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Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common causes of cancer-related deaths worldwide, and its incidence is rising. HCC develops almost exclusively on the background of chronic liver inflammation, which can be caused by chronic alcohol consumption, viral hepatitis, or an unhealthy diet. HCC exhibits a deregulation of a multitude of pathways, including the PI3K/Akt pathway. Protein kinase B (Akt) exists in 3 isoforms: Akt1, Akt2 and Akt3, transcribed from three different genes and differing in their expression levels throughout the human body. While Akt3 is expressed mainly in the brain and the testes, Akt1 is expressed constitutively in the body and Akt2 is mainly expressed in insulin-sensitive tissues. Targeting Akt through chemical inhibitors has shown potent anti-cancer effect. However, chemical inhibitors fail to show a specificity over either of the isoforms, which converge and diverge in their designated roles in controlling various cellular processes. Thus, selective inhibition is needed to confer the role of each of Akt1 and Akt2 isoforms, in the context of HCC. RNA-interference (RNAi) is a highly specific strategy to target the expression of a gene at the transcriptional level and can be exploited to suppress the expression of a given gene using exogenous small interfering siRNAs (siRNAs). For that, we designed (siRNAs) targeting solely Akt1 or Akt2 isoform in humans and rodents, simultaneously. The specificity of the siRNAs was verified by confirming, in-vitro on human HepG2 cell line, the selective inhibition of the designated Akt1 or Akt2 expression, in addition to the absence of predicted off-target effects upon in-silico analysis. Furthermore, the efficiency of the designed siRNAs was demonstrated; following 6 hours of exposure to designed Akt1 and Akt2 siRNAs, the Akt1 expression and Akt2 expression remained decreased up to 5 and 7 days in HepG2 cells, respectively, and showed efficacy at low concentrations, starting 20pM. The possible inflammatory effect of the siRNAs was also assessed, and the results show that the designed siRNAs do not activate any of the Toll-like receptors. Next, we assessed the phenotypic aspect (cytotoxicity, metabolism and proliferation) of the knockdown of Akt1 and Akt2 or the simultaneous knockdown of both by the designed siRNAs whilst comparing to Sorafenib (a verified treatment of HCC) and ARQ092 (a chemical inhibitor of Akt) on 4 different liver cancer cell lines -PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B and HepG2 cell lines. The results show that targeting a single isoform of Akt – either Akt1 or Akt2 – or the simultaneous knockdown of both isoforms – Akt1 and Akt2 - by the designed siRNAs have no impact on the viability, metabolism or proliferation of the cells that is contradictory to the effect seen upon treatment with inhibitors Sorafenib or ARQ092. Furthermore, the vectorization of the designed siRNAs by the Amphiphilic Dendrimer (AD) and their consequent use to target Akt1 or Akt2 in an in-ovo HepG2 and MV4-11 cell-line graft model showed neither a toxic effect on chick embryos, nor an anti-tumorigenic effect when compared to the control. Altogether, the results show that the knockdown of a single isoform of Akt: Akt1 or Akt2 using the designed siRNAs, is not sufficient to mount an anti-cancer effect. Furthermore, the simultaneous knockdown of both isoforms using the specific siRNAs against Akt1 and Akt2 does not mimic the effect seen by chemical Akt inhibitors. These results suggest the presence of compensatory mechanisms in the case of the targeted single isoform knockdown, and that in addition to the potent global inhibition of Akt, ARQ092 may exert an off-target inhibition leading to its prominent anti-cancer activity., Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l'une des causes les plus courantes de décès liés au cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Le CHC se développe presque exclusivement sur des antécédents inflammatoires chroniques du foie, qui peuvent être causés par une consommation addictive d’alcool, une hépatite virale ou une mauvaise alimentation. Le CHC présente une dérégulation d'une multitude de voies, y compris la voie PI3K/AKT. La protéine kinase B (Akt) existe sous 3 isoformes : Akt1, Akt2 et Akt3, transcrites à partir de trois gènes différant par leurs niveaux d'expression dans le corps humain. Alors qu'AktT3 est exprimé principalement dans le cerveau et les testicules, Akt1 est exprimé de manière constitutive dans tout le corps et Akt2 est principalement exprimé dans les tissus sensibles à l'insuline. Le ciblage d'Akt par des inhibiteurs chimiques a montré un puissant effet anticancéreux. Cependant, ces composés ne présentent pas de spécificité pour les différents isoformes, qui convergent et divergent dans leurs rôles dans le contrôle de divers processus cellulaires. Ainsi, une inhibition sélective est nécessaire pour attribuer le rôle de chacune des isoformes Akt1 et Akt2, dans le contexte du CHC. L'ARN interférence (ARNi) est une stratégie hautement spécifique pour cibler l'expression d'un gène au niveau transcriptionnel. Il est possible de l’utiliser pour supprimer l'expression d'un gène donné en utilisant des siARN interférents courts et exogènes. Ainsi, nous avons conçu des siARN ciblant uniquement l'isoforme Akt1 ou Akt2 chez l'homme et le rongeur, simultanément. La spécificité des siARN a été vérifiée en confirmant, in-vitro, sur la lignée cellulaire HepG2 humaine, l'inhibition sélective de l'expression Akt1 ou Akt2, en plus de l'absence d'effets « off-target » prédits lors de l'analyse in-silico. De plus, l'efficacité des siARN a été observée dès 6 heures après l'exposition aux siARN Akt1 et Akt2 et est restée jusqu'à 5 et 7 jours dans les cellules HepG2. Les siRNA ont montré une efficacité à de faibles concentrations, à partir de 20pM, à la fois au niveau des ARNm et des protéines. L'effet inflammatoire des siARN a également été évalué et les résultats montrent que les siARN conçus n'activent aucun des récepteurs de type Toll-like (TLR). Ensuite, nous avons évalué l'aspect phénotypique (cytotoxicité, métabolisme et prolifération) de l'inactivation d'Akt1 et d'Akt2 ou de l'inactivation simultanée des deux par les siARN en comparaison avec le Sorafenib (un traitement de référence en cours du CHC) et à l'ARQ092 (un inhibiteur chimique d’Akt) sur 4 lignées cellulaires différentes de cancer du foie : PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B et HepG2. Les résultats montrent que le ciblage d'une seule isoforme d'Akt ou l'inactivation simultanée des deux isoformes par les siARN conçus n'a aucun impact sur la viabilité, le métabolisme ou la prolifération des cellules, ce qui est contradictoire avec l'effet observé lors d'un traitement avec les inhibiteurs Sorafenib ou ARQ092. De plus, la vectorisation des siARN par le dendrimère amphiphile (AD) et leur utilisation pour cibler Akt1 ou Akt2 dans un modèle de greffe de lignée cellulaire (HepG2 et MV4-11) in-ovo n'ont montré aucun effet toxique sur les embryons de poulet, ni d’effet antitumoral. Dans l'ensemble, les résultats montrent que l'inactivation d'une seule isoforme d'Akt n'est pas suffisante pour monter un effet antitumoral. De plus, l'inactivation simultanée des deux n'imite pas l'effet observé par les inhibiteurs chimiques d'Akt. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes compensatoires dans le cas de l'inactivation d'une seule isoforme d’Akt, et qu'en plus de la forte inhibition globale d'Akt, ARQ092 pourrait exercer une inhibition pléiotrope conduisant à son importante activité anticancéreuse.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common causes of cancer-related deaths worldwide, and its incidence is rising. HCC develops almost exclusively on the background of chronic liver inflammation, which can be caused by chronic alcohol consumption, viral hepatitis, or an unhealthy diet. HCC exhibits a deregulation of a multitude of pathways, including the PI3K/Akt pathway. Protein kinase B (Akt) exists in 3 isoforms: Akt1, Akt2 and Akt3, transcribed from three different genes and differing in their expression levels throughout the human body. While Akt3 is expressed mainly in the brain and the testes, Akt1 is expressed constitutively in the body and Akt2 is mainly expressed in insulin-sensitive tissues. Targeting Akt through chemical inhibitors has shown potent anti-cancer effect. However, chemical inhibitors fail to show a specificity over either of the isoforms, which converge and diverge in their designated roles in controlling various cellular processes. Thus, selective inhibition is needed to confer the role of each of Akt1 and Akt2 isoforms, in the context of HCC. RNA-interference (RNAi) is a highly specific strategy to target the expression of a gene at the transcriptional level and can be exploited to suppress the expression of a given gene using exogenous small interfering siRNAs (siRNAs). For that, we designed (siRNAs) targeting solely Akt1 or Akt2 isoform in humans and rodents, simultaneously. The specificity of the siRNAs was verified by confirming, in-vitro on human HepG2 cell line, the selective inhibition of the designated Akt1 or Akt2 expression, in addition to the absence of predicted off-target effects upon in-silico analysis. Furthermore, the efficiency of the designed siRNAs was demonstrated; following 6 hours of exposure to designed Akt1 and Akt2 siRNAs, the Akt1 expression and Akt2 expression remained decreased up to 5 and 7 days in HepG2 cells, respectively, and showed efficacy at low concentrations, starting 20pM. The possible inflammatory effect of the siRNAs was also assessed, and the results show that the designed siRNAs do not activate any of the Toll-like receptors. Next, we assessed the phenotypic aspect (cytotoxicity, metabolism and proliferation) of the knockdown of Akt1 and Akt2 or the simultaneous knockdown of both by the designed siRNAs whilst comparing to Sorafenib (a verified treatment of HCC) and ARQ092 (a chemical inhibitor of Akt) on 4 different liver cancer cell lines -PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B and HepG2 cell lines. The results show that targeting a single isoform of Akt – either Akt1 or Akt2 – or the simultaneous knockdown of both isoforms – Akt1 and Akt2 - by the designed siRNAs have no impact on the viability, metabolism or proliferation of the cells that is contradictory to the effect seen upon treatment with inhibitors Sorafenib or ARQ092. Furthermore, the vectorization of the designed siRNAs by the Amphiphilic Dendrimer (AD) and their consequent use to target Akt1 or Akt2 in an in-ovo HepG2 and MV4-11 cell-line graft model showed neither a toxic effect on chick embryos, nor an anti-tumorigenic effect when compared to the control. Altogether, the results show that the knockdown of a single isoform of Akt: Akt1 or Akt2 using the designed siRNAs, is not sufficient to mount an anti-cancer effect. Furthermore, the simultaneous knockdown of both isoforms using the specific siRNAs against Akt1 and Akt2 does not mimic the effect seen by chemical Akt inhibitors. These results suggest the presence of compensatory mechanisms in the case of the targeted single isoform knockdown, and that in addition to the potent global inhibition of Akt, ARQ092 may exert an off-target inhibition leading to its prominent anti-cancer activity., Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l'une des causes les plus courantes de décès liés au cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Le CHC se développe presque exclusivement sur des antécédents inflammatoires chroniques du foie, qui peuvent être causés par une consommation addictive d’alcool, une hépatite virale ou une mauvaise alimentation. Le CHC présente une dérégulation d'une multitude de voies, y compris la voie PI3K/AKT. La protéine kinase B (Akt) existe sous 3 isoformes : Akt1, Akt2 et Akt3, transcrites à partir de trois gènes différant par leurs niveaux d'expression dans le corps humain. Alors qu'AktT3 est exprimé principalement dans le cerveau et les testicules, Akt1 est exprimé de manière constitutive dans tout le corps et Akt2 est principalement exprimé dans les tissus sensibles à l'insuline. Le ciblage d'Akt par des inhibiteurs chimiques a montré un puissant effet anticancéreux. Cependant, ces composés ne présentent pas de spécificité pour les différents isoformes, qui convergent et divergent dans leurs rôles dans le contrôle de divers processus cellulaires. Ainsi, une inhibition sélective est nécessaire pour attribuer le rôle de chacune des isoformes Akt1 et Akt2, dans le contexte du CHC. L'ARN interférence (ARNi) est une stratégie hautement spécifique pour cibler l'expression d'un gène au niveau transcriptionnel. Il est possible de l’utiliser pour supprimer l'expression d'un gène donné en utilisant des siARN interférents courts et exogènes. Ainsi, nous avons conçu des siARN ciblant uniquement l'isoforme Akt1 ou Akt2 chez l'homme et le rongeur, simultanément. La spécificité des siARN a été vérifiée en confirmant, in-vitro, sur la lignée cellulaire HepG2 humaine, l'inhibition sélective de l'expression Akt1 ou Akt2, en plus de l'absence d'effets « off-target » prédits lors de l'analyse in-silico. De plus, l'efficacité des siARN a été observée dès 6 heures après l'exposition aux siARN Akt1 et Akt2 et est restée jusqu'à 5 et 7 jours dans les cellules HepG2. Les siRNA ont montré une efficacité à de faibles concentrations, à partir de 20pM, à la fois au niveau des ARNm et des protéines. L'effet inflammatoire des siARN a également été évalué et les résultats montrent que les siARN conçus n'activent aucun des récepteurs de type Toll-like (TLR). Ensuite, nous avons évalué l'aspect phénotypique (cytotoxicité, métabolisme et prolifération) de l'inactivation d'Akt1 et d'Akt2 ou de l'inactivation simultanée des deux par les siARN en comparaison avec le Sorafenib (un traitement de référence en cours du CHC) et à l'ARQ092 (un inhibiteur chimique d’Akt) sur 4 lignées cellulaires différentes de cancer du foie : PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B et HepG2. Les résultats montrent que le ciblage d'une seule isoforme d'Akt ou l'inactivation simultanée des deux isoformes par les siARN conçus n'a aucun impact sur la viabilité, le métabolisme ou la prolifération des cellules, ce qui est contradictoire avec l'effet observé lors d'un traitement avec les inhibiteurs Sorafenib ou ARQ092. De plus, la vectorisation des siARN par le dendrimère amphiphile (AD) et leur utilisation pour cibler Akt1 ou Akt2 dans un modèle de greffe de lignée cellulaire (HepG2 et MV4-11) in-ovo n'ont montré aucun effet toxique sur les embryons de poulet, ni d’effet antitumoral. Dans l'ensemble, les résultats montrent que l'inactivation d'une seule isoforme d'Akt n'est pas suffisante pour monter un effet antitumoral. De plus, l'inactivation simultanée des deux n'imite pas l'effet observé par les inhibiteurs chimiques d'Akt. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes compensatoires dans le cas de l'inactivation d'une seule isoforme d’Akt, et qu'en plus de la forte inhibition globale d'Akt, ARQ092 pourrait exercer une inhibition pléiotrope conduisant à son importante activité anticancéreuse.

Preserving the integrity of genetic material is crucial to ensure cell survival and prevent tumor development. RNA Interference (RNAi) plays an important role in this context. This conserved process is well known to mediate sequence-specific transcriptional gene silencing via the induction of heterochromatin formation in a large variety of species. Through the various protective roles that this chromatin state has on the genome integrity, RNAi contributes to the preservation genomic stability. In parallel, RNAi has been involved also more directly in the cell response to genomic DNA damage in a variety of eukaryotes. In this case, it would participate to DNA damage signalization or repair. However, this function and the molecular mechanisms underlying its involvement remain poorly characterized, eventhough the function appears to be conserved from yeast to human.In this study, we explored the molecular function of RNAi in maintaining genomic stability, using the yeast Schizosacharomyces pombe as a model. In this organism, the key function of RNAi in the formation of heterochromatin has been extensively studied. The mechanism of action relies on the effector RITS complex (RNA Induced-Transcriptional Silencing), which is loaded with Dcr1produced small RNAs. These small RNAs guide RITS to the target regions in order to recruit the factors ensuring the deposition and maintenance of repressive epigenetic marks associated witth the formation of heterochromatin. RNAi has also been involved in the resolution of collisions between the replication and transcription machineries, occurring at hard-to-replicate genomic regions, like at regions containing highly repeated DNA. According to the current model, RNAi favors transcription termination thereby favouring replication fork progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Our study first showed that RITS, and not just Dcr1, are involved in maintaining genomic stability in S. pombe. The combination of biochemical and microscopic approaches revealed physical connections between RITS and the DNA replication and repair processes. We studied in particular the implication of RNAi in the genomic stability of the rDNA region. Our data indicated that RNAi participates in the maintenance of the numerous rDNA units, thereby preventing major chromosomal rearrangements. This function requires RITS and Dcr1, but does not involve other factors essential for the formation of heterochromatin. Moreover, we identified that RNAi contributes to promote replication fork progression within a region close to the origin of replication of the ribosomal unit. The terminally-arrested replication forks constitute fragile structures which can cause genomic instability. In order to further explore this function of RNAi, we used a conditional and inducible fork barrier to block replication at a unique locus in the genome. A genetic assay based on this system, strongly suggest that RITS and Dcr1 manages the homologous recombination-dependent fork restart by acting specifically on the DNA resection step of this process. Altogether, our findings provide a better understanding of the RNAi molecular function in the cellular response to replicative stress. This aspect has been poorly explored by the current studies led in other eukaryotic models., Préserver l’intégrité du matériel génétique est crucial pour assurer la survie cellulaire et prévenir le développement tumoral. L’ARN à interférence (RNAi) joue un rôle important dans ce contexte. Il s’agit d’un processus conservé surtout connu pour sa fonction de silencing transcriptionnel visant à induire la formation d’hétérochromatine chez différentes espèces. Au vu des divers rôles protecteurs dans l’intégrité du génome que revêt cet état chromatinien, le RNAi concourt ainsi, par ce biais, à préserver la stabilité du génome. Le RNAi a également été impliqué plus directement dans la réponse au stress génotoxique chez une variété d’eucaryotes. Dans ce cas, il agirait dans la signalisation ou la réparation des dommages de l’ADN. Cependant, cette fonction et les mécanismes moléculaires, qui sous-tendent son implication, restent très peu caractérisés, bien que la fonction soit clairement conservée de la levure à l’Homme.Dans cette étude, nous avons exploré la fonction moléculaire du RNAi dans le maintien de la stabilité génomique, en utilisant la levure Schizosacharomyces pombe comme modèle d’étude. Dans cet organisme, la fonction clé du RNAi dans la formation d’hétérochromatine a été disséquée. Son mécanisme d’action se base sur le complexe effecteur RITS (RNA Induced-Transcriptional Silencing), qui se charge en petits ARN produits par Dcr1. Ces derniers permettent de guider RITS au niveau des régions cibles afin de recruter les facteurs assurant la déposition et la maintenance des marques épigénétiques répressives associées à la formation d’hétérochromatine. En parallele, le RNAi participerait également à la résolution des collisions entre les machineries de réplication et de transcription se produisant au niveau de régions difficiles à répliquer, comme les régions riches en séquences d’ADN répétées. Selon le modèle proposé, il favoriserait la terminaison de la transcription, ce qui permettrait à la fourche de réplication de poursuivre sa progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Notre étude a d’abord montré que RITS, et pas seulement Dcr1, sont impliqués dans le maintien de la stabilité génomique chez S. pombe. La combinaison d’approches biochimiques et d’analyses microscopiques a révélé des connexions physiques entre RITS et les processus de réplication et de réparation de l’ADN. Nous nous sommes particulièrement intéressés à la fonction du RNAi dans la stabilité des rDNA. Nos données ont indiqué que le RNAi participe au maintien des nombreuses unités de rDNA, prévenant ainsi des réarrangements chromosomiques majeurs. Cette fonction requière RITS et Dcr1, mais n’implique pas d’autres facteurs essentiels à la formation d’hétérochromatine RNAi-dépendante. D’autre part, nous avons mis en évidence que le RNAi contribue à favoriser la progression des fourches de réplication au niveau d’une région proche des origines de réplication de l’unité ribosomale. Les fourches arrêtées constituent des structures fragiles pouvant entraîner une instabilité génomique. Afin d’explorer plus en détail la fonction du RNAi dans leur prise en charge, nous avons utilisé un système permettant de bloquer localement et de façon inductible la progression d’une seule fourche de réplication dans le génome. L’essai génétique basé sur ce système suggère que RITS et Dcr1 favoriseraient le redémarrage via la recombinaison homologue au niveau de la fourche bloquée. Ils agiraient tout particulièrement sur l’étape de la résection initiant ce processus. Dans l’ensemble, ces travaux permettent une meilleure compréhension de la fonction moléculaire du RNAi dans la réponse cellulaire au stress réplicatif. Cet aspect a été assez peu exploré dans les études actuelles chez les autres espèces eucaryotes.

Free-living amoeba are organisms capable of changing from a vegetative form, the trophozoite, to a dormant form, the cyst, under stressful environmental conditions. The signalling pathways of this process remain poorly understood. RNA interference is a genetic tool that would allow to modulate the expression of genes in the amoeba model Acanthamoeba castellanii, as it has already been performed in previous studies. Modulation of theses genes expressions would allow the study of their function. The objective of this internship was to adapt a siRNA protocol using cellulose synthase as the target gene, for which it was shown that expression increases during the encystation process. Although the first step, internalization of siRNA in the cell, was observed, cellulose synthase expression was not downregulated. Several critical points related to this genetic tool remain to be optimized; Les amibes libres sont des organismes capables de passer d’une forme active, le trophozoïte, à une forme de dormance, le kyste, afin de résister à des conditions environnementales qui leurs seraient défavorables. Les voies de signalisation de ce processus restent peu connues. Un outil génétique, l’interférence à l’ARN, permettrait de moduler l’expression de gènes chez l’amibe modèle Acanthamoeba castellanii, comme cela a déjà été réalisé précédemment dans différentes études. La modulation de l’expression de ces gènes permettrait l’étude de leur fonction. L’objectif de ce stage était d’adapter un protocole de siRNA en utilisant comme gène cible, la cellulose synthase, pour lequel il a été montré que l’expression augmente pendant le processus d’enkystement. Bien que la première étape, l’internalisation de siRNA dans la cellule, a été constatée, l’expression de la cellulose synthase n’a pas pu être diminuée. Différents points critiques liés à cet outil génétique restent à optimiser.

Preserving the integrity of genetic material is crucial to ensure cell survival and prevent tumor development. RNA Interference (RNAi) plays an important role in this context. This conserved process is well known to mediate sequence-specific transcriptional gene silencing via the induction of heterochromatin formation in a large variety of species. Through the various protective roles that this chromatin state has on the genome integrity, RNAi contributes to the preservation genomic stability. In parallel, RNAi has been involved also more directly in the cell response to genomic DNA damage in a variety of eukaryotes. In this case, it would participate to DNA damage signalization or repair. However, this function and the molecular mechanisms underlying its involvement remain poorly characterized, eventhough the function appears to be conserved from yeast to human.In this study, we explored the molecular function of RNAi in maintaining genomic stability, using the yeast Schizosacharomyces pombe as a model. In this organism, the key function of RNAi in the formation of heterochromatin has been extensively studied. The mechanism of action relies on the effector RITS complex (RNA Induced-Transcriptional Silencing), which is loaded with Dcr1produced small RNAs. These small RNAs guide RITS to the target regions in order to recruit the factors ensuring the deposition and maintenance of repressive epigenetic marks associated witth the formation of heterochromatin. RNAi has also been involved in the resolution of collisions between the replication and transcription machineries, occurring at hard-to-replicate genomic regions, like at regions containing highly repeated DNA. According to the current model, RNAi favors transcription termination thereby favouring replication fork progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Our study first showed that RITS, and not just Dcr1, are involved in maintaining genomic stability in S. pombe. The combination of biochemical and microscopic approaches revealed physical connections between RITS and the DNA replication and repair processes. We studied in particular the implication of RNAi in the genomic stability of the rDNA region. Our data indicated that RNAi participates in the maintenance of the numerous rDNA units, thereby preventing major chromosomal rearrangements. This function requires RITS and Dcr1, but does not involve other factors essential for the formation of heterochromatin. Moreover, we identified that RNAi contributes to promote replication fork progression within a region close to the origin of replication of the ribosomal unit. The terminally-arrested replication forks constitute fragile structures which can cause genomic instability. In order to further explore this function of RNAi, we used a conditional and inducible fork barrier to block replication at a unique locus in the genome. A genetic assay based on this system, strongly suggest that RITS and Dcr1 manages the homologous recombination-dependent fork restart by acting specifically on the DNA resection step of this process. Altogether, our findings provide a better understanding of the RNAi molecular function in the cellular response to replicative stress. This aspect has been poorly explored by the current studies led in other eukaryotic models., Préserver l’intégrité du matériel génétique est crucial pour assurer la survie cellulaire et prévenir le développement tumoral. L’ARN à interférence (RNAi) joue un rôle important dans ce contexte. Il s’agit d’un processus conservé surtout connu pour sa fonction de silencing transcriptionnel visant à induire la formation d’hétérochromatine chez différentes espèces. Au vu des divers rôles protecteurs dans l’intégrité du génome que revêt cet état chromatinien, le RNAi concourt ainsi, par ce biais, à préserver la stabilité du génome. Le RNAi a également été impliqué plus directement dans la réponse au stress génotoxique chez une variété d’eucaryotes. Dans ce cas, il agirait dans la signalisation ou la réparation des dommages de l’ADN. Cependant, cette fonction et les mécanismes moléculaires, qui sous-tendent son implication, restent très peu caractérisés, bien que la fonction soit clairement conservée de la levure à l’Homme.Dans cette étude, nous avons exploré la fonction moléculaire du RNAi dans le maintien de la stabilité génomique, en utilisant la levure Schizosacharomyces pombe comme modèle d’étude. Dans cet organisme, la fonction clé du RNAi dans la formation d’hétérochromatine a été disséquée. Son mécanisme d’action se base sur le complexe effecteur RITS (RNA Induced-Transcriptional Silencing), qui se charge en petits ARN produits par Dcr1. Ces derniers permettent de guider RITS au niveau des régions cibles afin de recruter les facteurs assurant la déposition et la maintenance des marques épigénétiques répressives associées à la formation d’hétérochromatine. En parallele, le RNAi participerait également à la résolution des collisions entre les machineries de réplication et de transcription se produisant au niveau de régions difficiles à répliquer, comme les régions riches en séquences d’ADN répétées. Selon le modèle proposé, il favoriserait la terminaison de la transcription, ce qui permettrait à la fourche de réplication de poursuivre sa progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Notre étude a d’abord montré que RITS, et pas seulement Dcr1, sont impliqués dans le maintien de la stabilité génomique chez S. pombe. La combinaison d’approches biochimiques et d’analyses microscopiques a révélé des connexions physiques entre RITS et les processus de réplication et de réparation de l’ADN. Nous nous sommes particulièrement intéressés à la fonction du RNAi dans la stabilité des rDNA. Nos données ont indiqué que le RNAi participe au maintien des nombreuses unités de rDNA, prévenant ainsi des réarrangements chromosomiques majeurs. Cette fonction requière RITS et Dcr1, mais n’implique pas d’autres facteurs essentiels à la formation d’hétérochromatine RNAi-dépendante. D’autre part, nous avons mis en évidence que le RNAi contribue à favoriser la progression des fourches de réplication au niveau d’une région proche des origines de réplication de l’unité ribosomale. Les fourches arrêtées constituent des structures fragiles pouvant entraîner une instabilité génomique. Afin d’explorer plus en détail la fonction du RNAi dans leur prise en charge, nous avons utilisé un système permettant de bloquer localement et de façon inductible la progression d’une seule fourche de réplication dans le génome. L’essai génétique basé sur ce système suggère que RITS et Dcr1 favoriseraient le redémarrage via la recombinaison homologue au niveau de la fourche bloquée. Ils agiraient tout particulièrement sur l’étape de la résection initiant ce processus. Dans l’ensemble, ces travaux permettent une meilleure compréhension de la fonction moléculaire du RNAi dans la réponse cellulaire au stress réplicatif. Cet aspect a été assez peu exploré dans les études actuelles chez les autres espèces eucaryotes.

Every organism is constantly under attack by pathogens whose genetic material is perceived as foreign by the cell. In order to protect themselves from these potential dangers, various inhibitory mechanisms have been put in place during evolution in the different kingdoms of life. RNA interference and the interferon response both belong to these mechanisms. Viruses are obligate intracellular parasites and are one of the major sources of foreign genetic material that produce the main form of nucleic acid recognized by RNA interference and the IFN response : double-stranded RNA.The goal of my project is to identify and characterize the different factors that may be involved in the cellular response to double-stranded RNA in mammalian somatic cells., Tous les organismes sont en permanence soumis à des attaques par des agents pathogènes dont le matériel génétique est perçu comme étranger par la cellule. Pour se protéger de ces dangers potentiels, différents mécanismes inhibiteurs permettant de percevoir et d’agir directement sur cette information génétique exogène ont été mis en place au cours de l’évolution dans les différents règnes du vivant. L’interférence par ARN et la réponse interféron appartiennent toutes deux à ces mécanismes de défense. Les virus, parasites intracellulaires obligatoires, sont l’une des sources majeures de matériel génétique étranger et produisent la principale forme d’acide nucléique reconnue par l’interférence par ARN et la réponse interféron : l’ARN double brin. Mon projet a pour vocation l’identification et à la caractérisation des différents facteurs pouvant être impliqués dans la réponse cellulaire à l’ARN double brin dans des cellules somatiques de mammifères.

PDVs are DNA viruses associated with tens of thousands of parasitoid hymenopteran species. They are divided into two taxa, the Bracoviruses (BVs) and the Ichnoviruses (IVs) associated respectively with the subfamilies of Braconidae and Ichneumonidae. PDVs are produced in a specialized tissue of the genital tract (calyx) of the female parasitoid. They are then injected during oviposition in a host caterpillar, altering its physiological functions and ensuring a favorable environment for the development of parasitoid offspring. The PDV genome is integrated into the genome of the wasps and consists of two functional components: firstly, sequences involved in virulence in the host that are the only ones to be packaged, and secondly regions with clusters of genes that are responsible for the production of viral particles. These clustered genes display viral gene characteristics and are specifically expressed in the replicative tissue, the calyx. They derive from the viral ancestor of current IVs, but show no sequence homology with known viral genes; as a result, the nature of the ancestral virus and the function of the genes that derivee from it remain unknown.Regions bearing these gene clusters have been named "Ichnovirus Structural Protein Encoding Re-gions (IVSPERs)". This thesis is part of a fundamental approach aimed at studying the function of IVSPERs genes in order to confirm their involvement in the production of IV particles and to verify whether they have retained or not a function similar to that of their viral ancestor. The model stud-ied was that of the Ichnovirus associated with the parasitoid wasp Hyposoter didymator (HdIV).To answer the question of IVSPERs gene function during HdIV production, we used RNA interference technology (RNAi) coupled with electron microscopy approaches. Our work has allowed us to identify IVSPER genes involved in different key steps of the IV replication cycle. On the one hand, we have highlighted at least 6 structural proteins involved in the assembly and trafficking of viral particles in calyx cells. On the other hand, we have identified a set of IVSPER genes that affect transcription levels of other viral genes and that could possibly be involved in the IVs replicative machinery.All the results obtained during this thesis made it possible to show the efficiency of the RNAi tech-nique to study the function of the viral genes associated with parasitoid wasps. On the other hand, the results presented here constitute the first functional validation of genes involved in the morphogenesis of IVs, highlighting that these proteins have functions similar to those of "classical" viral proteins, attesting to the more than likely viral origin of the genes contained in IVSPERs.; Les PDVs sont des virus à ADN associés à des dizaines de milliers d'espèces d'hyménoptères parasitoïdes. Ils sont divisés en deux taxa, les Bracovirus (BVs) et les Ichnovirus (IVs) associés respectivement aux sous-familles des Braconidae et Ichneumonidae. Les PDVs sont produits dans un tissu spécialisé du tractus génital (le calyx) de la femelle parasitoïde. Ils sont ensuite injectés lors de la ponte dans une chenille hôte, altérant les fonctions physiologiques et assurant un environnement favorable au développement de la progéniture du parasitoïde. Le génome des PDVs est intégré au génome des guêpes et est constitué de deux composants fonctionnels, avec d'une part des séquences impliquées dans la virulence chez l'hôte qui sont les seules à être encapsidées, et d'autre part des régions portant des clusters de gènes responsables de la production des particules virales. Ces gènes organisés en clusters arborent des caractéristiques de gènes viraux et sont exprimés spécifiquement dans le tissu réplicatif, le calyx. Ils dérivent de l’ancêtre viral des IVs actuels, mais ne présentent aucune homologie de séquence avec des gènes viraux connus ; en conséquence, la nature du virus ancêtre et la fonction des gènes qui en proviennent restent inconnues.Les régions portant ces groupes de gènes ont été nommées "Ichnovirus Structural Protein Encoding Regions (IVSPERs)". Cette thèse s'inscrit dans une démarche fondamentale visant à étudier la fonction des gènes IVSPERs afin de confirmer leur implication dans la production des particules virales d’IVs et de vérifier s’ils ont conservé ou non une fonction similaire à celle de leur ancêtre viral. Le modèle étudié a été celui de l'Ichnovirus associé à la guêpe parasitoïde Hyposoter didymator (HdIV).Pour répondre à la question de la fonction des gènes IVSPERs au cours de la production de HdIV, nous avons eu recours à la technologie de l'ARN interférence (ARNi) couplée à des approches de microscopie électronique. Nos travaux nous ont ainsi permis d’identifier des gènes IVSPERs impliqués dans différentes étapes clés du cycle de réplication des IVs. D’une part, nous avons mis en lumière au moins 6 protéines structurales intervenant dans l'assemblage et le trafic des particules virales dans les cellules du calyx. D’autre part, nous avons identifié un set de gènes IVSPERs qui jouent sur les niveaux de transcription des autres gènes viraux et qui pourraient vraisemblablement être impliqués dans la machinerie réplicative des IVs.L’ensemble des résultats obtenus ont permis de montrer l'efficacité de la technique de l'ARNi dans le but d'étudier la fonction des gènes viraux associés à ces guêpes parasitoïdes. D'autre part, les résultats présentés dans cette thèse constitue la première validation fonctionnelle de gènes impliqués dans la morphogénèse des IVs, mettant en évidence que ces protéines ont des fonctions similaires à celles de protéines virales "classiques", attestant de l'origine virale plus que probable des gènes contenus dans les clusters IVSPERs.

Transposable elements (TEs) are genomic parasites that are found in all genomes, a part of which display structure similarity to some viruses. In insect ovarian cells, TE transcript abundance is controlled by RNA interference (RNAi) machinery and more particularly by the piRNA pathway (Piwi-interacting RNA). Another RNAi pathway, named siRNA pathway (Small interfering RNA), is one of the key insect immune responses against viral infections and is also dedicated to TE somatic control. These two interfering RNA pathways are led by distinct molecular effectors and described as independent. However, similarities in structure and control mechanisms across TEs and viruses suggest that an interplay may exist. We used Drosophila as a model, and infected the organism with Sindbis virus (SINV), an arbovirus (Arthropod-Borne virus), or Sigma virus (SV), a Drosophila-specific virus. Using high-throughput sequencing, we characterized the RNA and small-RNA repertoires produced by Drosophila flies from carcass or ovary tissues. Overall, our results demonstrate an impact of viral infection on TE transcript amounts via modulation of the piRNA and siRNA repertoires and represent the first demonstration of the effects of viral infection on TE activity. More precisely, SINV infection promotes a global decrease of TE transcript levels while SV infection reactivates many TEs. Our data suggest that the modulation results from shared RNA substrates and common trans-regulators of the small RNA pathways. These results open new avenue of research in genomics, suggesting that viral epidemics or chronic infections can impact TE activity and thus the rate of subsequent genetic diversification; Les éléments transposables (ET) sont des parasites génomiques présents dans tous les génomes, dont une partie présente une structure similaire à celle de certains virus. Dans les cellules ovariennes d'insecte, l'abondance des transcrits d’ET est contrôlée par ARN interférence (ARNi), et plus particulièrement par la voie piARN (Piwi-interacting RNA). Une autre voie d'ARNi, la voie siARN (Small interfering RNA), constitue l'une des principales réponses immunitaires des insectes contre les infections virales, et est aussi dédiée au contrôle somatique des ET. Ces deux voies d'ARNi sont dirigées par des effecteurs moléculaires distincts et décrites comme indépendantes. Cependant, des similitudes structurales et de mécanisme de contrôle entre les ET et les virus suggèrent la possibilité d’une interaction. Nous avons utilisé la drosophile comme modèle et infecté l'organisme avec le virus Sindbis (SINV), un arbovirus (Arthropod-Borne virus), ou le virus Sigma (SV), un virus spécifique de drosophile. À l'aide d'un séquençage à haut débit, nous avons caractérisé les répertoires d'ARN et de petits ARN interférents produits par les drosophiles infectées, à partir des tissus de carcasses ou d'ovaires. Globalement, nos résultats démontrent un impact de l'infection virale sur les quantités de transcrits d’ET via la modulation des répertoires piARN et siARN, et représentent la première démonstration des effets d’infections virales sur l’activité des ET. Plus précisément, l’infection par SINV favorise une diminution globale des quantités de transcrits d’ET alors que l’infection par SV réactive de nombreux ET. Nos données suggèrent que la modulation résulte de substrats d'ARN partagés et de trans-régulateurs communs des voies de l'ARNi. Ces résultats ouvrent un nouvel axe de recherche en génomique, suggérant que les épidémies virales ou les infections chroniques peuvent avoir un impact sur l'activité des ET, et donc sur le taux de diversification génétique ultérieure

Transposable elements (TEs) are genomic parasites that are found in all genomes, a part of which display structure similarity to some viruses. In insect ovarian cells, TE transcript abundance is controlled by RNA interference (RNAi) machinery and more particularly by the piRNA pathway (Piwi-interacting RNA). Another RNAi pathway, named siRNA pathway (Small interfering RNA), is one of the key insect immune responses against viral infections and is also dedicated to TE somatic control. These two interfering RNA pathways are led by distinct molecular effectors and described as independent. However, similarities in structure and control mechanisms across TEs and viruses suggest that an interplay may exist. We used Drosophila as a model, and infected the organism with Sindbis virus (SINV), an arbovirus (Arthropod-Borne virus), or Sigma virus (SV), a Drosophila-specific virus. Using high-throughput sequencing, we characterized the RNA and small-RNA repertoires produced by Drosophila flies from carcass or ovary tissues. Overall, our results demonstrate an impact of viral infection on TE transcript amounts via modulation of the piRNA and siRNA repertoires and represent the first demonstration of the effects of viral infection on TE activity. More precisely, SINV infection promotes a global decrease of TE transcript levels while SV infection reactivates many TEs. Our data suggest that the modulation results from shared RNA substrates and common trans-regulators of the small RNA pathways. These results open new avenue of research in genomics, suggesting that viral epidemics or chronic infections can impact TE activity and thus the rate of subsequent genetic diversification; Les éléments transposables (ET) sont des parasites génomiques présents dans tous les génomes, dont une partie présente une structure similaire à celle de certains virus. Dans les cellules ovariennes d'insecte, l'abondance des transcrits d’ET est contrôlée par ARN interférence (ARNi), et plus particulièrement par la voie piARN (Piwi-interacting RNA). Une autre voie d'ARNi, la voie siARN (Small interfering RNA), constitue l'une des principales réponses immunitaires des insectes contre les infections virales, et est aussi dédiée au contrôle somatique des ET. Ces deux voies d'ARNi sont dirigées par des effecteurs moléculaires distincts et décrites comme indépendantes. Cependant, des similitudes structurales et de mécanisme de contrôle entre les ET et les virus suggèrent la possibilité d’une interaction. Nous avons utilisé la drosophile comme modèle et infecté l'organisme avec le virus Sindbis (SINV), un arbovirus (Arthropod-Borne virus), ou le virus Sigma (SV), un virus spécifique de drosophile. À l'aide d'un séquençage à haut débit, nous avons caractérisé les répertoires d'ARN et de petits ARN interférents produits par les drosophiles infectées, à partir des tissus de carcasses ou d'ovaires. Globalement, nos résultats démontrent un impact de l'infection virale sur les quantités de transcrits d’ET via la modulation des répertoires piARN et siARN, et représentent la première démonstration des effets d’infections virales sur l’activité des ET. Plus précisément, l’infection par SINV favorise une diminution globale des quantités de transcrits d’ET alors que l’infection par SV réactive de nombreux ET. Nos données suggèrent que la modulation résulte de substrats d'ARN partagés et de trans-régulateurs communs des voies de l'ARNi. Ces résultats ouvrent un nouvel axe de recherche en génomique, suggérant que les épidémies virales ou les infections chroniques peuvent avoir un impact sur l'activité des ET, et donc sur le taux de diversification génétique ultérieure

In recent years, the discovery of small non-coding RNAs has opened an all new field in molecular biology. Indeed, these non-coding sequences give rise to powerful regulators of gene expression. Nowadays, different types of small non-coding RNAs have been described. Of these, the best-characterized types are microRNAs, piRNAs (Piwi-interacting RNAs) and siRNAs (small interfering RNAs). Because of their fine-tuning important function in the regulation of gene and genome expression, an aberrant expression level of those small non-coding RNAs are associated to several pathologies. While this new research field is attracting attention, many aspects to be discovered. This review focuses on the biogenesis pathways of microRNAs, piRNAs and siRNAs in animals.

Poleroviruses infect a wide range of economically important plants. They are transmitted in a circulative and non-propagative mode by an insect vector, the aphid. The virus particles are acquired by aphids when ingesting the sap from an infected plant and cross successively the epithelia of the midgut and the salivary gland cells by a transcytosis mechanism that relies on the presence of unknown receptors.The ephrin receptor (Eph) is a membrane protein which contains a domain able to bind in yeast to the structural proteins of poleroviruses. By developing methods based on RNA interference, we have shown that oral acquisition of double-stranded RNA targeting Eph in the aphid Myzus persicae can reproducibly reduce polerovirus internalization into the aphid's body. Such treated aphids transmit the virus to plants with a lower efficiency. Eph could therefore function as a receptor for poleroviruses in M. persicae., Les polérovirus infectent une large gamme de plantes d’intérêt économique. Ils sont transmis par un insecte vecteur, le puceron, selon le mode circulant non-multipliant. Le virus, acquis par le puceron lors de l’ingestion de sève sur une plante infectée, traverse l’épithélium des cellules intestinales puis celui des glandes salivaires par un mécanisme de transcytose impliquant des récepteurs encore inconnus. Le récepteur de l’éphrine (Eph) est une protéine membranaire dont un domaine est capable de se lier dans la levure aux protéines structurales des polérovirus. En développant des techniques basées sur l’ARN interférence, nous avons montré que l’acquisition orale d’ARN double brin ciblant Eph chez le puceron Myzus persicae permet de réduire de manière reproductible l’internalisation des polérovirus dans le corps du puceron. Les pucerons ainsi traités transmettent le virus avec une efficacité réduite. Eph pourrait donc assurer la fonction de récepteur des polérovirus chez M. persicae.

Renal cell carcinoma accounts for 3% of all malignant diseases in adults making it the 10th most common cancer in France. The most frequent type of Kidney cancer is Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CCRCC). Almost all CCRCC show an inactivation of the Von Hippel Lindau tumour suppressor gene (VHL). Between 25-30% of the patients will develop metastatic renal cell carcinoma (mRCC) by the time they are diagnose or become unresponsive to all treatments and in these cases, the disease has a rapid progression. Over the past years, kinase-targeted therapies (Sunitinib, Sorafenib, Temsirolimus) have become the mainstay of treatment for mRCC, however, most, if not all, patients acquire resistance to these approaches over time.In this context my PhD had 3 goals: a) to find a new combinatory targeted therapy through a High Throughput Screening; b) to establish 3D models mimicking the real environment of the tumours (spheroids, Tissue Slice Culture); c) to validate the Hits through different molecular and cellular biology studies.We conducted a synthetic lethal screen on the CMBA platform (CEA-Grenoble), choosing 36 potential genes targets and 80 kinases inhibitors drugs. Each of the target gene was silenced by a transduction with shRNA Lentivirus into the 786-O cell line derived from ccRCC that lacks the tumour suppressor VHL, is radio- and chemo-therapy resistant, has increased mobility and is highly metastatic. Among the hit combinations that affect cell viability, one of them was chosen because it targets two important kinases involved in cell survival and DNA repair: CK2 and ATM. Moreover, this combination is specifically more active in the 786-O VHL- cells than in 786-O VHL+ cell line. We evaluated the effect of our drugs on the viability of our 786-O VHL+ and VHL- cells in normoxic (21% O2) or hypoxic (1.5% O2) conditions that reflect different environments that are present in a tumour. Surprisingly, in normoxia, we found a synergetic effect of the drug mix only on the 786-O VHL- cells but not on 786-O VHL+ cells. Furthermore, this effect was even stronger in conditions of Hypoxia (up to 20% of synergism).Mechanistically, an up-regulation of the stress pathways was much stronger in the VHL- cells in the presence of the combination than with the drugs alone. No apoptosis was detected in this 2D models. In Multi-Cellular Tumour Spheroid (MCTS) where the organization of a micro-tumour is reproduced, our drugs are even more effective in inducing cell apoptosis than in 2D monolayers of 786-O VHL- cells. These results also demonstrate that pharmaco-modulation of viability of renal tumour organotypic culture by chemical combination targeting protein kinases can be studied. Perspectives of this work are the validation of this drug combination on human renal tumours and the use of organotypic culture as a test for personalized treatment response., L’incidence du cancer du rein et sa mortalité associée se sont accrues au cours des dernières années. Le type de cancer rénal le plus fréquent est celui nommé Cancer Rénal à Cellules Claires (CRCC) où le plus souvent, le gène suppresseur de tumeur Von Hippel Lindau (VHL) est inactivé. Malgré une détection plus précoce, l’évolution de la pathologie demeure incertaine, en particulier quand les patients développent des métastases ou acquièrent une résistance au traitement (25-30% des patients). De nouvelles thérapies ciblant des kinases (Sunitinib, Sorafenib ou Temsirolimus) bien que très prometteuses conduisent très souvent à l’acquisition de résistance. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouveaux modèles prédictifs de la réponse des patients aux traitements et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.Ma thèse de science visait trois objectifs complémentaires : 1) Identifier par criblage chimio-génomique des kinases comme cibles thérapeutiques combinées. 2) Etablir deux modèles de culture 3D de cancer du rein qui intègrent le microenvironnement d’une tumeur: les sphéroïdes et la culture organotypique de coupe de tissus. 3) Etudier la chimio-sensibilité de ces modèles à une combinaison de molécules identifiées dans le criblage.Un criblage cellulaire a été réalisé sur la plateforme de Criblage de Molécules BioActives (CEA- Grenoble). Il a consisté à tester 80 molécules inhibitrices de protéine-kinases en combinaison avec l’extinction génique par interférence ARN (shRNAs lentiviraux) de 36 cibles potentielles connues pour leur implication dans divers cancers. La lignée cellulaire choisie (786-O) est dérivée d’une tumeur rénale à cellules claires radio et chimio-résistante et dépourvue de VHL. Parmi les touches qui compromettent la viabilité des cellules 786-O, la combinaison choisie pour son efficacité cible deux kinases importantes dans le contrôle de la survie cellulaire et de la réparation de l’ADN CK2 et ATM. Le statut VHL des cellules module de façon dramatique leur sensibilité à cette combinaison, l’association de ces deux inhibiteurs étant plus efficace sur les cellules 786-O (VHL -) que sur les mêmes cellules dans lesquelles VHL a été réintroduit (VHL+). Au sein d’une tumeur, les différents niveaux d’oxygénation constituent une variation environnementale supplémentaire créant des susceptibilités ou des résistances aux traitements thérapeutiques. Pour déterminer l’impact de nos molécules dans ce contexte, nous avons testé la viabilité des cellules 786-O VHL+ et VHL- dans des conditions normoxiques (21% O2) ou hypoxiques (1,5% O2), en présence des molécules seules ou en combinaison. En normoxie, une diminution synergique de la viabilité des cellules 786-O VHL- est observée en présence de la combinaison, alors que cet effet n’a pas lieu sur les cellules 786-O VHL+. Cette synergie est potentialisée en condition hypoxique. Au niveau mécanistique, les voies de signalisation de stress cellulaires sont d’avantage activées dans les cellules VHL- en présence de la combinaison de molécules comparé au traitement avec chacune des molécules seules. Dans les sphéroïdes tumoraux multicellulaires reproduisant l’organisation d’une micro-tumeur, nos résultats montrent que notre combinaison de molécules induit d’avantage l’apoptose des cellules VHL- que les molécules seules, alors que les cellules VHL+ ne sont sensibles à aucun des traitements.Ces résultats montrent que l’action de nos molécules combinées est clairement plus efficace dans un modèle 3-D. Ils démontrent également qu’il est possible d’objectiver une pharmaco-modulation de la viabilité de cultures organotypiques de tumeur du rein par des combinaisons d’inhibiteurs chimiques de protéine-kinases. Les perspectives de ce travail sont la validation de cette combinaison sur des tumeurs humaines et l’exploitation des cultures organotypiques comme test personnalisé de réponse aux traitements.

The comorbidity of depression and cocaine addiction suggests shared mechanisms and anatomical pathways. Specifically, the limbic structures, such as the nucleus accumbens (NAc), play a crucial role in both disorders. P11 (S100A10) is a promising target for manipulating depression and addiction in mice. We summarized the recent genetic and viral strategies used to determine how the titration of p11 levels within the NAc affects hedonic behavior and cocaine reward learning in mice. In particular, p11 in the ChAT+ cells or DRD1+ MSN of the NAc, controls depressive-like behavior or cocaine reward, respectively. Treatments to counter maladaptation of p11 levels in the NAc could provide novel therapeutic opportunities for depression and cocaine addiction in humans.

The ciliate Paramecium tetraurelia is an interesting model to study the diversity and evolution of RNA interference (RNAi) pathways. One of the vegetative RNAi pathways is induced by feeding cells with bacteria producing double-stranded RNA (dsRNA) homologous to a given gene, which is then post-transcriptionally silenced through the production of 23-nt siRNAs. A forward genetic screen allowed us to obtain Mendelian mutants deficient in dsRNA-induced RNAi, and mutated genes were identified by whole-genome resequencing. 6 genes were identified: one Dicer, two RNA-dependent RNA polymerases (RDR1 et 2), one nucleotidyl-transferase (CID1) and two genes encoding novel poteins (PDS1 and 2). To study their roles in siRNA biosynthesis or action, we sequenced small RNAs from wild-type or mutants cells fed with a dsRNA homologous to a non-essential endogenous gene. Bioinformatic analyses showed that 'primary' siRNAs are produced from the bacterial dsRNA trigger, while 'secondary' siRNAs, predominantly of antisense polarity, are produced from the whole length of the targeted endogenous mRNA. While primary siRNA production requires all of the genes studied, the results only implicate RDR2 in the production of secondary siRNAs. Finally, I showed that some clusters of endogenous siRNAs depend on RDR1 and CID1, whereas others depend on RDR2. Paramecium was also shown to produce siRNAs that are antisense to bacterial ribosomal RNAs, suggesting new hypotheses about the possible natural functions of this pathway., Le cilié Paramecium tetraurelia est un modèle intéressant pour l'étude de la diversité et de l'évolution des voies d'ARN interférence (ARNi) chez les eucaryotes. L'une des voies d'ARNi végétatives peut être induite en nourrissant les paramécies de bactéries produisant un ARN double-brin (ARNdb) homologue à un gène donné, dont l'expression est inactivée de manière post-transcriptionnelle par la production de siARN de 23 nt. Un crible de mutagénèse a permis d'obtenir des mutants mendéliens déficients pour l'ARNi, dont les génomes ont été séquencés afin d'identifier sans a priori des gènes impliqués dans cette voie. 6 gènes ont été identifiés: un Dicer, deux ARN polymérases ARN-dépendantes (RDR1 et 2), une nucléotidyl-transférase (CID1) et deux gènes codant de nouvelles protéines (PDS1 et 2). Pour étudier leur rôle dans la biosynthèse ou l'action des siARN, ces derniers ont été séquencés à partir de cellules sauvages ou mutantes, nourries d'un ARNdb homologue à un gène non essentiel. L'analyse bio-informatique a montré que des siARN dits 'primaires' sont produits à partir de l'ARNdb bactérien, tandis que des siARN dits 'secondaires' sont produits à partir de la totalité de l'ARNm endogène ciblé, et sont majoritairement de polarité anti-sens. Alors que la production des siARN primaires dépend de tous les gènes étudiés, les résultats n'impliquent que RDR2 dans celle des siARN secondaires. Enfin, j'ai montré que certains clusters de siARN endogènes dépendent de RDR1 et de CID1, tandis que d'autres dépendent de RDR2. La paramécie produit également des siARN antisens aux ARN ribosomaux bactériens, suggérant de nouvelles hypothèses quant à la fonction naturelle de cette voie.

Patients with familial amyloidpolyneuropathies (FAP) require multidisciplinary neurologic and cardiologic management, including specific treatments to control the progression of systemic amyloidogenesis, symptomatic treatment of peripheral and autonomic neuropathies, and management of severe organ involvement (heart, eyes, kidneys). The first-line specific treatment of choice for met30 TTR-FAP is liver transplantation (LT) which suppresses the main source of mutant TTR, halts the progression of neuropathy in 70% of cases, and doubles the median survival time. Dual kidney-liver or heart-liver transplantation may be appropriate for patients with severe renal or cardiac failure. Tafamidis (Vyndaqel(R), Pfizer), a novel stabilizer of tetrameric TTR, has shown short-term effectiveness in slowing the progression of peripheral neuropathy in very early stages of met30 TTR-FAP This drug should thus be proposed for stage 1 symptomatic polyneuropathy. Other innovative medicines (RNA interference, antisense oligonucleotides) have been developed to block hepatic production of both mutant and wildtype TTR (noxious in late-onset forms of NAH after age 50 years), and to remove amyloid deposits (monoclonal anti-SAP). Clinical trials should first include patients with late-onset FAP or non-met30 TTR-FAP who are less responsive to LT7 and patients in whom Vyndaqel(R) is ineffective or inappropriate. Initial and periodic cardiac assessment is necessary, as cardiac impairment is inevitable and largely responsible for mortality. Symptomatic treatment is crucial to improve these patients' quality of life. Familial screening for carriers of the TTR gene mutation and regular clinical examination are essential to detect disease onset and to start specific therapy in a timely manner.

Oligonucleotides are finding an extremely large number of applications in molecular diagnostics and might become a very selective class of drugs for the treatment of a vast palette of diseases. Oligonucleotides are polyanions that exert their specifie activity following hybridization to a complementary sequence borne by another polyanionic nucleic acid. Simple electrostatic considerations imply that hybridization energy and cell binding couId benefit from addition of cationic groups to the oligonucleotide structure. Towards the aim of improving hybridization by decreasing electrostatic repulsions between the negatively charged strands, oligonucleotide-oligocation conjugates whose global charge is modulated by the number of cationic spermine moieties grafted on the oligonucleotides have been developed. Oligonucleotide-oligospermine conjugates are produced using an automated solid-phase synthesis of conjugates that are entirely based on the phosphoramidite coupling chemistry. Zip Nucleic Acids {ZNAs} are oligonucleotides with a short polycationic tail, composed of relatively few spermine units, leading to molecules overall negative in charge. The modification improves hybridisation by accelerating the target recognition and increases the melting temperature linearly with the number of grafted spermines on the oligonucleotide without altering the specificity. ZNAs have been shown to be potent primers and probes for PCR and are new interesting tools for molecular biology and diagnostics applications. Small interfering RNA (siRNA}-mediated gene silencing has become a drug development paradigm. As drug candidates, they must aIso be able to cross the anionic cell membrane. However, still one major limitation of the use of siRNA remains their inability to penetrate efficiently into cells of a particular tissue or tumour. That gives to oligonucleotide-oligospermine conjugates a real interest in this domain and more generally in vivo therapies. Cationic SIRNAPLUS are duplexes of small RNAs targeting a specifie mRNA. They are produced as an oligospermine-RNA sense strand, with positive global charge, associated to an antisense RNA strand. Results have shown that cationic siRNAs are able to enter cells efficiently without vector and to display silencing activity at nanomolar concentration. To have positive global charge, the number of spermine moieties has been increased. Purification and characterization methods have been developed to have cationic siRNAs compatible with in vivo experiments. My thesis will describe the synthesis of oligonucleotide-oligospermine conjugates as well as their applications.; Les oligonucleotides sont utilisés pour de nombreuses applications dans le domaine du diagnostic et ils peuvent également être utilisés comme traitement pour de nombreuses maladies. Les oligonucléotides sont des polyanions qui viennent s'hybrider sur leurs séquences complémentaires elles aussi anioniques. Les répulsions électrostatiques impliquent que l'addition de charges positives sur les oligonucléotides serait bénéfique pour diminuer les répulsions et améliorer l'hybridation. Dans le but de diminuer ces répulsions électrostatiques, des conjugués oligonucléotide-oligocation sur lesquels sont greffées des unités spermines ont été développés. Les conjugués oligonucléotideoligocation sont synthétisés sur un synthétiseur automatique d'oligonucléotide en utilisant la chimie des phosphoramidites. Les« Zip Nucleic Acid »ou ZNAs sont des oligonucléotides portant une queue cationique de quelques unités de spermine et sont de charge globale négative. Les modifications apportées permettent d'améliorer l'hybridation en accélérant la reconnaissance de la séquence cible et en augmentant la température de fusion linéairement avec le nombre de spermines greffées sans altérer la spécificité. Les ZNAs se révèlent être efficaces utilisés comme amorces ou sondes en PCR et ils apparaissent comme de nouveaux outils intéressants pour la biologie moléculaire. Les petits ARNintérferents (si RNA) induisant l'extinction d'un gène par la voie d' ARN interférence ont suscités un grand engouement ces dernières années, cependant leur très faible pénétration cellulaire est un frein majeur à leur utilisation. C'est pour cela que les conjugués oligonucléotide- oligospermine ont un réel intérêt pour le domaine de la thérapie in vivo. Les duplexes SIRNAPLUS cationiques sont des siRNAs ciblantspécifiquement un ARN messager. Ils sont constitués d'un brin sens ARN-oligospermine de charge globale positive hybridé à un brin antisens. Les résultats ont montré que lesSIRNAPLUS pouvaient entrer seuls dans les cellules sans agent de transfert pour induire l'extinction d'un gène cible et les premières expériences montrent qu'ils sont actifs in vivo. Mes travaux de thèse ont porté sur le développement des conjugués oligonucléotide oligospermine et démontrent des applications potentielles dans le domaine du diagnostic et de la thérapie.

Cervical cancer is the third most common female cancer. Infection by human papillomavirus (mainly HPV-16 and 18), with tropisms for mucosal or cutaneous squamous surfaces, is the major etiological agent implicated in cancer and tumor development. After infection, the oncogenic process is triggered by integration of oncoproteins E6 and E7 coding regions into the host cell genome. After integration, these oncoproteins interfere with the cell cycle and induce immortalization and cellular transformation of normal cells. The best known function of these two oncoproteins is the degradation of tumors suppressors p53 and pRb respectively. My thesis project consisted in the development of adenoviral vectors expressing miRNA directed against E6 oncoprotein. Their in vitro expression resulted in cellular death by apoptosis of the treated tumor cells, and allowed reduction of tumor growth in vivo in nude mice xenografts. In addition, the adenoviral therapeutical strategy showed its possible extensions on other types of HPV-positive cancers, but also through the possible expression of different therapeutic molecules aimed at preventing the interaction of viral oncoproteins, such as E6, with their cellular partners. These abolished interactions prevent oncoproteins from exercising their biological activities implicated in the development of cancers. In conclusion, we can say that adenoviruses can also be seen as functional tools suppressing E6 and enabling to highlight the repercussions of its suppression on other cellular processes., Le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l’agent étiologique majeur est l’infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L’inducteur majeur du processus oncogène est le processus d’intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l’infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l’immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l’oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l’induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l’activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d’autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l’expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l’interaction des oncoprotéines telles qu’E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d’exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d’extinction fonctionnels d’E6 et permettant d’étudier les répercutions sur d’autres processus cellulaires.

Oligonucleotides are finding an extremely large number of applications in molecular diagnostics and might become a very selective class of drugs for the treatment of a vast palette of diseases. Oligonucleotides are polyanions that exert their specifie activity following hybridization to a complementary sequence borne by another polyanionic nucleic acid. Simple electrostatic considerations imply that hybridization energy and cell binding couId benefit from addition of cationic groups to the oligonucleotide structure. Towards the aim of improving hybridization by decreasing electrostatic repulsions between the negatively charged strands, oligonucleotide-oligocation conjugates whose global charge is modulated by the number of cationic spermine moieties grafted on the oligonucleotides have been developed. Oligonucleotide-oligospermine conjugates are produced using an automated solid-phase synthesis of conjugates that are entirely based on the phosphoramidite coupling chemistry. Zip Nucleic Acids {ZNAs} are oligonucleotides with a short polycationic tail, composed of relatively few spermine units, leading to molecules overall negative in charge. The modification improves hybridisation by accelerating the target recognition and increases the melting temperature linearly with the number of grafted spermines on the oligonucleotide without altering the specificity. ZNAs have been shown to be potent primers and probes for PCR and are new interesting tools for molecular biology and diagnostics applications. Small interfering RNA (siRNA}-mediated gene silencing has become a drug development paradigm. As drug candidates, they must aIso be able to cross the anionic cell membrane. However, still one major limitation of the use of siRNA remains their inability to penetrate efficiently into cells of a particular tissue or tumour. That gives to oligonucleotide-oligospermine conjugates a real interest in this domain and more generally in vivo therapies. Cationic SIRNAPLUS are duplexes of small RNAs targeting a specifie mRNA. They are produced as an oligospermine-RNA sense strand, with positive global charge, associated to an antisense RNA strand. Results have shown that cationic siRNAs are able to enter cells efficiently without vector and to display silencing activity at nanomolar concentration. To have positive global charge, the number of spermine moieties has been increased. Purification and characterization methods have been developed to have cationic siRNAs compatible with in vivo experiments. My thesis will describe the synthesis of oligonucleotide-oligospermine conjugates as well as their applications., Les oligonucleotides sont utilisés pour de nombreuses applications dans le domaine du diagnostic et ils peuvent également être utilisés comme traitement pour de nombreuses maladies. Les oligonucléotides sont des polyanions qui viennent s'hybrider sur leurs séquences complémentaires elles aussi anioniques. Les répulsions électrostatiques impliquent que l'addition de charges positives sur les oligonucléotides serait bénéfique pour diminuer les répulsions et améliorer l'hybridation. Dans le but de diminuer ces répulsions électrostatiques, des conjugués oligonucléotide-oligocation sur lesquels sont greffées des unités spermines ont été développés. Les conjugués oligonucléotideoligocation sont synthétisés sur un synthétiseur automatique d'oligonucléotide en utilisant la chimie des phosphoramidites. Les« Zip Nucleic Acid »ou ZNAs sont des oligonucléotides portant une queue cationique de quelques unités de spermine et sont de charge globale négative. Les modifications apportées permettent d'améliorer l'hybridation en accélérant la reconnaissance de la séquence cible et en augmentant la température de fusion linéairement avec le nombre de spermines greffées sans altérer la spécificité. Les ZNAs se révèlent être efficaces utilisés comme amorces ou sondes en PCR et ils apparaissent comme de nouveaux outils intéressants pour la biologie moléculaire. Les petits ARNintérferents (si RNA) induisant l'extinction d'un gène par la voie d' ARN interférence ont suscités un grand engouement ces dernières années, cependant leur très faible pénétration cellulaire est un frein majeur à leur utilisation. C'est pour cela que les conjugués oligonucléotide- oligospermine ont un réel intérêt pour le domaine de la thérapie in vivo. Les duplexes SIRNAPLUS cationiques sont des siRNAs ciblantspécifiquement un ARN messager. Ils sont constitués d'un brin sens ARN-oligospermine de charge globale positive hybridé à un brin antisens. Les résultats ont montré que lesSIRNAPLUS pouvaient entrer seuls dans les cellules sans agent de transfert pour induire l'extinction d'un gène cible et les premières expériences montrent qu'ils sont actifs in vivo. Mes travaux de thèse ont porté sur le développement des conjugués oligonucléotide oligospermine et démontrent des applications potentielles dans le domaine du diagnostic et de la thérapie.

The “cost of reproduction” is a concept defining that a high reproductive investment has a price that is paid later by an acceleration of senescence. That may translate tradeoff between reproduction and other physiological functions such as antioxidant defense. In the Pacific oyster Crassostrea gigas, reproduction is a major physiological function. In a study led to understand the summer mortalities affecting this species, a negative correlation between reproductive effort and survival was observed. Moreover, some antioxidant genes were identified as differentially expressed between lines of oysters selected for resistance or susceptibility to summer mortalities. Some studies suggest that the susceptibility to oxidative stress may represent a cost of reproduction taking part to the process of senescence. In this context, we analyzed the antioxidant capacity of oysters according to their reproductive investment. For this, the technique of RNA interference was used to manipulate the reproductive effort of oysters. The expression of the main antioxidant enzymes (transcript levels and enzyme activities) and the dosage of oxidative damages were then measured in different tissues and cells of the organism (gills, gonad, hemocytes and gametes). The results obtained in this thesis suggest that the antioxidant capacity of C. gigas is particularly effective and that reproduction alone is not sufficient to induce oxidative stress. This antioxidant capacity appears to be tissue-specific even cell-specific and glutathione metabolism would to play a major role in this protection. This resistance to oxidative stress would make C. gigas be a species particularly adapted to life in stressful environments.; Le “coût de la reproduction” est un concept qui définit qu’un investissement à la reproduction élevé a un prix qui se paye ultérieurement par une accélération de la sénescence. Cela peut notamment traduire des compromis entre la reproduction et d’autres fonctions physiologiques comme la défense antioxydante. Chez l’huître creuse Crassostrea gigas, la reproduction représente une fonction physiologique majeure. Dans le cadre des études effectuées pour comprendre les mortalités estivales affectant cette espèce, une corrélation négative entre effort reproducteur et survie a été observée. D’autre part, des gènes antioxydants ont été mis en évidence comme différentiellement exprimés entre les lignées d’huîtres sélectionnées pour leur résistance ou leur sensibilité aux mortalités estivales. Certaines études proposent que la susceptibilité au stress oxydant puisse représenter un coût de la reproduction participant au processus de sénescence. Dans ce contexte, nous avons analysé la capacité antioxydante des huîtres en fonction de leur investissement reproducteur. Pour cela, la technique d’ARN interférence a été utilisée pour manipuler l’effort reproducteur des huîtres. L’expression des principales enzymes antioxydantes (taux de transcrits et activités enzymatiques) et le dosage de dommages oxydatifs ont ensuite été mesurés dans différents tissus et cellules de l’organisme (branchies, gonade, hémocytes et gamètes). Les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse suggèrent que la capacité antioxydante de C. gigas est particulièrement efficace et que la reproduction seule n’est pas suffisante pour induire un stress oxydant. Cette capacité antioxydante apparaît comme tissu-spécifique voire cellule-spécifique et le métabolisme du glutathion semble jouer un rôle majeur dans cette protection. Cette grande résistance au stress oxydant contribuerait à faire de C. gigas une espèce particulièrement adaptée à la vie dans des environnements stressants.

Leishmania and Trypanosoma brucei are protozoan parasites responsible for worldwide distributed severe diseases. No vaccine is available and the treatment relies upon a limited number of drugs, which are costly, often toxic and not highly efficient, and for which resistances are increasing. Hence the necessity to urgently discover novel drug targets with the aim of developing new drug treatments which would be more efficient, less toxic and if possible cheaper.Trypanosomatids, of which the genome has been entirely sequenced, exhibit numerous peculiarities in their cell and molecular biology, for example a single and complex mitochondrial DNA network termed kinetoplast. Also, their development follows a ‘double' cell cycle ensuring the replication of, on the one hand, the nucleus (classical mitosis) and on the other hand, the “basal body-kinetoplast” whole, of which the correct segregation conditions cytokinesis. They also possess tow types of proteasomes, one classical one (26S) and one of the prokaryotic type, more specific and absent in human, the HslVU complex. We have shown that HslVU is located exclusively in the single mitochondrion of these parasites and, in T. brucei, that it is essential to parasite's survival. Indeed, its RNAinterference-based knockdown leads to a cytokinesis block followed par cell death. The first aim of this work was to try to better understand the role of HslVU in the ‘kinetoplast-associated' cell cycle in these parasites that already possess a classical proteasome. Putting an end to several contradictory publications, we confirmed the mitochondrial location of this complex in Leishmania and T. brucei. For the first time, we also demonstrate that it is just as essential in bloodstream forms (those present in the mammalian host) than in procyclic forms. We finally show a differentiated role for the different subunits of the complex in the progress of the kinetoplast-associated cell cycle.The second aim of this work was to identify novel mitochondrial proteins which would participate in the regulation of the kinetoplast-associated cell cycle. To do this, we developed a ‘semi-systematic' screening approach using RNA interference for 104 mitochondrial proteins, most of them being of unknown function. If the inhibition of most of these proteins (64) had no effect on cell growth, that of the 42 remaining ones induced a moderate or severe growth defect. Surprisingly, this inhibition yielded significant and more or less visible modifications of the cell cycle progress, suggesting that the latter is dependent upon multiple cell functions.Finally, this study validates the HslVU proteasome as a pertinent drug target, particularly for the bloodstream forms of T. brucei. The functional differentiation of HslU1 and HslU2 and the independent activity of HslV are intriguing and give a complex picture of the functioning of this proteasome. On the other hand, the RNA interference data suggest a cell cycle regulation which would be highly integrated to the whole of the cell activities., Leishmania et Trypanosoma brucei sont des protozoaires parasites responsables de graves parasitoses de distribution mondiale. Aucun vaccin n'est disponible contre ces maladies dont le traitement reste basé sur un nombre limité de médicaments coûteux, souvent toxiques et peu efficaces, problème auquel s'ajoute celui des chimiorésistances. D'où l'urgente nécessité de trouver de nouvelles cibles pour le développement de nouveaux traitements qui soient à la fois efficaces, non ou moins toxiques et à un coût plus accessible. Les Trypanosomatidés, dont les génomes ont été entièrement séquencés, présentent de nombreuses originalités dans leur biologie cellulaire et moléculaire, par exemple un ADN mitochondrial unique et extrêmement complexe appelé kinétoplaste. Leur développement suit également un "double" cycle cellulaire répliquant, d'une part, classiquement le noyau et, d'autre part, l'ensemble "corps basal-ADN mitochondrial" dont la ségrégation correcte conditionne la cytodiérèse. Ils possèdent par ailleurs deux types de protéasomes, un classique (26S) et un de type procaryote, plus spécifique et absent chez l'homme, le complexe HslVU. Nous avons montré que HslVU est localisé exclusivement dans l'unique mitochondrie des parasites, et qu'il est, chez T. brucei, essentiel pour la survie de ces organismes. En effet, son inhibition par ARN interférence entraine un blocage de la cytodiérèse suivi par une mort cellulaire. Le premier objectif de cette thèse a été de tenter de mieux comprendre le rôle de HslVU dans le cycle cellulaire associé au kinétoplaste chez ces parasites possédant déjà un protéasome classique. Mettant un terme à plusieurs publications contradictoires, nous avons confirmé la localisation mitochondriale de ce complexe chez Leishmania et chez T. brucei. Nous montrons pour la première fois qu'il est tout aussi essentiel dans les formes sanguines, celles présentes chez l'hôte mammifère, que dans les formes procycliques. Nous montrons aussi un rôle différencié des différentes sous-unités du complexe dans le déroulement du cycle cellulaire associé au kinétoplaste. Le deuxième objectif de cette thèse a été d'identifier de nouvelles protéines mitochondriales régulatrices du cycle cellulaire associé au kinétoplaste. Pour ce faire, nous avons développé une approche de criblage par ARN interférence "semi-systématique" sur 104 protéines mitochondriales, principalement de fonction inconnue. Si l'inhibition de l'expression de la majorité de ces protéines (62) n'a aucun effet sur la croissance cellulaire, celle des 42 restantes induit une baisse moyenne ou sévère de cette croissance. De façon surprenante, cette inhibition modifie significativement et avec plus ou moins d'ampleur le déroulement du cycle cellulaire, suggérant qu'il est dépendant de multiples fonctions cellulaires. Finalement, ce travail valide le protéasome HslVU comme une cible thérapeutique pertinente tout particulièrement à l'adresse des formes sanguines de T. brucei. La différenciation fonctionnelle de HslU1 et HslU2 et l'activité indépendante de HslV donnent une image plus complexe sur le fonctionnement de ce protéasome. Les données d'ARN interférence pour leur part nous orientent vers une régulation du cycle cellulaire très intégrée à l'ensemble des activités cellulaires.

Wheat, Triticum aestivum, is one of the world's major cereal crops and is of considerable importance to human nutrition, supplying one-fifth of the calories consumed by humans. For important food crops such as wheat, rice and maize, grain yield mainly depends on grain number and size. In rice (Oryza sativa), GW2 was isolated from a major quantitative trait locus for grain size and weight, and encodes an E3 RING ligase that negatively regulates these yield components. Wheat has TaGW2 homologs in A, B and D genomes; and copies show distinct expression pattern during whole grain development in wheat. TaGW2-A was mapped in a genomic region on 6AS, encompassing previous reported QTLs for yield; and polymorphisms in TaGW2-A (promoter and intron 7) were associated with thousand-grain weight, in a worldwide wheat core collection. To investigate TaGW2 function, RNA interference was used to down-regulate TaGW2 transcripts levels. Surprisingly, transgenic wheat lines significantly showed decreased grain weight and size-related dimensions, and endosperm cell number compared to controls. The present study thus suggests that TaGW2 is a positive regulator of the final grain size in wheat, conversely to GW2 in rice. Biochemical and molecular analyses of the protein TaGW2-A revealed that 1) TaGW2-A is a functional E3 ubiquitine ligase in vitro, 2) TaGW2-A accumulates in the nucleolus, the nucleoplasm, and the cytosol, 3) E3 ubiquitine ligase activity seems to impact TaGW2-A subcellular localization. To investigate the TaGW2 signalling pathway(s), cDNA library from whole wheat grains was built and screened with the bait protein TaGW2(1-320). Preliminary results from the interactomic study suggest that TaGW2 may regulate cell division. Moreover, TaGW2 may also function as an E3 Nedd8 ligase, besides its E3 ubiquitin ligase function., Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées au monde et est d'une importance considérable pour l'alimentation humaine, fournissant environ un cinquième des calories consommées par l'Homme. Le rendement en grain chez les céréales dépend majoritairement du nombre et de la taille des grains. Chez le riz (Oryza sativa), le gène GW2 a été isolé dans un locus à effet quantitatif majeur pour la taille et le poids du grain. Ce gène code pour une enzyme E3 ligase de type RING, qui régule négativement la taille et le poids du grain de riz. L'homologue de GW2 chez le blé tendre, le gène TaGW2, est exprimé par trois copies TaGW2-A,TaGW2-B et TaGW2-D, portées par chacun des génomes homéologues A, B et D. Les trois copies présentent des profils d'expression distincts au cours du développement du grain. TaGW2-A a été cartographié dans une région de QTLs pour le rendement, sur le chromosome 6AS ; et du polymorphisme dans sa séquence promotrice et intronique a été retrouvé associé au poids de 1000-grains dans une core collection mondiale de blé tendre. Afin de rechercher la fonction de TaGW2, l'extinction stable des trois copies TaGW2 a été entreprise par ARN interférence. De manière surprenante, les plantes transgéniques montrent des réductions significatives des dimensions et du poids du grain de blé (- 22,5 et - 30% du volume et de la masse du grain, respectivement), ainsi que du nombre de cellules de l'albumen (- 25%), comparé aux plantes témoins dans nos conditions ; suggérant que TaGW2 est un régulateur positif de la taille finale du grain chez le blé tendre. La protéine TaGW2-A a été caractérisée aux niveaux moléculaire et biochimique : elle est une E3 ubiquitine ligase fonctionnelle in vitro, et s'accumule dans la cellule au niveau du nucléole, du nucléoplasme et du cytoplasme. Sa fonction E3 ligase semble notamment influencer sa localisation subcellulaire. Afin de déterminer la ou les voie(s) de signalisation dans la(es)quelle(s) intervient TaGW2, une banque ADNc de grains de blé a été construite et criblée par double-hybride avec 320 acides aminés de la protéine TaGW2-A. Les premiers interacteurs potentiels identifiés suggèrent d'une part un rôle de TaGW2 dans la régulation de la division cellulaire, et d'autre part une fonction E3 Nedd8 ligase, en plus de son activité E3 ligase.

Pour compléter leur cycle de vie, les virus interagissent avec de nombreux facteurs de la cellule-hôte. Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) ne fait pas exception. Une récente étude protéomique du virus effectuée par notre laboratoire a permis d’identifier 49protéines cellulaires potentiellement incorporées dans les virions matures d’HSV-1 [1]. Étant donné que certaines de ces protéines peuvent jouer des rôles importants au cours du cycle de vie du virus, elles constituent des cibles de choix pour identifier et caractériser de nouvelles interactions hôte-pathogène dans le contexte d’HSV-1. D’ailleurs le laboratoire a été effectué un criblage aux petits ARN d’interférence qui a démontré qu'au moins 15 des protéines incorporées sont impliqués dans le cycle de réplication de HSV-1 en culture cellulaire (Annexe 1). Des nombreuses études rapportent l'incorporation des protéines de l'hôte dans les virions matures mais très peu abordent l'importance de la fraction des protéines cellulaires incorporée dans les virions pour le cycle virale. Pour vérifier ça, nous avons déplété ces protéines des virions matures extracellulaires en utilisant des petits ARN d’interférence. Par la suite, nous avons utilisé ces virus déplétés pour réinfecter des cellules déplétées ou normales. Cette méthode nous a permis d'identifier pour la première fois 8 protéines (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 et 14-3-3ζ) dont l'absence dans les virions réduit la production virale d'au moins 50%. Pour mieux comprendre à quelle étape du cycle viral ces protéines sont nécessaires, nous avons aussi quantifié les virus intracellulaires, produits des cellules déplétées individuellement des quinze protéines cellulaires. Ainsi, nous avons trouvé que dans nos conditions 7 de ces 8 protéines cellulaires (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A et Rab10) semblent impliquées dans la production des virus intracellulaires, ce qui nous a stimulés à débuter une série de tests plus approfondis de l’entrée d’HSV-1. Les résultats préliminaires, démontrent l’implication dans l’entrée d’HSV-1 d’au moins 3 à 4 de ces protéines (HSPA8, KRT10, Rab5A et Rab10)., To complete their life cycle viruses interact with many factors of the host cell. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is no exception. A recent proteomic study of the virus carried by our laboratory has identified up to 49 cellular proteins potentially incorporated into the mature virions of HSV-1[1]. Since some of these proteins may play important roles during the viral life cycle, they are interesting targets for identification and characterization of new host-pathogen interactions in the context of HSV-1. To target the proteins that are relevant to the viral life cycle of Herpes, the laboratory performed a screening with small interfering RNAs (siRNAs), which showed that at least 15 incorporated proteins are involved in the replication cycle of HSV- 1 in cell culture (Appendix 1). Numerous studies report the incorporation of host proteins in mature virions but few addresses the importance for the viral infectivity of the fractions of cellular proteins incorporated into the virions. To verify this, we depleted these proteins from the mature extracellular virions using siRNAs. Subsequently, we used these viruses to re-infect depleted or normal cells. This method allowed us to identify for the first time eight proteins (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 and 14-3-3ζ) whose absence in virions reduced viral production by at least 50%. As part of understanding at what stage of the life cycle these proteins are necessary for HSV-1, we tested the infectivity of intracellular depleted viruses. Thus, we found at least seven cellular proteins (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A and Rab10) to have a pronounced effect on the replication of herpes virus, which has stimulated us to begin a series of more in-depth tests of the entry of HSV-1. Preliminary results demonstrate the involvement in the entry of HSV-1 of at least three to four proteins (HSPA8, KRT10, Rab5A and Rab10).

This work has enabled a comprehensive evaluation of different sequences of siRNAs directed against EWS/Fli-1 in the treatment of tumors of the Ewing sarcoma family of tumors (ESFT). A siRNA was efficiently vectorized by polymeric nanoparticles targeted against a specific membrane marker of ESFT. These nanoparticles were characterized and appear to be well tolerated both in vitro and in vivo. Their evaluation was conducted on human cells and tumors which represents an interesting step forward in the fight against ESFT. The development of a fluorescent model of Ewing's sarcoma will better characterize their effect on metastasis, a key factor in patient survival. Finally, it was shown that in vivo imaging techniques allow to follow the fate of nanoparticles in vivo. That will allow understanding their biodistribution and their mode of action.; Ce travail a permis de réaliser une évaluation complète de différentes séquences de siRNA dirigées contre EWS/Fli-1 dans le cadre du traitement des tumeurs de la famille du sarcome d’Ewing Un siRNA a été vectorisé de manière efficace par des nanoparticules polymères ciblées contre un marqueur membranaire spécifique des ESFT. Ces nanoparticules ont été caractérisées et semblent bien tolérées à la fois in vitro et in vivo. Leur évaluation a été réalisée sur des cellules humaines et après prise des tumeurs ce qui représente une avancée intéressante dans la lutte contre les ESFT. La mise au point d’un modèle fluorescent de sarcome d‘Ewing permettra de mieux caractériser leur effet sur les métastases, facteur essentiel dans la survie des patients. Enfin, il a été montré que les techniques d’imagerie in vivo permettaient de suivre le devenir in vivo des nanoparticules ce qui permettra de comprendre leur biodistribution et leur mode d’action.

This work has enabled a comprehensive evaluation of different sequences of siRNAs directed against EWS/Fli-1 in the treatment of tumors of the Ewing sarcoma family of tumors (ESFT). A siRNA was efficiently vectorized by polymeric nanoparticles targeted against a specific membrane marker of ESFT. These nanoparticles were characterized and appear to be well tolerated both in vitro and in vivo. Their evaluation was conducted on human cells and tumors which represents an interesting step forward in the fight against ESFT. The development of a fluorescent model of Ewing's sarcoma will better characterize their effect on metastasis, a key factor in patient survival. Finally, it was shown that in vivo imaging techniques allow to follow the fate of nanoparticles in vivo. That will allow understanding their biodistribution and their mode of action.; Ce travail a permis de réaliser une évaluation complète de différentes séquences de siRNA dirigées contre EWS/Fli-1 dans le cadre du traitement des tumeurs de la famille du sarcome d’Ewing Un siRNA a été vectorisé de manière efficace par des nanoparticules polymères ciblées contre un marqueur membranaire spécifique des ESFT. Ces nanoparticules ont été caractérisées et semblent bien tolérées à la fois in vitro et in vivo. Leur évaluation a été réalisée sur des cellules humaines et après prise des tumeurs ce qui représente une avancée intéressante dans la lutte contre les ESFT. La mise au point d’un modèle fluorescent de sarcome d‘Ewing permettra de mieux caractériser leur effet sur les métastases, facteur essentiel dans la survie des patients. Enfin, il a été montré que les techniques d’imagerie in vivo permettaient de suivre le devenir in vivo des nanoparticules ce qui permettra de comprendre leur biodistribution et leur mode d’action.

L’ubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protéine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont très peu d’homologie de séquence, mais partagent des similarités remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme l’Ub et la majorité des autres Ubls, UFM1 se lie de façon covalente à ses substrats par l’intermédiaire d’une cascade enzymatique. Il est de plus en plus fréquemment rapporté que les protéines Ubls sont impliquées dans des maladies humaines. Le gène Ufm1 est surexprimé chez des souris de type MCP développant une ischémie myocardique et dans les îlots de Langerhans de patients atteints du diabète de type 2. UFM1 et ses enzymes spécifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservés chez les métazoaires et les plantes suggérant un rôle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modèle animal le plus simple utilisé en biologie. Sa morphologie, ses phénotypes visibles et ses lignées cellulaires ont été décrits de façon détaillée. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gènes sur la longévité. Ce modèle nous permet de facilement manipuler l’expression du gène Ufm1 et de mieux connaître ses fonctions. En diminuant l’expression du gène ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de l’ARN interférence par alimentation, nous n’avons observé aucun problème morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possédaient un nombre de progéniture normal. Cependant, les vers sauvage exposés à l’ARNi d’ufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrôles et ce, de façon indépendante de la voie de signalisation de l’insuline/IGF. Chez le C. elegans la longévité et la résistance au stress cellulaire sont intimement liées. Nous n’avons remarqué aucun effet d’ufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress protéotoxique. Il est également nécessaire au maintien de l’intégrité neuronale au cours du vieillissement des animaux. L’ensemble de nos données nous renseigne sur les fonctions putatives du gène Ufm1., The ubiquitin-fold modifier (UFM1) is part of the type 1 class of the family of ubiquitin-like protein (Ubl). UFM1 and Ub have very little sequence homology but share remarkable similarities in their tertiary structure. Like Ub and most other UBLS, UFM1 binds covalently to its substrates through an enzymatic cascade. It is frequently reported that UBLs are involved in human diseases. UFM-1 is overexpressed in mice developing a myocardial ischemia and in the islets of patients suffering from type 2 diabetes. UFM1 and its specific enzymes, UBA5, UFL1, and UFC1 are conserved in metazoans and plants suggesting an important role in multicellular organisms. Caenorhabditis elegans is one of the the simplest animal models used in biology. Some features such as morphology, visible phenotypes and cell lineage have completely been described. The short lifecycle of C. elegans makes it easy to observe gene effects on longevity. This model allows us to easily manipulate the expression of the Ufm1 gene and learn more about its putative functions. To study putative functions of Ufm1, we decreased the expression of ufm-1 using RNA interference introduces through feeding. No gross morphological disturbances were observed; worms resembled wild type and had a normal brood size. However, worms exposed to ufm-1 RNAi had a significantly shorter lifespan than the controls. This effect is independent of the insulin/IGF pathway, which is a major axis of longevity genetics. In C. elegans longevity and cellular stress resistance are intimately linked. We have observed no effect of ufm-1 on thermal, osmotic or oxidative stress, but it is required for protection against proteotoxic stress. It is also necessary to maintain neuronal integrity during aging. Together, our results shed light on putative functions of Ufm1 gene.

RNA interference (RNAi) is a cellular process known for inhibiting gene expression in a sequence-specific manner. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, this process induces modifications in chromatin structure and is assumed to involve an interaction between nascent transcripts and a small RNA contained in the RNAi complex, RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional gene Silencing). RITS targets repeated and non-coding regions, and is essential for heterochromatin integrity at these genomic sites. In one study, RITS complex subunit Argonaute 1, and a heterochromatin mark, methylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9me), were detected on chromatin of two meiotic genes, mei4 and ssm4. This finding suggested a possible new function for RNAi in sexual differentiation. During my PhD studies, I found that a RNA-binding protein, Mmi1 (Meiotic mRNA interception protein 1), enables RITS to specifically associate with the chromatin and messenger RNAs of these meiotic genes. Mmi1 protein triggers a post-transcriptional repression of specific meiotic genes, a silencing activity essential for the control of sexual differentiation. We conducted a genome wide transcriptomic analysis from a mmi1Δ strain, and uncovered additional meiotic mRNAs that are directly targeted by both Mmi1 and RNAi. Intriguingly, chromatin of the corresponding meiotic genes does not necessarily display the repressive epigenetic mark H3K9me, suggesting that RNAi might silence some protein-coding genes only at a post-transcriptional level. In parallel, combining genetic, molecular biology and physiological techniques, we highlighted a potentially direct role for RNAi in the inhibition of sexual differentiation. We propose that RNAi cooperates with Mmi1 to efficiently block expression of the early meiotic transcriptional programme during vegetative growth. This regulation might be essential for the proper timing of activation of this programme during sexual differentiation progression., L'interférence à l'ARN (RNAi) est un mécanisme cellulaire connu pour inhiber l'expression de gènes avec une grande spécificité de séquence. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, ce processus induit des modifications de structure de la chromatine et implique une interaction entre un ARN naissant et un petit ARN associé au complexe du RNAi, RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional gene Silencing). RITS cible les régions répétées et non codantes et joue un rôle essentiel dans l'intégrité de l'hétérochromatine de ces sites génomiques. Une étude a mis en évidence la présence de la sous-unité Argonaute 1 du complexe RITS, ainsi qu'une marque de l'hétérochromatine, la méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me), au niveau de la chromatine de deux gènes méiotiques, mei4 et ssm4. Ceci suggérait une nouvelle fonction du RNAi dans la différenciation sexuelle. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la protéine de liaison à l'ARN Mmi1 (Meiotic mRNA interception protein 1), permet à RITS de s'associer spécifiquement à la chromatine et à l'ARN messager de ces gènes méiotiques. La protéine Mmi1 orchestre une répression post-transcriptionnelle de gènes méiotiques spécifiques, une activité de « silencing » essentielle au contrôle de la différenciation sexuelle. Nous avons mené une analyse de l'ensemble du transcriptome dans une souche déficiente pour Mmi1, ce qui nous a conduits à l'identification de nouveaux ARNm méiotiques ciblés directement par Mmi1 et le RNAi. Curieusement, la chromatine des gènes méiotiques correspondants ne présente pas systématiquement la marque épigénétique répressive H3K9me, ce qui suggère que le RNAi pourrait réprimer certains gènes codants seulement au niveau post-transcriptionnel. En parallèle, en combinant des techniques de génétique, de biologie moléculaire et de physiologie cellulaire, nous mettons en évidence un probable rôle direct du RNAi dans l'inhibition de la différenciation sexuelle. Nous proposons que le RNAi pourrait coopérer avec Mmi1 pour bloquer de manière efficace une partie du programme transcriptionnel méiotique durant le cycle végétatif. Cette régulation serait essentielle pour l'activation appropriée de ce programme au cours de la progression de la différenciation sexuelle.

RNA interference (RNAi) is a cellular process known for inhibiting gene expression in a sequence-specific manner. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, this process induces modifications in chromatin structure and is assumed to involve an interaction between nascent transcripts and a small RNA contained in the RNAi complex, RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional gene Silencing). RITS targets repeated and non-coding regions, and is essential for heterochromatin integrity at these genomic sites. In one study, RITS complex subunit Argonaute 1, and a heterochromatin mark, methylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9me), were detected on chromatin of two meiotic genes, mei4 and ssm4. This finding suggested a possible new function for RNAi in sexual differentiation. During my PhD studies, I found that a RNA-binding protein, Mmi1 (Meiotic mRNA interception protein 1), enables RITS to specifically associate with the chromatin and messenger RNAs of these meiotic genes. Mmi1 protein triggers a post-transcriptional repression of specific meiotic genes, a silencing activity essential for the control of sexual differentiation. We conducted a genome wide transcriptomic analysis from a mmi1Δ strain, and uncovered additional meiotic mRNAs that are directly targeted by both Mmi1 and RNAi. Intriguingly, chromatin of the corresponding meiotic genes does not necessarily display the repressive epigenetic mark H3K9me, suggesting that RNAi might silence some protein-coding genes only at a post-transcriptional level. In parallel, combining genetic, molecular biology and physiological techniques, we highlighted a potentially direct role for RNAi in the inhibition of sexual differentiation. We propose that RNAi cooperates with Mmi1 to efficiently block expression of the early meiotic transcriptional programme during vegetative growth. This regulation might be essential for the proper timing of activation of this programme during sexual differentiation progression.; L'interférence à l'ARN (RNAi) est un mécanisme cellulaire connu pour inhiber l'expression de gènes avec une grande spécificité de séquence. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, ce processus induit des modifications de structure de la chromatine et implique une interaction entre un ARN naissant et un petit ARN associé au complexe du RNAi, RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional gene Silencing). RITS cible les régions répétées et non codantes et joue un rôle essentiel dans l'intégrité de l'hétérochromatine de ces sites génomiques. Une étude a mis en évidence la présence de la sous-unité Argonaute 1 du complexe RITS, ainsi qu'une marque de l'hétérochromatine, la méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me), au niveau de la chromatine de deux gènes méiotiques, mei4 et ssm4. Ceci suggérait une nouvelle fonction du RNAi dans la différenciation sexuelle. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la protéine de liaison à l'ARN Mmi1 (Meiotic mRNA interception protein 1), permet à RITS de s'associer spécifiquement à la chromatine et à l'ARN messager de ces gènes méiotiques. La protéine Mmi1 orchestre une répression post-transcriptionnelle de gènes méiotiques spécifiques, une activité de « silencing » essentielle au contrôle de la différenciation sexuelle. Nous avons mené une analyse de l'ensemble du transcriptome dans une souche déficiente pour Mmi1, ce qui nous a conduits à l'identification de nouveaux ARNm méiotiques ciblés directement par Mmi1 et le RNAi. Curieusement, la chromatine des gènes méiotiques correspondants ne présente pas systématiquement la marque épigénétique répressive H3K9me, ce qui suggère que le RNAi pourrait réprimer certains gènes codants seulement au niveau post-transcriptionnel. En parallèle, en combinant des techniques de génétique, de biologie moléculaire et de physiologie cellulaire, nous mettons en évidence un probable rôle direct du RNAi dans l'inhibition de la différenciation sexuelle. Nous proposons que le RNAi pourrait coopérer avec Mmi1 pour bloquer de manière efficace une partie du programme transcriptionnel méiotique durant le cycle végétatif. Cette régulation serait essentielle pour l'activation appropriée de ce programme au cours de la progression de la différenciation sexuelle.

The treatment of familial amyloid polyneuropathies (FAP) is complex and requires a neurological and cardiological multidisciplinary coverage. It includes specific treatments to control the progression of the systemic amyloidogenesis, the symptomatic treatment of the peripheral and autonomic neuropathy (digestive, urinary, sexual, postural hypotension) and the treatment of organs severely involved by amyloidosis (heart, eyes, kidneys). First line specific treatment of met30 TTR-FAP is liver transplantation (LT) which allows to suppress the main source of mutant TTR, to stop the progression of the neuropathy in 70 % of cases at long-term (with an experience of 18 years) and to double the median survival. In case of severe renal or cardiac insufficiency, a double transplant kidney-liver or heart-liver can be discussed. The tafamidis (in temporary authorization of use in France) is a stabilizing medicine of the tetrameric TTR which showed in very early stages of met30 TTR-FAP short-term capacities to stop the progress of the peripheral neuropathy in 60 % of the cases versus 38 % with placebo. It should be proposed in case of contraindication of TH (age70 years [20 % of the cases]), of very early stages (very low NIS-LL score), or for the period of wait of LT. Other innovative medicines issued from biopharmaceutical companies have been developed to block the hepatic production of both mutant and wild TTR which are noxious in the late forms NAH (50 years old) (RNAi [RNA interference] therapeutics, AntiSens oligonucleotids), for removing the amyloid deposits (monoclonal antibody anti-SAP), or to slow down the formation of deposits of TTR and amyloidosis (combination of doxycycline-TUDCA). Clinical trials should be first addressed to the patients with a late onset of FAP or non-met30 TTR-FAP who are less responding to LT and patients with contraindications in the LT. Initial cardiac assessment and periodic cardiac investigations are important for the FAP according to the frequency of cardiac impairment which is responsible of high rate of mortality. Conduction disorders (atrio-ventricular blocks) require the implantation of a pacemaker in about one third of the cases during the evolution of the disease. A myocardial infiltration is detected in two third of the cases and is for a long time latent; it remains often limited to a diastolic dysfunction which can be responsible for hemodynamical difficulties during the LT; it evolves sometimes, late, towards a systolic dysfunction of bad prognosis. A combined liver-heart transplantation is proposed in cases of severe cardiac involvement which are contraindication to the LT only, essentially in forms "not met30". In every case of FAP, a regular cardiological follow-up is required for life, because of the progress of the cardiac involvement, which is not always stopped by the liver transplantation. The symptomatic treatments are indispensable to improve the quality of life of the patients: neurogenic pains, urinary disorders, liqueurs, sexual impotence, postural hypotension. The familial screening of the carriers of the TTR gene mutation and their regular follow-up by appropriate clinical examination and complementary investigations are major to detect early the onset of the disease to start as soon as possible specific therapy.

Epithelial cells are key components for a plethora of vital functions in mammals, in particular because they can polarize and cohesively interact in a dynamic manner. These properties, grouped under the term of « Epithelial plasticity », can manifest themselves in different ways of which the most complex is Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT), a process that drives a cohesive epithelial cell (or a group of cells) to strongly modify its organization and its protein composition, in order to gain migratory capacities. Such morphological changes have been first described during embryogenesis and are known to be under control of a series of transcription factors, some of which are also expressed during tumor progression. SNAIL1 factor (or SNAIL), whose role is determinant in many organogenesis steps, is also highly expressed at the invasive edge of several carcinoma and seems to participate in cancer cells dissemination. During the EMT process, SNAIL1 expression and localization, as well as its transcriptional activity, are under control of a complex regulation involving different post-translational modifications including phosphorylation. Therefore, the goal of my thesis was to understand regulation mechanisms of SNAIL1 by the protein-kinase CK2 in the context of EMT programs induction. This work was performed in two steps, of which the first was a biochemical characterisation of SNAIL1 phosphorylation by CK2 and its regulation by the CK2β regulatory subunit. In a second time, I focused on the consequences of CK2 inhibition by RNA interference in MCF10A mammary epithelial cells. This model highlighted the determining role of CK2β in maintaining epithelial phenotype and a cohesive architecture within MCF10A cells in vitro. Collectivelly, these findings suggest that protein- kinase CK2, under control of its regulatory subunit CK2β, acts as a negative regulator of SNAIL1 transcriptional level and protein stability in order to set against EMT induction., Les cellules épithéliales sont à la base de nombreuses fonctions vitales chez les mammifères, en particulier grâce à leurs propriétés de polarisation et de cohésion dynamiques regroupées sous le terme de « Plasticité Epithéliale ». Une manifestation originale de cette plasticité est la Transition Epithélio-Mésenchymateuse (EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition), un processus complexe qui permet à une cellule épithéliale (ou un groupe de cellules) de modifier sa composition et l'organisation de ses protéines pour se détacher de la masse cellulaire à laquelle elle appartient, et ainsi acquérir une organisation de type fibroblastique propice à la motilité cellulaire. Ce phénomène, initialement mis en évidence pour son rôle dans le développement embryonnaire, met en jeu une régulation fine, sous le contrôle de facteurs de transcription dont certains semblent également jouer un rôle au cours de la progression tumorale. Le facteur SNAIL1 (ou SNAIL), dont le rôle est déterminant au cours de la mise en place de nombreux organes, est également fortement exprimé au niveau du front invasif de certains carcinomes et pourrait participer à la dissémination des cellules cancéreuses au sein de l'organisme. Au cours de l'EMT, son expression, sa localisation et son activité sont soumises à une régulation complexe qui implique plusieurs modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes de régulation de SNAIL1 par la protéine-kinase CK2 au cours de l'EMT. Ce travail a été réalisé en deux étapes dont la première fût une caractérisation biochimique de la phosphorylation de SNAIL1 par CK2 et sa régulation par la sous-unité régulatrice CK2β. Dans un deuxième temps, je me suis penché sur l'étude des conséquences de l'inhibition du complexe CK2 par ARN interférence dans les cellules épithéliales mammaires MCF10A. Ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle déterminant de CK2β dans le maintien de l'expression d'un phénotype épithélial et d'une architecture cohésive au sein des cellules MCF10A en culture in vitro. L'ensemble de ces résultats suggère en effet que la protéine-kinase CK2, sous le contrôle de sa sous-unité régulatrice CK2β, exerce une régulation négative sur le niveau d'expression transcriptionnelle et la stabilité protéique de SNAIL1 visant à s'opposer à l'induction de l'EMT.

Advances in chromosome dynamics have increased our understanding of the significant role of telomeres and telomerase in cancer. Telomerase is expressed in almost all cancer cells but is inactive in most normal somatic cells. Therefore, telomerase is an important target for the design of therapeutic agents that might have minimal side effects. Herein, we evaluate current approaches to telomerase/telomere-targeted therapy, discuss the benefits and disadvantages, and speculate on the future direction of telomerase inhibitors as cancer therapeutics.

Background: MicroRNAs (miRNAs), small RNA molecules of approximately 22 nucleotides, have been shown to be up- or downregulated in specific cell types and disease states. These molecules have become recognized as one of the major regulatory gatekeepers of coding genes in the human genome. Content: We review the structure, nomenclature, mechanism of action, technologies used for miRNA detection, and associations of miRNAs with human cancer. miRNAs are produced in a tissue-specific manner, and changes in miRNA within a tissue type can be correlated with disease status. miRNAs appear to regulate mRNA translation and degradation via mechanisms that are dependent on the degree of complementarity between the miRNA and mRNA molecules. miRNAs can be detected via several methods, such as microarrays, bead-based arrays, and quantitative real-time PCR. The tissue concentrations of specific miRNAs have been associated with tumor invasiveness, metastatic potential, and other clinical characteristics for several types of cancers, including chronic lymphocytic leukemia, and breast, colorectal, hepatic, lung, pancreatic, and prostate cancers. Summary: By targeting and controlling the expression of mRNA, miRNAs can control highly complex signal-transduction pathways and other biological pathways. The biologic roles of miRNAs in cancer suggest a correlation with prognosis and therapeutic outcome. Further investigation of these roles may lead to new approaches for the categorization, diagnosis, and treatment of human cancers.

The lytic cycle of EBV plays an important role in pathologies associated with this virus. Involved in manufacturing of the viral capsid, protease (PR) is essential for infectious virions production. It represents thereby a prime target for a therapeutic strategy to inhibit viral replication. In this work, the therapeutic efficiency of siRNA targeting EBV-PR was tested on 293 epithelial cells transfected with EBV B95-8 genome. The decrease of PR mRNA was measured by quantitative RT-PCR, the amount of expressed protein by Western blot, and the number of produced infectious viral particles by super-infection of Raji cells. The efficiency of the best siRNA anti-PR was compared to that of anti-DNA polymerase anti-CMV drug and then assessed in combination with siRNA targeting other lytic cycle proteins of EBV. The anti-PR siRNA tested here allow getting a 70% decrease of PR mRNA, 35% of protein and 95% of infectious viral particles number. Compared to anti-DNA polymerase, only the siRNA anti-PR enables a significant reduction of infectious viral particles number and its association with ganciclovir increases even more its effectiveness (p, Le cycle lytique de l'EBV joue un rôle important dans les pathologies associées à ce virus. Participant à la fabrication de la capside virale, la protéase (PR) est essentielle à la production de virions infectieux. Elle représente ainsi une cible de choix pour une stratégie thérapeutique visant à inhiber la réplication virale. Dans ce travail, l'efficacité thérapeutique de siRNA ciblant EBV-PR a été évaluée sur des cellules épithéliales 293 transfectées avec le génome d'EBV B95-8. La diminution de l'ARNm PR a été mesurée par RT-PCR quantitative, la quantité de protéine exprimée, par Western blot, et le nombre de particules virales infectieuses produites, par sur-infection de cellules Raji. L'efficacité du meilleur siRNA anti-PR a été comparée à celle de drogues anti-ADN polymérase anti-CMV puis évaluée en combinaison avec des siRNA ciblant d'autres protéines du cycle lytique d'EBV. Les siRNA anti-PR testés ici permettent d'obtenir une diminution de 70% de l'ARNm PR, de 35% de la protéine et de 95% du nombre de particules virales infectieuses. Comparés aux anti-ADN polymérase, seul le siRNA anti-PR permet d'obtenir une diminution significative de nombre de particules virales infectieuses et son association au ganciclovir permet encore d'augmenter cette efficacité (p

Polyglutamine expansion diseases are adult-onset inherited neurodegenerative disorders that lead to death 10 to 20 years after the first symptoms. Currently, there is no therapy to fight against these diseases. They include Huntington's disease, spinobulbar muscular atrophy, dentatorubral-pallido-luysian atrophy and six types of spino-cerebellar ataxia. The diseases are caused by a unique mutational mechanism: an expansion of the CAG trinucleotide in the corresponding genes coding for an expanded tract of glutamine in the mutated proteins. Polyglutamine expansion confers to the mutant proteins toxic properties that cause neuronal cell death in brain regions specific to each disease. Thanks to cellular and animal models (fly, fish, mouse and rat) of these diseases, we have considerably improved our understanding of the toxic nature of polyglutamine expansion and the physiopathology, and we are now in position to design and test therapeutic strategies to prevent or delay the disease process.

Les moustiques anophèles sont les vecteurs du parasite Plasmodium l’agent du paludisme. Le parasite subit des pertes massives pendant son cycle de développement chez l’anophèle, ce qui suggère que les moustiques sont capables de développer une réaction immunitaire efficace contre le parasite. La connaissance de l’immunité et de la résistance des moustiques au genre Plasmodium provient principalement de systèmes de laboratoire qui utilisent des espèces de parasites de rongeurs ou d’oiseaux comme modèles du paludisme humain. Les observations présentées dans cette thèse suggèrent que certains gènes comme Tep1 et LRIM1 sont des médiateurs de réponses antiparsitiques contre différents Plasmodiums dans différents vecteurs. Cependant, le degré d'efficacité avec laquelle un moustique est capable de réduire le nombre de parasites peut être variable surtout entre combinaison de souche de moustique et de souche de parasite différentes, selon que la paire soit hautement compatible ou non., Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Résumé La recherche antivirale est une discipline encore récente et le nombre de molécules disponibles pour lutter contre les infections virales demeure insuffisant. Pourtant, tant les pathologies causées par des virus endémiques ou émergents que l’existence de résistance de certains virus aux antiviraux rendent indispensables une recherche constante de nouvelles molécules antivirales. Parallèlement à la mise au point des molécules traditionnelles tels que les analogues nucléosidiques, dont l’efficacité n’est plus à démontrer, l’industrie pharmaceutique se tourne aujourd’hui vers de nouvelles solutions antivirales telles que les peptides, qui constituent un nouveau champ d’exploration pour la thérapie. Les progrès importants et récents de disciplines comme la génomique, la protéomique ou la biologie structurale ont permis d’améliorer notre connaissance fondamentale du monde viral. Ces progrès peuvent être mis à profit pour créer de façon rationnelle de nouveaux médicaments plus sélectifs et plus efficaces. L’identification et la mise au point de ces molécules nécessitent l’utilisation de techniques récentes comme le criblage à haut-débit de banques de composés combinatoires où l’utilisation de nouveaux outils bioinformatiques. Cette revue a pour but de présenter certaines méthodes récentes de mise au point de molécules antivirales.

RNA silencing is a conserved eukaryotic process mediated by small RNA molecules that inhibit gene expression at the transcriptional, mRNA-stability or translational level through sequence-specific interactions. Diverse roles have been identified for RNA silencing such as genome defense against mobile DNA elements or down-regulation of specific factors during plant and animal development. In plants, RNA silencing plays a crucial role in antiviral defense by inhibiting viral accumulation and sometimes preventing systemic infection. As a counter-defense mechanism, viruses have evolved anti-silencing strategies through the production of viral suppressors of RNA silencing. Here we review the mechanism of RNA silencing and its inhibition during plant/virus interactions and suggest the possible consequences of this molecular arms race on the evolution of both viral and host genomes.

Photodynamic therapy (PDT) is a treatment modality against small localized tumors, based on the combined action of a photosensitizer (PS), light and oxygen. A new method of PDT, the VTP (vascular targeted photodynamic therapy) was studied. The purpose of our strategy is to promote the anti-vascular effect of PDT by targeting the tumor vasculature. We studied the behaviour of the tetraphenylchlorine (TPC) conjugated, via the Ahx spacer, to a VEGF co-receptor (neuropilin-1) specific heptapeptide (ATWLPPR), in vitro and in vivo. A comparative study of TPC versus the conjugated PS, TPC-Ahx-ATWLPPR, allowed us to identify in vitro, using a technique of RNA interference-mediated silencing of NRP-1, a receptordependent uptake of the conjugate. In vivo, a preferential accumulation of TPC-Ahx-ATWLPPR in endothelial cells and its anti-vascular effect were demonstrated. A study of stability in vitro and in vivo of the conjugate was conducted. In vivo, the peptide sequence was degraded 4 h after intra-venous injection. Pharmacokinetics and tissue biodistribution studies of TPC-Ahx ATWLPPR and its main degradation product, TPC-Ahx-A, was performed in bearing nude mice. The degradation process of the peptide is important in the organs of the reticuloendothelial system, where the accumulation of the conjugate is majority. In order to improve in vivo stability of the targeting-peptide, new peptides were design and tested. The pseudopeptide Aψ[CH2NH] TWLPPR bound NRP-1, and after coupling with the PS, no degradation is observed in plasma in vivo 4 h after intra-venous injection., La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l'action conjuguée d'un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l'oxygène. Dans le cadre d'un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l'effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d'un corécepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d'ARN interférence visant à éteindre l'expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur dépendante du conjugué. In vivo, l'accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l'endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l'accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d'augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide Aψ[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse.

microRNAs constitute one of the most important discovery in the past few years in the field of gene expression regulation. They can precisely regulate the expression of a specific protein by inhibiting its translation and/or promoting the degradation of its mRNA. In several cancers, the expression of some microRNAs is misregulated, pointing toward the existence of microRNAs with oncogenic or tumour suppressor properties. The miR-17-92 miRNA cluster has been reported to have a pro-oncogenic role in a mouse model system of Myc-induced B cell lymphoma. Some of its targets mRNAs code for proteins with pro-apoptotic or anti-proliferative functions, which shed some light on the mechanism of action of this cluster. On the other hand, a tumour suppressor miRNA like let-7 targets mRNAs coding for oncogenes and is frequently down-regulated in cancers. The finding that c-Myc controls the expression of several of these microRNAs reveals new information on how misregulation of this proto-oncogene can promote tumorigenesis.

14-3-3 proteins are ubiquitous proteins highly conserved among eukaryotes. They are involved in the regulation of several cellular processes by modifying the function and the localization of many targeted proteins. FTT-1 and FTT-2 are the two 14-3-3 orthologs identified in C. elegans. We showed that FTT proteins are involved in the main longevity pathway of C. elegans : the AF-2/Insulin/IGF-1-like pathway which also regulates stress resistance and metabolism through the activity of its final effector DAF-16, the ortholog of the Forkhead transcription factor in mammals. This PhD work allowed us to determine the specific functions of each FTT protein in the different phenotypes conferred by this pathway and to highlight the prominent role of FTT-2. Moreover, our data revealed the additional implication of FTT-2 in the regulation of lifespan and lipid metabolism, and the contribution of both FTT proteins in stress resistance, by a mechanism distinct from the DAF-2/Insulin/IGF-1-like pathway and independant of DAF-16. Taking together, our results enhance the complexity of FTT functions and demonstrate their involvement in several processes essential for worms survival, not only under stress conditions, but also during normal aging.; Les protéines 14-3-3 sont des protéines ubiquitaires conservées chez tous les eucaryotes. Elles interagissent avec de multiples partenaires, dont elles modulent la fonction et la localisation, et interviennent de ce fait dans de nombreux processus cellulaires. FTT-1 et FTT-2 sont les deux orthologues de 14-3-3 présents chez Caenorhabditis elegans. En utilisant l'approche de RNA interférence, nous avons montré que les protéines FTT sont impliquées dans la voie DAF-2/Insuline/IGF-1, régissant la longévité, la résistance au stress et le métabolisme chez C. elegans, et dont l'effecteur majeur est le facteur de transcription DAF-16, orthologue de Forkhead chez les mammifères. Ce travail de thèse a permis de caractériser les fonctions de chacune des protéines FTT dans la régulation des différents phénotypes engendrés par cette voie et de mettre en évidence le rôle prépondérant de FTT-2. D'autre part, nos données ont révélé la contribution supplémentaire de FTT-2 dans la régulation de la longévité et du métabolisme lipidique et de FTT-1 et FTT-2 dans la résistance au stress, à travers un mécanisme parallèle à la voie DAF-2/Ins/IGF-1 et ne mettant pas en jeu DAF-16. Les résultats de notre étude soulignent la complexité des fonctions des protéines FTT et démontrent leur participation à plusieurs processus importants pour la survie de C. elegans lors d'une exposition à un stress mais aussi lors du vieillissement physiologique du nématode.

Clustered, Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) system is a putative RNA-interference-based immune system conferring an acquired resistance against foreign DNA agressions in prokaryotes. It consists of a succession of highly conserved regions (DR) varying in size from 23 to 47 bp, separated by similarly sized unique sequences (spacer) of usually viral origin. Polymorphism can be observed in different strains of a species and may be used for genotyping. This thesis describes three bioinformatics tools available freely on the web (http://crispr.u-psud.fr) and their applications for the CRISPR investigations and typing. The first one is CRISPRFinder, a tool that allows the identification of CRISPRs from published genomes. The second one is CRISPRdb, a database of CRISPRs in the sequenced prokaryotes and several associated tools to facilitate its query and the CRISPRs investigations. The third tool is CRISPRcompar for the identification and comparison of CRISPRs loci and their component determination., Les CRISPRs constituent une famille particulière d'éléments génétiques, retrouvés dans de nombreux génomes de procaryotes (la moitié des bactéries et presque toutes les archées). Des études récentes suggèrent que cette structure représente un système de défense contre les ADNs étrangers fonctionnant grâce à un mécanisme d'interférence ARN. Les CRISPRs consistent en la succession de régions très bien conservées (DR) dont la taille varie de 23 à 47 pb, séparées par des séquences uniques d'une taille similaire et ayant en général une origine virale. Le polymorphisme observé entre différentes souches de la même espèce fait du CRISPR un marqueur génétique intéressant pour des analyses comparatives de souches bactériennes très proches et pour des études phylogénétiques. Cette thèse décrira trois outils bioinformatiques accessibles à l'adresse (http://crispr.u-psud.fr) et leurs applications dans l'investigation et le typage des CRISPRs. Le premier outil est CRISPRFinder qui est un programme d'identification des CRISPRs à partir des séquences génomiques. Le deuxième est la base de données CRISPRdb et ses utilitaires qui fournissent un accès aux CRISPRs de tous les génomes procaryotes séquencés. le troisième outil est CRISPRcompar qui sert à identifier et comparer les CRISPRs dans des génomes proches pour faciliter la procédure de typage.