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New gene formation is one of the major sources of evolutionary innovations for organisms. Beyond their mutational effects, transposable elements can be source of new genes. During my thesis, I have studied Harbinger DNA transposons, which I have characterized in teleost fish genomes. Moreover, I have identified four new genes derived from Harbinger transposons in vertebrates by bioinformatical screening. Three of them were formed at the base of jawed vertebrates around 500 million years ago, and another at the base of sarcopterygians around 430 million years ago. Using the zebrafish model, we have observed that these genes are expressed during early development and in adult tissues, with a co-expression in male brain. They are also activated in human brain, particularly during fetal development. In order to study Harbinger-derived genes function, their inactivation was performed using CRISPR/Cas9 and morpholino antisense oligonucleotide techniques. The inactivation of MSANTD2 gene, which has been associated with neurodevelopmental diseases such as autism spectrum disorder and schizophrenia, produced embryos with delayed development as well as tail and nervous system malformations, specifically with brain ventricles and neuronal pattern defects. Thus, this thesis has highlighted the recurrent and concomitant molecular domestications of Harbinger transposons, which have led to a new gene family in vertebrates. The study of one its member, MSANTD2, contributes to a better understanding of genetic innovations having driven the evolution of the nervous system in vertebrates., La formation de nouveaux gènes est une source majeure d’innovation pour les organismes. Au-delà de leurs effets mutagènes, les éléments transposables peuvent être source de nouveaux gènes. Lors de cette thèse, j’ai étudié les transposons à ADN Harbinger, que j’ai pu caractériser chez les poissons téléostéens. J’ai de plus identifié chez les vertébrés par criblage bioinformatique quatre nouveaux gènes dérivés de transposons Harbinger, trois formés à la base des vertébrés à mâchoires il y a environ 500 millions d’années et un chez les sarcoptérygiens il y a environ 430 millions d’années. Chez le poisson-zèbre, ces gènes sont exprimés pendant le développement précoce et dans les tissus adultes, avec une co-expression dans le cerveau mâle. Ils sont également activés dans le cerveau humain, en particulier pendant le développement fœtal. Afin d’étudier la fonction des gènes dérivés de transposons Harbinger, leur inactivation a été réalisée par CRISPR/Cas9 et oligonucléotides antisense de type morpholino. L’inactivation du gène MSANTD2, qui a été associé à des maladies neurodéveloppementales comme les troubles du spectre de l’autisme et la schizophrénie, produit des embryons présentant des retards de développement et des malformations de la queue et du système nerveux, en particulier des défauts de formation des ventricules du cerveau et de patterns neuronaux. Ainsi, cette thèse a permis de mettre en évidence des domestications moléculaires récurrentes de transposons Harbinger qui ont abouti à la formation d’une nouvelle famille de gènes chez les vertébrés. L’étude d’un des membres, MSANTD2, contribue à une meilleure compréhension des innovations génétiques qui ont déterminé l’évolution précoce du système nerveux des vertébrés.

L'acide rétinoïque (AR) est nécessaire au développement de plusieurs organes, dont le cerveau, les yeux, le coeur et les poumons. La perte ainsi que le gain de la signalisation de l’AR perturbent le développement de ces organes, indiquant qu’une régulation précise est nécessaire pour un développement approprié. L’AR se lie aux récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR), qui sont des facteurs de transcription qui modulent l'expression des gènes cibles. Des mutations de novo du gène RARB conduisent à un syndrome rare et sévère appelé PDAC caractérisé principalement par une hypoplasie Pulmonaire, une hernie Diaphragmatique, une Anophtalmie et/ou une microphtalmie et des anomalies Cardiaques. Au total, notre groupe a identifié 15 variants pathogènes de RARB chez plus de 30 patients atteints du syndrome PDAC. In vitro, certains de ces variants induisent un gain de fonction (GOF) tandis que d'autres agissent de manière dominante-négative (DN). L'objectif de ce projet est d'utiliser le modèle du poisson zèbre pour étudier l'impact fonctionnel des variants RARB in vivo. Nous avons constaté que la surexpression de l'ARN de RARB humain de type sauvage (WT) chez le poisson zèbre provoquait des anomalies développementales, notamment une microphtalmie, des défauts de la vessie natatoire et un oedème cardiaque, tandis que l'introduction d'une mutation non-sens (p.K102X) abolit ces effets. Nous avons testé l'impact des présumés GOF (p.R269T, p.R387C) et DN (p.M290R, p.L402P). Nous montrons que la surexpression des GOF provoque un phénotype moins sévère que celui de RARB WT. La co-injection des DN révèle que le variant L402P se comporte comme un DN dans un contexte développemental, alors que M290R agit comme une perte de fonction. De plus, nous avons caractérisé une lignée de poisson zèbre rarga -/-. Nous avons découvert que le poisson zèbre rarga -/- développe des défauts de la vessie natatoire et des arcs branchiaux. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliquant RARB au cours du développement pourrait aider à développer des stratégies thérapeutiques efficaces par la modulation de la signalisation de l’AR., Retinoic acid (RA) is required for the development of several organs, including the brain, eye, heart, and lungs. Both loss and gain of RA signalling disrupt the development of these organs, indicating that its precise regulation is required for appropriate development. RA can bind to retinoic acid receptors (RARs), which are transcription factors that modulate target gene expression. De novo mutations in the RARB gene lead to a severe, rare and complex syndrome called PDAC charcaterized mainly by a Pulmonary hypoplasia, Diaphragmatic hernia, Anophthalmia and/or microphthalmia and Cardiac defects. In total, our group have identified 15 pathogenic variants in RARB in more than 30 patients affected with PDAC. Some of these variants induce gain-of-function (GOF) whereas others act in a dominant-negative (DN) manner in cell-based transcriptional assays. The goal of this project is to use the zebrafish model to study the functional impact of RARB variants in vivo. We found that expression of wild-type human RARB RNA in zebrafish caused RA dependent developmental defects including microphthalmia, swim bladder defects and cardiac edema. The introduction of a non-sense variant (p.K102X) abolished these effects. We tested the impact of putative GOF (p.R269T, p.R387C) and DN (p.M290R, p.L402P) on this RARB activity. We show that overexpression of the putative GOF cause a less severe phenotype compared to the WT RARB. However, the co-injection of the putative DN reveal that variant L402P behave as a DN in a developmental context, whereas M290R does not. Also, we characterize a rarga mutant line carrying a frameshift deletion in the middle of the ligand binding domain. We discovered that homozygous rarga zebrafish are lacking inflated swimbladder and branchial arches. A better understanding of the molecular mechanism of RARB during development might help develop effective therapeutic strategies through the modulation of the RA signaling.

Extracellular vesicles are involved in an increasing number of physiopathological processes and represent promising clinical tools for the diagnosis and treatment of various diseases. Their small size has long hindered in situ studies, which has limited their in vivo characterization and clinical use. Imaging approaches now allow the monitoring of extracellular vesicles in different animal models, in real time and at the single vesicle scale. The zebrafish appears in particular to be a relevant model organism to explore the biology of extracellular vesicles in vivo and to evaluate their therapeutic potential in preclinical studies.L’imagerie in vivo - Un outil incontournable pour mieux comprendre la biologie des vésicules extracellulaires.Les vésicules extracellulaires interviennent dans un nombre croissant de processus physiopathologiques et constituent des outils cliniques prometteurs pour le diagnostic et le traitement de diverses maladies. Leur petite taille a longtemps entravé leur étude in situ, ce qui a limité leur caractérisation in vivo et leur utilisation en clinique. Les avancées récentes en imagerie permettent à présent d’examiner et de suivre les vésicules extracellulaires dans différents modèles animaux, en temps réel et à l’échelle de la vésicule unique. Le poisson zèbre apparaît notamment comme un organisme modèle pertinent pour explorer le cycle de vie de ces vésicules in vivo et évaluer leurs potentialités thérapeutiques.

The motor neurons (MN) form the ultimate route to convey the commands from the central nervous system to muscles. During development, MN extend axons that follow stereotyped trajectories to their muscle targets, guided by various attractive and repulsive molecular cues. Extracellular matrix (ECM) is a major source of guidance cues, but its role in axonal development and regeneration remains poorly documented. Regenerating axons are able to return to their synaptic target following their original trajectory. The same guidance cues could be thus involved in motor nerve regeneration. Zebrafish has become a popular model system in understanding the development of the peripheral nervous system. Thanks to the generation of fluorescent transgenic lines and the optical transparency of embryos and larvae, it allows direct visualization of axonogenesis. Additionally, and contrary to humans, its remarkable capacity to regenerate makes it well suited for the study of nerve regeneration. A laser method to ablate nerves in living zebrafish larvae has been developed in our laboratory that, combined with the use of the fluorescent mnx1:gfp zebrafish transgenic line, allows the follow up of the dynamics of the nerve regeneration process. To study the role of ECM proteins present in the axonal path, mutant lines for different ECM proteins (already available in our laboratory or generated in mnx1:gfp fish using CRISPR-Cas9 method) will be used to analyze their role during the regeneration process. These mutant lines for ECM will be crossed with existing fluorescent transgenic lines to visualize different cell types involved in the nerve regeneration, such as macrophages (mfap4:mcherry), neutrophils (mpx:gfp) or even Schwann cells (sox10:mrfp). Overall, this study will depict the role of ECM in nerve regeneration and will provide essential knowledge for the development of new biomaterials to promote the regeneration of injured motor nerves.

Animals have to continuously adapt to their environment. Spontaneous behavior is thus modulated by sensory cues extracted from its environment, but shows an intrinsic variability, both between individuals and within individuals. The regulation of the internal state that defines the observed behavior at each moment, and how it is modulated by environmental conditions, remains elusive. In this thesis, we use zebrafish larva, a vertebrate amenable to whole-brain imaging, to probe these internal dynamics. Temperature allows the modulation of individual internal dynamics and serves as a lever for the study of variability in this animal. A behavioral study allowed us to establish how the paramaters that control fish navigation were dependent on both absolute temperature and its temporal variation, allowing the animal to confine itself to a temperature range of 22--28\degree{C}. We also mapped whole-brain neural response to brief thermal stimuli. These demonstrate that regions involved in processing hot and cold signals are distinct and both widely distributed throughout the brain. In a second part, we focused on exploratory behavior and its variability for larvae swimming in water at different temperatures without thermal gradient. We showed that the swimming dynamics is constrained within a fixed space defined by the statistical structure of the different kinematic parameters, a space probed by the animal over several tens of minutes. We then focused on a neural circuit controlling the orientation of the swim (right vs left), whose activity shows a persistence property over long times. We showed that behavioral and neural orientational persistence times evolve consistently with bath temperature. These neural recording data were used to train a network model (Ising model) able to reproduce the observed neural dynamics. In conclusion, this work has provided a quantitative description of the spontaneous exploratory dynamics of larval zebrafish, its stochastic and variable character, and the influence of temperature on this behavior. Functional imaging, coupled with neural circuit modeling, has allowed us to shed light on some of the neural mechanisms behind these oberservations., Les animaux doivent constamment s'adapter à leur environnement pour survivre. Le comportement spontané de l'animal est donc modulé par les informations sensorielles qu'il extrait de son environnement, mais présente une variabilité intrinsèque, à la fois entre individus et au sein d'un même individu. La régulation de l'état interne qui définit à chaque instant le comportement observé, et comment celui-ci peut être modulé par les conditions environnementales, reste mal comprise. Dans le cadre de cette thèse, nous utilisons la larve de poisson-zèbre, un vertébré permettant l’enregistrement de l’ensemble du cerveau, pour sonder cette dynamique interne. La température permet la modulation des dynamiques internes individuelles et sert de levier pour l'étude de la variabilité chez cet animal. Une étude comportementale nous a permis d’établir comment les paramètres qui contrôlent la navigation du poisson dépendaient à la fois de la température absolue et de sa variation temporelle, permettant à l’animal de se confiner dans une plage de température de 22--28\degree C. Nous avons par ailleurs établi les cartes de réponses neuronales à l'échelle du cerveau entier à de brefs stimuli thermiques. Elles démontrent que les régions impliquées dans le traitement des signaux chauds et froids sont distinctes et toutes deux largement distribuées dans l'ensemble du cerveau. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés au comportement exploratoire et à sa variabilité pour des larves nageant dans de l'eau à différentes températures en l’absence de gradient thermique. Nous avons montré que la dynamique de nage est contrainte à un espace fixe défini par la structure statistique des différents paramètres cinématiques, espace sondé par l’animal sur des temps caractéristiques de plusieurs dizaines de minutes. Nous nous sommes ensuite focalisés sur un circuit neuronal qui contrôle l'orientation de la nage (droite vs gauche), dont l'activité présente une propriété de persistance sur des temps longs. Nous avons montré que les temps de persistance orientationnelle comportementaux et neuronaux évoluent de manière cohérente avec la température du bain. Ces données d’enregistrement neuronaux ont servi à entraîner un modèle sur réseau (modèle d'Ising) capable de reproduire la dynamique neuronale observée. En conclusion, ce travail a permis de fournir une description quantitative de la dynamique exploratoire spontanée de la larve de poisson zèbre, son caractère stochastique et variable, et l’influence de la température sur ce comportement. L’imagerie fonctionnelle, couplée à la modélisation des circuits neuronaux, nous a permis d’éclairer certains des mécanismes neuronaux à l’origine de ces observations.

This work demonstrates that protocadherin-18a (Pcdh18a), expressed by the stromal cell progenitors, plays important roles in their migration and the subsequent formation of the first niche of definitive hematopoiesis, called the caudal hematopoietic tissue in zebrafish. The genesis of filopodia and migration of stromal cells expressing a Pcdh18a, lacking a major part of its cytoplasmic domain (Pcdh18a-ΔCP106), are compromised and cellular connections are retained for a longer time during cell migration. These results suggest that the cytoplasmic domain of Pcdh18a affects F-actin regulation and is also involved in cell-contact-mediated repulsion. Expression of Pcdh18a-ΔCP106 also leads to a 2-fold decrease in the number of stromal cells, and alters the formation of the venous plexus, the other main component of the niche, resulting in a non-functioning hematopoietic niche. It also induces the overexpression of fibronectin 1b, which probably contributes to the abnormal morphogenesis of the venous plexus. Finally, we found that the four-amino-acid motif REDV present in the extracellular region of Pcdh18a appears required for the attachment of stromal cells onto the vessels and their differentiation in stromal perivascular cells.; Ces travaux de thèse démontrent que la protocadhérine-18a (Pcdh18a), exprimée par les progéniteurs des cellules stromales, joue un rôle important dans leur migration, puis dans la formation de la première niche d’hématopoïèse définitive, appelé tissu hématopoïétique caudal chez le poisson zèbre. La genèse des filopodes et la migration de cellules stromales, exprimant une Pcdh18a tronquée dans sa partie cytoplasmique (Pcdh18a-ΔCP106), sont compromises et les connexions cellulaires sont plus durables au cours de la migration. Cela suggère que le domaine cytoplasmique de Pcdh18a affecte la régulation de l’actine-F et est impliqué dans la médiation de la répulsion cellulaire. L’expression de Pcdh18a-ΔCP106 conduit aussi à une diminution du nombre de cellules stromales, et altère la formation du plexus veineux, composant majeur de la niche, résultant en une niche hématopoïétique non fonctionnelle. Elle induit également la surexpression de la fibronectine 1b, ce qui contribue probablement à la morphogenèse anormale du plexus veineux. Enfin, nous avons découvert qu'un motif à quatre acides aminés REDV présent dans la région extracellulaire de Pcdh18a est requis pour la fixation des cellules stromales sur les vaisseaux et leur différenciation en cellules stromales périvasculaires.

In vertebrates, the ontogeny of microglia, the resident macrophages of the central nervous system, initiates early during development from primitive macrophages. While murine embryonic microglia then persist through life, in zebrafish these cells are transient, as they are fully replaced by an adult population originating from larval hematopoietic stem cell (HSC)-derived progenitors. Colony-stimulating factor receptor 1 (csf1r) is a fundamental regulator of microglia ontogeny in vertebrates, including zebrafish which possess two paralogous genes: csf1ra and csf1rb. While previous work showed invalidation of both genes completely abrogates microglia development, the specific contribution of each paralog remains largely unknown. Here, using a fate-mapping strategy to discriminate between the two microglial waves, we uncover non-overlapping roles for csf1ra and csf1rb in hematopoiesis, and identified csf1rb as an essential regulator of adult microglia development. Notably, we demonstrate that csf1rb positively regulates HSC-derived myelopoiesis, resulting in macrophage deficiency, including microglia, in adult mutant animals. Overall, this study contributes to new insights into evolutionary aspects of Csf1r signaling and provides an unprecedented framework for the functional dissection of embryonic versus adult microglia in vivo., info:eu-repo/semantics/published

Whereas the biochemical signals guiding axon growth and neuronal migration are extensively studied, the contribution of mechanical cues in neuronal circuit formation is still poorly explored in vivo. We aim at investigating how mechanical forces influence the construction of the zebrafish olfactory circuit. This circuit forms during the morphogenesis of the olfactory placode (OP) by the passive displacement of neuronal cell bodies away from the tip of their axons. My PhD work focuses on the mechanical contribution of the adjacent eye tissue, which develops underneath the OP through extensive evagination and invagination movements, to this passive neuronal migration and to their associated axon elongation. Quantitative live cell imaging analysis during OP morphogenesis first revealed that OP and eye cells undergo correlated movements. In embryos lacking eyes, the movements of OP cell bodies are affected, resulting in thinner placodes and shorter axons, and the mechanical stress along the direction of axon elongation within the OP is reduced. Finally, extracellular matrix was observed to accumulate at the eye/OP interface, and its enzymatic degradation decreased the correlation between OP and eye cell movements. Altogether, these results suggest that the developing eye exerts traction forces on the OP through extracellular matrix, mediating proper neuronal movements and axon extension. This work sheds new light on the role of mechanical forces exchanged between developing neurons and surrounding tissues in the sculpting of neuronal circuits in vivo., Alors que les signaux biochimiques impliqués dans la croissance axonale et la migration neuronale sont largement étudiés, la contribution des signaux mécaniques dans la formation des circuits neuronaux reste peu explorée in vivo. Nous cherchons à étudier comment les forces mécaniques contribuent à la formation du circuit olfactif du poisson-zèbre. Ce circuit se développe durant la morphogénèse de la placode olfactive (PO), par le mouvement passif des corps cellulaires qui s’éloignent de l’extrémité de leurs axones. Mes travaux de thèse s’intéressent à la contribution mécanique de l’œil, qui se forme sous la PO par des mouvements d’évagination et d’invagination, à cette migration passive des neurones et à l’extension de leurs axones. L'analyse quantitative des mouvements cellulaires a tout d’abord révélé que les mouvements des cellules de la PO et de l’œil sont corrélés. Chez des embryons dans lesquels l’œil ne se développe pas, les mouvements des cellules de la PO sont affectés, ce qui produit des PO plus fines et des axones plus courts, et la tension mécanique dans la direction d’élongation des axones dans la PO est réduite. Enfin, la matrice extracellulaire s’accumule à l’interface oeil/PO et sa dégradation enzymatique réduit la corrélation entre les mouvements des cellules de la PO et de l’œil. Ces résultats suggèrent que l’œil en formation exerce des forces de traction sur la PO, transmises par la matrice, entrainant le mouvement des neurones et l’extension des axones. Ce travail apporte un éclairage nouveau sur le rôle des forces mécaniques échangées entre les neurones en développement et les tissus environnants dans la formation des circuits neuronaux in vivo.

Tauopathies are a group of neurodegenerative diseases, associated with pathological Tau proteins. The Tau protein is expressed in the nervous system cells and is involved in microtubule network stabilization, via specific binding domains. Abnormal post-translational processes can lead to the loss of Tau stabilizing function. Therefore, acquisition of aggregative and neurotoxic properties results into the accumulation of neurofibrillary tangles in neurons, which are histopathological markers of tauopathies and Alzheimer’s disease. Oligomer formation and aggregation is also associated with Tau mutations specific of different pathologies with distinct etiology. One of the projects led by the team is to characterize the involvement of the neurotrophic factor BDNF in zebrafish models of tauopathies. A decrease in BDNF induced by the peptide Aβ has been observed in patients with Alzheimer’s disease, but few studies have focused on the possible links between BDNF and pathological Tau proteins. Initial results evidenced a decrease in BDNF in zebrafish larvae expressing the pathological protein TauP301L. The main objective of my thesis was the analysis of the neuronal and sensory-motor phenotypes of zebrafish larvae with overexpression of wild type or mutated Tau proteins (TauWT, TauA152T and TauP301L). Tau phosphorylation, neurotoxicity and sensory-motor defects induced by this overexpression were characterized. We next evaluated the neuroprotective role of an exogenous treatment of BDNF on neurotoxicity at the cellular and functional levels. In addition, other signaling pathways that may be involved in the observed deficits were investigated. Our results showed that overexpression of human Tau protein in zebrafish larvae induces Tau hyperphosphorylation, neuronal death and/or axonal retraction, associated with sensory and locomotor deficits. Overexpression of TauWT, or mutated proteins (TauA152T, TauP301L) lead to different locomotor responses: TauWT induced a decrease in locomotor activity, decrease even more pronounced for TauA152T, while TauP301L leads to locomotor hyperactivity of the larvae. In order to rescue the observed phenotypes, we tested neuroprotective factors including lithium chloride (LiCl), known as a GSK3β inhibitor described to improve the deficits induced by TauP301L. LiCl resulted in the recovery of a locomotor phenotype for the TauP301L lineage, similar to the controls. At the same time, an exogenous supply of BDNF, or a TrkB receptor agonist, partially alleviated neurotoxicity and fully restored locomotor defects. The BDNF and LiCl treatments had no beneficial effect on locomotor alterations in larvae expressing the TauWT and TauA152T proteins. In order to test other signaling pathways involved in tauopathies, we next investigated the endoplasmic reticulum stress pathway, or UPR. Our preliminary data indicate several alterations of UPR effectors in larvae, such as an increase in the PERK protein level for larvae expressing TauWT and TauA152T. However, no beneficial effect was observed with a PERK inhibitor on TauWT or TauA152T larvae. In conclusion, our results demonstrate that overexpression of TauA152T or TauP301L proteins leads to Tau protein hyperphosphorylation, and a similar neurotoxicity. Sensory-motor tests were able to discriminate the effects induced by these two mutations. Furthermore, only TauP301L larvae displayed a decrease in the expression of the neurotrophic factor BDNF, that could be rescued by a pharmacological approach with the recovery of the locomotor phenotype. The two mutations studied have different aggregation and propagation properties and our data provide a complementary functional aspect in the perspective of testing new neuroprotective compounds., Les tauopathies sont des maladies neurodégénératives impliquant des formes pathologiques de la protéine Tau. La protéine Tau est exprimée dans le système nerveux et intervient dans la stabilisation du réseau de microtubules. Suite à des modifications post-traductionnelles, la protéine Tau peut perdre sa fonction de stabilisation et acquérir des propriétés neurotoxiques et former des agrégats. Cela conduit à l’accumulation d’enchevêtrements neurofibrillaires dans les neurones, des marqueurs histopathologiques associés aux tauopathies et à la maladie d’Alzheimer (MA). La présence de mutations sur la protéine Tau peut favoriser son agrégation et conduire à des physiopathologies différentes du point de vue évolutif et clinique. Une diminution du BDNF a été observée chez les patients atteints par la MA, mais peu d’études se sont intéressées aux liens entre le facteur neurotrophique BDNF et la protéine Tau. La caractérisation de l’implication du BDNF dans des modèles poisson-zèbre de tauopathies a été réalisé au sein de l’équipe. Des premiers résultats montrent que les larves de poisson-zèbre exprimant la protéine mutée TauP301L présentent une diminution du BDNF. Dans ces travaux de thèse, nous avons étudié les effets de la surexpression neuronale de différentes protéines Tau, sauvage ou mutées (TauWT, TauA152T et TauP301L) chez les larves de poisson-zèbres. La phosphorylation de la protéine Tau, la neurotoxicité ainsi que les défauts sensori-moteurs provoqués par cette surexpression ont été caractérisés. Nous avons ensuite recherché des facteurs neuroprotecteurs au niveau cellulaire et fonctionnel par une approche pharmacologique ciblant les voies de signalisation pouvant être impliquées dans les déficits observés. La surexpression d’une protéine Tau humaine chez les larves de poisson-zèbres induit son hyperphosphorylation, une augmentation de la neurotoxicité et provoque des déficits sensori-moteurs. La surexpression de la protéine sauvage (TauWT) ou mutée (TauA152T, TauP301L) conduit à des réponses locomotrices différentes. TauWT induit une diminution de l’activité locomotrice, TauA152T la diminue drastiquement, alors que TauP301L conduit à une hyperactivité locomotrice des larves. Afin de réparer les phénotypes observés, nous avons testé dans un premier temps le chlorure de lithium (LiCl), un inhibiteur de la GSK3β décrit pour améliorer les déficits induits par TauP301L. Le LiCl permet de rétablir l’activité locomotrice des larves TauP301L. Parallèlement, un apport exogène de BDNF permet de diminuer la neurotoxicité et également de réparer les défauts locomoteurs. Les traitements BDNF et LiCl ne montrent aucun effet bénéfique sur les altérations locomotrices des larves TauWT et TauA152T. Sachant que la voie du stress du réticulum endoplasmique (UPR) est également dérégulée dans les tauopathies, nous avons réalisé une étude préliminaire chez les larves. Nos résultats indiquent des altérations de certains effecteurs de cette voie, avec une augmentation de la protéine PERK pour les larves TauWT et TauA152T. Cependant, aucun effet bénéfique n’est obtenu avec un inhibiteur de PERK sur les larves TauWT ou TauA152T. En conclusion, nous avons montré que la surexpression de TauA152T ou TauP301L conduit à une hyperphosphorylation et une neurotoxicité similaire entre ces deux lignées de poissons-zèbres. Seuls les tests sensori-moteurs sont en mesure de discriminer les effets induits par ces deux mutations. De plus, nous avons montré que seules les larves TauP301L présentent une diminution du facteur neurotrophique BDNF. Prévenir ces dérégulations par une approche pharmacologique a permis de restaurer le phénotype locomoteur et/ou partiellement la neurotoxicité chez les larves TauP301L. Les deux mutations étudiées possèdent des propriétés d’agrégation et de propagation différentes et nos données apportent un aspect fonctionnel complémentaire dans la perspective de tests de nouveaux composés neuroprotecteurs.

Tauopathies are a group of neurodegenerative diseases, associated with pathological Tau proteins. The Tau protein is expressed in the nervous system cells and is involved in microtubule network stabilization, via specific binding domains. Abnormal post-translational processes can lead to the loss of Tau stabilizing function. Therefore, acquisition of aggregative and neurotoxic properties results into the accumulation of neurofibrillary tangles in neurons, which are histopathological markers of tauopathies and Alzheimer’s disease. Oligomer formation and aggregation is also associated with Tau mutations specific of different pathologies with distinct etiology. One of the projects led by the team is to characterize the involvement of the neurotrophic factor BDNF in zebrafish models of tauopathies. A decrease in BDNF induced by the peptide Aβ has been observed in patients with Alzheimer’s disease, but few studies have focused on the possible links between BDNF and pathological Tau proteins. Initial results evidenced a decrease in BDNF in zebrafish larvae expressing the pathological protein TauP301L. The main objective of my thesis was the analysis of the neuronal and sensory-motor phenotypes of zebrafish larvae with overexpression of wild type or mutated Tau proteins (TauWT, TauA152T and TauP301L). Tau phosphorylation, neurotoxicity and sensory-motor defects induced by this overexpression were characterized. We next evaluated the neuroprotective role of an exogenous treatment of BDNF on neurotoxicity at the cellular and functional levels. In addition, other signaling pathways that may be involved in the observed deficits were investigated. Our results showed that overexpression of human Tau protein in zebrafish larvae induces Tau hyperphosphorylation, neuronal death and/or axonal retraction, associated with sensory and locomotor deficits. Overexpression of TauWT, or mutated proteins (TauA152T, TauP301L) lead to different locomotor responses: TauWT induced a decrease in locomotor activity, decrease even more pronounced for TauA152T, while TauP301L leads to locomotor hyperactivity of the larvae. In order to rescue the observed phenotypes, we tested neuroprotective factors including lithium chloride (LiCl), known as a GSK3β inhibitor described to improve the deficits induced by TauP301L. LiCl resulted in the recovery of a locomotor phenotype for the TauP301L lineage, similar to the controls. At the same time, an exogenous supply of BDNF, or a TrkB receptor agonist, partially alleviated neurotoxicity and fully restored locomotor defects. The BDNF and LiCl treatments had no beneficial effect on locomotor alterations in larvae expressing the TauWT and TauA152T proteins. In order to test other signaling pathways involved in tauopathies, we next investigated the endoplasmic reticulum stress pathway, or UPR. Our preliminary data indicate several alterations of UPR effectors in larvae, such as an increase in the PERK protein level for larvae expressing TauWT and TauA152T. However, no beneficial effect was observed with a PERK inhibitor on TauWT or TauA152T larvae. In conclusion, our results demonstrate that overexpression of TauA152T or TauP301L proteins leads to Tau protein hyperphosphorylation, and a similar neurotoxicity. Sensory-motor tests were able to discriminate the effects induced by these two mutations. Furthermore, only TauP301L larvae displayed a decrease in the expression of the neurotrophic factor BDNF, that could be rescued by a pharmacological approach with the recovery of the locomotor phenotype. The two mutations studied have different aggregation and propagation properties and our data provide a complementary functional aspect in the perspective of testing new neuroprotective compounds.; Les tauopathies sont des maladies neurodégénératives impliquant des formes pathologiques de la protéine Tau. La protéine Tau est exprimée dans le système nerveux et intervient dans la stabilisation du réseau de microtubules. Suite à des modifications post-traductionnelles, la protéine Tau peut perdre sa fonction de stabilisation et acquérir des propriétés neurotoxiques et former des agrégats. Cela conduit à l’accumulation d’enchevêtrements neurofibrillaires dans les neurones, des marqueurs histopathologiques associés aux tauopathies et à la maladie d’Alzheimer (MA). La présence de mutations sur la protéine Tau peut favoriser son agrégation et conduire à des physiopathologies différentes du point de vue évolutif et clinique. Une diminution du BDNF a été observée chez les patients atteints par la MA, mais peu d’études se sont intéressées aux liens entre le facteur neurotrophique BDNF et la protéine Tau. La caractérisation de l’implication du BDNF dans des modèles poisson-zèbre de tauopathies a été réalisé au sein de l’équipe. Des premiers résultats montrent que les larves de poisson-zèbre exprimant la protéine mutée TauP301L présentent une diminution du BDNF. Dans ces travaux de thèse, nous avons étudié les effets de la surexpression neuronale de différentes protéines Tau, sauvage ou mutées (TauWT, TauA152T et TauP301L) chez les larves de poisson-zèbres. La phosphorylation de la protéine Tau, la neurotoxicité ainsi que les défauts sensori-moteurs provoqués par cette surexpression ont été caractérisés. Nous avons ensuite recherché des facteurs neuroprotecteurs au niveau cellulaire et fonctionnel par une approche pharmacologique ciblant les voies de signalisation pouvant être impliquées dans les déficits observés. La surexpression d’une protéine Tau humaine chez les larves de poisson-zèbres induit son hyperphosphorylation, une augmentation de la neurotoxicité et provoque des déficits sensori-moteurs. La surexpression de la protéine sauvage (TauWT) ou mutée (TauA152T, TauP301L) conduit à des réponses locomotrices différentes. TauWT induit une diminution de l’activité locomotrice, TauA152T la diminue drastiquement, alors que TauP301L conduit à une hyperactivité locomotrice des larves. Afin de réparer les phénotypes observés, nous avons testé dans un premier temps le chlorure de lithium (LiCl), un inhibiteur de la GSK3β décrit pour améliorer les déficits induits par TauP301L. Le LiCl permet de rétablir l’activité locomotrice des larves TauP301L. Parallèlement, un apport exogène de BDNF permet de diminuer la neurotoxicité et également de réparer les défauts locomoteurs. Les traitements BDNF et LiCl ne montrent aucun effet bénéfique sur les altérations locomotrices des larves TauWT et TauA152T. Sachant que la voie du stress du réticulum endoplasmique (UPR) est également dérégulée dans les tauopathies, nous avons réalisé une étude préliminaire chez les larves. Nos résultats indiquent des altérations de certains effecteurs de cette voie, avec une augmentation de la protéine PERK pour les larves TauWT et TauA152T. Cependant, aucun effet bénéfique n’est obtenu avec un inhibiteur de PERK sur les larves TauWT ou TauA152T. En conclusion, nous avons montré que la surexpression de TauA152T ou TauP301L conduit à une hyperphosphorylation et une neurotoxicité similaire entre ces deux lignées de poissons-zèbres. Seuls les tests sensori-moteurs sont en mesure de discriminer les effets induits par ces deux mutations. De plus, nous avons montré que seules les larves TauP301L présentent une diminution du facteur neurotrophique BDNF. Prévenir ces dérégulations par une approche pharmacologique a permis de restaurer le phénotype locomoteur et/ou partiellement la neurotoxicité chez les larves TauP301L. Les deux mutations étudiées possèdent des propriétés d’agrégation et de propagation différentes et nos données apportent un aspect fonctionnel complémentaire dans la perspective de tests de nouveaux composés neuroprotecteurs.

Molecular transport in neurons plays an essential role in their development and the maintenance of their functions, due in particular to their long branches. The consequences of axonal transport abnormalities have long been associated with Alzheimer's disease, such as the swelling of axons caused by the accumulation of transported organelles. However, there are few tools allowing the detailed long-term study of this transport in culture and even less in vivo.The team in which this work was conducted has developed a method for measuring intraneuronal transport in mouse cultured neurons based on the tracking of endosomes having spontaneously internalized fluorescent nanodiamonds. This technique was able to detect genetic risk factors of neuropsychiatric diseases, proving its high sensitivity.The objective of my thesis was to extend this measurement method to the neuronal circuit of the zebrafish larvae’s brain. For this purpose, I have used nanocrystals (NCs) with non-linear optical response, which can be excited in a tissue transparency window at a wavelength ≈1 µm, and generate a second harmonic signal. We have used the multiphoton microscope of the Emerg'In facility (INRAE, Jouy-en-Josas), which is installed next to a fish farming and has resonant galvanometric scanners and hybrid detectors, which allowed us to maintain a frame rate of 20 fps despite the need to scan the laser beam, unlike in culture studies conducted in wide field.We have developed a new measurement protocol, from the injection of the NC to the extraction of transport parameters from the videos data. To do this, I have optimized and automated the data analysis by developing two programs written in Python: one that automatically reconstructs the trajectories of the NCs as faithfully as possible and the other that segments the trajectories into motion and pause phases in order to extract transport parameters.I have applied these new tools to study, in a transgenic zebrafish model, the functional impact of a mutation present in neuropathies including hereditary spastic paraplegia and peripheral Charcot-Marie-Tooth disease. In patients suffering from one of these diseases, several mutations have been identified in the KIF5A gene coding for the heavy chain of the kinesin 1 molecular motor which ensures anterograde movements (from the cell body to the periphery). We have measured endosome transport in axons of neurons in the brain of transgenic zebrafish larvae bearing a mutation on kif5a, and we observed subtle changes in this transport. More than 500 endosome trajectories (acquired at a depth of ≈100 µm below the surface of the head) were analyzed from 40 larvae.As a control, we also studied endosomal transport in mutants deprived of dynein motors, the only ones to ensure retrograde transport, and observed that bi-directional transport was totally stopped in the mutants.This methodology can be used to screen for functional abnormalities resulting from genetic factors of neurological or neurodegenerative disorders., Le transport moléculaire dans les neurones joue un rôle essentiel dans leur développement et la maintenance de leurs fonctions, en raison notamment de leurs longues arborescences. Les conséquences d’anomalies du transport axonal ont été associées de longue date à la maladie d’Alzheimer telle que le gonflement des axones consécutif à l’accumulation des organelles transportés, mais il y a peu d’outils permettant l’étude fine sur le long terme de ce transport en culture et encore moins in vivo.L’équipe dans laquelle cette thèse a été réalisée a développé une méthode de mesure du transport intraneuronal en culture de neurone de souris reposant sur le suivi d’endosomes ayant internalisé spontanément des nanodiamants fluorescents. Elle a également démontré la grande sensibilité de cette méthode à détecter des facteurs de risques génétiques de maladies neuropsychiatriques.L’objectif de ma thèse a été d’étendre cette méthode de mesure au circuit neuronal intègre du cerveau de larves de poisson zèbre. Pour ce faire j’ai utilisé des nanocristaux (NCs) à réponse optique non-linéaires, pouvant être excité dans une fenêtre de transparence des tissus, à une longueur d’onde ≈1 µm, et générant un signal de second harmonique (SHG). Nous avons utilisé le microscope multiphoton de la plateforme Emerg’In (INRAE, Jouy-en-Josas) qui est installée au sein d’une pisciculture et dispose de scanners galvanométriques résonants et de détecteurs hybrides, ce qui nous a permis de maintenir une cadence de 20 champs par seconde malgré la nécessité de balayer le faisceau laser, contrairement aux études en culture, menées en champ large.Nous avons mis au point un nouveau protocole de mesure, depuis l’injection des NC jusqu’à l’extraction des paramètres de transport à partir des données vidéos. Pour cela, j’ai optimisé et automatisé les analyses des données en développant deux programmes écrits en Python : l’un permettant de reconstruire automatiquement les trajectoires des NCs de manière la plus fidèle possible et l’autre permettant de segmenter les trajectoires en phases de mouvement et de pauses afin d’en extraire des paramètres de transport.J’ai appliqué ces nouveaux outils à l’étude, sur un modèle transgénique de poisson zèbre, de l’impact fonctionnel d’une mutation présente dans des neuropathies dont une paraplégie spastique héréditaire et la maladie de Charcot-Marie-Tooth périphérique. Chez des patients atteints par l’une de ces maladies, plusieurs mutations ont été identifiées sur le gène KIF5A codant pour la chaine lourde du moteur moléculaire kinésine 1 qui assure des déplacements antérogrades (du corps cellulaire vers la périphérie). Nous avons mesuré le transport d’endosomes dans les axones de neurones du cerveau de larve de poissons zèbres transgéniques portant une mutation sur kif5a, et avons observé des modifications subtiles de ce transport. Pour cela, plus de 500 trajectoires d’endosomes (acquises à une profondeur de ≈100 µm sous la surface de la tête) ont été analysées, issues de 40 larves.En guise de contrôle, nous avons également étudié le transport endosomal dans des mutants privés des moteurs dynéines, les seuls à assurer le transport rétrograde, et avons observé que le transport bidirectionnel était totalement arrêté dans les mutants.La méthodologie mise en place peut servir à cribler des anomalies fonctionnelles résultant de facteurs génétiques de troubles neurologiques ou neurodégénératifs.

The vestibular apparatus provides animals with postural and movement-related information that is essential to adequately execute numerous sensorimotor tasks. In order to activate this sensory system in a physiological manner, one needs to macroscopically rotate or translate the animal’s head, which in turn renders simultaneous neural recordings highly challenging. My thesis work focused on the development of a miniaturized light-sheet microscope that can be dynamically co-rotated with a head-restrained zebrafish larva, enabling control- led vestibular stimulation. The mechanical rigidity of the microscope allows me to perform whole-brain functional imaging with state-of-the-art resolution and signal-to-noise ratio while imposing up to 25◦ in angular position and 6 000◦/s2 in rotational acceleration. I illustrate the potential of this novel setup by producing the first whole-brain response maps to rolling and tilting vestibular stimulation. The responsive population spans multiple brain areas and displays bilateral symmetry, and its organization is highly stereotypic across individuals. Using Fourier and regression analyses, I identified three major functional clusters that exhibit well defined phasic and tonic response patterns to vestibular stimulation. This rotatable light-sheet microscope provides a unique tool for systematically studying vestibular processing in the vertebrate brain and extends the potential of virtual- reality systems to explore complex multisensory and motor integration during simulated 3D navigation.; L’appareil vestibulaire fournit aux animaux des informations relatives à la posture et aux mouvements qui sont essentielles pour exécuter correctement les tâches sensori-motrices. Afin d’activer ce système sensoriel de manière physiologique, il est nécessaire d’effectuer une rotation ou une translation macroscopique de la tête de l’animal, ce qui rend les enregistrements neuronaux simultanés très difficiles. Mon travail de thèse a porté sur le développement d’un microscope à feuille de lumière miniaturisé, qui peut être mis en rotation dynamique avec une larve de poisson zèbre retenue par la tête permettant une stimulation vestibulaire contrôlée. La rigidité mécanique du microscope m’a permis d’effectuer une imagerie fonctionnelle de l’ensemble du cerveau avec une résolution et un rapport signal/bruit équivalent à l’état de l’art, tout en imposant jusqu’à 25◦ d’amplitude et 6 000◦/s2 d’accélération angulaire. Le potentiel de ce nouveau système m’a permis de produire les premières cartes de réponses du cerveau entier à la stimulation vestibulaire en roulis et en tangage. Les neurones excités s’étendent sur plusieurs zones cérébrales et présentent une symétrie bilatérale, et son organisation est très stéréotypée d’un individu à l’autre. En utilisant l’analyse de Fourier et de régression, j’ai identifié trois grands groupes fonctionnels qui présentent des schémas de réponse phasique et tonique bien définis à la stimulation vestibulaire. Ce microscope rotatif fournit un outil unique pour l’étude du traitement vestibulaire dans le cerveau des vertébrés.

The vestibular apparatus provides animals with postural and movement-related information that is essential to adequately execute numerous sensorimotor tasks. In order to activate this sensory system in a physiological manner, one needs to macroscopically rotate or translate the animal’s head, which in turn renders simultaneous neural recordings highly challenging. My thesis work focused on the development of a miniaturized light-sheet microscope that can be dynamically co-rotated with a head-restrained zebrafish larva, enabling control- led vestibular stimulation. The mechanical rigidity of the microscope allows me to perform whole-brain functional imaging with state-of-the-art resolution and signal-to-noise ratio while imposing up to 25◦ in angular position and 6 000◦/s2 in rotational acceleration. I illustrate the potential of this novel setup by producing the first whole-brain response maps to rolling and tilting vestibular stimulation. The responsive population spans multiple brain areas and displays bilateral symmetry, and its organization is highly stereotypic across individuals. Using Fourier and regression analyses, I identified three major functional clusters that exhibit well defined phasic and tonic response patterns to vestibular stimulation. This rotatable light-sheet microscope provides a unique tool for systematically studying vestibular processing in the vertebrate brain and extends the potential of virtual- reality systems to explore complex multisensory and motor integration during simulated 3D navigation.; L’appareil vestibulaire fournit aux animaux des informations relatives à la posture et aux mouvements qui sont essentielles pour exécuter correctement les tâches sensori-motrices. Afin d’activer ce système sensoriel de manière physiologique, il est nécessaire d’effectuer une rotation ou une translation macroscopique de la tête de l’animal, ce qui rend les enregistrements neuronaux simultanés très difficiles. Mon travail de thèse a porté sur le développement d’un microscope à feuille de lumière miniaturisé, qui peut être mis en rotation dynamique avec une larve de poisson zèbre retenue par la tête permettant une stimulation vestibulaire contrôlée. La rigidité mécanique du microscope m’a permis d’effectuer une imagerie fonctionnelle de l’ensemble du cerveau avec une résolution et un rapport signal/bruit équivalent à l’état de l’art, tout en imposant jusqu’à 25◦ d’amplitude et 6 000◦/s2 d’accélération angulaire. Le potentiel de ce nouveau système m’a permis de produire les premières cartes de réponses du cerveau entier à la stimulation vestibulaire en roulis et en tangage. Les neurones excités s’étendent sur plusieurs zones cérébrales et présentent une symétrie bilatérale, et son organisation est très stéréotypée d’un individu à l’autre. En utilisant l’analyse de Fourier et de régression, j’ai identifié trois grands groupes fonctionnels qui présentent des schémas de réponse phasique et tonique bien définis à la stimulation vestibulaire. Ce microscope rotatif fournit un outil unique pour l’étude du traitement vestibulaire dans le cerveau des vertébrés.

Dans le système nerveux central adulte, la glycine est principalement connue pour son rôle de transmission d’un signal inhibiteur à l'intérieur des neurones matures, régulant ainsi l'activité du réseau neuronal. Paradoxalement, durant l'embryogenèse, ce même neurotransmetteur génère une transmission excitatrice produisant ainsi le premier signal électrique dans les neurones immatures. Le rôle et la signification fonctionnelle de ce changement d’activité durant le développement neurologique restent toujours inconnus. En utilisant l’embryon du poisson-zèbre comme modèle, nous avons exploré les mécanismes moléculaires et cellulaires dépendants de la signalisation de glycine dans les cellules souches neuronales (CSNs). En premier lieu, nous avons développé un outil d’analyse basé sur une combinaison de deux éléments: une lignée transgénique qui exprime du GFP dans les CSNs et la technique de séquençage de l’ARN total. Nous avons utilisé cette technique pour isoler et déterminer les mécanismes moléculaires régulés par la glycine dans les CSNs. Ceci a permis d’identifier plusieurs gènes candidats dont l’expression est modulée par l’activité glycinergique. Ces gènes appartiennent principalement à cinq différentes voies de signalisation canoniques incluant la voie de signalisation du calcium, TGF-bêta, Shh, Wnt et p53. Pour en apprendre davantage sur ces mécanismes moléculaires, nous avons exploré l’un d’entre eux soit la régulation de la signalisation p53 par l’activité glycinergique. En effet, nous avons démontré que l’activité glycinergique favorise la survie des CSNs par la régulation de la signalisation de p53 et agit spécifiquement sur la sous-population CSN-nestin+ durant la neurogenèse. Dans un autre projet, nous avons examiné la régulation de l’expression de lnx1 par l’activité glycinergique. Nous avons démontré que la signalisation de glycine/lnx1 régule la prolifération des CSNs via la modulation de l’activité de Notch durant la neurogenèse. En conclusion, dans ce projet de thèse, j’ai mis en lumière plusieurs mécanismes moléculaires et cellulaires modulés par l’activité glycinergique dans les CSNs. Ceci peut contribuer dans le futur à la compréhension de la physiopathologie liée au dysfonctionnement de cette dernière ainsi qu’à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques., In the adult central nervous system, glycine is mainly known as an inhibitory neurotransmitter in mature neurons, thereby regulating the neural network activity. Paradoxically, during embryogenesis, the same neurotransmitter generates excitatory transmission and induces the first electrical signal in immature neurons. The role and functional significance of this change in glycinergic activity during neurogenesis are still unknown. In this study, we used zebrafish embryos as a model to explore the glycine-dependent molecular and cellular mechanisms in neural stem cells (NSCs). First, we developed an in vivo analysis method based on two main elements: a transgenic line that expresses GFP within NSCs and the RNA sequencing technique. This method of analysis was used to determine glycine-dependent molecular mechanisms in NSCs. We identified several candidate genes whose expression is modulated by the glycinergic activity. These genes participate in five different canonical signaling pathways including the calcium signaling pathway, TGF-beta, Shh, Wnt and p53. To further understand these molecular mechanisms, we focused our investigation on the regulation of p53 signaling by the glycinergic activity. Indeed, we have demonstrated that glycinergic activity promotes the survival of NSCs by regulating p53 signaling and more specifically acting on NSC-nestin + subpopulation during neurogenesis. Finally, we explored the regulation of lnx1 expression by glycinergic activity. We have demonstrated that glycine/lnx1 signaling regulates the proliferation of NSCs via the modulation of Notch activity during neurogenesis. In conclusion, during this thesis project, I highlighted several molecular and cellular mechanisms modulated by the glycinergic activity in NSCs. These relevant results may contribute in the future to the understanding of the physiopathology related to glycinergic activity dysfunctions and the identification of new therapeutic targets.

Mutations in the MAB21L2 gene have been associated with major eye developmental malformations including coloboma and microphtalmia, occasionally coupled with skeletal dysplasia and intellectual disability. Mab21l2, one of three members of Mab21 gene family, indeed plays a key role in cell fate and differentiation during embryonic development while its lack leads to severe defects in the formation of the vertebrate visual system. However, Mab21l2 function remains poorly understood, and although it is highly expressed in the hindbrain, the impact of its depletion on this developing structure had yet to be investigated. My PhD project thereby aimed at : (i) refining the characterisation of the phenotype associated with the lack of Mab21l2 both in the visual system and in the hindbrain during development of the zebrafish via a dual approach of partial (i.e., antisense RNA technology) or total (establishment of a mutant line using the CRISPR/Cas9 strategy) loss of function; and (ii) identifying Mab21l2 target genes by a comparative transcriptomic analysis. My results have so far shown that partial or total loss of Mab21l2 leads to similar defects such as abnormal architecture of the retina, defects in axon outgrowth and navigation of the retinal ganglion cells, and a severe disorganisation of the hindbrain metameric structure. Moreover, using the tools I have developed in the lab, I observed that the lack of Mab21l2 resulted in changes in gene expression, which pointed at a regulating role for Mab21l2 in the cell cycle as well as in major molecular pathways such as Wnt and FGF signalling., Des mutations du gène MAB21l2 engendrent principalement des malformations développementales de l’œil dont des colobomes et des microphtalmies. Mab21l2, l’un des trois membres de la famille génique Mab21, joue en effet un rôle clé dans le destin et la différenciation cellulaires au cours du développement embryonnaire et son absence induit des défauts sévères de formation du système visuel chez les vertébrés. Cependant, la fonction cellulaire de Mab21l2 reste obscure et bien qu’il soit exprimé au niveau du rhombencéphale, l’impact de sa déplétion sur cette structure n’avait encore jamais été étudié. Les objectifs de ma thèse se sont donc focalisés sur : (i) la caractérisation précise des défauts associés à la perte de fonction de Mab21l2 tant au niveau du système visuel que du rhombencéphale du poisson-zèbre par une double approche de perte de fonction partielle (stratégie d’ARN antisens) ou totale via l’établissement d’une lignée mutante CRISPR/Cas9 ; et (ii) l’identification de gènes cibles de Mab21l2 par une analyse transcriptomique comparative. Mes résultats ont montré que la perte de fonction partielle ou totale de Mab21l2 engendre des défauts similaires tels une architecture anormale de la rétine, des défauts de croissance et de navigation axonale des cellules ganglionnaires de la rétine et une sévère désorganisation de l’organisation métamérique du rhombencéphale. De plus en utilisant les outils que j’avais développés, j’ai pu observer que la perte de Mab21l2 entraîne des changements d’expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et les grandes voies de signalisation Wnt et FGF, sous-tendant un rôle de Mab21l2 dans ces processus cellulaires et moléculaires.

Mutations in the MAB21L2 gene have been associated with major eye developmental malformations including coloboma and microphtalmia, occasionally coupled with skeletal dysplasia and intellectual disability. Mab21l2, one of three members of Mab21 gene family, indeed plays a key role in cell fate and differentiation during embryonic development while its lack leads to severe defects in the formation of the vertebrate visual system. However, Mab21l2 function remains poorly understood, and although it is highly expressed in the hindbrain, the impact of its depletion on this developing structure had yet to be investigated. My PhD project thereby aimed at : (i) refining the characterisation of the phenotype associated with the lack of Mab21l2 both in the visual system and in the hindbrain during development of the zebrafish via a dual approach of partial (i.e., antisense RNA technology) or total (establishment of a mutant line using the CRISPR/Cas9 strategy) loss of function; and (ii) identifying Mab21l2 target genes by a comparative transcriptomic analysis. My results have so far shown that partial or total loss of Mab21l2 leads to similar defects such as abnormal architecture of the retina, defects in axon outgrowth and navigation of the retinal ganglion cells, and a severe disorganisation of the hindbrain metameric structure. Moreover, using the tools I have developed in the lab, I observed that the lack of Mab21l2 resulted in changes in gene expression, which pointed at a regulating role for Mab21l2 in the cell cycle as well as in major molecular pathways such as Wnt and FGF signalling.; Des mutations du gène MAB21l2 engendrent principalement des malformations développementales de l’œil dont des colobomes et des microphtalmies. Mab21l2, l’un des trois membres de la famille génique Mab21, joue en effet un rôle clé dans le destin et la différenciation cellulaires au cours du développement embryonnaire et son absence induit des défauts sévères de formation du système visuel chez les vertébrés. Cependant, la fonction cellulaire de Mab21l2 reste obscure et bien qu’il soit exprimé au niveau du rhombencéphale, l’impact de sa déplétion sur cette structure n’avait encore jamais été étudié. Les objectifs de ma thèse se sont donc focalisés sur : (i) la caractérisation précise des défauts associés à la perte de fonction de Mab21l2 tant au niveau du système visuel que du rhombencéphale du poisson-zèbre par une double approche de perte de fonction partielle (stratégie d’ARN antisens) ou totale via l’établissement d’une lignée mutante CRISPR/Cas9 ; et (ii) l’identification de gènes cibles de Mab21l2 par une analyse transcriptomique comparative. Mes résultats ont montré que la perte de fonction partielle ou totale de Mab21l2 engendre des défauts similaires tels une architecture anormale de la rétine, des défauts de croissance et de navigation axonale des cellules ganglionnaires de la rétine et une sévère désorganisation de l’organisation métamérique du rhombencéphale. De plus en utilisant les outils que j’avais développés, j’ai pu observer que la perte de Mab21l2 entraîne des changements d’expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et les grandes voies de signalisation Wnt et FGF, sous-tendant un rôle de Mab21l2 dans ces processus cellulaires et moléculaires.

Heat shock proteins (HSPs) are reported to play an important role in erythropoiesis. The expression of HSP genes is mainly controlled by Heat shock factor 1 (HSF1), a highly conserved transcription factor. So far, a detailed understanding of the function of HSF1 in erythropoiesis remains uncharacterized. This study has employed zebrafish as a relevant model to investigate the role of Hsf1 during embryonic erythropoiesis. We established hsf1-disrupted zebrafish lines using the CRISPR/Cas9 technology and performed phenotypic analyses throughout embryogenesis. We found that Hsf1 deficient embryos had a decreased number of primitive erythrocytes, while erythrocyte number in adults was unchanged. In Hsf1 deficient embryos, expression of embryonic a and b-globin genes was reduced as well as gata1 expression. In addition, the morphology of erythrocytes suggested an inhibition of erythrocyte maturation. On the other hand, no significant changes were observed in myeloid cells.Altogether our results support a key role for Hsf1 in erythrocyte maturation in vivo., Il a été démontré que les protéines de choc thermique (HSP) jouent un rôle important dans l'érythropoïèse. Or, l'expression des gènes HSP est contrôlée par le facteur de choc thermique 1 (HSF1), un facteur de transcription hautement conservé. Jusqu'à présent, une compréhension détaillée de la fonction d’HSF1 dans l'érythropoïèse reste à établir. Dans notre étude, nous avons utilisé le poisson zèbre, modèle animal pertinent, pour étudier le rôle du gène hsf1 pendant l'érythropoïèse embryonnaire. Nous avons établi des lignées de poisson-zèbre invalidées pour le gène hsf1 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 et nous avons effectué des analyses phénotypiques tout au long de l'embryogenèse. Nous avons constaté que les embryons déficients en Hsf1 ont un nombre réduit d'érythrocytes primitifs, alors que le nombre d'érythrocytes chez les poissons zèbres adultes reste inchangé. L'expression des gènes embryonnaires des chaînes a et b-globines est réduite ainsi que l'expression de gata1. De plus, la morphologie des érythrocytes révèle une inhibition de la maturation des érythrocytes. En revanche, aucun changement significatif n'a été observé dans les cellules myéloïdes.Nos résultats montrent que le gène hsf1 est un régulateur positif de la maturation des érythrocytes in vivo.

In recent years, zebrafish have become well established for the study of fundamental biology, toxicology and drug discovery. Here we propose fast, standardized protocols for high-throughput and high-content 3D imaging of 5dpf zebrafish fry using a confocal laser scanning microscope. Using a lipophilic fluorescent dye, we generated a reference labeling in cleared fish. We developed a mounting method based on 3D-printed stamps used to create a grid of wells in an agarose cast. We demonstrate that the quality and homogeneity of the fluorescence signal allows an unequivocal segmentation of the whole specimen and the white matter. From there, we built an automated image registration and analysis pipeline for the volumetric analysis of morphological defects. The platform, termed ‘ZeBraInspector’, is focused on the analysis of the shape of the whole fry or the white-matter of the central nervous system. We finally provide two examples of application: the characterization of a phenotype associated with a neuro-developmental mutation, and of the defects caused by treatments with a toxic anti-cancer compound. ZeBraInspector can be adapted to a wide variety of high-content analyses., L’observation d’organismes vivants par microscopie est d’un intérêt scientifique indéniable. Le poisson zèbre est un modèle de choix pour tirer le meilleur de ces observations, sa transparence pouvant être améliorée par des méthodes de clarification de tissus. L’objectif de ma thèse a été de développer un ensemble de méthodes permettant la mise au point une plateforme d’analyse à haut débit. Toutes les étapes ont été considérées : préparation et montage des échantillons, optimisation des acquisitions, développement de méthodes d’analyse des images 3D. Cette plateforme permet d’observer une centaine d’échantillons alignés par recalage de l’axe interoculaire. La segmentation de l’alevin et d’une partie de son cerveau permet l’analyse volumétrique des différentes structures. La capacité de cette méthode a été testée avec deux projets à portée biomédicale : l’étude de mutants possédant des défauts neurodéveloppementaux et l’effet tératogène de traitements anticancéreux. Nous avons montré que la plateforme permet l’obtention de résultats précis par la volumétrie. Cette plateforme et les résultats associés ont fait l’objet d’une publication. Au cours de ma thèse, je me suis aperçu des limites des méthodes de clarification. J’ai donc développé un algorithme de correction du contraste publié dans un second article. Je suis convaincu que mon travail de thèse va offrir à la communauté poisson zèbre comme à d’autre communauté un nouvel outil permettant d’analyser de nombreux processus biologiques à grande échelle et avec une très forte résolution. Des applications supplémentaires sont discutées dans la partie perspectives de ma thèse

Bethlem myopathy (BM) is a neuromuscular disease characterized by joint contractures and muscle weakness. BM is caused by mutations in one of the genes encoding one of the three α-chains of collagen VI (COLVI), a component of the skeletal muscle extracellular matrix. Nowadays, an unresolved question is to understand how alteration of COLVI located outside the muscle cells leads to functional modifications in muscle fibers. The zebrafish model col6a1Étude physiopathologique de la myopathie de Bethlem à l’aide d’un modèle de poisson zèbre - 16La myopathie de Bethlem (BM) est une maladie caractérisée par des rétractions et une faiblesse musculaires. Cette pathologie résulte de mutations dans un des gènes codant l’une des trois chaînes α du collagène VI (COLVI), un composant de la matrice extracellulaire musculaire squelettique. Aujourd’hui, une question non résolue est de comprendre comment l’altération de COLVI présent à l’extérieur des cellules musculaires conduit à des modifications fonctionnelles dans les fibres musculaires. Le modèle poisson zèbre col6a1

The purpose of this thesis work was to hilight the importance of hemodynamic forces in normal heart development. These forces, caused by the contractions of the cardiac tube since the earliest steps of embryogenesis, will act on the primitive vasculature and generate a mechanical stress constituting a differenciation signal for the endothelial cells. The transduction of this signal, mediated by the non-selective mechanosensitive ion channel Piezo, will induce a change in the genetic expression profile within the endothelium and surrounding tissues, and therefore contribute to the development of specialised cardiac structures. By using several in situ hybridisation technics coupled with pharmacological treatments and antisense morpholino knock-down injections, we could reveal in zebrafish that the cardiac expression of aggrecan a, a gene coding a proteoglycane allowing for tissue compression resistance, depends on hemodynamic forces. The expression of this gene, restraint to the outflow tract (OFT) of the heart, is found to be localised in cells surrounding the endothelium. CRISPR/Cas9 mutagenesis knock-out and morpholino injection induced knock-down of aggrecan a provoke the apparition of a phenotype characterised by a heart edema and developmental and cardiac chambers arrangement defects. Continuing with knock-down experiments on zebrafish, we demonstrated that the loss of expression of aggrecan a results in OFT underdevelopment, and that this hypoplasia strongly affects cardiac performance. These experimental results are concordant with the transcriptomics analysis on human valve tissue, showing a dramatic loss of expression of the AGGRECAN gene in the aortic valves of patients suffering from type 0 bicuspidy. This strongly suggests the association of this gene’s expression abnormalities with the development of this type of congenital heart defects in Humans. In a similar manner, we performed chromogenic and fluorescent in situ hybridisation experiments in order to reveal the cardiac expression profile of the spp1 gene. This gene codes an extracellular matrix protein involved in mineralisation and cell migration, and is found to be expressed at the level of the atrioventricular and aortic valve formation sites. Antisense morpholino injections induced the loss of expression of tnnt2, a gene that is essential for cardiac contraction, and allowed us to confirm that the expression of spp1 is hemodynamically dependent. The knock-down of piezo1b gave similar results, thus confirming its mechanotransducing role. The knock-down of spp1 by morpholino injection revealed dysmorphic aortic valve cusps development at 6 days when observed in vivo on a biphotonic microscopy setup. In parallel, we created a spp1 knock-out line using CRISPR/Cas9 mutagenesis, then confirmed the insertion of a premature STOP codon in the coding sequence of spp1 by sequencing. However, we were not able to detect any phenotype in these fish, suggesting the emergence of a compensation phenomenon that degrades nonsense mRNA (Nonsense-Mediated mRNA Decay). In order to cope with this issue, we strated new knock-out experiments, using a « RNA-less » spp1 promoter sequence excision strategy. Finally, we identified human mutations in the SPP1 orthologous gene in patients suffering from congenital aortopathies, including a rare 4 nucleotides deletion that a priori induces the loss of the C-terminal part of the protein, involved in the binding of CD44. These results show the interest of the zebrafish as a model for mutations validation and determination of their impact on congenital heart defects in Humans.; L’objectif de ce travail de thèse a été de mettre en évidence l’importance des forces hémodynamiques dans le développement normal du cœur. Ces forces, causées par les contractions du tube cardiaque dès les premières étapes de l’embryogenèse, vont agir sur la vasculature primordiale et engendrer un stress mécanique constituant un signal de différenciation pour les cellules endothéliales. La transduction de ce signal, médiée par le canal ionique mécanosensible non-sélectif Piezo1, va permettre un changement de profil d’expression génique au sein de l’endothélium et des tissus adjacents, et ainsi contribuer au développement de structures cardiaques spécialisées. Grâce à plusieurs techniques d’hybridation in situ couplées à des traitements pharmacologiques et de knock-down par injection de morpholinos anti-sens, nous avons pu révéler chez le poisson-zèbre que l’expression cardiaque d’aggrecan a, gène codant un protéoglycane permettant la résistance tissulaire à la compression, est dépendante des forces hémodynamiques. L’expression de ce gène, restreinte à la chambre d’éjection systolique (OutFlow Tract, OFT) dans le cœur, s’avère être localisée dans les cellules qui entourent l’endothélium. Des techniques de knock-out via mutagenèse CRIPSR/Cas9 et de knock-down par injection de morpholinos ont permis de révéler l’apparition d’un phénotype caractérisé par un œdème cardiaque et des défauts de développement et de disposition des chambres cardiaques. La poursuite des expériences de knock-down du gène aggrecan a chez le poisson-zèbre a permis de révéler un sous-développement de l’OFT impactant fortement la performance cardiaque. Ces résultats expérimentaux sont concordants avec les données obtenues par l’analyse transcriptomique de tissus valvulaires humains, révélant une forte sous-expression du gène AGGRECAN dans les valves aortiques de patients atteints de bicuspidie de type 0. Cela suggère l’association d’anomalies d’expression de ce gène avec le développement de ce type de cardiopathies congénitales chez l’Homme. De façon similaire, nous avons pu réaliser chez le poisson-zèbre des expériences d’hybridation in situ chromogènes et fluorescentes afin de révéler l’expression cardiaque du gène spp1. Ce gène code une protéine de la matrice extracellulaire impliquée dans la minéralisation et la migration cellulaire, et se trouve être exprimé au niveau des sites de formation des valves aortique et atrioventriculaire. Des injections de morpholinos anti-sens nous ont permis d’inhiber l’expression du gène tnnt2, indispensable à la contraction cardiaque, et ont ainsi permis de confirmer la dépendance hémodynamique de l’expression de spp1. Le knock-down du gène piezo1b a donné des résultats comparables, confirmant ainsi son rôle mécanotransducteur. Le knock-down de spp1 par injection de morpholino a permis de révéler lors de l’observation de larves de 6 jours en microscopie biphotonique in vivo le développement dysmorphique des cupules de la valve aortique. Nous avons créé en parallèle une lignée knock-out spp1 par mutagenèse via CRISPR/Cas9, puis confirmé par séquençage l’insertion d’un codon STOP précoce dans la séquence codante. Cependant, aucun phénotype n’a été détecté chez ces individus, suggérant un phénomène de compensation par dégradation des ARNm non-sens (phénomène NMD). Pour palier à ce problème, de nouvelles expériences de knock-out sont en cours, utilisant une stratégie dite « RNA-less » d’excision de la partie promotrice de spp1. Enfin, nous avons pu identifier des mutations humaines du gène orthologue SPP1 chez des patients atteints d’aortopathies congénitales, dont une délétion rare de 4 nucléotides provoquant a priori la perte de la partie C-terminale de la protéine, impliquée dans la liaison à CD44. Ces résultats montrent l’intérêt du modèle poisson-zèbre dans la validation de mutations et la détermination de leur impact sur le développement de cardiopathies congénitales chez l’Homme.

Une mutation intronique du gène C9orf72 est une cause prépondérante de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte. Cependant, la fonction de C9orf72 demeure incertaine. Heureusement, les modèles animaux sont une excellente façon d’en faire l’étude in vivo dans des systèmes complexes. Conséquemment, pour étudier la fonction et l’expression de C9orf72, nous avons tenté de développer 3 lignées de poissons-zèbres pour lesquelles des étiquettes 12xhistidines ou eGFP devaient être insérés par CRISPR/Cas9 près du N et C terminal de C9orf72. Surprenamment, ces modifications furent mal tolérées durant le développement, empêchant l’obtention de sujets F0 adultes en mesure de transmettre un tag inséré. Pour étudier l’effet d’une invalidation persistante de C9orf72 chez le poisson, une lignée présentant une délétion près du N-terminal menant à un knock-out fonctionnel de C9orf72 a été développée des poissons injectés pour l’insertion de 12xHistidine. Nos résultats préliminaires suggèrent un phénotype au niveau de la mobilité et de la mortalité. De plus, deux lignées de poissons transgéniques exprimant le gène C9orf72 humain, seul ou marqué au eGFP, ont été développées par Tol2 pour étudier la localisation de C9orf72 et l’effet de sa surexpression. Ces lignées, une fois validées et caractérisées, permettront d’ouvrir de nouvelles perspectives pour caractériser la fonction et l’expression de C9orf72 ainsi que la modélisation de la SLA. Il semble donc que la perte d'un allèle ou une haplo-insuffisance du gène C9orf72 est mal tolérée, mais que la transgenèse, par addition d'un troisième allèle, permettrait l'étude de C9orf72 in vivo., An intronic mutation in the gene C9orf72 is the most prevailing cause of Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), an adult onset neurodegenerative disease of the motoneurons. Despite this, the function of C9orf72 remains uncertain. As animal models are an excellent way to study gene function and expression in vivo in complex systems, by using the CRISPR/Cas9 system we attempted to generate 3 lines of zebrafishes for which 12xhistidines or eGFP tags were inserted near either the N or C terminal of C9orf72. Surprisingly, these modifications were ill tolerated during the development, preventing us from obtaining F0 specimens able to pass on the inserted tag for any of our lines. To study the effects of a persistent knock-out of C9orf72 in the zebrafish, a line with deletions near the N-terminal, resulting in a functional knock-out of C9orf72, was obtained from the fishes injected for the 12xHistidine insertion. Preliminary results indicate a higher mortality rate and decrease mobility phenotypes. Additionally, two transgenic zebrafish lines expressing human C9orf72 alone or with eGFP were generated, using Tol2 in order to study C9orf72 localisation and the effect of its overexpression namely on morphology, development and the central nervous system. These lines, once validated and characterised will open new avenues to determine the role and subcellular localization of C9orf72, as well as for modeling ALS. Thus, it appears that the loss of an allele or haploinsufficiency of the C9orf72 gene is ill tolerated, but that transgenesis, by addition of a third allele, may allow for in vivo study of C9orf72.

The myotendinous junction (MTJ) is a specialized extracellular matrix which allows the transmission of skeletal muscle forces to bones. My thesis project aimed at characterizing the in vivo role of COLXXII using the zebrafish as a model. The zebrafish col22a1 gene encodes COLXXII whose expression begins in the entire somite, and is then restricted gradually at the MTJ, where the protein is deposited. Morphants (Knockdown) develop a dystrophic phenotype and we have demonstrated that COLXXII is likely a member of the integrin a7ß1 anchoring complex. However, because morpholinos are efficient only few days after injection, our study was limited to early stages of zebrafish development. We thus generated two mutant lines (CRISPR-Cas9) invalidated for col22a1. The typical sarcolemmal interdigitations of the MTJ are almost absent in mutants, from larvae to adult (as in morphants), which could impact the force transmission and/or the muscle attachment to myosepta (tendons). In the two mutant lines, the same proportion of larvae displays a severe phenotype leading to fish death 14 days post-fertilization. On the contrary, other larvae survive without any obvious general phenotype. A first candidate genes approach was realized by qPCR and tends to show that the phenotypic differences may be due to both, variable expressivity and genetic compensation. Finally, I have shown that 6 months col22a1-/- fish show a highly decreased swimming capacity and consume more O2 during effort compared to wild type animals. Thus, we conclude that the musculoskeletal system efficiency seems altered in absence of COLXXII. Our results should allow considering COL22A1 as a candidate gene for muscular dystrophies with unclarified genetic cause., Le collagène XXII (COLXXII) a été décrit, en 2004, comme un marqueur des jonctions tissulaires chez la souris. En particulier, la jonction myotendineuse (JMT) est une matrice extracellulaire spécialisée qui assure une liaison structurale entre le muscle squelettique et le tendon et permet la transmission des forces de contraction au squelette. Mon projet de thèse a visé à caractériser le rôle de COLXXII in vivo; le modèle du poisson zèbre a été choisi. Chez le poisson zèbre, col22a1 code pour COLXXII dont l'expression débute dans tout le somite, puis, se restreint progressivement aux extrémités des fibres musculaires au niveau de la JMT, où est déposée la protéine. Utilisant la technique de morpholino-knockdown, nous avons montré que les morphants développent un phénotype dystrophique et que le COLXXII fait très probablement partie du complexe d'ancrage intégrine α7β1. Cependant, compte tenu de la durée d'efficacité réduite des morpholinos, notre étude était limitée. Utilisant la technologie CRISPR-Cas9, nous avons donc généré deux lignées invalidées pour col22a1. L'analyse ultra-structurale des poissons col22a1-/-, de la jeune larve à l'adulte, montre que les interdigitations du sarcolemme, caractéristiques de la JMT, sont pratiquement absentes chez les mutants (comme chez les morphants), pouvant impacter la transmission des forces et/ou l'attachement du muscle aux myoseptes (tendons). De façon intéressante, pour les deux lignées, la même proportion de larves présente un phénotype très sévère entrainant la mort vers 2 semaines post-fécondation (spf). Les autres larves, elles, survivent et ne montrent pas de phénotype global particulier. En revanche, une forte réduction des interdigitations de la JMT est constatée et dans de rares cas, après challenge des poissons, une rupture musculaire est observée. Une première approche de q- PCR par gène candidat a été réalisée et il semble possible que les différences phénotypiques soient liées à des évènements conjoints d'expressivité variable et de compensation génique. Enfin, utilisant un système original de test de nage à contre-courant par palier, j'ai montré que les poissons col22a1-/- âgés de 6 mois ont une capacité de nage très diminuée et consomment d'avantage d'O2 pendant l'effort comparés aux animaux sauvages. L'efficacité du système musculo-squelettique semble donc moindre en l'absence de collagène XXII. Nos résultats devraient permettre de considérer COL22A1 comme un gène candidat pour les cas de dystrophies musculaires dont la cause génétique est non élucidée

In this manuscript, we present an imaging technique based on digital holography.It enables to image in 3D and in time the blood circulation in a zebrafish larva. The 3D information is acquired in a single frame of the camera, which makes possible to track the movement of red blood cells in the vascular system. We will first discuss the traditional techniques of bio and blood flow imaging, then we will remind the principles of holography. Afterwards, we will describe the imaging method we developed and the experimental results obtained. We will then present the improvements that have been made to the technique. Finally, we will briefly discuss the application of the compressed sensing to the blood flow imaging in zebrafish.; Nous présentons dans ce manuscrit une technique d’imagerie basée sur l’holographie numérique. Elle permet d’imager en 3D et dans le temps la circulation sanguine chez une larve de poisson-zèbre. L’information 3D est acquise en une seule image de la caméra, ce qui permet de suivre le mouvement des globules rouges dans le système vasculaire. Nous évoquerons dans un premier temps les techniques de bio-imagerie et d’imagerie du flux sanguin traditionnelles, puis nous rappellerons les principes de l’holographie. Ensuite, nous décrirons la méthode d’imagerie que nous avons développée et les résultats expérimentaux obtenus. Nous compléterons, en présentant les différentes améliorations que nous avons apportées à la technique. Enfin, nous discuterons brièvement de l’application du compressed sensing à l’imagerie de la circulation sanguine dans le poisson-zèbre.

In this manuscript, we present an imaging technique based on digital holography.It enables to image in 3D and in time the blood circulation in a zebrafish larva. The 3D information is acquired in a single frame of the camera, which makes possible to track the movement of red blood cells in the vascular system. We will first discuss the traditional techniques of bio and blood flow imaging, then we will remind the principles of holography. Afterwards, we will describe the imaging method we developed and the experimental results obtained. We will then present the improvements that have been made to the technique. Finally, we will briefly discuss the application of the compressed sensing to the blood flow imaging in zebrafish.; Nous présentons dans ce manuscrit une technique d’imagerie basée sur l’holographie numérique. Elle permet d’imager en 3D et dans le temps la circulation sanguine chez une larve de poisson-zèbre. L’information 3D est acquise en une seule image de la caméra, ce qui permet de suivre le mouvement des globules rouges dans le système vasculaire. Nous évoquerons dans un premier temps les techniques de bio-imagerie et d’imagerie du flux sanguin traditionnelles, puis nous rappellerons les principes de l’holographie. Ensuite, nous décrirons la méthode d’imagerie que nous avons développée et les résultats expérimentaux obtenus. Nous compléterons, en présentant les différentes améliorations que nous avons apportées à la technique. Enfin, nous discuterons brièvement de l’application du compressed sensing à l’imagerie de la circulation sanguine dans le poisson-zèbre.

Although cell culture and mouse models will remain a cornerstone of cancer research, the unique capabilities of the zebrafish outline the potential of this model for shedding light on cancer biology in vivo. Zebrafish develops cancers spontaneously, after chemical mutagenesis or through genetic manipulations. Furthermore, zebrafish cancers are similar to human tumors at the histological and molecular levels allowing the study of tumor initiation, progression and heterogeneity. Xenotransplantation of human cancer cells in embryos or adult zebrafish presents the advantage of following cancer cell behavior in vivo. Finally, zebrafish embryos are used in molecule screens and contribute to the identification of novel anti-cancer therapeutic strategies. Here, we review different involvements of the zebrafish model in cancer research.

Polychlorinated biphenyls (PCBs) and polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are two families of hydrophobic compounds sharing some similar environmental properties. Previous studies have demonstrated that these compounds could affect fish life-history traits. However, few studies have focused on environmental situations. This thesis is divided into three parts. The first part aimed to evaluate the effects of a realistic mixture of PCBs and PBDEs on the life-history traits of zebrafish. The results showed a slower growth, but to a larger asymptotic length, and delayed spawning probability in exposed fish. In addition, offspring issued from early spawning events of exposed fish exhibited a lower larval survival under starvation condition. The second part aimed to identify, on the basis of a bioenergetic model (DEB), the physiological modes of action (PMoA) of PCBs and PBDEs. Two potential PMoAs have been revealed: the first one was through an increase of the fraction of energy allocated to somatic maintenance and growth and the second one was through an increase of the cost of production of an egg. The third part focused on the population dynamical consequences of the individual life-history effects of PCBs and PBDEs. The results showed a lower abundance, a higher biomass and a higher risk of overexploitation in exposed population compared to control population. The results of this thesis could be a helpful tool for sustainable management of fish stocks that take into account the effects of multiple contaminations that are added to the fishing pressure.; Les polychlorobiphényles (PCB) et les polybromodiphényléthers (PBDE) sont deux familles de composés hydrophobes partageant certaines propriétés physico-chimiques. Des travaux antérieurs ont montré que ces composés pouvaient affecter les traits d’histoire de vie des poissons. Il s’avère cependant que les études approchant des situations environnementales sont rares. Cette thèse se divise en trois parties. La première partie s’est attachée à évaluer les effets d’une exposition à un mélange réaliste de PCB et de PBDE sur les traits d’histoire de vie du poisson-zèbre. Les résultats ont montré une taille asymptotique plus élevée, une probabilité de ponte retardée chez les individus exposés et une faible survie des larves F1 en situation de jeûne issues des pontes précoces des individus exposés. La seconde partie a cherché à identifier, sur la base d’un modèle bioénergétique (DEB), les modes d’action physiologique (PMoA) de PCB et PBDE. Deux PMoAs probables ont été révélés: le premier est lié à l’augmentation de la fraction d’énergie allouée à la maintenance et la croissance somatique et le deuxième est lié à l’augmentation des coûts de production d’un œuf. La troisième partie de la thèse s’est intéressée à évaluer les conséquences de la contamination sur la dynamique de population de poissons. Les résultats ont montré une réduction de l’abondance numérique, une augmentation de la biomasse et un grand risque de surexploitation chez la population exposée, Les résultats de cette thèse pourraient constituer un outil d’aide à une gestion durable des stocks halieutiques qui prennent en compte les effets de multiples contaminations qui se surajoutent à la pression de pêche.

The identification of GSC and the analysis of their functional properties have been investigated in different species including fish. The transplantation of GSC into the abdominal cavity of hatching embryos is a promising approach in agronomy for the conservation and regeneration of genetic resources in farmed fish. In order to improve the efficiency of the transplantation, it is necessary to know the modalities influencing their capacity to colonize the gonads and to be recruited to initiate a gametogenetic wave. The present study was aimed to determine whether GSC colonize the gonad alone or with their surrounding somatic cell forming the germinal niche. A mixture of ovarian cells expressing DsRed protein in the ovocytes and GFP in granulosa cells was transplanted into hatched fry at 16-22 days of age. Both fluorescence specific to GFP and DsRed was suspected in few 50-days old recipients. The next observations will be carried out at 120 days of age to make sure that the GSC have enough time to self-renew and colonize large area of the gonads.; L’identification des cellules souches germinales (GSC) et l’analyse de leurs propriétés fonctionnelles ont fait l’objet de plusieurs études chez différentes espèces incluant les poissons. La transplantation des GSC dans la cavité abdominale d’embryons est une approche prometteuse en agronomie, pour la conservation et la régénération des ressources génétiques (nucléaire et mitochondriales) chez les poissons d’élevage. Dans le but d’améliorer l’efficacité de la transplantation, il est nécessaire de connaître les modalités influençant leur capacité à coloniser les gonades et à être recrutée pour la gamétogénèse. La présente étude menée chez le poisson zèbre avait pour objectif de déterminer si les GSC s’implantent seules ou avec les cellules somatiques environnantes formant la niche germinale. Un mélange de cellules ovariennes exprimant la protéine DsRed dans les ovocytes et la GFP dans les cellules de la granulosa a été transplanté dans des alevins âgés de 16 à 35 dpf. La fluorescence spécifique aux deux types cellulaires est suspectée chez des individus receveurs âgés de 50 dpf. Les prochaines observations seront réalisées à 120 dpf pour laisser le temps aux GSC d’être recrutées et de se renouveler.

Unlike mammals, the adult teleost brain exhibits widespread neurogenic activity and can regenerate after injury. The adult zebrafish has the capacity to regenerate neurons from constitutive or latent progenitors. During my PhD, I studied the neuronal regeneration in the zebrafish dorsal midbrain (optic tectum, OT). At adult stage, neuroepithelial-like progenitors at the OT periphery contribute to neuronal and glial lineages during homeostasis.I identified a putative enhancer of meis2a, which allowed me to trace the progeny of neuroepithelial-like progenitors. In a non-regenerative context I showed that enhancer-targeted progenitors were at the origin of the whole structure during development and of its continued neurogenesis during post-embryonic growth.Following lesion, OT displayed reactive neurogenesis, at larval and adult stages, nevertheless its topographical structure remained altered. In adults, I showed that both constitutive neuroepithelial-like progenitors and latent ependymoglial progenitors were activated in a regenerative context.; Contrairement aux mammifères, le système nerveux central du poisson téléostéen adulte possède un potentiel énorme de neurogenèse et de régénération après une lésion cérébrale. Chez le poisson zèbre adulte, de nouveaux neurones peuvent être régénérés à partir de progéniteurs constitutifs ou latents. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée aux capacités de régénération neuronale du cerveau moyen dorsal (le toit optique, TO) chez le poisson zèbre. Le TO présente à sa périphérie une zone de progéniteurs de type neuroépithélial à l’origine des neurones et des cellules épendymogliales qui le constituent. J’ai tout d’abord identifié un enhancer potentiel du gène meis2a, qui m’a permis d’effectuer des lignages cellulaires de progéniteurs neuroépithéliaux. En contexte homéostatique, j’ai montré que ces progéniteurs construisent la totalité du TO pendant le développement et soutiennent sa neurogenèse continue pendant la croissance post-embryonnaire. A la suite d’une lésion cérébrale chez la larve et l’adulte, le TO à la capacité de générer de nouveaux neurones, toutefois sa structure topographique n’est pas restaurée. Chez l’adulte, j’ai montré que les progéniteurs constitutifs neuroépithéliaux et des progéniteurs latents épendymogliaux sont activés lors du processus de régénération.

Unlike mammals, the adult teleost brain exhibits widespread neurogenic activity and can regenerate after injury. The adult zebrafish has the capacity to regenerate neurons from constitutive or latent progenitors. During my PhD, I studied the neuronal regeneration in the zebrafish dorsal midbrain (optic tectum, OT). At adult stage, neuroepithelial-like progenitors at the OT periphery contribute to neuronal and glial lineages during homeostasis.I identified a putative enhancer of meis2a, which allowed me to trace the progeny of neuroepithelial-like progenitors. In a non-regenerative context I showed that enhancer-targeted progenitors were at the origin of the whole structure during development and of its continued neurogenesis during post-embryonic growth.Following lesion, OT displayed reactive neurogenesis, at larval and adult stages, nevertheless its topographical structure remained altered. In adults, I showed that both constitutive neuroepithelial-like progenitors and latent ependymoglial progenitors were activated in a regenerative context.; Contrairement aux mammifères, le système nerveux central du poisson téléostéen adulte possède un potentiel énorme de neurogenèse et de régénération après une lésion cérébrale. Chez le poisson zèbre adulte, de nouveaux neurones peuvent être régénérés à partir de progéniteurs constitutifs ou latents. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée aux capacités de régénération neuronale du cerveau moyen dorsal (le toit optique, TO) chez le poisson zèbre. Le TO présente à sa périphérie une zone de progéniteurs de type neuroépithélial à l’origine des neurones et des cellules épendymogliales qui le constituent. J’ai tout d’abord identifié un enhancer potentiel du gène meis2a, qui m’a permis d’effectuer des lignages cellulaires de progéniteurs neuroépithéliaux. En contexte homéostatique, j’ai montré que ces progéniteurs construisent la totalité du TO pendant le développement et soutiennent sa neurogenèse continue pendant la croissance post-embryonnaire. A la suite d’une lésion cérébrale chez la larve et l’adulte, le TO à la capacité de générer de nouveaux neurones, toutefois sa structure topographique n’est pas restaurée. Chez l’adulte, j’ai montré que les progéniteurs constitutifs neuroépithéliaux et des progéniteurs latents épendymogliaux sont activés lors du processus de régénération.

This PhD thesis aims at assessing the potential of innovative in vitro and in vivo zebrafish based bioassays for biomonitoring of surface water contamination by xeno-estrogens. For this purpose, the bioassays were applied to assess the effect of environmentally relevant surface water pollutants, alone and in simple (artificial) and complex (environmental samples) mixtures. The screening of surface water samples in zebrafish- (ZELH-zfERβ2 cells) and human-based (MELNcells) bioassays revealed qualitative and quantitative differences which could not be entirely explained by the xeno-estrogens identified. To better understand the response of bioassays to complex environmental mixtures, the activity of environmentally relevant surface waterpollutants was characterized across the bioassays, alone and in 2 to 12-component mixtures combining estrogenic and non-estrogenic chemicals to simulate an environmental contamination.The results indicate that zebrafish-based bioassays have a different and even in some cases an opposite response to the simple mixtures compared with the human-based bioassay MELN. These differences are explained by different sensitivity to some pollutants leading to bioassay-specific interactions with estrogen receptor activation. Al together, this work shows that the biological particularities of each bioassay can influence the response to estrogenic chemicals when mixed with other environmental pollutants, opening the discussion regarding their implementation in chemical water biomonitoring., L’objectif de ce travail de thèse est d’évaluer le potentiel de nouveaux bio-essais in vitro et in vivo basés sur le poisson zèbre pour la biosurveillance de la contamination chimique de l’eau par les xeno-estrogènes. Pour cela, les bio-essais ont été appliqués pour évaluer les effets de polluants aquatiques environnementaux seuls, mais aussi en mélanges simples (reconstitués) et complexes (échantillons environnementaux). L’évaluation d’échantillons d’eau à travers les bioessais in vitro humain (MELN) et poisson zèbre (ZELH-zfERβ2) a montré des différences qualitatives et quantitatives de réponse, non expliquées par les molécules estrogéniques détectées. Afin de mieux comprendre ces différences, l’activité de polluants aquatiques a été caractérisée sur les différents modèles, individuellement et au sein de mélanges de 2 à 12 polluants, combinant molécules estrogéniques et non estrogéniques pour simuler des situations environnementales.Les résultats obtenus montrent que les bio-essais basés sur le poisson zèbre répondent différemment, et parfois de manière opposée, au modèle humain MELN aux mélanges reconstitués. Ces différences s’expliquent par des sensibilités différentes à certaines molécules entrainant des interactions avec la réponse aux xeno-oestrogènes spécifiques à chaque modèle biologique. Dans son ensemble, ce travail montre que les particularités biologiques de chaque bioessai peuvent influencer la réponse des xeno-estrogènes quand présents au sein de mélange avec d’autres polluants. Ces résultats sont discutés au regard de l’utilisation de bio-essais dans l’évaluation de la contamination chimique des masses d’eau.

Hemodynamic forces play an essential epigenetic role in heart valve development, but how they do so is not known. Here, we show that the shear-responsive transcription factor KLF2 is required in endocardial cells to regulate the mesenchymal cell responses that remodel cardiac cushions to mature valves. Endocardial Klf2 deficiency results in defective valve formation associated with loss of Wnt9b expression and reduced canonical WNT signaling in neighboring mesenchymal cells, a phenotype reproduced by endocardial-specific loss of Wnt9b. Studies in zebrafish embryos reveal that wnt9b expression is similarly restricted to the endocardial cells overlying the developing heart valves and is dependent upon both hemodynamic shear forces and klf2a expression. These studies identify KLF2-WNT9B signaling as a conserved molecular mechanism by which fluid forces sensed by endothelial cells direct the complex cellular process of heart valve development and suggest that congenital valve defects may arise due to subtle defects in this mechanotransduction pathway. journal article research support, non-u.s. gov't research support, n.i.h., extramural 2017 11 06 2017 10 19 imported

Among vertebrates, progesterone (P4) is an endogenous progestin acting through the nuclear and molecular progesterone receptor to mediate key processes of development and reproduction. Many molecules are designed to mimic the action of P4. These synthetic progestins and P4 are widely used as pharmaceuticals and some of them are found in this aquatic environment, thus posing risks to aquatic species. However, information is lacking to evaluate the dangers and risks of these substances for the environment. This thesis studied the mechanisms of action and the effects of progestins on zebrafish, using a combination of reporter-gene in vitro and in vivo tools based on the mechanism of action of endocrine disruptors. We characterized the toxicological profile of 26 progestins towards different human and zebrafish nuclear steroid receptors and towards the tissue-specific expression of steroidogenic genes (cyp19a1b in the brain and cyp11c1 in the interrenal cells). Our results show that some progestins can disrupt different signaling pathways in developing larvae at the molecular level, cellular and tissular level, and physiological level. Overall, the results of this thesis allow for a better characterization of the dangers of progestins on several endocrine targets., Chez les vertébrés, la progestérone (P4) est un progestatif endogène agissant via les récepteurs nucléaires et membranaires de la progestérone pour médier des processus clés du développement et de la reproduction. De nombreuses molécules sont conçues pour mimer l’action de la P4. Ces progestatifs synthétiques et la P4 sont très utilisés en tant que substances pharmaceutiques et certains sont retrouvées dans l’environnement aquatique, posant un risque pour les organismes. Cependant, les informations sont insuffisantes pour évaluer les dangers et les risques de ces substances pour l’environnement. Dans ce travail de thèse, les mécanismes d’action et les effets biologiques des progestatifs sur le poisson zèbre ont été étudiés grâce à une combinaison d’outils in vitro et in vivo de type gène-rapporteur basés sur le mécanisme d’action des perturbateurs endocriniens. Nous avons caractérisé le profil toxicologique complexe de 26 progestatifs vis-à-vis de différents récepteurs nucléaires stéroïdiens humain et poisson zèbre et vis-à-vis de l’expression tissu-spécifique de gènes de la stéroïdogenèse (cyp19a1b dans le cerveau et cyp11c1 dans les interrénales). Nos résultats montrent que certains progestatifs peuvent perturber différentes voies de signalisation chez les larves en développement au niveau moléculaire, cellulaire et tissulaire ainsi qu’au niveau physiologique. Dans l’ensemble, les résultats de cette thèse permettent une meilleure caractérisation des dangers des progestatifs sur différentes cibles endocriniennes.

The collective decision-making is one of the mecanisms used by social species during foraging, path optimisation, collective movements, predator avoidance or habitat selection. Zebrafish (Danio rerio), gregarious animal models in biology, have never been studied in the context of collective binary choices. We found logical to analyse their decision behaviours. The goal of this thesis is to meet the expectations of the ASSISI|bf project of creation of an andjustable experimental setup able to sustain robots and fish, of development of an adaptive and self-organised mixed society and of the caracterisation of individual and collective behaviours of the zebrafish, implementable in the robots. We show that the collective decision making and the cohesion of groups of zebrafish in an open environment, composed of two identical landmarks, are dynamical processes that vary in function of the strain of Danio rerio (AB or TL) and are related to the density of the populations. Always on the move, the fish oscillate between the two landmarks. The AB zebrafish are more attracted by the landmarks and are less cohesive than the TL zebrafish. In a contrained environment, two rooms connected by a corridor, we do the same type of experiments with only AB zebrafish and vary the density of the groups from 1 to 20 individuals. AB zebrafish swim together. The increase of the density of the groups make them split. We noticed that the density of the groups has an effect on the topology of the groups : during collective departures from a room to the other one, there is a correlation between the rank of exit of the zebrafish (followers) and the rank of the distances of each individual from the initiator of the exits. This correlation is higher when the followers are either the closest or the farest from the initiator.Using the previous experimental setup, we focused also on the topics related to leadership for groups of 2 to 10 individuals. We show that each fish intiate at least once a collective departure and that the number of initiations is proportional to the number of initiation attempts. Also, we found that all the fish have the same success rate in the initiations after an initiation attempt and that there is a positive correlation between the intiations and the average speed. A deeper analysis of the collective movements shows that the zebrafish swim in group and transit without any interruption or even without periodicity between the rooms. We are currently improving this study and will bring new points of comparison to check if the non-periodicity of the transitions could be related to the density of the groups. Finally, we developed a new version of the Y-maze based on the previous observations.This perpetual Y-maze shows many usefull features for the study of the behaviour : a low habituation rate, a reduction of the interactions between the animals and the experimentators, and allows the fish to move in a Y-maze without starting nor ending zones as in typical Y-maze, La prise de décision collective est un des mécanismes usités par les espèces sociales lors d’événements de collectes de nourriture, d’optimisation de chemins, de mouvements collectifs, de fuites face à un prédateur ou bien même de sélections d’habitat. Les zebrafish (Danio rerio), animaux grégaires de référence en biologie, n’ont jamais été étudiés dans des contextes de choix collectifs binaires et ils nous semblait légitime d’analyser leurs comportements décisionnels. L’objectif de cette thèse est de répondre aux attentes du projet ASSISI|bf de création d’un système expérimental modulable capable d’accueillir robots comme poissons, de mise au point d’une société mixte adaptative auto-organisée, et de caractérisation des comportements individuels et collectifs des zebrafish implémentables dans les robots. Nos observations montrent que la prise collective de décision et la cohésion des groupes en environnement ouvert, et présentant deux points de repère identiques, sont des processus dynamiques qui varient selon la souche de Danio rerio (AB ou TL) et sont liées à la densité des populations. Constamment en mouvement, les poissons oscillent entre les deux points de repère identiques installés dans leur environnement. La souche AB est toujours plus attirée par ces hétérogénéités et est beaucoup moins cohésive que la souche TL. En environnement contraint, de type deux chambres reliées par un couloir, nous réitérons le même type d’expérience chez la souche la plus à même de prendre des décisions collectivement (AB) et en faisant varier la densité des groupes de 1 à 20 individus. Il ressort que les Danio rerio de type AB restent essentiellement en groupe mais que l’augmentation de leur densité tend à les diviser. Nous remarquons aussi que la densité influe partiellement sur la topologie du groupe : il existe, lors des sorties collectives, une corrélation entre l’ordre de sortie des zebrafish (les suiveurs) et l’ordre de distance de chaque individu par rapport à l’initiateur desdites sorties. Cette corrélation est d’autant plus forte quand les suiveurs sont soit très proches, soit les plus éloignés de l’initiateur. Le dispositif expérimental précédent nous permet d’autre part de nous concentrer sur la notion de leadership chez des groupes de 2 à 10 Danio rerio AB. Nous mettons en évidence que chaque poisson initie au moins une fois un départ collectif, le nombre d’initiations effectives est proportionnel au nombre de tentatives d’initiations, que tous les poissons présentent le même taux de succès d’initiation après une tentative et qu’il existe une corrélation positive entre initiations et vitesse moyenne de nage.Une analyse poussée des mouvements collectifs nous fait constater que les zebrafish se déplacent essentiellement en groupe et transitent sans interruption ni périodicité entre les chambres. Nous sommes actuellement en train d’améliorer cette étude en apportant de nouveaux points de comparaison afin de vérifier si la non-périodicité des transitions entre les chambres est liée à la densité des groupes testés. Enfin, nous nous inspirons du précédent système expérimental – les deux chambres reliées par un couloir – pour créer une version actualisée d’un labyrinthe en Y. Ce labyrinthe en Y est dit perpétuel car il combine tout le savoir faire que nous avons développé dans l’élaboration des précédents systèmes expérimentaux : une faible habituation des zebrafish pour leur milieu, une réduction des interactions entre l’expérimentateur et les animaux et la possibilité pour les poissons de circuler dans un labyrinthe à symétrie centrale, sans zone de départ ni zone de fin formalisées (typiques des labyrinthes en Y)

Medecine shows a growing interest regarding nanobiotechnologies. Among them are poly(lactic acid) (PLA) nanoparticles, which represent a biocompatible and competent nanosystem to heighten the specificity and efficacy of diverse therapeutic and vaccine treatments, following mucosal and intravenous administration. However, the further optimization of such nanosystem is poised by the lack of informations regarding their in vivo biodistribution, especially at the cellular level.The main objective of this PhD is to increment the knowledge about PLA nanoparticles biodistribution in vivo, after muquous and intravenous administration, to further expand their optimisation and use perspectives. The zebrafish model has been utilized to perform this research because of his conserved complexity as well as his suitability for whole-organism studies.To fulfill this project, a precise methodology has been developed to analyze the PLA nanoparticles biodistribution. Which allowed, after bathing administriation, to unveil their robust innate tropism toward mucous dendritic cells. From these data has been established a targeting strategy, utilizing the peanut agglutinin lectin, which has been proved to enhance nanoparticle uptakes by both gills and skin mucosae. Finally, the study of PLA nanoparticles behavior and destiny after intravenous injection, revealed numerous elaborated interactions with the circulatory system.Overall, this work has been able to strengthen our understandings of PLA nanoparticles among living organisms, furthermore highlighting their promizing potential as nanovehicles for mucosal vaccines, L'utilisation des nanobiotechnologies dans le domaine de la santé est en plein essor. Les nanoparticules de poly(acide lactique) (PLA) représentent un nanosystème biocompatible capable d'accroître la spécificité et l'efficacité de traitements thérapeutiques et vaccinaux administrables par voie muqueuse et intraveineuse. Toutefois, l'optimisation de ces nanosystèmes se heurte à une caractérisation incomplète de leur biodistribution in vivo, en particulier à l'échelle cellulaire.L'objectif de ce travail de thèse est d'enrichir les connaissances sur la biodistribution des nanoparticules de PLA in vivo après administration muqueuse ou intraveineuse, dans le but d'élargir les perspectives d'optimisation et d'utilisation. Animal complexe et adapté pour les études sur organisme-entier, le modèle du poisson-zèbre (Danio rerio) a été utilisé. Pour mener à bien ce projet, une méthodologie rigoureuse d'analyse de la biodistribution des nanoparticules de PLA a été développée. Ce qui permit, après administration par balnéation, d'en révéler le fort tropisme inné envers les cellules dendritiques muqueuses. Ces données ont servi à élaborer une stratégie de ciblage, utilisant la lectine agglutinine de cacahuète, capable d'augmenter la prise en charge des nanoparticules de PLA par les branchies et la peau. Enfin, l'étude du devenir de ces nanoparticules après injection intraveineuse, a révélé de nombreuses interactions avec le système circulatoire. Ce travail a permis d'approfondir la connaissance des interactions des nanoparticules de PLA avec le vivant, soulignant le potentiel prometteur de ces nanoparticules pour la vaccination muqueuse

The proper establishment of Left/Right (L/R) asymmetry is fundamental to normal development in bilaterians. However, the initial mechanisms involved in symmetry breaking and their conservation throughout the course of evolution remain poorly understood. In zebrafish, the L/R organizer region or Kupffer’s vesicle (KV) consists as a fluid filled cavity, whose circular counterclockwise motion is driven by the motion of motile cilia. We have observed the presence of vesicles containing the ESCRT component Chmp1b in the lumen of the KV. Hence, the diminution of their number is associated with laterality defect, suggesting a potential role for those vesicles in L/R asymmetry establishment. We also participate to show that in spite of its overall circular geometry, the KV flow can ensure the directional transport of vesicles in the organ lumen. Secondly, we are also showing that the function of the Myo1D protein, implicated in L/R asymmetry establishment in drosophila, is conserved in zebrafish. The loss of Myo1D leads to an impaired early lateralization. Moreover, Myo1D functionally interact with the protein Vangl2, a component of the PCP pathway, which controls the tilt and positioning of KV cilia. These findings are supportive of a mechanism according to which Myo1D system represents a conserved molecular machinery essential for L/R asymmetry establishment in bilaterians., La mise en place de l’asymétrie droite/gauche (D/G) est fondamentale au développement normal des organismes bilatériens. Cependant, les mécanismes essentiels à la cassure de symétrie ainsi que leur conservation au cours de l’évolution sont encore mal compris. Chez le poisson-zèbre l’organisateur de l’asymétrie D/G ou vésicule de Kupffer (KV), consiste en une sphère remplie d’un liquide mis en mouvement de façon circulaire antihoraire pas le battement de cils motiles. Nous avons observé dans la lumière de la KV la présence de vésicules positives pour la protéine ESCRT Chmp1b. De plus, une diminution du nombre de ces vésicules est associée à l’apparition de défauts de latéralité, ce qui suggère un rôle potentiel de ces vésicules dans la mise en place de l’asymétrie D/G. Nous montrons que malgré sa forme circulaire, le flux de la KV peut transporter de façon asymétrique des vésicules. Deuxièmement, nous avons également montré que la fonction de la protéine Myo1D, impliquée dans l’asymétrie D/G chez la drosophile, est conservée chez le poisson-zèbre. La perte de Myo1D a un impact sur les signaux les plus précoces d’initialisation de la latéralité. De plus, Myo1D interagit de façon fonctionnelle avec la protéine Vangl2, un composant de la voie PCP contrôlant le positionnement et l’orientation des cils de la KV. Ces découvertes établissent ainsi que le système Myo1D représente une machinerie conservée au cours de l’évolution pour l’établissement d’une latéralité chez les animaux.

Among vertebrates, progesterone (P4) is an endogenous progestin acting through the nuclear and molecular progesterone receptor to mediate key processes of development and reproduction. Many molecules are designed to mimic the action of P4. These synthetic progestins and P4 are widely used as pharmaceuticals and some of them are found in this aquatic environment, thus posing risks to aquatic species. However, information is lacking to evaluate the dangers and risks of these substances for the environment. This thesis studied the mechanisms of action and the effects of progestins on zebrafish, using a combination of reporter-gene in vitro and in vivo tools based on the mechanism of action of endocrine disruptors. We characterized the toxicological profile of 26 progestins towards different human and zebrafish nuclear steroid receptors and towards the tissue-specific expression of steroidogenic genes (cyp19a1b in the brain and cyp11c1 in the interrenal cells). Our results show that some progestins can disrupt different signaling pathways in developing larvae at the molecular level, cellular and tissular level, and physiological level. Overall, the results of this thesis allow for a better characterization of the dangers of progestins on several endocrine targets., Chez les vertébrés, la progestérone (P4) est un progestatif endogène agissant via les récepteurs nucléaires et membranaires de la progestérone pour médier des processus clés du développement et de la reproduction. De nombreuses molécules sont conçues pour mimer l’action de la P4. Ces progestatifs synthétiques et la P4 sont très utilisés en tant que substances pharmaceutiques et certains sont retrouvées dans l’environnement aquatique, posant un risque pour les organismes. Cependant, les informations sont insuffisantes pour évaluer les dangers et les risques de ces substances pour l’environnement. Dans ce travail de thèse, les mécanismes d’action et les effets biologiques des progestatifs sur le poisson zèbre ont été étudiés grâce à une combinaison d’outils in vitro et in vivo de type gène-rapporteur basés sur le mécanisme d’action des perturbateurs endocriniens. Nous avons caractérisé le profil toxicologique complexe de 26 progestatifs vis-à-vis de différents récepteurs nucléaires stéroïdiens humain et poisson zèbre et vis-à-vis de l’expression tissu-spécifique de gènes de la stéroïdogenèse (cyp19a1b dans le cerveau et cyp11c1 dans les interrénales). Nos résultats montrent que certains progestatifs peuvent perturber différentes voies de signalisation chez les larves en développement au niveau moléculaire, cellulaire et tissulaire ainsi qu’au niveau physiologique. Dans l’ensemble, les résultats de cette thèse permettent une meilleure caractérisation des dangers des progestatifs sur différentes cibles endocriniennes.

By their ability to self-renew or differentiate into gametes, the spermatogonial stem cells (SSCs) are essential for sperm production throughout the life of male. The work done during the thesis had for objective the understanding of the cellular and molecular mechanisms potentially involved in the fate of the SSC in the teleost fish. With a new line of transgenic zebrafish expressing GFP under the control of a new gene promoter fragment vasa, we characterized a subpopulation of undifferentiated spermatogonia composed of asymmetric doublet. The observation of the GFP protein indicates that these doublets can fragment to generate isolated spermatogonia. Transplantation of fluorescent spermatogonial cells into the abdominal cavity of a recipient embryo shows that these cells have all functional properties of SSC. All our observations suggest that asymmetric doublet constitute a pool of stem cells with bivalent fate: they can continue their sperm differentiation or participate in the dynamic renewal of SSC pool. A rnaseq based transcritpome analysis of transcripts expressed in undifferentiated spermatogonia fluorescent and Sertoli cells highlights the diversity of paracrine regulatory pathways potentially involved in the control of the SSC (cell adhesion molecules, cytokines, growth factors, primary metabolites). Phylogenetic analyzes show that some of these regulatory pathways are well conserved among all Gnathostomes while others were lost in tetrapods or mammals only. A comparative approach initiated in rainbow trout generic confirms the interest of the data acquired in the zebrafish for fish of agronomic interest.; Les capacités d’auto-renouvellement ou de différenciation progressive en gamètes des cellules souches spermatogoniales (SSC) sont indispensables à la production de spermatozoïdes tout au long de la vie des individus de sexe mâle. Les travaux réalisés au cours de la thèse ont eu pour objectif de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires potentiellement impliqués dans le contrôle du devenir des SSC chez les poissons téléostéens. Grâce à une nouvelle lignée de poisson-zèbre transgénique exprimant la GFP sous le contrôle d’un nouveau fragment promoteur du gène vasa, nous avons caractérisé une sous-population de spermatogonies indifférenciées composés de doublets asymétriques. L’ensemble de nos observations suggère que ces doublets asymétriques constituent un pool de cellules souches recrutées pouvant soit poursuivre leur différenciation spermatique soit participer à la dynamique de renouvèlement du stock de SSC. Une approche de séquençage à haut débit des transcrits exprimés au sein des spermatogonies indifférenciées fluorescentes et des cellules de Sertoli met en évidence la diversité des voies de régulation paracrine potentiellement impliquées dans le contrôle du devenir des SSC (molécules d’adhésion cellulaire, cytokines, facteurs de croissance…). Les analyses phylogénétiques montrent que certaines de ces voies de régulation sont conservées chez les Gnathostomes alors que d’autres ont été perdues chez les tétrapodes ou les mammifères seulement. Une approche comparée initiée chez la truite arc-en-ciel confirme l’intérêt générique des données acquises chez le poisson-zèbre pour les poissons d’intérêt agronomique.

Mycobacterium abscessus is a rapid- growing mycobacterial species and an emerging pathogen,responsible for severe lung infections, particularly in cystic fibrosis patients. Naturally resistant to mostcurrently available antibiotics, its presence can represent a contraindication to subsequent lungtransplantation in these patients. That the currently recommended treatments present fluctuating resultsamong patients and are often associated with important side effects, imposes to develop innovativetherapeutic strategies and/or to identify new pharmacologically relevant targets in the fight against thispathogen. This project, focusing on M. abscessus, is intended to explore mechanistic and functionalaspects of members of the MmpL (Mycobacterial Membrane Protein Large) family of membrane proteinswith respect to i) their role in elaboration of the mycobacterial envelope, ii) their involvement in thephysiopathology of the infection and iii) their validation as potentially attractive therapeutic drug targets.In this context, my studies unraveled the key role of MmpL4a in the transport of glycopeptidolipids (GPL)in Mycobacterium bolletii, a sub-species of the M. abscessus complex and demonstrated its implication inthe formation of biofilms, cording and virulence of M. bolletii in infected zebrafish. Moreover, theseresults put forward the importance of critical residues, conserved in all MmpL members, involved in theestablishment of the proton-motive force required for the activity of these transporters. Finally, thesestudies succeeded in the identification of a new chemical entity exhibiting a potent activity against M.abscessus both in vitro and in vivo. This hit compounds targets MmpL3, leading to the inhibition of thetransport of mycolic acids, known to represent essential components of the mycobacterial cell wall. Theseresults emphasize the mode of action of the first specific inhibitor of mycolic acid transport in M.abscessus, paving the way to promising therapeutic applications.; Mycobacterium abscessus est une mycobactérie pathogène émergente à croissance rapidecapable d’induire des infections pulmonaires sévères, notamment chez les patients atteints demucoviscidose. Naturellement résistant à la plupart des antibiotiques disponibles, sa présence peut êtreune contre-indication à la greffe pulmonaire chez ces patients. De plus, l’efficacité des traitementsactuellement préconisés est très fluctuante d’un individu à l’autre et s’accompagne souvent d’effetssecondaires indésirables. Il apparaît donc urgent de développer des stratégies thérapeutiques innovanteset/ou d’identifier de nouvelles cibles pharmacologiques dans la lutte contre ce pathogène. Ce projet dethèse, focalisé sur M. abscessus, est centré sur l’étude mécanistique et fonctionnelle des transporteursmembranaires de la famille des MmpL (Mycobacterial Membrane Protein Large) en rapport avec leur rôledans i) l’élaboration de l’enveloppe mycobactérienne, ii) la physiopathologie infectieuse et iii) leurvalidation en tant que cible d’intérêt thérapeutique.Ainsi, mes travaux ont permis de mettre à jour le rôle clé de MmpL4a dans le transport desglycopeptidolipides (GPL) chez Mycobacterium bolletii, une sous-espèce du complexe M. abscessus et dedémontrer sa participation dans la formation de biofilms, des cordes mycobactériennes et dans la virulencede M. bolletii chez l’embryon de zebrafish. De plus, ces résultats mettent en exergue l’importance derésidus critiques impliqués dans l’établissement de la force proto-motrice, conservés chez toutes les MmpL,et nécessaires à l’activité de ces transporteurs. Enfin, ces études ont abouti à l’identification d’une nouvelleentité chimique très active contre M. abscessus à la fois in vitro et in vivo. Ce composé phare est capable decibler le MmpL3, conduisant à une inhibition du transport des acides mycoliques, connus comme étant descomposants essentiels chez les mycobactéries. Ces travaux représentent le premier exemple d’un inhibiteurciblant spécifiquement le transport d’acides mycoliques chez M. abscessus, ouvrant la voie vers desapplications thérapeutiques prometteuses.

Mycobacterium abscessus is a rapid- growing mycobacterial species and an emerging pathogen,responsible for severe lung infections, particularly in cystic fibrosis patients. Naturally resistant to mostcurrently available antibiotics, its presence can represent a contraindication to subsequent lungtransplantation in these patients. That the currently recommended treatments present fluctuating resultsamong patients and are often associated with important side effects, imposes to develop innovativetherapeutic strategies and/or to identify new pharmacologically relevant targets in the fight against thispathogen. This project, focusing on M. abscessus, is intended to explore mechanistic and functionalaspects of members of the MmpL (Mycobacterial Membrane Protein Large) family of membrane proteinswith respect to i) their role in elaboration of the mycobacterial envelope, ii) their involvement in thephysiopathology of the infection and iii) their validation as potentially attractive therapeutic drug targets.In this context, my studies unraveled the key role of MmpL4a in the transport of glycopeptidolipids (GPL)in Mycobacterium bolletii, a sub-species of the M. abscessus complex and demonstrated its implication inthe formation of biofilms, cording and virulence of M. bolletii in infected zebrafish. Moreover, theseresults put forward the importance of critical residues, conserved in all MmpL members, involved in theestablishment of the proton-motive force required for the activity of these transporters. Finally, thesestudies succeeded in the identification of a new chemical entity exhibiting a potent activity against M.abscessus both in vitro and in vivo. This hit compounds targets MmpL3, leading to the inhibition of thetransport of mycolic acids, known to represent essential components of the mycobacterial cell wall. Theseresults emphasize the mode of action of the first specific inhibitor of mycolic acid transport in M.abscessus, paving the way to promising therapeutic applications.; Mycobacterium abscessus est une mycobactérie pathogène émergente à croissance rapidecapable d’induire des infections pulmonaires sévères, notamment chez les patients atteints demucoviscidose. Naturellement résistant à la plupart des antibiotiques disponibles, sa présence peut êtreune contre-indication à la greffe pulmonaire chez ces patients. De plus, l’efficacité des traitementsactuellement préconisés est très fluctuante d’un individu à l’autre et s’accompagne souvent d’effetssecondaires indésirables. Il apparaît donc urgent de développer des stratégies thérapeutiques innovanteset/ou d’identifier de nouvelles cibles pharmacologiques dans la lutte contre ce pathogène. Ce projet dethèse, focalisé sur M. abscessus, est centré sur l’étude mécanistique et fonctionnelle des transporteursmembranaires de la famille des MmpL (Mycobacterial Membrane Protein Large) en rapport avec leur rôledans i) l’élaboration de l’enveloppe mycobactérienne, ii) la physiopathologie infectieuse et iii) leurvalidation en tant que cible d’intérêt thérapeutique.Ainsi, mes travaux ont permis de mettre à jour le rôle clé de MmpL4a dans le transport desglycopeptidolipides (GPL) chez Mycobacterium bolletii, une sous-espèce du complexe M. abscessus et dedémontrer sa participation dans la formation de biofilms, des cordes mycobactériennes et dans la virulencede M. bolletii chez l’embryon de zebrafish. De plus, ces résultats mettent en exergue l’importance derésidus critiques impliqués dans l’établissement de la force proto-motrice, conservés chez toutes les MmpL,et nécessaires à l’activité de ces transporteurs. Enfin, ces études ont abouti à l’identification d’une nouvelleentité chimique très active contre M. abscessus à la fois in vitro et in vivo. Ce composé phare est capable decibler le MmpL3, conduisant à une inhibition du transport des acides mycoliques, connus comme étant descomposants essentiels chez les mycobactéries. Ces travaux représentent le premier exemple d’un inhibiteurciblant spécifiquement le transport d’acides mycoliques chez M. abscessus, ouvrant la voie vers desapplications thérapeutiques prometteuses.

Mutations in SPG4, encoding spastin cause the major form of Hereditary Spastic Paraplegias (HSP), a paralytic disorder characterised by the degeneration of the corticospinal tracts. Spastin and its close homologue p60-katanin are microtubule-severing enzymes (MSE) required for spinal motor neuron (SMN) axon extension during zebrafish development. However, their roles in SMN axon navigation which also rely on microtubules (MTs) remain elusive. My PhD work aimed at refining the functional specificity and redundancy of these MSE during motor circuit wiring and clarifying the physiopathology of SPG4-linked HSP. I have first contributed to show that p60-Katanin controls SMN axon targeting and larval locomotion in a dose-dependent manner. We also demonstrated that Spastin and p60-Katanin play differential roles in SMN navigation and identified TTLL6-mediated MT polyglutamylation as a key event in regulating p60-Katanin activity in this process. Concomitantly, I have conducted a functional analysis of spastin main isoforms (resulting from alternative translation, M1 and M61) during zebrafish development, which reveals their critical and specific involvement in two distinct signalling pathways that are both essential for motor circuit wiring and locomotor behaviours. This study has provided compelling evidences for a concerted role for M1 and other HSP proteins in the down-regulation of the BMP pathway and reveals a specific role for M87 as a downstream effector of Neuropilin-1 signalling. Altogether, our study emphasizes defective BMP signalling as a key pathogenic mechanism in HSP, and shows that dysregulation of the Neuropilin-1 pathway may equally contribute to SPG4-linked HSP.; Les mutations du gène SPG4 codant la spastin sont responsables de la forme la plus fréquente de Paraplégies Spastiques Héréditaires (PSH), des maladies neurologiques caractérisées par une dégénérescence des faisceaux cortico-spinaux. La spastin, ainsi que son homologue p60-katanin sont des enzymes de cassure des microtubules (MSE) essentielles à la croissance des neurones moteurs spinaux (NMS) chez l'embryon de poisson-zèbre mais dont le rôle dans les processus de guidage axonal également dépendant des microtubules (MTs) demeurent énigmatiques. Les principaux objectifs de ma thèse ont consisté à préciser le rôle et le degré de redondance fonctionnelle existant entre ces deux MSE lors de l'établissement des circuits moteurs chez ce téléoste et de clarifier les mécanismes pathogéniques à l¿origine des PSH liées au gène SPG4.J'ai tout d'abord contribué à montrer que la p60-Katanin contrôle la trajectoire des axones des NMS et la mobilité des larves de façon dose-dépendante et non redondante avec la spastin. De plus, notre étude identifie la polyglutamylation des MTs par TTLL6 comme un élément clé de l'activité de la p60-Katanin lors de ce processus. Sur le même modèle, j'ai révélé un rôle différentiel des isoformes majoritaires de la spastin (résultant d¿une traduction alternative, M1 et M61) au cours du développement des NMS en démontrant un rôle coopératif de M1 et d'autres protéines de PSH dans l'inhibition de la voie des BMPs et révélant un rôle pour M61 en aval de la signalisation Neuropilin-1. Ces données suggèrent que l'altération de ces deux grandes voies de signalisation essentielles au développement des NMS pourrait contribuer à la pathogénèse des formes SPG4.

Fanconi Anemia is a rare autosomal recessive genetic disease with heterogenous phenotypes including myelosuppression, congenital malformations and heightened cancer predisposition. FA cells are highly sensitive to cross-linking agents. Since the 90's, at least 19 FANC proteins (FANCA to FANCT) have been identified as working together in a unique pathway detecting and triggering the repair of DNA crosslinks. Since then, the creation of animal models in various species (nematode, fruit fly, zebrafish and mouse) contributed to a better understanding of the physiopathology of the disease. This review aims to summarize the main discoveries made in these in vivo models, as well as to discuss some controversies that arose from these studies.

National audience

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