Search

International audience

The F-type ATPase or ATP synthase, anchored to the inner mitochondrial membrane, is a macromolecular complex using the proton motive force (pmf ) generated by the oxydation of small molecules, such as NADH2 and FADH2, in the different respiratory complexes to form ATP. The pmf is converted into mechanical work by the clockwise rotation of the ATP synthase viewed from the membrane. The rotation successively distorts the three catalytic interfaces of the enzyme to allow the synthesis of ATP. Anoxia or hypoxia are cases in which the rotation of ATP synthase proceeds in the direction of ATP hydrolysis. A small peptide named IF1, 63 aminoacids-long in yeast and 84 aminoacids-long in bovine, specifically inhibits the mitochondrial ATP synthase in the direction of ATP hydrolysis. This inhibition is reversible since the peptide is released when the inner mitochondrial membrane is re-energized. In this work, we were interested in characterizing the inhibition mechanism of the mitochondrial ATP synthase of S.cerevisiae by its endogenous peptide IF1. To elaborate and strengthen our statements, we mainly used the structures of IF1 ant of the inhibited IF1-F1-ATPase complex of B.taurus. The data obtained by Elena Cabezón on bovine and yeast IF1 showed that different forms of the peptide coexist and that their pre-eminence depends on the pH. The bovine IF1 mainly adopts a dimeric form at pH below 6.5 and tetrameric one at pH above 6.5. Its inhibitory properties also vary with the pH. The dimeric form is inhibitory and the tetrameric one is not. In yeast, it is known that a monomeric form is predominant at pH above 6.5 and a dimeric form predominant at pH below 6.5. The monomeric form is inhibitory but nothing has been reported about the inhibitory properties of the dimeric form. By using ths structural data of the bovine IF1, we tried to determine the dimerization region of the yeast IF1. For this aim, we decided to combine Site-Directed Spin Labeling (SDSL) with electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. Thus, we attached labels on the C-ter or the mid-region and we could propose that the dimer of yeast IF1 preferentially forms by the mid-region. This work is currently in the preliminary stage and other experiments would be necessary to confirm the precize region of dimerization. In a second part, we tried to precise the inhibitory mechanism by detailing the different steps of recognition, locking and stabilization of the inhibited complex. This was achieved by combining the mutagenesis of yeast IF1 and F1-ATPase with kinetics of inhibition. First, we evaluated the role of some residues located in the C-terminal part of β subunit in the specific molecular recognition of IF1 by the mitochondrial ATPase. These residues belong to the region of the α/ β interface that closes up on IF1 peptide. Then, we showed that the N-terminal part of IF1 plays a minor role in the molecular recognition but its winding around the γ subunit constitutes an important lock in the inhibited complex. Finally, the closing of the catalytic interface on IF1 creates a contact region between the α and the γ subunit which is the last key that definitively locks the peptide in the cage "F1-ATPase". This last locking point is the only one that does not involve any IF1 residue.; L'ATP synthase ou ATPase de type F, ancrée aux membranes internes des mitochondries, est un complexe macromoléculaire qui utilise le gradient électrochimique généré par l'oxydation de petites molécules (NADH2, FADH2) dans les différents complexes de la chaîne respiratoire pour former l'ATP, vecteur énergétique universel. Le gradient électrochimique ou pmf est transformé en une énergie mécanique qui se traduit par le mouvement du rotor de l'ATP synthase dans un sens horaire vu depuis la membrane. La rotation de la sous-unité déforme successivement les trois sites catalytiques et permet ainsi la synthèse d'ATP. Dans certains cas, comme ceux de l'anoxie ou de l'hypoxie, le gradient électrochimique peut s'effondrer et l'ATP synthase hydrolyse alors l'ATP. Pour éviter cette hydrolyse futile, un petit peptide nommé IF1, régulateur spécifique des ATP synthases mitochondriales, vient s'insérer entre les sous-unités d'une interface catalytique et bloque instantanément le fonctionnement de l'ATPase. Cette inhibition est réversible puisque le peptide se décroche lorsque la membrane interne mitochondriale se réénergise. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à caractériser le mécanisme d'inhibition de l'ATPase de S.cerevisiae par son peptide endogène IF1 en s'appuyant essentiellement sur les quelques données structurales qui ont été publiées sur le peptide et sur le complexe inhibé IF1-F1-ATPase de B.taurus. Constitué de 63 acides aminés chez S.cerevisiae et 84 acides aminés chez B.taurus, IF1 est majoritairement structuré en hélice α. Les études menées par Elena Cabezón ont montré qu'IF1 possédait différentes formes dont la prédominance et l'activité dépendait essentiellement du pH. Chez B.taurus, il existe une forme inhibitrice dimérique prédominante à pH inférieurs à 6,5 et une forme tétramérique dont nous connaissons la structure 3D qui est non inhibitrice et prépondérante à pH supérieurs à 6,5. Chez S.cerevisiae, il existe une forme monomérique inhibitrice prépondérante à pH supérieur à 6,5 et une forme dimérique prédominante à pH inférieurs à 6,5 et dont le caractère inhibiteur ou non n'a pas encore été déterminé. Sur la base de la structure 3D de l'IF1 bovin, nous avons voulu identifier les régions de dimérisation du peptide de levure en utilisant la technique de marquage de spin couplée à de la spectroscopie RPE. En plaçant des marqueurs de spin (MTSL) en partie médiane (E33C) ou en C-terminale (L54C), nous avons pu favoriser l'interface de dimérisation plutôt en partie médiane du peptide. Ce travail est encore au stade embryonnaire et ne nous permet pas, à ce jour, d'identifier la zone exacte de dimérisation. Dans un deuxième volet, nous avons voulu caractériser le mécanisme d'inhibition d'un point de vue dynamique et nous avons pu en préciser les différentes étapes : reconnaissance, verrouillage et stabilisation. Pour cela, nous avons associé la mutagenèse sur le peptide et sur l'enzyme aux cinétiques d'inhibition. Nous avons tout d'abord évalué le rôle de plusieurs résidus situés en Cterminal de la sous-unité β, dans la région de l'interface α/ β qui se referme sur le peptide IF1, dans la reconnaissance moléculaire spécifique d'IF1 par l'ATPase mitochondriale. Nous avons ensuite montré que la partie N-terminale d'IF1 joue un rôle mineur dans la reconnaissance moléculaire mais son enroulement autour de la sous-unité constitue un loquet important dans la stabilisation du complexe inhibé. Enfin, la fermeture de l'interface catalytique sur IF1 crée une zone de contact entre la "bosse" de la sous-unité γ et la partie C-terminale de la sous-unité α qui constitue la dernière clef de blocage du peptide au sein de la F1-ATPase. Ce dernier point de fermeture est le seul qui n'implique aucun résidu du peptide IF1.

Some ATP-binding-cassette (ABC) transporters confer multidrug resistance (MDR) to pathogenic microorganisms and human tumor cells by mediating the extrusion of a variety of chemotherapeutic drugs out of the cell. One major resistance to chemotherapy has been correlated with the presence of these ABC transporters, acting as molecular " pumps " that actively transport drugs out of the cell, the most prevalent of these being P-glycoprotein (P-gp). Although the X-ray structures of two bacterial ABC proteins have been determined, and the first structures of mouse Pgp released recently in the Protein Data Bank (PDB), establishing molecular structures of human P-gp is still of particular interest because of its clinical relevance. Using homology modeling tools, we rebuilt three structures of human P-gp in different conformations: one nucleotide-bound and two in the absence of nucleotide. Nucleotide binding swaps the accessibility of the transporter from cytoplasmic (inward) facing to extracellular (outward) facing. We placed the three modeled conformational states in a native-like membrane environment, in order to locate several known mutations that alter specificity of drug binding, in particular relatively to the membrane surroundings. We then rebuilt two modeled structures of hamster P-gp in inward and outward conformations, and conducted docking studies of three molecules without any structural similarity (verapamil, vinblastine and tentoxin), but having competitive, non competitive and partial overlapping binding modes. The best poses obtained are consistent with the existence of two different pharmacophores for the recognition of the drug transported by P-glycoprotein., La P-glycoprotéine (P-gp) appartient à la famille des transporteurs ABC qui confèrent, aux microorganismes pathogènes et cellules tumorales humaines, par transport actif à travers la membrane plasmique, une résistance à de multiples molécules antibiotiques et anticancéreuses sans parenté structurale. Malgré les quelques structures de transporteurs ABC bactériens, la caractérisation par microscopie électronique de la P-gp, et la récente structure de P-gp de souris déposée dans la Protein Data Bank (PDB), obtenir une structure pour la P-gp humaine est d'un intérêt particulier à cause de son importance clinique. Actuellement, il n'existe pas de modèle structural d'interaction P-gp/substrat permettant d'expliquer sa multispécificité. Par modélisation par homologie, nous avons reconstruit trois structures de la Pgp humaine: une en présence et deux autres en absence de nucléotide. La liaison du nucléotide change l'accessibilité du transporteur de la face cytoplasmique vers la face extracellulaire. Ces trois états conformationnels ont été placés dans un environnement membranaire afin de révéler la localisation des mutations spécifiques altérant la liaison de la P-gp à certains médicaments. Enfin, nous avons réalisé une étude de docking sur deux structures modélisées de P-gp de Hamster dans les deux orientations. Ce docking a concerné trois molécules sans aucune ressemblance structurale (vérapamil, vinblastine et tentoxine) mais dont les fixations sont mutuellement soit compétitives, soit non-compétitives. Les meilleures poses obtenues sont compatibles avec l'existence de deux pharmacophores distincts pour la reconnaissance des drogues transportées par la P-gp.

International audience

Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase is a membrane protein for which several conformations have been determined by X-ray crystallography. These structures have been very useful to guide interpretation of our functional studies of the role of the A domain and of the L6-7 loop in Ca2+-ATPase. However, we have shown that crystallization conditions may sometimes induce artefactual structures. Thus, the presence of high concentrations of Ca2+ during the crystallization process may favour for the AMPPCP-bound enzyme a structure different from the average one prevailing in solution. Similarly, inhibitors generally used to stabilize Ca2+-free ATPase close the access from the lumen to its Ca2+ binding sites in «E2P like» states. We have finally documented and attempted to understand both advantages and drawbacks to the use of amphipatic polymers for stabilisation of membrane proteins in solution.; L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique est une protéine membranaire dont plusieurs conformations ont été résolues par cristallographie des rayons X. Ces structures ont été précieuses pour l'interprétation de nos études fonctionnelles sur le rôle du domaine A et de la boucle L6-7 de l'ATPase. Mais nous avons montré que les conditions de cristallisation aboutissent parfois à des structures paradoxales : la présence de concentrations importantes de Ca2+ pendant la cristallisation en présence d'AMPPCP conduit l'ATPase à adopter une conformation probablement différente de sa structure moyenne en solution; de même, dans les conformations de l'ATPase proches de l'état phosphorylé «E2P», les inhibiteurs généralement utilisés pour stabiliser l'ATPase bloquent de façon artéfactuelle l'ouverture des sites Ca2+ vers la lumière du réticulum. Nous avons tenté de comprendre les avantages et inconvénients de divers polymères amphiphiles conçus pour stabiliser en solution les protéines membranaires.

Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase is a membrane protein for which several conformations have been determined by X-ray crystallography. These structures have been very useful to guide interpretation of our functional studies of the role of the A domain and of the L6-7 loop in Ca2+-ATPase. However, we have shown that crystallization conditions may sometimes induce artefactual structures. Thus, the presence of high concentrations of Ca2+ during the crystallization process may favour for the AMPPCP-bound enzyme a structure different from the average one prevailing in solution. Similarly, inhibitors generally used to stabilize Ca2+-free ATPase close the access from the lumen to its Ca2+ binding sites in «E2P like» states. We have finally documented and attempted to understand both advantages and drawbacks to the use of amphipatic polymers for stabilisation of membrane proteins in solution., L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique est une protéine membranaire dont plusieurs conformations ont été résolues par cristallographie des rayons X. Ces structures ont été précieuses pour l'interprétation de nos études fonctionnelles sur le rôle du domaine A et de la boucle L6-7 de l'ATPase. Mais nous avons montré que les conditions de cristallisation aboutissent parfois à des structures paradoxales : la présence de concentrations importantes de Ca2+ pendant la cristallisation en présence d'AMPPCP conduit l'ATPase à adopter une conformation probablement différente de sa structure moyenne en solution; de même, dans les conformations de l'ATPase proches de l'état phosphorylé «E2P», les inhibiteurs généralement utilisés pour stabiliser l'ATPase bloquent de façon artéfactuelle l'ouverture des sites Ca2+ vers la lumière du réticulum. Nous avons tenté de comprendre les avantages et inconvénients de divers polymères amphiphiles conçus pour stabiliser en solution les protéines membranaires.

The article opens with an overview of economic literature concerning the modeling of personal consumption and labour supply choices when incorporating labour market participation costs (childminding, etc.). We then use data from the 1985 French Family Budgets survey to estimate the relationships between household demand for goods and services and total demand for goods and services (Engel curves) conditioned by female activity using M. Browning and C. Meghir's 1991 methodology. It appears that households allocate the same budget differently to goods depending on whether the woman works part time, full time or not at all.; Dans cet article, nous commençons par présenter l' état de la littérature économique en matière de modélisation des choix individuels de consommation et d'offre de travail en présence de coûts de participation au marché du travail (gardes d'enfants, etc.). Puis, à partir de données issues de l'enquête Budget des Familles de 1985, nous procédons à l'estimation des relations entre la demande des ménages en biens et services et la demande totale en biens et services (courbes d'Engel) conditionnellement à l' activité féminine, selon la méthodologie développée par M. Browning et C. Meghir (1991). Il apparaît ainsi que les ménages allouent différemment un même budget entre les biens, selon que la femme travaille à temps partiel ou à temps complet, ou selon qu'elle ne travaille pas.