétés antifongiques des macrophages agissant en aval de la voie permettant l'induction de l'expression des CLRs via PPARƴ. Ces données révèlent pour la première fois l'implication d'un PAM dans le contrôle de la différenciation des macrophages et leurs fonctions microbicides.

Cationic antimicrobial peptides (AMPs) are evolutionary small and amphipatic conserved molecules which are involved in the immune defense of a wide range of organisms, including bacteria, insects, plants and vertebrates. Beside their direct microbicidal activity against pathogens, most of them are known to exert immunomodulatory functions on innate and adaptive immune cells. Here we evaluated the immunomodulatory properties of an original cationic AMP, named P17, discovered and isolated by our team from the ant Tetramorium bicarinatum venom. We have focused on its efficiency to modulate human monocyte-derived macrophages (h-MDM) differentiation and its capacity to provide them an antifungal activity against the main opportunistic yeast Candida albicans (C. albicans). We showed that P17 directed h-MDM polarization toward an alternative phenotype characterized by mannose (MR) and dectin-1 C-type lectin receptors (CLRs) upregulation. Interestingly, we demonstrated that this upregulation of MR and Dectin-1 in P17-treated h-MDM requires AA mobilization and leukotriene B4 (LTB4) synthesis, essential for PPAR activation. We also demonstrated that this AA metabolite led to the PPARƴ nuclear receptor activation which is a key factor of macrophages alternative activation and the associated CLRs expression. In this study, we observed that P17-activated h-MDM exhibited an improved capacity to eliminate C. albicans. Indeed, these P17-polarized macrophages displayed an increased ability to recognize and phacocyte yeasts. Furthermore, the study of microbicidal mechanisms leading to C. albicans clearance revealed that P17-activated h-MDM produced reactive oxygen species (ROS) and inflammasome-dependant IL-1ß in high amounts. These mechanisms induction in P17-polarized h-MDM was dependent on the LTB4/ PPARƴ/Dectin-1-MR axis. Finally, these data were supported by in vivo experiments demonstrating that P17-treated mice infected with C. albicans developed less severe gastrointestinal infection related to a higher efficiency of their macrophages to engulf C. albicans, to produce ROS and to kill yeasts. Altogether, these results identify P17 as an original activator of the fungicidal response of macrophages that acts downstream the pathway leading to CLRs expression through PPARƴ activation.; Les peptides antimicrobiens (PAMs) cationiques sont des molécules amphipatiques conservées chez une grande diversité d'espèces vivantes. Ils participent ainsi à la défense immunitaire de nombreux organismes incluant les bactéries, les insectes, les plantes et les vertébrés. En plus de leur activité microbicide directe dirigée contre un large spectre de pathogènes, la plupart des PAMs cationiques sont désormais connus pour exercer des fonctions immunomodulatrices sur les réponses innée et adaptative. Notre équipe a récemment découvert et isolé un nouveau PAM à partir du venin de la fourmi Tetramorium bicarinatum, nommé P17. Dans ce travail, nous avons étudié les propriétés immunomodulatrices du P17 sur la réponse immunitaire innée médiée par les macrophages. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à sa capacité à moduler la différenciation de macrophages dérivés de monocytes humains (h-MDM) ainsi que leurs fonctions fongicides associées vis-à-vis d'une levure opportuniste majeure Candida albicans (C. albicans). Nous avons ainsi pu mettre en évidence que le P17 oriente la différenciation des h-MDM vers un phénotype alternatif caractérisé par la surexpression des récepteurs lectine de type C (CLRs) tels que Dectine-1 et le récepteur mannose (MR). De manière intéressante, nous avons mis en évidence que la surexpression de ces deux récepteurs à la surface des h-MDM activés par le P17 nécessite la mobilisation de l'acide arachidonique et la production de leucotriène B4 (LTB4). Nous avons également démontré que ce métabolite de l'AA conduit à l'activation du récepteur nucléaire PPARƴ, facteur clé de l'activation alternative des macrophages et de l'expression des CLRs associée à ce phénotype. Au cours de ce travail, nous avons démontré que les h-MDM polarisés par le P17 présentent une meilleure capacité à éliminer C. albicans. En effet, ces h-MDM activés par le P17 ont une capacité de reconnaissance, par les CLRs Dectine-1 et MR, et de phagocytose de C. albicans augmentée. De plus, l'étude des mécanismes microbicides conduisant à l'élimination de C. albicans révèle que les h-MDM activés par le P17 produisent de fortes quantités d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et d'IL-1ß via l'inflammasome. Ainsi, ce travail met en évidence que l'induction de l'activité fongicide des h-MDM par le P17 est dépendante de l'axe LTB4/ PPARƴ/Dectine-1-MR. Nous avons finalement confirmé ces données in vivo sur un modèle de candidose gastro-intestinale induite chez des souris traitées par voie intra-péritonéale par P17 ou non. Les résultats obtenus ont révélé que les souris traitées par P17 étaient plus résistantes à l'infection gastro-intestinale à C. albicans. La diminution de la charge fongique au niveau du cæcum des souris traitées par le P17 est associée à une meilleure efficacité de leurs macrophages à phagocyter C. albicans, à produire des ROS et à tuer C. albicans. Ainsi, ces résultats identifient le P17 comme un activateur original des propriétés antifongiques des macrophages agissant en aval de la voie permettant l'induction de l'expression des CLRs via PPARƴ. Ces données révèlent pour la première fois l'implication d'un PAM dans le contrôle de la différenciation des macrophages et leurs fonctions microbicides.

The solar saltern of Sfax is a hypersaline located in the central area of the eastern coast of Tunisia. In this study, we isolated, identified, and characterized halophilic strains producing antimicrobial peptides (halocins), aiming to understand their role in microbial interactions in hypersaline environments. Two ponds (TS18, 390 g.L-1 NaCl and M1, 200 g.L-1 NaCl) were selected for sampling. Thirty-five halophilic strains have been isolated and characterized, among which 11 displayed antimicrobial activity. Three of them produced antimicrobial substances of proteinaceous nature. Using PCR and RT-PCR, we have demonstrated that Halobacterium salinarum ETD5 and ETD8 express the gene encoding halocin S8, a 3.6 kDa peptide previously isolated from a strain S8 unidentified. The peptide was purified from cultures of strain Hbt. salinarum ETD5. Following bioguided purification, the active fractions revealed two protein bands of 8 and 14 kDa exhibiting antimicrobial activity. N-terminal sequencing and mass spectrometry analyses allowed identification of these two halocins. The 8 kDa band corresponds to halocin S8, undergoing a different proteolytic post-translational processing from that originallydescribed. Cloning and sequencing of the gene encoding the precursor of halocin S8 showed that the sequence is identical for both strains ETD5 and S8a. The 14 kDa band is a new halocin termed halocin S14. Halocin S14 corresponds to an N-terminally truncated portion of the archaeal Mnsuperoxide dismutase (SOD). This could result from divergent evolution of a gene encoding two distinct proteins, or a different post-translational processing of SOD. Our study helps to better understand which molecules are involved in microbial interactions within hypersaline environments and and how they contribute to the competitions in such extreme environments, which are susceptible to give rise to original structures and modes of action.; La saline de Sfax est un milieu hypersalin localisé dans la zone centrale de la côte est de Tunisie. Dans ce travail, nous avons isolé, identifié, et caractérisé des souches halophiles produisant des peptides antimicrobiens (halocines), afin de mieux comprendre leur rôle dans les interactions microbiennes au sein des milieux hypersalins. Deux étangs salins (TS18, 390 g.L-1 NaCl et M1, 200 g.L-1 NaCl) ont été choisis pour l’échantillonnage. Trente-cinq souches de procaryotes halophiles ont été isolées et caractérisées, dont 11 ont présenté une activité antimicrobienne. Parmi ces souches, 3 produisent des substances antimicrobiennes de nature protéique. A l’aide de PCR et RT-PCR nous avons montré que les souches Halobacterium salinarum ETD5 et ETD8 exprimaient le gène de l’halocine S8, un peptide de 3,6 kDa préalablement purifié d’une souche S8a non identifiée. Le peptide a été purifié à partir de cultures de la souche Hbt. salinarum ETD5. Après purification bioguidée, les fractions actives révèlent deux bandes de 8 et 14 kDa présentant une activité antimicrobienne. L’analyse par séquençage Nterminal et spectrométrie de masse a permis d’identifier ces deux halocines. La bande de 8 kDa correspond à une halocine S8 de 81 acides aminés qui subirait une maturation post-traductionnelle protéolytique différente de celle initialement décrite dans la littérature. Le clonage et le séquençage du gène codant le précurseur de l’halocine S8 démontrent que la séquence est identique chez les deux souches ETD5 et S8a. La bande de 14 kDa correspond à une nouvelle halocine, l’halocine S14. L’halocine S14 correspond à une forme tronquée en partie N-terminale de la Mn-superoxyde dismutase (SOD) d’Hbt. salinarum. Il pourrait s’agir d’évolution divergente d’un gène codant deux protéines distinctes, ou d’une maturation différente de la SOD. Ce travail permettra de mieux connaître les molécules intervenant dans les interactions microbiennes dans les milieux hypersalins, des milieux extrêmes susceptibles de révéler des structures et des modes d’action originaux.

The solar saltern of Sfax is a hypersaline located in the central area of the eastern coast of Tunisia. In this study, we isolated, identified, and characterized halophilic strains producing antimicrobial peptides (halocins), aiming to understand their role in microbial interactions in hypersaline environments. Two ponds (TS18, 390 g.L-1 NaCl and M1, 200 g.L-1 NaCl) were selected for sampling. Thirty-five halophilic strains have been isolated and characterized, among which 11 displayed antimicrobial activity. Three of them produced antimicrobial substances of proteinaceous nature. Using PCR and RT-PCR, we have demonstrated that Halobacterium salinarum ETD5 and ETD8 express the gene encoding halocin S8, a 3.6 kDa peptide previously isolated from a strain S8 unidentified. The peptide was purified from cultures of strain Hbt. salinarum ETD5. Following bioguided purification, the active fractions revealed two protein bands of 8 and 14 kDa exhibiting antimicrobial activity. N-terminal sequencing and mass spectrometry analyses allowed identification of these two halocins. The 8 kDa band corresponds to halocin S8, undergoing a different proteolytic post-translational processing from that originallydescribed. Cloning and sequencing of the gene encoding the precursor of halocin S8 showed that the sequence is identical for both strains ETD5 and S8a. The 14 kDa band is a new halocin termed halocin S14. Halocin S14 corresponds to an N-terminally truncated portion of the archaeal Mnsuperoxide dismutase (SOD). This could result from divergent evolution of a gene encoding two distinct proteins, or a different post-translational processing of SOD. Our study helps to better understand which molecules are involved in microbial interactions within hypersaline environments and and how they contribute to the competitions in such extreme environments, which are susceptible to give rise to original structures and modes of action.; La saline de Sfax est un milieu hypersalin localisé dans la zone centrale de la côte est de Tunisie. Dans ce travail, nous avons isolé, identifié, et caractérisé des souches halophiles produisant des peptides antimicrobiens (halocines), afin de mieux comprendre leur rôle dans les interactions microbiennes au sein des milieux hypersalins. Deux étangs salins (TS18, 390 g.L-1 NaCl et M1, 200 g.L-1 NaCl) ont été choisis pour l’échantillonnage. Trente-cinq souches de procaryotes halophiles ont été isolées et caractérisées, dont 11 ont présenté une activité antimicrobienne. Parmi ces souches, 3 produisent des substances antimicrobiennes de nature protéique. A l’aide de PCR et RT-PCR nous avons montré que les souches Halobacterium salinarum ETD5 et ETD8 exprimaient le gène de l’halocine S8, un peptide de 3,6 kDa préalablement purifié d’une souche S8a non identifiée. Le peptide a été purifié à partir de cultures de la souche Hbt. salinarum ETD5. Après purification bioguidée, les fractions actives révèlent deux bandes de 8 et 14 kDa présentant une activité antimicrobienne. L’analyse par séquençage Nterminal et spectrométrie de masse a permis d’identifier ces deux halocines. La bande de 8 kDa correspond à une halocine S8 de 81 acides aminés qui subirait une maturation post-traductionnelle protéolytique différente de celle initialement décrite dans la littérature. Le clonage et le séquençage du gène codant le précurseur de l’halocine S8 démontrent que la séquence est identique chez les deux souches ETD5 et S8a. La bande de 14 kDa correspond à une nouvelle halocine, l’halocine S14. L’halocine S14 correspond à une forme tronquée en partie N-terminale de la Mn-superoxyde dismutase (SOD) d’Hbt. salinarum. Il pourrait s’agir d’évolution divergente d’un gène codant deux protéines distinctes, ou d’une maturation différente de la SOD. Ce travail permettra de mieux connaître les molécules intervenant dans les interactions microbiennes dans les milieux hypersalins, des milieux extrêmes susceptibles de révéler des structures et des modes d’action originaux.

Halophilic archaea are prokaryotes living in extremely high salinity conditions. Those microorganisms thrive in hypersaline environments and produce antimicrobial peptides named halocins, which may confer them a selective advantage over competitors. Among the known antimicrobial peptides produced by halophilic archaea, halocin C8 had been initially purified from the halophilic strain Natrinema sp. AS7092. This work demonstrates that halocin C8 production is conserved among several halophilic archaea belonging to genera Natrinema, Haloterrigena, Haloferax and Halobacterium. An antimicrobial activity has been associated with non-infectious particles larger than 100 kDa, suggesting that halocin C8 could be localized in membrane vesicles. Results obtained from this work will lead to a better understanding of microbial competitions arising in hypersaline environments and the ecological role of halocins; Les archées halophiles sont des procaryotes vivant dans des conditions d’extrême salinité. Ces micro-organismes colonisent les environnements hypersalins et synthétisent des peptides antimicrobiens appelés halocines, qui pourraient leur conférer un avantage sélectif sur leurs compétiteurs. Parmi les peptides antimicrobiens d’archées halophiles décrits, on distingue l’halocine C8, initialement purifiée à partir de la souche halophile Natrinema sp. AS7092. Ce travail de thèse a permis de montrer que la production d’halocine C8 était conservée chez plusieurs archées halophiles appartenant aux genres : Natrinema, Haloterrigena, Haloferax et Halobacterium. Une activité antimicrobienne associée des particules supérieures à 100 kDa non infectieuses suggère que l’halocine C8 pourrait être localisée dans des vésicules membranaires. Ce travail présente des résultats qui déboucheront sur une meilleure compréhension des compétitions microbiennes dans les environnements hypersalins et du rôle écologique des halocines.

The demonstration of the role of the Cytolethal Distending Toxin (CDT) of Helicobacter hepaticusin the development of hepatocarcinoma in mice, makes this toxin a relevant candidate in theactivation of precancerous processes. As in the case of the CagA toxin of Helicobacter pylori, theCdtB active subunit of CDT could be an oncoprotein. We studied the role of Helicobacter CdtB ininflammation and digestive carcinogenesis using a lentiviral strategy for constitutive or conditionalexpression of the CdtB subunit or its corresponding DNase mutant. We conducted a study of thetranscriptome and showed that CdtB induced an inflammatory response by overexpressingcytokines, chemokines, antimicrobial peptides and activating the NF-kB pathway in epithelialcells. The CdtB also regulated the expression and nuclear localization of the transcription factorand oncogene MafB. These results were confirmed for the CdtB of Helicobacter pullorum.Infection of cells with wild type strains and the corresponding CDT-mutant strains (of H. hepaticus& H. pullorum) were used to validate the results and to attribute the effects to the CdtB and, inparticular, to its DNase activity. We also developed a novel epithelial cell xenograft model toevaluate the inducible expression of H. hepaticus CdtB. In this model, the CdtB, in addition to itspreviously well-known effects, delayed tumor growth, induced apoptosis, senescence and theoverexpression of nuclear proliferation marker, Ki-67, suggesting cell survival. All of these resultsprovide new arguments in favor of the oncogenic potential of the CDT., La démonstration du rôle de la CDT (« Cytolethal Distending Toxin ») de Helicobacterhepaticus dans le développement de l’hépatocarcinome murin fait de cette toxine un candidatpertinent dans l'activation de processus pro-cancéreux. Comme la toxine CagA de Helicobacterpylori, la sous-unité active CdtB de la CDT pourrait être une oncoprotéine. Nous avons étudié lerôle de la CdtB des Hélicobacters dans l’inflammation et la carcinogenèse digestive via unestratégie lentivirale d’expression constitutive ou conditionnelle de la CdtB ou de son mutant pourl’activité DNase. Nous avons réalisé une étude du transcriptome et montré que la CdtB deH. hepaticus induisait une réponse inflammatoire en surexprimant des cytokines, chimiokines,peptides antimicrobiens et en activant la voie du NF-κB des cellules épithéliales. La CdtB réguleégalement l’expression et la localisation nucléaire du facteur de transcription et oncogène MafB.Ces résultats ont été confirmés pour la CdtB de Helicobacter pullorum. Des expériencesd'infection des cellules avec des souches sauvages et mutées pour la CDT (deH. hepaticus & H. pullorum) ont permis de valider les résultats obtenus et de les attribuer à laCdtB et notamment à son activité DNase. Nous avons aussi développé un nouveau modèle dexénogreffes de cellules épithéliales inductibles pour l’expression de la CdtB de H. hepaticus.Dans ce modèle, la CdtB, en plus de ses effets déjà connus, retarde la croissance tumorale,induit l’apoptose, la sénescence et la surexpression du marqueur nucléaire de prolifération,Ki-67, suggérant la survie cellulaire. L’ensemble de ces résultats fournit de nouveaux argumentsen faveur du potentiel oncogénique de la CDT.

The demonstration of the role of the Cytolethal Distending Toxin (CDT) of Helicobacter hepaticusin the development of hepatocarcinoma in mice, makes this toxin a relevant candidate in theactivation of precancerous processes. As in the case of the CagA toxin of Helicobacter pylori, theCdtB active subunit of CDT could be an oncoprotein. We studied the role of Helicobacter CdtB ininflammation and digestive carcinogenesis using a lentiviral strategy for constitutive or conditionalexpression of the CdtB subunit or its corresponding DNase mutant. We conducted a study of thetranscriptome and showed that CdtB induced an inflammatory response by overexpressingcytokines, chemokines, antimicrobial peptides and activating the NF-kB pathway in epithelialcells. The CdtB also regulated the expression and nuclear localization of the transcription factorand oncogene MafB. These results were confirmed for the CdtB of Helicobacter pullorum.Infection of cells with wild type strains and the corresponding CDT-mutant strains (of H. hepaticus& H. pullorum) were used to validate the results and to attribute the effects to the CdtB and, inparticular, to its DNase activity. We also developed a novel epithelial cell xenograft model toevaluate the inducible expression of H. hepaticus CdtB. In this model, the CdtB, in addition to itspreviously well-known effects, delayed tumor growth, induced apoptosis, senescence and theoverexpression of nuclear proliferation marker, Ki-67, suggesting cell survival. All of these resultsprovide new arguments in favor of the oncogenic potential of the CDT., La démonstration du rôle de la CDT (« Cytolethal Distending Toxin ») de Helicobacterhepaticus dans le développement de l’hépatocarcinome murin fait de cette toxine un candidatpertinent dans l'activation de processus pro-cancéreux. Comme la toxine CagA de Helicobacterpylori, la sous-unité active CdtB de la CDT pourrait être une oncoprotéine. Nous avons étudié lerôle de la CdtB des Hélicobacters dans l’inflammation et la carcinogenèse digestive via unestratégie lentivirale d’expression constitutive ou conditionnelle de la CdtB ou de son mutant pourl’activité DNase. Nous avons réalisé une étude du transcriptome et montré que la CdtB deH. hepaticus induisait une réponse inflammatoire en surexprimant des cytokines, chimiokines,peptides antimicrobiens et en activant la voie du NF-κB des cellules épithéliales. La CdtB réguleégalement l’expression et la localisation nucléaire du facteur de transcription et oncogène MafB.Ces résultats ont été confirmés pour la CdtB de Helicobacter pullorum. Des expériencesd'infection des cellules avec des souches sauvages et mutées pour la CDT (deH. hepaticus & H. pullorum) ont permis de valider les résultats obtenus et de les attribuer à laCdtB et notamment à son activité DNase. Nous avons aussi développé un nouveau modèle dexénogreffes de cellules épithéliales inductibles pour l’expression de la CdtB de H. hepaticus.Dans ce modèle, la CdtB, en plus de ses effets déjà connus, retarde la croissance tumorale,induit l’apoptose, la sénescence et la surexpression du marqueur nucléaire de prolifération,Ki-67, suggérant la survie cellulaire. L’ensemble de ces résultats fournit de nouveaux argumentsen faveur du potentiel oncogénique de la CDT.

Colistin is a cationic cyclic polypeptide antibiotic belonging to the polymyxin family and targeting bacterial membranes. It is produced by Paenibacillus polymyxa through a Nonribosomal Peptide Synthetase (NRPS) mechanism. In the context of cystic fibrosis (CF), colistin is used for the treatment of lung infections caused by multiresistant Gram-negative bacteria including Pseudomonas aeruginosa. Unfortunately, this molecule is also known for its strong side effects. So far, genetic systems controlling the production of polymyxins were little known. In this study we characterized by High-resolution LC-MS the antimicrobial molecules, including colistins, of a new Paenibacillus. A genomic library of this strain was constructed and screened to identify genes involved in the production of these antibiotics. A degenerated PCR screening was performed and allowed to select four clones in the genomic library. In silico study allowed to identify a new NRPS gene cluster responsible for the biosynthesis of colistin variants. In the future, this work might allow the harnessing of the production of colistin derived structures, more active and/or showing fewer side effects. In parallel, a second investigation was performed in order to find new NRPS genes in a collection of one hundred intertidal mudflat bacterial isolates. This work has allowed the identification of new sequences and the characterization of a new antimicrobial producing strain.; La colistine, antibiotique appartenant à la famille des polymyxines, est un polypeptide cyclique, cationique, ciblant les membranes bactériennes. Elle est produite par Paenibacillus polymyxa via des complexes multi-enzymatiques appelés Non-Ribosomal Peptides Synthétases (NRPS). Dans le cas de la mucoviscidose, et malgré des effets secondaires importants, la colistine est utilisée comme ultime recours pour lutter contre les bactéries Gram-négatives multirésistantes responsables d’infections pulmonaires dont Pseudomonas aeruginosa. Jusqu’ici les systèmes génétiques à l’origine de la production de la colistine étaient peu connus. Au cours de cette étude, nous avons caractérisé par LC-MS haute résolution des molécules antimicrobiennes, dont des colistines, produites par un nouveau Paenibacillus. Afin d’identifier et de cloner le cluster de gène responsable de la production de ces antibiotiques, une banque d’ADN génomique a été construite et criblée par homologie de séquence avec des systèmes de production déjà connus. Ce criblage a permis de sélectionner quatre clones d’intérêt. L’étude in silico de leurs séquences a permis d’identifier les différents modules d’un nouveau cluster NRPS qui serait à l’origine de la synthèse de variants de la colistine. À terme, cette découverte pourrait permettre de mieux contrôler la production de la colistine et d’obtenir des composés plus actifs et/ou présentant des effets secondaires amoindris. En parallèle à ce premier travail, nous avons également recherché la présence de nouvelles NRPS chez une centaine de micro-organismes issus d’une station d’étude environnementale du laboratoire (vasière intertidale). Ce travail a permis de découvrir des nouvelles séquences et d’isoler un nouveau micro-organisme producteur d’antibiotique(s).

Résumé. Interface entre l’organisme et l’environnement, la peau est le plus grand organe qui assure une fonction « barrière » vis-à-vis des stress biotiques ou abiotiques. Elle est constituée de trois couches cellulaires superposées: l’hypoderme, le derme, et l’épiderme. L’épiderme renferme également quatre couches cellulaires distinctes: la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse et la couche cornée. Les kératinocytes issus de la couche basale, constituent le type cellulaire le plus abondant au sein de l’épiderme. Dans ce projet, nous avons analysé l’expression de nombreux gènes (gènes structuraux et gènes de défense) par PCR quantitative en temps réel, au sein des différentes couches épidermiques isolées d’explant de peau humaine saine par microdissection laser (Laser Capture Microdissection, LCM). Nous avons ensuite évalué les effets de bactéries du microbiome cutané sur l’expression de gènes de défense. La distribution des produits de ces gènes a également été examinée par une approche immunocytochimique. Les résultats majeurs obtenus sont décrits ci-après. 1) Nous avons optimisé le protocole de LCM pour isoler deux fractions épidermiques respectivement enrichies en kératinocytes de la couche basale et de la couche granuleuse (Percoco et al., 2012. Experimental Dermatology 21, 531-534). Cet outil prometteur est maintenant aisément applicable à la recherche en Dermatologie. 2) Nous avons montré, que dans une peau humaine saine, les gènes responsables de l’immunité innée, codant notamment pour les bêta-defensines humaines de type 2 et 3 (human beta-defensin, hBD), sont exprimés de façon différentielle au sein des couches épidermiques. 3) Nous avons observé que les trois bactéries Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas fluorescens sont capables de moduler positivement l’expression des gènes codant pour des beta-defensines (hBD2 et hBD3) et des cytokines pro-inflammatoires (IL-1 alpha et bêta et IL-6). 4) En utilisant des anticorps spécifiques, nous avons localisé les produits de ces gènes dans les différentes couches épidermiques, à l’échelle cellulaire par microscopie à épifluorescence, et à l’échelle ultrastructurale par microscopie électronique à transmission (Percoco et al., Soumis).; The skin is the largest organ of the body. It is a natural barrier between the environment and the organism that plays a key role in the protection of the body against abiotic or biotic stress. The skin is made up of three different cell layers, namely the hypodermis, the dermis and the epidermis. The epidermis is, in turn, composed of four different layers, the basal, the spinous, the granular and the horny layer. In the epidermis, keratinocytes is the major cell type known to originate from basal cells. In the present work, we have studied the expression of a number of genes (antimicrobial peptide genes and pro-inflammatory cytokine genes) in different layers of healthy human epidermis using quantitative real-time PCR coupled to Laser Capture Microdissection (LCM). Using the same approach, we have also investigated the effect of bacteria belonging the human epidermal microbiota on the expression of the same genes within the epidermal layers. In addition, the spatial distribution of gene products has also been examined using immunocytochemsitry. The major findings are: 1) We have developed an optimized LCM protocol for the isolation of human epidermal layers. We have been able to isolate two fractions highly enriched in keratinocytes from the basal and the granular layers (Percoco et al. 2012. Experimental Dermatology. 21, 531-534). Such a method can now be easily applied in dermatological research. 2) We have found that, in healthy human epidermis, innate immunity-related genes including human beta-defensin genes are differentially expressed within different layers. 3) We have found that the three bacteria Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus and Pseudomonas fluorescens induce a significant increase in the expression of beta-defensin (hBD2 and hBD3) and pro-inflammatory cytokines (IL-1 alpha, IL-1 beta and IL-6) genes. 4) We have localized the gene products within different cell layers using specific antibodies in conjunction with immunofluorescence and immunogold-electron microscopy (Percoco et al., Submitted).

We studied the role of the skin innate immunity during the transmission of Borrelia (the infectious agent of Lyme borreliosis) by its vector, a hard tick belonging to the genus Ixodes. We showed that tick saliva and its protein Salp15 both inhibate Borrelia-induced inflammatory reaction of keratinocytes. The antialarmin effect of tick saliva ensure a favorable environment for Borrelia. We also showed that Borrelia induce a strong inflammatory response in dermal fibroblasts. We also demonstrate a dose-dependent lytic effect of tick salivary gland extracts on dermal fibroblasts and that this cytotoxic effect was of proteinaceous nature and not related to Salp15. These results indicate that dermal fibroblasts could be considered as central mediators in immune cell recruitment to the skin site of Borrelia invasion., Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- « alarmine » de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l’inflammation cutanée induite par Borrelia.

Résumé. Interface entre l’organisme et l’environnement, la peau est le plus grand organe qui assure une fonction « barrière » vis-à-vis des stress biotiques ou abiotiques. Elle est constituée de trois couches cellulaires superposées: l’hypoderme, le derme, et l’épiderme. L’épiderme renferme également quatre couches cellulaires distinctes: la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse et la couche cornée. Les kératinocytes issus de la couche basale, constituent le type cellulaire le plus abondant au sein de l’épiderme. Dans ce projet, nous avons analysé l’expression de nombreux gènes (gènes structuraux et gènes de défense) par PCR quantitative en temps réel, au sein des différentes couches épidermiques isolées d’explant de peau humaine saine par microdissection laser (Laser Capture Microdissection, LCM). Nous avons ensuite évalué les effets de bactéries du microbiome cutané sur l’expression de gènes de défense. La distribution des produits de ces gènes a également été examinée par une approche immunocytochimique. Les résultats majeurs obtenus sont décrits ci-après. 1) Nous avons optimisé le protocole de LCM pour isoler deux fractions épidermiques respectivement enrichies en kératinocytes de la couche basale et de la couche granuleuse (Percoco et al., 2012. Experimental Dermatology 21, 531-534). Cet outil prometteur est maintenant aisément applicable à la recherche en Dermatologie. 2) Nous avons montré, que dans une peau humaine saine, les gènes responsables de l’immunité innée, codant notamment pour les bêta-defensines humaines de type 2 et 3 (human beta-defensin, hBD), sont exprimés de façon différentielle au sein des couches épidermiques. 3) Nous avons observé que les trois bactéries Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas fluorescens sont capables de moduler positivement l’expression des gènes codant pour des beta-defensines (hBD2 et hBD3) et des cytokines pro-inflammatoires (IL-1 alpha et bêta et IL-6). 4) En utilisant des anticorps spécifiques, nous avons localisé les produits de ces gènes dans les différentes couches épidermiques, à l’échelle cellulaire par microscopie à épifluorescence, et à l’échelle ultrastructurale par microscopie électronique à transmission (Percoco et al., Soumis)., The skin is the largest organ of the body. It is a natural barrier between the environment and the organism that plays a key role in the protection of the body against abiotic or biotic stress. The skin is made up of three different cell layers, namely the hypodermis, the dermis and the epidermis. The epidermis is, in turn, composed of four different layers, the basal, the spinous, the granular and the horny layer. In the epidermis, keratinocytes is the major cell type known to originate from basal cells. In the present work, we have studied the expression of a number of genes (antimicrobial peptide genes and pro-inflammatory cytokine genes) in different layers of healthy human epidermis using quantitative real-time PCR coupled to Laser Capture Microdissection (LCM). Using the same approach, we have also investigated the effect of bacteria belonging the human epidermal microbiota on the expression of the same genes within the epidermal layers. In addition, the spatial distribution of gene products has also been examined using immunocytochemsitry. The major findings are: 1) We have developed an optimized LCM protocol for the isolation of human epidermal layers. We have been able to isolate two fractions highly enriched in keratinocytes from the basal and the granular layers (Percoco et al. 2012. Experimental Dermatology. 21, 531-534). Such a method can now be easily applied in dermatological research. 2) We have found that, in healthy human epidermis, innate immunity-related genes including human beta-defensin genes are differentially expressed within different layers. 3) We have found that the three bacteria Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus and Pseudomonas fluorescens induce a significant increase in the expression of beta-defensin (hBD2 and hBD3) and pro-inflammatory cytokines (IL-1 alpha, IL-1 beta and IL-6) genes. 4) We have localized the gene products within different cell layers using specific antibodies in conjunction with immunofluorescence and immunogold-electron microscopy (Percoco et al., Submitted).

The characterization of the interactions of different biomolecules such as proteins and peptides with lipids, constitute a crucial step for better understanding the behavior and mechanisms of action of such molecules with cell membranes. We present here biomimetic studies of a muscular protein by using different membrane models and biophysical methods. Dystrophin is a long filamentous protein essential to skeletal muscle function. Its deficiency or mutated forms are responsible of muscular dystrophies. In the present study, we analyzed the properties of different spectrin like repeats from the dystrophin central domain. We characterized the specific interactions of two different subdomains constituted by the repeats 1 to 3 and 20 to 24 with lipids. We further show that the interaction and the organization of the repeats 11 to 15 with both anionic and zwitterionic membranes are modulated by lipid curvature as well as by lipid packing. Surface rheology measurements show that repeats 11 to 15 constitute a functional link between the membrane and cytoskeletal actin filaments. This mechanical bridge could contribute in vivo to the shock absorber function of dystrophin during contraction-relaxation cycles in muscle cells. In the last part of this work, we studied the structure-activity relationship of a "de novo" antimicrobial peptides K4. We identify a detergent-like mechanism for the antimicrobial activity of this peptide.; La caractérisation de l'interaction de différentes biomolécules avec les lipides constitue une étape cruciale pour la compréhension du comportement et du mode d'action de ces molécules avec les membranes cellulaires. Nous présentons ici des études biomimétiques d'une protéine musculaire. Des modèles membranaires et des méthodes biophysiques ont été utilisées. La dystrophine est une protéine filamenteuse essentielle pour le fonctionnement musculaire. Son absence ou sa modification suite à des mutations ont responsables de myopathies. Dans cette étude, nous avons analysé les propriétés de certaines répétitions homologues à la spectrine du domaine central de la dystrophine. Nous caractérisons les interactions spécifiques de deux sous domaines constitués des répétitions 1 à 3 et 20 à 24 avec les lipides. Nous montrons d'autre part, que l'interaction et l'organisation des répétitions 11 à 15 avec des membranes anioniques et zwitterioniques sont modulées par la courbure membranaire et le packing lipidique. L'analyse de propriétés rhéologiques de surface montre que les répétitions 11 à 15 forment un lien fonctionnel entre la membrane et les filaments d'actine du cytosquelette. Cette liaison mécanique contribuerait in vivo au rôle d'amortisseur de chocs attribué à la dystrophine lors des cycles de contractions-relaxations musculaires. Dans une dernière partie de ce travail, nous avons étudié la relation structure-activité d'un "de novo" peptide antimicrobien, K4. Nous identifions un mécanisme d'action de type detergent-like, conférant l'activité antimicrobienne.

The chemical communication systems constitute an essential element in the establishment of intra- or inter-species relationships in marine environment, weaving a dense network of relations between individuals, in ecosystem. The invertebrates lacking of an immune system and usually sessile produce this type of bioactive metabolites playing a crucial role in the answer to the environmental pressures like the predation and the defence against potentially pathogens organisms. The aim of this work was to identify antimicrobial peptides in commercially bivalve and gastropod marine molluscs. Thus, the search for antimicrobial molecules from peptidic nature was undertaken in acid extracts of bivalve molluscs Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis, and gastropods Crepidula fornicata, Buccinum undatum and Littorina littorea and from Crassostrea gigas hemolymph. The extracts were pre-purified by Solid Phase Extraction C18 (SPE) and elution was ensured by three successive steps of 10%, 40% and 80% of ACN-0.1% TFA. The antibacterial activities were assayed by determination of the CMI against a panel of target bacteria including Gram+ and Gram- bacteria. In parallel, antiviral activities were assayed in vitro against Herpes simplex virus type 1 and Vero cells by cell viability. The species C. edule, L. littorea and C. gigas proved to be the most effective and non cytotoxic species. A partial characterization of the activity detected in these species allowed determining the protenaceous nature of the active molecules. The purification of antimicrobial peptides realised on the C. gigas hemolymph led us to the identification of a peptide which structure lets foresee a bacterial origin. The hypothese of an association between C. gigas and bacteria led us from non axenic oysters culture to search for antagonist bacteria in C. gigas hemolymph and has conduced to isolate 2 Vibrio spp. and 3 Pseudoalteromonas spp. The Pseudoalteromonas spp. hCg 5 strain, allowed to partially characterized an active compound. Whole of these results suggests that the bacteria associated with the immune system could play an essential function of defence in bivalves.; Les systèmes de communication chimique constituent un élément indispensable dans l'établissement des relations intra- ou inter-espèces en milieu marin, tissant un réseau de relations entre individus, au sein d'un écosystème. Les invertébrés dépourvus de système immunitaire à mémoire et au mode de vie sessile produisent des métabolites bioactifs jouant un rôle essentiel dans la réponse aux pressions environnementales telles que la prédation et la défense vis-à-vis d'autres organismes potentiellement pathogènes. L'objectif de ces travaux a été d'identifier la présence de peptides antimicrobiens chez des mollusques bivalves et des gastéropodes d'importance commerciale. Ainsi, la recherche de molécules de défense antimicrobiennes de nature peptidique a été conduite dans des extraits acides des mollusques bivalves, Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis et gastéropodes, Buccinum undatum, Littorina littorea et Crepidula fornicata, ainsi qu'à partir de l'hémolymphe de Crassostrea gigas. Les extraits ont été pré-purifiés par extraction sur phase solide C18 (SPE) et l'élution a été réalisée par 3 paliers successifs de 10%, 40% et 80% d'ACN-0,1% TFA. L'activité antibactérienne a été évaluée via la détermination de la CMI sur un ensemble de bactéries à Gram+ et à Gram- ; et l'activité antivirale a été déterminée in vitro sur le modèle virus Herpes simplex type 1/cellules Vero via la viabilité cellulaire. Les espèces C. edule, L. littorea et C. gigas se sont révélées être les espèces les plus efficaces et non cytotoxiques. Une caractérisation partielle de l'activité détectée chez ces espèces a permis de déterminer la nature peptidique des molécules actives. La purification des peptides antimicrobiens a été conduite sur l'hémolymphe de C. gigas et a permis l'identification d'un peptide dont la structure de type lantibiotique laisse présager une origine bactérienne. L'hypothèse d'une association entre C. gigas et des bactéries nous a conduit, à partir de cultures d'huîtres non axéniques, à rechercher des bactéries antagonistes dans l'hémolymphe et a permis d'isoler 2 Vibrio spp. et 3 Pseudoalteromonas spp. A partir de la bactérie Pseudoalteromonas spp. souche hCg 5, un composé actif a été partiellement caractérisé. L'ensemble de ces résultats suggère que les bactéries associées au système immunitaire pourraient jouer un rôle essentiel dans la défense des bivalves.

The chemical communication systems constitute an essential element in the establishment of intra- or inter-species relationships in marine environment, weaving a dense network of relations between individuals, in ecosystem. The invertebrates lacking of an immune system and usually sessile produce this type of bioactive metabolites playing a crucial role in the answer to the environmental pressures like the predation and the defence against potentially pathogens organisms. The aim of this work was to identify antimicrobial peptides in commercially bivalve and gastropod marine molluscs. Thus, the search for antimicrobial molecules from peptidic nature was undertaken in acid extracts of bivalve molluscs Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis, and gastropods Crepidula fornicata, Buccinum undatum and Littorina littorea and from Crassostrea gigas hemolymph. The extracts were pre-purified by Solid Phase Extraction C18 (SPE) and elution was ensured by three successive steps of 10%, 40% and 80% of ACN-0.1% TFA. The antibacterial activities were assayed by determination of the CMI against a panel of target bacteria including Gram+ and Gram- bacteria. In parallel, antiviral activities were assayed in vitro against Herpes simplex virus type 1 and Vero cells by cell viability. The species C. edule, L. littorea and C. gigas proved to be the most effective and non cytotoxic species. A partial characterization of the activity detected in these species allowed determining the protenaceous nature of the active molecules. The purification of antimicrobial peptides realised on the C. gigas hemolymph led us to the identification of a peptide which structure lets foresee a bacterial origin. The hypothese of an association between C. gigas and bacteria led us from non axenic oysters culture to search for antagonist bacteria in C. gigas hemolymph and has conduced to isolate 2 Vibrio spp. and 3 Pseudoalteromonas spp. The Pseudoalteromonas spp. hCg 5 strain, allowed to partially characterized an active compound. Whole of these results suggests that the bacteria associated with the immune system could play an essential function of defence in bivalves.; Les systèmes de communication chimique constituent un élément indispensable dans l'établissement des relations intra- ou inter-espèces en milieu marin, tissant un réseau de relations entre individus, au sein d'un écosystème. Les invertébrés dépourvus de système immunitaire à mémoire et au mode de vie sessile produisent des métabolites bioactifs jouant un rôle essentiel dans la réponse aux pressions environnementales telles que la prédation et la défense vis-à-vis d'autres organismes potentiellement pathogènes. L'objectif de ces travaux a été d'identifier la présence de peptides antimicrobiens chez des mollusques bivalves et des gastéropodes d'importance commerciale. Ainsi, la recherche de molécules de défense antimicrobiennes de nature peptidique a été conduite dans des extraits acides des mollusques bivalves, Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis et gastéropodes, Buccinum undatum, Littorina littorea et Crepidula fornicata, ainsi qu'à partir de l'hémolymphe de Crassostrea gigas. Les extraits ont été pré-purifiés par extraction sur phase solide C18 (SPE) et l'élution a été réalisée par 3 paliers successifs de 10%, 40% et 80% d'ACN-0,1% TFA. L'activité antibactérienne a été évaluée via la détermination de la CMI sur un ensemble de bactéries à Gram+ et à Gram- ; et l'activité antivirale a été déterminée in vitro sur le modèle virus Herpes simplex type 1/cellules Vero via la viabilité cellulaire. Les espèces C. edule, L. littorea et C. gigas se sont révélées être les espèces les plus efficaces et non cytotoxiques. Une caractérisation partielle de l'activité détectée chez ces espèces a permis de déterminer la nature peptidique des molécules actives. La purification des peptides antimicrobiens a été conduite sur l'hémolymphe de C. gigas et a permis l'identification d'un peptide dont la structure de type lantibiotique laisse présager une origine bactérienne. L'hypothèse d'une association entre C. gigas et des bactéries nous a conduit, à partir de cultures d'huîtres non axéniques, à rechercher des bactéries antagonistes dans l'hémolymphe et a permis d'isoler 2 Vibrio spp. et 3 Pseudoalteromonas spp. A partir de la bactérie Pseudoalteromonas spp. souche hCg 5, un composé actif a été partiellement caractérisé. L'ensemble de ces résultats suggère que les bactéries associées au système immunitaire pourraient jouer un rôle essentiel dans la défense des bivalves.

The mytiliculture is one of the most important aquaculture in the world, however, little is known on the mussel immune system, which plays a critical role in case of infectious diseases. Like all the other invertebrates, our model, the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis, possesses only an innate immune system considered to be primitive and non-specific. In the present study, our results showed that the mussel immune system (i) is capable of responding differently to a variety of stimulations, suggesting a specific recognition process; (ii) reacts differently according to the geographic origin of the animals, showing an adaptation to their own environment; (iii) is influenced by the season, which explains the seasonal mortalities; (iv) presents an extended polymorphism of antimicrobial peptides, which increases in turn the number of molecular effectors. In conclusion, the innate immunity system of the mussel appears more complex than suspected and involving polymorphic immune effectors. Moreover, this system is capable of responding specifically to different stimuli, of adaptation to the environment, and is influenced by the season., La mytiliculture occupe une place très importante dans l'aquaculture, cependant, le système immunitaire de la moule, qui joue un rôle décisif face aux diverses maladies infectieuses, reste mal connu. Comme tous les invertébrés, notre modèle d'étude, la moule méditerranéenne Mytilus galloprovincialis, ne possède qu'un système d'immunité innée souvent décrit comme peu complexe et non spécifique. Les résultats de cette thèse ont montré que le système immunitaire des moules (i) est capable de répondre différemment à diverses stimulations, ce qui suggère une reconnaissance spécifique ; (ii) répond différemment suivant l'origine géographique des animaux, ce qui montre une adaptation à l'environnement ; (iii) est influencé par la saison, ce qui explique les mortalités saisonnières constatées ; (iv) présente un polymorphisme des peptides antimicrobiens, ce qui augmente d'autant le nombre d'effecteurs moléculaires. En conclusion, le système d'immunité innée de la moule apparaît comme complexe, impliquant des effecteurs polymorphes, capable de répondre spécifiquement à divers stimuli, adapté à l'environnement et influencé par la saison.

The colonial lifestyle has ecological and evolutionary advantages, but it increases the risks of pathogen transmission. To minimize this problem, social insects have developed several behavioural and physiological defence mechanisms, including using protection provided by other organisms. Bees and ants utilize antimicrobial substances of vegetable origin and ants harbour antibiotics-producing bacteria to control parasites. Ants are insects that cannot live without their nestmates with which they maintain many interactions, such as grooming and trophallaxis. In the first part of this thesis, we studied the behavioural alterations in workers of the ant Camponotus fellah after mounting an immune response. We hypothesized that if social interactions and physiological immune responses are expensive, individual workers should be forced to choose where to invest energy. In fact, after mounting an immune response, the workers increased their trophallaxis rate and no sign of avoidance by nestmates was observed. This result highlights the importance of social relations for individual cure and prophylactic mechanisms. In the second part, we studied the primary endosymbiont of C. fellah, a bacterium of Blochmannia genus. This bacterium plays a role in ant nutrition, a function already demonstrated in other Camponotus species. We considered the possibility that the importance of this association is not exclusively nutritional. The bacterium might improve the host immune system and increase the development rate of incipient colonies. Indeed, it might be involved in colony odour formation. The first step was to describe formally this new bacterium with molecular biology techniques. Next, we showed that it improves the host immune response by increasing the encapsulation rate against foreign particles. It increases host larvae production and the number of adult workers. Though we did not find a relation between the number of bacteria and the amount of cuticular hydrocarbons, when the bacteria was eliminated with antibiotics, cuticular hydrocarbons were overproduced, which could be interpreted as a stress response. This work highlights new functions of Blochmannia endosymbionts in their association with the ants. The bacterium likely contributed to the ecological success of Camponotus ants, a globally widespread genus.; La vie en société présente des avantages écologiques et évolutifs, mais augmente les risques de transmission de pathogènes. Pour faire face à ce problème, les insectes sociaux ont développé plusieurs mécanismes de défenses comportementales et physiologiques, et en plus utilisé la protection fournie par des organismes tiers. C'est ainsi que des abeilles et des fourmis se servent de substances antimicrobiennes d'origine végétale ou des fourmis possèdent des bactéries productrices d'antibiotiques. La fourmi est un insecte qui, par définition, ne peut vivre que dans sa société avec des congénères avec lesquels elle entretient des relations nombreuses comme des léchages interindividuels et des échanges en bouche à bouche (appelés trophallaxies). Dans la première partie de la thèse, nous avons étudié les altérations comportementales des ouvrières de la fourmi Camponotus fellah après le déclenchement d'une réaction immunitaire. Nous avons posé l'hypothèse que si les relations sociales sont aussi coûteuses que les défenses immunitaires physiologiques, l'individu devrait être confronté à un choix : où investir son énergie ? Au contraire, suite à une réaction immunitaire les fourmis ont augmenté leur taux de trophallaxie et aucun signe d'isolement de l'ouvrière malade ne fut observé. Ce résultat met en évidence l'importance des relations sociales pour la guérison de l'individu et qui peuvent même avoir une fonction prophylactique. La deuxième partie a été consacrée à l'étude d'un endosymbiote primaire de C. fellah, une bactérie du genre Blochmannia. Cet endosymbiote a un rôle nutritif qui a été déjà montré chez d'autres espèces de Camponotus. Nous avons envisagé qu'il ait aussi d'autres fonctions comme : favoriser le système immunitaire de la fourmi, favoriser le développement des nouvelles colonies et participer à la formation de l'odeur coloniale. Nous avons d'abord décrit cette nouvelle bactérie par des techniques de biologie moléculaire. Ensuite, nous avons pu montrer qu'elle favorise la réponse immunitaire des fourmis en augmentant l'encapsulation de particules étrangères. Elle contribue à une plus grande production de larves, aboutissant à une plus grande quantité d'ouvrières. Nous n'avons pas mis en évidence de lien entre la quantité de bactéries et celle d'hydrocarbures cuticulaires, bien que leur élimination par un antibiotique entraînait une surproduction de ces hydrocarbures, probablement une réponse liée au stress. Plus généralement, ces travaux montrent de nouvelles fonctions des endosymbiotes, qui ont probablement contribué au succès écologique de ce groupe de fourmis hautement diversifié et très répandu.