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Clostridioides difficile is a Gram-positive pathogenic bacterium found mainly in the soils and intestines of mammals. It is the leading cause of adult health care associated diarrhea in industrialized countries. The incidence of these infections continues to increase and this trend is accentuated by the general aging of the population. C. difficile now represents a real danger to human and animal health. A better understanding of the regulation of the colonization process of the digestive tract therefore seems essential for the study of this emerging pathogen. In most bacteria, non-coding RNAs (ncRNAs) govern the regulation of many physiological processes, including virulence processes. Recent transcriptomic experiments initiated by my laboratory have identified a large number of regulatory RNAs in C. difficile. The objective of this thesis is to characterize the role of non-coding RNAs in the control of the infectious cycle in C. difficile, but also to better understand the regulatory networks controlling the processes essential for the development of C. difficile in contact with its host. To do this, a transcriptomic approach making it possible to simultaneously visualize the RNAs induced or repressed in the host and the pathogen during the infection was implemented, which made it possible to identify certain RNAs differentially expressed during the infection versus a controlled condition. On the other hand, several regulatory RNAs specific to a hypervirulent ribotype 027 strain had already been identified during a comparative transcriptomic experiment between this same strain and a reference strain 630. The study of one of these non-coding RNAs located in a prophagic region made it possible to characterize a new riboswitch, located upstream of a gene involved in a process of defense against phage infection (Abi). Finally, a last original aspect of virulence control by C. difficile is also explored by studying the role of an RNA chaperone protein (Hfq) known to be involved in numerous regulatory networks of bacterial physiology, but also in the control of virulence processes in most Gram-negative bacteria. The characterization of a deletion mutant for this protein made it possible to study the role of this protein in C. difficile in the regulation of virulence through the characterization of various phenotypes related to virulence and during in vivo tests in mice. This project has thus enabled a better understanding of the regulatory mechanisms of certain original aspects of virulence control by non-coding RNA in C. difficile.; Clostridioides difficile est une bactérie pathogène à Gram positif retrouvée principalement dans les sols et les intestins des mammifères. Il est la principale cause de diarrhées associées aux soins chez les adultes dans les pays industrialisés. L’incidence de ces infections continue à augmenter et cette tendance est accentuée par le vieillissement général de la population. C. difficile représente aujourd’hui un réel danger pour la santé humaine et animale. Mieux comprendre la régulation du processus de colonisation du tube digestif semble donc indispensable pour l’étude de ce pathogène émergent. Chez la plupart des bactéries, les ARN non codants (ARNnc) interviennent dans la régulation de nombreux processus physiologiques, dont les processus de virulence. Des expériences récentes de transcriptomique menées par mon laboratoire ont permis d’identifier un grand nombre d’ARNs régulateurs chez C. difficile. L’objectif de cette thèse est de caractériser le rôle des ARNs non codant dans le contrôle du cycle infectieux chez C. difficile, mais également de mieux comprendre les réseaux de régulation contrôlant les processus indispensables au développement de C. difficile au contact de son hôte. Pour ce faire, une approche de transcriptomique permettant de visualiser simultanément les ARNs induits ou réprimés chez l’hôte et le pathogène durant l’infection a été mise en œuvre, ce qui a permis d’identifier certains ARNs différentiellement exprimés au cours de l’infection par rapport à une condition contrôle. D’autre part, plusieurs ARNs régulateurs spécifiques à une souche hypervirulente de PCR-ribotype 027 avaient déjà été identifiés lors d’une expérience de transcriptomique comparative entre cette même souche et une souche de référence 630. L’étude de l’un de ces ARN non codant localisée dans une région prophagique a permis de caractériser un nouveau riboswitch, situé en amont d’un gène intervenant dans un processus de défense contre l’infection phagique (Abi). Finalement, un dernier aspect original du contrôle de la virulence par C. difficile est également exploré par l’étude du rôle d’une protéine ARN chaperonne (Hfq) connue pour être impliquées dans de nombreux réseaux de régulations de la physiologie bactérienne, mais également dans le contrôle des processus de virulence chez la plupart des bactéries à Gram négatif. La caractérisation d’un mutant de délétion pour cette protéine a permis d’étudier le rôle de cette protéine chez C. difficile dans la régulation de la virulence via la caractérisation de divers phénotypes reliés à la virulence et durant des tests in vivo chez la souris. Ce projet a ainsi permis une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de certains aspects originaux du contrôle de la virulence par ARN non codant chez C. difficile.

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Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening genetic disorder in Caucasians, affects many organs but chronic lung disease is the main cause of morbidity and mortality. This disease, characterized by CFTR gene alterations, results in ions transport dysfunctions that contribute to impair mucociliary clearance, favoring bacterial colonization and inflammation, and ultimately leading to lung destruction. Nowadays, therapeutic drugs have limited benefit, so development of new alternatives or complementary molecules remains essential. Recently, our team demonstrated that the intervention on CFTR mRNA stability leads to an increase in CFTR protein level and an improvement of the CFTR channel activity. An alternative way would be to target key actors such as miRNA and ARE-BP (RNA binding protein), deregulated in CF tissues, that display a pleiotropic activity and act together to control expression of several genes.Our findings led to the identification of dysregulated miRNA in CF samples and revealed multiple isoforms relative to miRNA of reference (i.e. isomiRs). We focused on two miRNA, miR-101, that displays a modification in isomiR distribution and miR-181a-5p that is highly deregulated, in three CF airways models. These miRNA modulate expression of key genes or related genes in PI3K-Akt/MAPK-Erk and Wnt signaling pathways.Our work also revealed the deregulation of an ARE-BP protein, TTP (Tristetraprolin, ZFP36), in CF context. This protein is a master regulator in inflammatory resolution. We next investigated the mechanism whereby this ARE-BP is regulated in bronchial cells and showed that TTP phosphorylation is regulated by MK2 through ERK activation. We also determined for the first time that TTP binds to the 3’UTR of CFTR mRNA where TTP binding stabilizes CFTR mRNA level.These data bring new insights into CF physiopathology and open new research opportunities in CF.; La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis), maladie autosomique récessive la plus fréquente dans la population caucasienne, se manifeste par l’atteinte de plusieurs organes due à l’absence ou au dysfonctionnement du canal CFTR. Au niveau des poumons, la perte de l’activité du canal se traduit par une déshydration du mucus, des cycles d’infections et d’inflammation aboutissant à terme à la destruction du parenchyme pulmonaire. Les thérapeutiques proposées à l’heure actuelle, sont principalement symptomatiques et l’exploration de nouvelles pistes reste nécessaire. De récents travaux émanant de notre équipe ont révélé qu’une intervention au niveau de la stabilisation des transcrits pourrait être bénéfique pour améliorer la quantité de protéines nécessaires pour restaurer une activité suffisante du canal CFTR. Une autre piste qui pourrait être explorée serait de cibler, en plus de l’expression du gène CFTR, des régulateurs clés qui participent aux processus de réparation cellulaire ou à la réponse inflammatoire. Dans cet objectif, nous nous sommes focalisés sur des régulateurs clés comme les miARN et les ARE-BP (protéines de liaison à l’ARN) qui sont dérégulés dans les tissus CF et qui peuvent agir ensemble dans le contrôle de l’expression de nombreux gènes.Les travaux que nous avons réalisés nous ont permis d’une part, de montrer la dérégulation de miARN dans des échantillons CF ainsi que des isoformes de certains miARN. Deux miARN ont retenu notre attention, le miR-101 dont la distribution de ses séquences isomiR varient dans des cultures CF et le miR-181a-5p qui présente une dérégulation de son expression dans trois modèles ex-vivo CF que nous avons utilisés. Ces miARN ont la particularité de moduler l’expression de gènes clés dans les voies de signalisation PI3K-Akt/MAPK-Erk et Wnt. D’autre part, nos travaux ont révélé la dérégulation de la protéine ARE-BP TTP (Tristétraproline ou ZFP36) en contexte CF. Cette protéine est d’autant plus intéressante qu’elle est connue pour être un régulateur clé de l’inflammation. La suite de ce travail a donc été d’étudier sa régulation et son impact sur ses ARNm cibles. L’activité de cette ARE-BP a été principalement décrite pour être contrôlée par la voie p38-MAPK. Nous montrons l’implication de la voie p42/p44-MAPK (Erk1/2) dans la régulation de la phosphorylation de TTP dans des cultures bronchiques. La recherche des interactions entre TTP et ses cibles a également révélé que cette protéine agissait sur ses propres régulateurs ainsi que sur l’ARNm CFTR. Nous montrons ainsi pour la première fois que TTP se fixe au niveau de la région 3’UTR du transcrit CFTR et joue un rôle de stabilisateur sur ce transcrit.Identifier de nouveaux acteurs de la régulation du gène CFTR mais également des régulateurs centraux des processus altérés en contexte CF offre de nouvelles opportunités pour concevoir des outils ciblés pour combattre cette maladie.

Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening genetic disorder in Caucasians, affects many organs but chronic lung disease is the main cause of morbidity and mortality. This disease, characterized by CFTR gene alterations, results in ions transport dysfunctions that contribute to impair mucociliary clearance, favoring bacterial colonization and inflammation, and ultimately leading to lung destruction. Nowadays, therapeutic drugs have limited benefit, so development of new alternatives or complementary molecules remains essential. Recently, our team demonstrated that the intervention on CFTR mRNA stability leads to an increase in CFTR protein level and an improvement of the CFTR channel activity. An alternative way would be to target key actors such as miRNA and ARE-BP (RNA binding protein), deregulated in CF tissues, that display a pleiotropic activity and act together to control expression of several genes.Our findings led to the identification of dysregulated miRNA in CF samples and revealed multiple isoforms relative to miRNA of reference (i.e. isomiRs). We focused on two miRNA, miR-101, that displays a modification in isomiR distribution and miR-181a-5p that is highly deregulated, in three CF airways models. These miRNA modulate expression of key genes or related genes in PI3K-Akt/MAPK-Erk and Wnt signaling pathways.Our work also revealed the deregulation of an ARE-BP protein, TTP (Tristetraprolin, ZFP36), in CF context. This protein is a master regulator in inflammatory resolution. We next investigated the mechanism whereby this ARE-BP is regulated in bronchial cells and showed that TTP phosphorylation is regulated by MK2 through ERK activation. We also determined for the first time that TTP binds to the 3’UTR of CFTR mRNA where TTP binding stabilizes CFTR mRNA level.These data bring new insights into CF physiopathology and open new research opportunities in CF., La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis), maladie autosomique récessive la plus fréquente dans la population caucasienne, se manifeste par l’atteinte de plusieurs organes due à l’absence ou au dysfonctionnement du canal CFTR. Au niveau des poumons, la perte de l’activité du canal se traduit par une déshydration du mucus, des cycles d’infections et d’inflammation aboutissant à terme à la destruction du parenchyme pulmonaire. Les thérapeutiques proposées à l’heure actuelle, sont principalement symptomatiques et l’exploration de nouvelles pistes reste nécessaire. De récents travaux émanant de notre équipe ont révélé qu’une intervention au niveau de la stabilisation des transcrits pourrait être bénéfique pour améliorer la quantité de protéines nécessaires pour restaurer une activité suffisante du canal CFTR. Une autre piste qui pourrait être explorée serait de cibler, en plus de l’expression du gène CFTR, des régulateurs clés qui participent aux processus de réparation cellulaire ou à la réponse inflammatoire. Dans cet objectif, nous nous sommes focalisés sur des régulateurs clés comme les miARN et les ARE-BP (protéines de liaison à l’ARN) qui sont dérégulés dans les tissus CF et qui peuvent agir ensemble dans le contrôle de l’expression de nombreux gènes.Les travaux que nous avons réalisés nous ont permis d’une part, de montrer la dérégulation de miARN dans des échantillons CF ainsi que des isoformes de certains miARN. Deux miARN ont retenu notre attention, le miR-101 dont la distribution de ses séquences isomiR varient dans des cultures CF et le miR-181a-5p qui présente une dérégulation de son expression dans trois modèles ex-vivo CF que nous avons utilisés. Ces miARN ont la particularité de moduler l’expression de gènes clés dans les voies de signalisation PI3K-Akt/MAPK-Erk et Wnt. D’autre part, nos travaux ont révélé la dérégulation de la protéine ARE-BP TTP (Tristétraproline ou ZFP36) en contexte CF. Cette protéine est d’autant plus intéressante qu’elle est connue pour être un régulateur clé de l’inflammation. La suite de ce travail a donc été d’étudier sa régulation et son impact sur ses ARNm cibles. L’activité de cette ARE-BP a été principalement décrite pour être contrôlée par la voie p38-MAPK. Nous montrons l’implication de la voie p42/p44-MAPK (Erk1/2) dans la régulation de la phosphorylation de TTP dans des cultures bronchiques. La recherche des interactions entre TTP et ses cibles a également révélé que cette protéine agissait sur ses propres régulateurs ainsi que sur l’ARNm CFTR. Nous montrons ainsi pour la première fois que TTP se fixe au niveau de la région 3’UTR du transcrit CFTR et joue un rôle de stabilisateur sur ce transcrit.Identifier de nouveaux acteurs de la régulation du gène CFTR mais également des régulateurs centraux des processus altérés en contexte CF offre de nouvelles opportunités pour concevoir des outils ciblés pour combattre cette maladie.

Les leucémies aiguës mégacaryoblastiques de l’enfant (ou LAM7) sont généralement associées à un mauvais pronostic et à l’expression d’oncogènes de fusion impliquant des régulateurs transcriptionnels. Des résultats récents indiquent que la fusion ETO2-GLIS2 altère l’activité de régions régulatrices de l’expression génique appelées « enhancers » et l’expression des facteurs GATA et ETS, essentiels au développement des cellules souches hématopoïétiques. Une dérégulation de l’équilibre GATA/ETS est également retrouvée dans d’autres sous-groupes de LAM7. Cette revue porte sur les bases transcriptionnelles de la transformation survenant dans les LAM7 de l’enfant et les perspectives thérapeutiques que cela ouvre.

Normal glucose homeostasis is characterized by appropriate insulin secretion and low HbA1c. Gene expression signatures associated with these two phenotypes could be essential for islet function and pathophysiology of type 2 diabetes (T2D). Herein, we employed a novel approach to identify candidate genes involved in T2D by correlating islet microarray gene expression data (78 donors) with insulin secretion and HbA1c level. The expression of 649 genes (P < 0.05) was correlated with insulin secretion and HbA1c. Of them, five genes (GLR1A, PPP1R1A, PLCDXD3, FAM105A and ENO2) correlated positively with insulin secretion/negatively with HbA1c and one gene (GNG5) correlated negatively with insulin secretion/positively with HbA1c were followed up. The five positively correlated genes have lower expression levels in diabetic islets, whereas GNG5 expression is higher. Exposure of human islets to high glucose for 24 h resulted in up-regulation of GNG5 and PPP1R1A expression, whereas the expression of ENO2 and GLRA1 was down-regulated. No effect was seen on the expression of FAM105A and PLCXD3. siRNA silencing in INS-1 832/13 cells showed reduction in insulin secretion for PPP1R1A, PLXCD3, ENO2, FAM105A and GNG5 but not GLRA1. Although no SNP in these gene loci passed the genome-wide significance for association with T2D in DIAGRAM+ database, four SNPs influenced gene expression in cis in human islets. In conclusion, we identified and confirmed PPP1R1A, FAM105A, ENO2, PLCDX3 and GNG5 as potential regulators of islet function. We provide a list of candidate genes as a resource for exploring their role in the pathogenesis of T2D.

In the reductionist perspective, genetic modifications are considered to initiate cancer. Their appearance is a stochastic phenomenon, but there are some biases linked to DNA sequence or exposure to mutagenic agents for instance. Cancer genome sequencing has shown a high interand intra-tumoral heterogeneity, sometimes questioning the genetic origin of cancer. Other stochastic processes are also studied in cancer, especially epigenetic modifications. They have a major role in diversifying phenotypes among cancer cells in the progression steps, but might also provide an alternative to genetic theories of cancer initiation. Nevertheless, the reductionist framework remains dominant here. Finally, stochastic cell-to-cell variations in gene expression constitute a third class of stochastic phenomena that can be considered as causal factors in cancer. Highlighting the role of high gene expression variability due to disruption of cellular interactions and communications allows avoiding reductionism by considering the interplay between genetic and tissue levels at every step of the disease. No organization level is privileged in this alternative theory.; Dans la perspective réductionniste, les modifications génétiques sont conçues comme les éléments initiateurs des cancers. Elles apparaissent de manière aléatoire et les séquençages de génomes cancéreux ont montré une forte hétérogénéité génétique inter- et intratumorale. D’autres phénomènes aléatoires retiennent aussi l’attention,en particulier les modifications épigénétiques de la chromatine. Elles fournissent pour certains une alternative à une théorie seulement génétique du cancer. Enfin les variations aléatoires de l’expression des gènes constituent une troisième classe d’événements aléatoires qui pourraient avoir un rôle causal. L’accent mis sur ce dernier type d’événements permet de sortir du schéma réductionniste en considérant les interactions entre les niveaux génétique et tissulaire.

The Ccr4-Not complex is a conserved multi-subunit complex in eukaryotes that carries 2 enzymatic activities: ubiquitination mediated by the Not4 RING E3 ligase and deadenylation mediated by the Ccr4 and Caf1 orthologs. This complex has been implicated in all aspects of the mRNA life cycle, from synthesis of mRNAs in the nucleus to their degradation in the cytoplasm. More recently the complex has also been implicated in many aspects of the life cycle of proteins, from quality control during synthesis of peptides, to assembly of protein complexes and protein degradation. Consistently, the Ccr4-Not complex is found both in the nucleus, where it is connected to transcribing ORFs, and in the cytoplasm, where it was revealed to be both associated with translating ribosomes and in RNA processing bodies. This functional and physical presence of the Ccr4-Not complex at all stages of gene expression raises the question of its fundamental role. This review will summarize recent evidence designing the Not3/5 module of the Ccr4-Not complex as a functional module involved in coordination of the regulation of gene expression between the nucleus and the cytoplasm.

Sex determination in plants leads to the development of unisexual flowers from an originally bisexual floral meristem. Cucurbits are not only species of agronomic interest but they also represent model species for the study of plant sex determination, because of their ability to harbor different sexual types. Such sexual forms are controlled by the identity of the alleles at the following loci: andromonoecious (a) and gynoecious (g) in melon, or androecious (a), Female (F), and Monoecious (M) in cucumber. We firstly showed that the andromonoecious a gene in melon encodes for an ACC synthase (CmACS7) and demonstrated that andromonoecy results from a mutation in the active site of the enzyme. Expression of the active enzyme inhibits the development of the male organs and is not required for carpel development. Because the a gene in melon and M gene in cucumber control the same sexual transition, monoecy to andromonoecy, we isolated the andromonoecy M gene in cucumber using a candidate gene approach in combination with genetic and biochemical analysis. We demonstrated the co-segregation of CsACS2, a close ortholog of CmACS7, with the M locus, and showed that the cucumber andromonoecious phenotype is also due to a loss of ACS enzymatic activity. CsACS2 is expressed specifically in carpel primordia of female flowers and should play a similar role to that of CmACS7 in melon in the inhibition of stamina development. Finally, we also showed that the transition from male to female flowers in the gynoecious lines results from epigenetic changes in the promoter of a C(2)H (2) zinc-finger transcription factor, CmWIP1. This epigenetic change is elicited by the insertion of a DNA transposon, which causes the spreading of DNA methylation to the CmWIP1 promoter. Expression of CmWIP1 leads to carpel abortion, resulting in the development of unisexual male flowers. From all these results, we built a model in which CmACS7 and CmWIP1 interact to control the development of male, female and hermaphrodite flowers in melon.

Voltage dependent calcium channels (VDCC) participate to various cellular processes such as neurotransmitters release, muscular contraction or gene expression regulation. VDCC are composed of a pore-forming subunit (alpha1 or Cav), that allows Ca2+ to enter the cells associated with auxiliary subunits, alpha2delta, beta and gamma. My thesis studies on a new signaling pathway in which the beta4 subunit of VDCC couples neuronal excitability to transcription. In particular it focuses on the understanding of the beta4 nuclear translocation determinants and the mechanisms of gene expression regulation by this VDCC subunit. beta4 translocation from the cytoplasm to the nucleus is observed during neuronal differentiation. This translocation depends on beta4 structural integrity and more precisely on interaction between the beta4 SH3 (Src Homology 3) and GK (Guanylate Kinase) domains. beta4 nuclear translocation is conditioned by its association with a partner: the regulatory subunit of phosphatase protein 2A (PP2A), B56delta. Membrane depolarization induces beta4 channel uncoupling and association with B56delta. Thus, beta4 migrates to the nucleus in complex with B56delta/PP2A. A study on gene expression generated by microarray was carried on to compare profiles of gene expression in lethargic (lh) mice, considered as spontaneous beta4 KO with wild-type (WT) mice cerebellum. This study proved the influence ofbeta4 on the repression and the activation of certain genes. Particularly, beta4 strongly represses tyrosine hydroxylase (TH) gene expression. In the nucleus, beta4 interacts with a transcription factor: the thyroid hormone receptor alpha (TR alpha). This association allows beta4/B56delta/PP2A complex to target the TH gene promoter as shown by chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments. This complex is also able to associate itself with histones and dephosphorylate Ser10 histone H3 in the TH gene promoter. This chromatin modification is correlated with HP1 gamma (Heterochromatin Protein 1 gamma) recruitment in the TH gene promoter. HP1 gamma is known to promote heterochromatin formation that could explain the TH gene repression by beta4. Thus, in lh mice cerebellum, the absence of beta4 triggers a complete disorganization of this signaling pathway that results in the up-regulation of the TH gene. R482X, the human mutation inducing the C-terminus domain deletion of beta4 and responsible for a form of juvenile myoclonic epilepsy prevents beta4 nuclear localization. In fact, the mutant beta1-481 unable to associate with B56delta/PP2A and to migrate to the nucleus does not interact with HP1gamma and histones. The signaling pathway allowing gene regulation by beta4 is prevented by the mutant. Thus, beta4 does not play a confined role in the cytoplasm as CCVD auxiliary subunit but also functions in the nucleus as a gene expression regulator., Les canaux calciques dépendants du voltage (CCVD) sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la libération de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou encore la régulation de l'expression génique. Les CCVD sont constitués d'une sous-unité canalaire (alpha1 ou Cav) par laquelle les ions Ca2+ entrent dans le milieu intracellulaire, associée à différentes sous-unités auxiliaires, alpha2delta, beta et gammaqui régulent leur fonction. Ma thèse a contribué à la mise en évidence d'une nouvelle voie de régulation du couplage excitation-transcription impliquant la sous-unité beta4 des CCVD. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à la compréhension des déterminants de l'entrée de beta4 dans le noyau et aux mécanismes de régulation de l'expression génique par cette sous-unité des CCVD. Un modèle animal nous a été particulièrement utile, la souris léthargique (lh), déficiente pour la sous-unité beta4 et considérée comme un modèle d'étude de l'épilepsie-absences. Une translocation de beta4 du cytoplasme vers le noyau est observée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l'intégrité structurale de beta4 et plus précisément de l'interaction de ses domaines SH3 (Src Homology 3) et GK (Guanylate Kinase). La translocation de beta4 au noyau nécessite son association avec un partenaire : la sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 2A (PP2A), B56delta. La dépolarisation membranaire permet un décrochage de beta4 du canal et son association à B56delta. beta4 migre donc vers le noyau sous forme de complexe avec B56delta/PP2A. Une étude transcriptomique réalisée pour comparer le profil d'expression dans le cervelet de souris lh par rapport aux souris wild-type a montré l'implication de beta4 dans la répression et l'activation d'un certain nombre de gènes. Particulièrement beta4 réprime fortement l'expression du gène qui code pour la tyrosine hydroxylase (TH). Dans le noyau, beta4 interagit avec un facteur de transcription, le récepteur aux hormones thyroïdiennes alpha(TRalpha). Cette association permet au complexe beta4/B56delta/PP2A de cibler la région promotrice du gène TH comme cela a été montré par des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le complexe beta4/B56delta/PP2A est capable de s'associer aux histones et de déphosphoryler spécifiquement les histones H3 en Ser10 au niveau de la région promotrice du gène TH. Cette modification de la chromatine est corrélée avec le recrutement de Heterochromatin Protein 1 gamma (HP1gamma au niveau du promoteur du gène TH. HP1gamma est impliquée dans la formation d'hétérochromatine et pourrait expliquer la répression de l'expression du gène TH. Ainsi dans le cervelet de souris lh, l'absence de beta4 déclenche un dérèglement de cette voie de signalisation qui entraîne la sur-expression du géne TH. La mutation humaine R482X à l'origine de la délétion d'une partie du domaine C-terminal de beta4 et responsable d'une forme d'épilepsie juvénile myoclonique, perturbe la localisation nucléaire de beta4. En effet, le mutant beta1-481 incapable de s'associer à B56delta/PP2A et de migrer au noyau n'interagit pas avec les histones. La voie de signalisation permettant la régulation de l'expression génique par beta4 n'est donc plus assurée par le mutant. Ainsi, la fonction debeta4 ne se limite pas à son action cytoplasmique en tant que sous-unité auxiliaire des CCVD. En effet, ce travail montre combien dans le noyau,beta4, joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique.

Voltage dependent calcium channels (VDCC) participate to various cellular processes such as neurotransmitters release, muscular contraction or gene expression regulation. VDCC are composed of a pore-forming subunit (alpha1 or Cav), that allows Ca2+ to enter the cells associated with auxiliary subunits, alpha2delta, beta and gamma. My thesis studies on a new signaling pathway in which the beta4 subunit of VDCC couples neuronal excitability to transcription. In particular it focuses on the understanding of the beta4 nuclear translocation determinants and the mechanisms of gene expression regulation by this VDCC subunit. beta4 translocation from the cytoplasm to the nucleus is observed during neuronal differentiation. This translocation depends on beta4 structural integrity and more precisely on interaction between the beta4 SH3 (Src Homology 3) and GK (Guanylate Kinase) domains. beta4 nuclear translocation is conditioned by its association with a partner: the regulatory subunit of phosphatase protein 2A (PP2A), B56delta. Membrane depolarization induces beta4 channel uncoupling and association with B56delta. Thus, beta4 migrates to the nucleus in complex with B56delta/PP2A. A study on gene expression generated by microarray was carried on to compare profiles of gene expression in lethargic (lh) mice, considered as spontaneous beta4 KO with wild-type (WT) mice cerebellum. This study proved the influence ofbeta4 on the repression and the activation of certain genes. Particularly, beta4 strongly represses tyrosine hydroxylase (TH) gene expression. In the nucleus, beta4 interacts with a transcription factor: the thyroid hormone receptor alpha (TR alpha). This association allows beta4/B56delta/PP2A complex to target the TH gene promoter as shown by chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments. This complex is also able to associate itself with histones and dephosphorylate Ser10 histone H3 in the TH gene promoter. This chromatin modification is correlated with HP1 gamma (Heterochromatin Protein 1 gamma) recruitment in the TH gene promoter. HP1 gamma is known to promote heterochromatin formation that could explain the TH gene repression by beta4. Thus, in lh mice cerebellum, the absence of beta4 triggers a complete disorganization of this signaling pathway that results in the up-regulation of the TH gene. R482X, the human mutation inducing the C-terminus domain deletion of beta4 and responsible for a form of juvenile myoclonic epilepsy prevents beta4 nuclear localization. In fact, the mutant beta1-481 unable to associate with B56delta/PP2A and to migrate to the nucleus does not interact with HP1gamma and histones. The signaling pathway allowing gene regulation by beta4 is prevented by the mutant. Thus, beta4 does not play a confined role in the cytoplasm as CCVD auxiliary subunit but also functions in the nucleus as a gene expression regulator., Les canaux calciques dépendants du voltage (CCVD) sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la libération de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou encore la régulation de l'expression génique. Les CCVD sont constitués d'une sous-unité canalaire (alpha1 ou Cav) par laquelle les ions Ca2+ entrent dans le milieu intracellulaire, associée à différentes sous-unités auxiliaires, alpha2delta, beta et gammaqui régulent leur fonction. Ma thèse a contribué à la mise en évidence d'une nouvelle voie de régulation du couplage excitation-transcription impliquant la sous-unité beta4 des CCVD. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à la compréhension des déterminants de l'entrée de beta4 dans le noyau et aux mécanismes de régulation de l'expression génique par cette sous-unité des CCVD. Un modèle animal nous a été particulièrement utile, la souris léthargique (lh), déficiente pour la sous-unité beta4 et considérée comme un modèle d'étude de l'épilepsie-absences. Une translocation de beta4 du cytoplasme vers le noyau est observée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l'intégrité structurale de beta4 et plus précisément de l'interaction de ses domaines SH3 (Src Homology 3) et GK (Guanylate Kinase). La translocation de beta4 au noyau nécessite son association avec un partenaire : la sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 2A (PP2A), B56delta. La dépolarisation membranaire permet un décrochage de beta4 du canal et son association à B56delta. beta4 migre donc vers le noyau sous forme de complexe avec B56delta/PP2A. Une étude transcriptomique réalisée pour comparer le profil d'expression dans le cervelet de souris lh par rapport aux souris wild-type a montré l'implication de beta4 dans la répression et l'activation d'un certain nombre de gènes. Particulièrement beta4 réprime fortement l'expression du gène qui code pour la tyrosine hydroxylase (TH). Dans le noyau, beta4 interagit avec un facteur de transcription, le récepteur aux hormones thyroïdiennes alpha(TRalpha). Cette association permet au complexe beta4/B56delta/PP2A de cibler la région promotrice du gène TH comme cela a été montré par des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le complexe beta4/B56delta/PP2A est capable de s'associer aux histones et de déphosphoryler spécifiquement les histones H3 en Ser10 au niveau de la région promotrice du gène TH. Cette modification de la chromatine est corrélée avec le recrutement de Heterochromatin Protein 1 gamma (HP1gamma au niveau du promoteur du gène TH. HP1gamma est impliquée dans la formation d'hétérochromatine et pourrait expliquer la répression de l'expression du gène TH. Ainsi dans le cervelet de souris lh, l'absence de beta4 déclenche un dérèglement de cette voie de signalisation qui entraîne la sur-expression du géne TH. La mutation humaine R482X à l'origine de la délétion d'une partie du domaine C-terminal de beta4 et responsable d'une forme d'épilepsie juvénile myoclonique, perturbe la localisation nucléaire de beta4. En effet, le mutant beta1-481 incapable de s'associer à B56delta/PP2A et de migrer au noyau n'interagit pas avec les histones. La voie de signalisation permettant la régulation de l'expression génique par beta4 n'est donc plus assurée par le mutant. Ainsi, la fonction debeta4 ne se limite pas à son action cytoplasmique en tant que sous-unité auxiliaire des CCVD. En effet, ce travail montre combien dans le noyau,beta4, joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique.

International audience; Key pointsMiRNAs are small noncoding RNA ensuring post-transcriptional regulation of gene expression. Their expression is tissue-specific and some miRNAs have diagnostic and/or prognostic interest for tumor classes. MiRNAs are involved in tumoral process in quantitative (amplification, deletion of chromosomal regions) or qualitative terms (mutation in the miRNA or in the corresponding site of interaction in the mRNA). Overexpression of three miRNAs (miR-146b, miR-221 and miR-222) correlates with the development of papillary thyroid tumors. Polymorphisms in the c-kit gene or in that encoding miR-146a are susceptibility factors for the development of papillary thyroid tumors. Points essentiels Les micro-ARNs (miRNAs) sont des petits ARN non codant assurant la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique. Leur expression est tissu-spécifique et certains miRNAs ont une valeur diagnostique et/ou pronostique de classes tumorales. Les miRNAs sont impliqués dans les processus tumoraux par deux mécanismes: amplification ou délétion de régions chromosomiques renfermant des clusters de gènes codant des miRNAs (effet quantitatif) ou modification des effets des miRNAs sur leur gènes cibles par mutation dans le site d’interaction avec les ARNm (effet qualitatif). La surexpression de trois miRNAs (miR-146b, miR-221et miR-222) est corrélée au développement des tumeurs papillaires de la thyroïde. Des polymorphismes dans le gène c-Kit ou dans celui codant pour miR-146a sont des facteurs de susceptibilité au développement des tumeurs papillaires de la thyroïde.

Background Despite the known importance of somatic cells for oocyte developmental competence acquisition, the overall mechanisms underlying the acquisition of full developmental competence are far from being understood, especially in non-mammalian species. The present work aimed at identifying key molecular signals from somatic origin that would be shared by vertebrates. Results Using a parallel transcriptomic analysis in 4 vertebrate species - a teleost fish, an amphibian, and two mammals - at similar key steps of developmental competence acquisition, we identified a large number of species-specific differentially expressed genes and a surprisingly high number of orthologous genes exhibiting similar expression profiles in the 3 tetrapods and in the 4 vertebrates. Among the evolutionary conserved players participating in developmental competence acquisition are genes involved in key processes such as cellular energy metabolism, cell-to-cell communications, and meiosis control. In addition, we report many novel molecular actors from somatic origin that have never been studied in the vertebrate ovary. Interestingly, a significant number of these new players actively participate in Drosophila oogenesis. Conclusions Our study provides a comprehensive overview of evolutionary-conserved mechanisms from somatic origin participating in oocyte developmental competence acquisition in 4 vertebrates. Together our results indicate that despite major differences in ovarian follicular structure, some of the key players from somatic origin involved in oocyte developmental competence acquisition would be shared, not only by vertebrates, but also by metazoans. The conservation of these mechanisms during vertebrate evolution further emphasizes the important contribution of the somatic compartment to oocyte quality and paves the way for future investigations aiming at better understanding what makes a good egg.

Background: MicroRNAs (miRNAs), small RNA molecules of approximately 22 nucleotides, have been shown to be up- or downregulated in specific cell types and disease states. These molecules have become recognized as one of the major regulatory gatekeepers of coding genes in the human genome. Content: We review the structure, nomenclature, mechanism of action, technologies used for miRNA detection, and associations of miRNAs with human cancer. miRNAs are produced in a tissue-specific manner, and changes in miRNA within a tissue type can be correlated with disease status. miRNAs appear to regulate mRNA translation and degradation via mechanisms that are dependent on the degree of complementarity between the miRNA and mRNA molecules. miRNAs can be detected via several methods, such as microarrays, bead-based arrays, and quantitative real-time PCR. The tissue concentrations of specific miRNAs have been associated with tumor invasiveness, metastatic potential, and other clinical characteristics for several types of cancers, including chronic lymphocytic leukemia, and breast, colorectal, hepatic, lung, pancreatic, and prostate cancers. Summary: By targeting and controlling the expression of mRNA, miRNAs can control highly complex signal-transduction pathways and other biological pathways. The biologic roles of miRNAs in cancer suggest a correlation with prognosis and therapeutic outcome. Further investigation of these roles may lead to new approaches for the categorization, diagnosis, and treatment of human cancers.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

We have been dealing with different projects using a physical method of in vivo gene transfer,called electrotransfer, widely used in mouse muscle and skin with high gene expression.By in vivo optical imaging, we have been working on optimization of electrotransfer. We havedeveloped an artificial regulation system to in vivo control an exogenous gene expression based onthe antisense technology using muscular electrotransfer in mouse. We have worked on molecularoptimization of DNA electrotransfer for genetic immunization for botulinum antigen screening.This kind of DNA immunization has been used to induce antibodies production in mouse andrabbit. We have been studying the methylation status and the reasons for persistence of plasmidDNA in muscle cells after electrotransfer since intramuscularly injected and electrotransferredplasmid DNA leads to a persisting expression for more than a year.; L'électrotransfert est une technique de transfert de gène in vivo, permettant une expressionélevée du transgène dans un grand nombre de tissus. Dans ce contexte, nous avons utilisé l'imagerieoptique pour optimiser différents protocoles d'électrotransfert dans le muscle et la peau.Nous avons développé un système de régulation de l'expression des gènes combinant le systèmede régulation répressible à la tétracycline Tet-Off et une stratégie antisens. Nous avons examinéle potentiel de l'électrotransfert d'ADN plasmidique pour l'obtention d'anticorps neutralisants àhaut titre contre les toxines botuliques A, B et E. Les animaux immunisés avec des plasmidescodant les fragments immunogènes des toxines expriment de façon endogène ces fragments detoxines, qui servent d'antigènes et déclenchent une réponse immune. Nous avons finalement étudiél'état de méthylation de l'ADN plasmidique après injection et électrotransfert dans le musclesquelettique et sa possible intégration dans le génome.

We have been dealing with different projects using a physical method of in vivo gene transfer,called electrotransfer, widely used in mouse muscle and skin with high gene expression.By in vivo optical imaging, we have been working on optimization of electrotransfer. We havedeveloped an artificial regulation system to in vivo control an exogenous gene expression based onthe antisense technology using muscular electrotransfer in mouse. We have worked on molecularoptimization of DNA electrotransfer for genetic immunization for botulinum antigen screening.This kind of DNA immunization has been used to induce antibodies production in mouse andrabbit. We have been studying the methylation status and the reasons for persistence of plasmidDNA in muscle cells after electrotransfer since intramuscularly injected and electrotransferredplasmid DNA leads to a persisting expression for more than a year., L'électrotransfert est une technique de transfert de gène in vivo, permettant une expressionélevée du transgène dans un grand nombre de tissus. Dans ce contexte, nous avons utilisé l'imagerieoptique pour optimiser différents protocoles d'électrotransfert dans le muscle et la peau.Nous avons développé un système de régulation de l'expression des gènes combinant le systèmede régulation répressible à la tétracycline Tet-Off et une stratégie antisens. Nous avons examinéle potentiel de l'électrotransfert d'ADN plasmidique pour l'obtention d'anticorps neutralisants àhaut titre contre les toxines botuliques A, B et E. Les animaux immunisés avec des plasmidescodant les fragments immunogènes des toxines expriment de façon endogène ces fragments detoxines, qui servent d'antigènes et déclenchent une réponse immune. Nous avons finalement étudiél'état de méthylation de l'ADN plasmidique après injection et électrotransfert dans le musclesquelettique et sa possible intégration dans le génome.

Chromatin is an important and dynamic participant in the regulation of transcription initiation and elongation. In the nucleosome (the basic sub-unit of chromatin), DNA is tightly wound around an octamer of histone proteins, thereby restricting access of the DNA-binding factors to the DNA. Moreover, the histone N-terminal tails are subject to several cova-lent post-translational modifications including phosphorylation, acetyla-tion, methylation and poly-ADP-ribosylation ; each of these modifications can potentially alter the interaction between DNA and the histone octamer and thus modulate transcription factor access to DNA. Chromatin is heterogeneous in the nucleus : small regions of the genome are extremely sensitive to digestion by nucleases (such as DNase I) and are called nuclease-hypersensitive sites. This increase in nuclease sensitivity is thought to result from the local disruption of the packaging of DNA into nucleosomes by DNA-bound regulatory proteins. DNase I-hypersen-sitive sites ("nucleo some-free regions") are found associated with regions of the genome that are important for the regulation of gene expression (such as enhancers, promoters, silencers, origins of replication). Moreover, changes in nuclease sensitivity secondary to the disrup¬ tion of specific nucleosomes have been observed during transcriptional activation or silencing. Consequently, understanding the mechanisms responsible for the positioning and for the disruption of specific nucleosomes is a crucial step in understanding the transcriptional regulation of the corresponding genes. Recent studies have identified a large group of proteins whose primary function is to help activate or repress transcrip¬ tion by altering chromatin. Retroviruses in general, and HIV (Human Immunodeficiency Virus) in particular, are confronted with a unique problem in terms of transcriptional regulation and packaging into chromatin. They can integrate in many different sites within the host cell genome, each site with its own properties susceptible of influencing the degree of viral expression. The focus of our laboratory is understanding HIV-1 transcription within its natural context, which is represented by the provirus integrated into the cellular genome and packaged into chromatin. We have previously stud¬ ied the chromatin structure of HIV-1 integrated into several chronically infected cell lines and identified five major DNase I-hypersensitive sites in the complete proviral genome. Three hypersensitive sites were identified in the HIV 5' LTR where transcription initiation takes place : two of these sites (HS2 and HS3 ) correspond to the viral promo ter ! enhancer region, and the third major site (HS4) corresponds to a new domain immediately downstream of the 5' LTR. A single major DNase I-hyper-sensitive site is associated with the LTR located at the 3' portion of the virus where transcripts are polyadenylated (HS8). In addition, we have identified a single major DNase I-hypersensitive site in the 8-kb region located between the two LTRs. This site (HS7) maps to the pol gene of HIV and corresponds to a new positive transcriptional regulatory element. We have defined the precise positions of nucleosomes in the 5' LTR of HIV-1 integrated in several chronically infected cell lines. We have observed that only one change occurs in this chromatin organization during transcriptional activation of the HIV-1 promoter : a single nucle-osome (called nuc-1 and positioned immediately after the transcription start site) is specifically disrupted ! displaced in response to several bio¬ logical modifiers including TNF (Tumor Necrosis Factor) and phorbol esters. The position of nuc-1 immediately after the transcription start site and its disruption during transcriptional activation suggest that nuc-1 might play a direct role in the suppression of HIV-1 transcription during latency and that transcriptional activation might proceed in part through chromatin modification(s). To directly test this model, we examined the effect of a chromatin modification (histone acetylation) on HIV-1 gene expression. Chromatin is an active component of transcriptional regulation and histone acetylation/deacetylation is critical in this modulating role. Acetylation of histones takes place on their amino-ter-minal tail and is the result of a dynamic equilibrium between histone acetyltransferases and histone deacetylases. Trapoxin (TPX) and Tri-chostatin A (TSA) are two specific inhibitors of histone deacetylase(s) and cause a global hyperacetylation of cellular histones. Treatment of cell lines latently infected with HIV-1 with these inhibitors causes the transcriptional activation of HIV gene expression. This activation occurs in the absence of NF-kB stimulation. Using RNA differential display to screen a large number of genes, we have shown that the expression of a small fraction of cellular genes (~2%o of all genes ) is changed in response to histone hyperacetylation, indicating that the activation of HIV-1 transcription in response to TSA or TPX demonstrates a speci¬ ficity and does not result from a global derepression of all cellular genes. Remarkably, despite the global histone hyperacetylation observed fol¬ lowing treatment with these drugs, we found that the sole detectable modification at the level of HIV chromatin was the disruption of nuc-1 in the HIV promoter. These results are consistent with a model in which the HIV promoter is under the constitutive negative control of one or several histone deacetylases, which are specifically targeted to nuc-1 by a direct or indirect interaction with a DNA-binding factor (s). The functional role of nuc-1 in latency and the mechanism of nuc-1 disruption in response to TNF or to histone hyperacetylation remain to be determined. A potential mechanism is that nuc-1 could block the bind¬ ing of a transcription factor necessary for the assembly of the initiation complex. Alternatively, nuc-1, by its position immediately after the tran¬ scription start site, could impede the progression of RNA polymerase II (by accentuating a natural pausing site), resulting in inefficient elonga¬ tion and in the accumulation of short attenuated transcripts detected in vivo. Since the viral trans -regulatory protein Tat binds to TAR in a region close to nuc-1 and since Tat activity is critical for transcriptional elongation through a region corresponding to nuc-1, our results point to a role for Tat or for a Tat co-factor in the disruption of nuc-1 through a post-translational modification such as acetylation. Overall, these studies provide fundamental new insights into the pro¬ cess of HIV-1 transcriptional latency and reactivation and ultimately should contribute to an increased understanding of AIDS pathogenesis. These aspects of HIV-1 biology might define novel targets for therapy aimed at interfering with HIV-1 replication by maintaining cells in the latent state. Additionally, since chromatin influences the transcriptional regulation of many genes besides HIV-1, the observations made in this system will bear relevance to the regulation of other genes whose expres¬ sion is altered in human diseases., Van Lint Carine. Le rôle de la structure chromatinienne dans la régulation transcriptionnelle de l'expression des gènes. In: Bulletin de la Classe des sciences, tome 10, n°7-12, 1999. pp. 303-338.

The adipose conversion of cultured preadipose cells involves the activation of numerous genes and is controlled by various adipogenic and mitogenic factors. The differentiation program can be divided into early and late events. Early events are triggered by growth arrest at the G1/S boundary and characterized by the activation of a set of genes (pOb24, lipoprotein lipase, etc.). The expression of the terminal differentiation-related genes takes place after a limited growth resumption of early markers containing cells and requires the presence of permissive hormones (growth hormone and triiodothyronine). Insulin acts solely as a modulator in the expression of the terminal differentiation-related genes. In vivo studies suggest that the acquisition of new adipocytes might result from terminal differentiation of dormant, already committed (pOb24 positive) cells when exposed to appropriate mitogenic or adipogenic stimuli.

The initial step in muscle formation is the fusion of undifferentiated myoblasts into multinucleated myotubes which synthesize the specific proteins of the muscle. During this transition a whole series of genes are turned on. A simple explanation for this activation process is that each gene contains a structure which is common to all genes of the family and which is recognized by (a) specific factor(s). Experimental evidence supporting this model is described. Appearance of a new protein may not involve gene activation but be the result of a new mode of splicing as in the case of tropomyosins. Examples have been chosen to illustrate the various strategies used to control gene expression and provide the necessary diversity required during the process of muscle maturation. They include controlled expression of linked genes, coexpression of genes from unrelated phenotypes or alternative splicing of unique genes.

For a number of years our group has been mainly interested in the regulation of muscle gene expression during myogenesis. Using primary cultures and cell lines we have tried to find out whether the coding sequences for muscle proteins are already present in an unexpressed form or if there is a transcriptional switch at the onset of differentiation. Metabolic studies on pulse-labelled RNA, together with translation and molecular hybridization experiments have given a certain number of indications. More recently the development of genetic engineering techniques has made it possible to answer these questions directly with probes which are complementary to specific muscle coding sequences. We have identified a plasmid which contains a coding sequence for muscle actin. Other recombinant plasmids are being characterized. Such plasmids, used as probes, will permit us to study the organization and expression of the genes coding for the contractile proteins in muscle cells.

Starvation, glucagon and cyclic AMP inhibit, and refeeding starved animals and insulin or IGF-I plus triiodothyronine stimulate accumulation of FAS and its mRNA in liver; transcription is the primary regulated step. In the uropygial gland, differentiation of basal cells into mature sebocytes is accompanied by the accumulation of large amounts of FAS and its mRNA. By analogy with liver, transcription is likely to be the regulated step, but direct experimental evidence for this hypothesis is lacking. FAS mRNA is a unique gene and is probably more than 100 kb in length. The FAS gene of goose and duck is transcribed into two mature mRNAs of about 10,800 and 12,200 nucleotides. The 3'-untranslated regions of the FAS mRNAs contain an unusual polypyrimidine tract which, at the mRNA level at least, appears unrelated to regulation of gene expression. Polypyrimidine tracts similar in sequence to that in the FAS gene are found in about 20 different parts of the genome. All of the fragments which contain these tracts are hypermethylated. The next stage of this investigation will involve identification of cis-acting sequence elements in the FAS gene which specify responses to diet, hormones and tissue-specific regulatory factors. Isolation and characterization of the 5'-ends of the cDNA and the gene are underway.