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Neuroendocrine cells secrete hormones and neuropeptides through calcium-regulated exocytosis, controlled especially by Rho GTPases. Neuroendocrine tumours, such pheochromocytomas, are generally associated with a dysfunction of secretion. Although this aspect is well known by clinicians, it has never been explored at the molecular level. Moreover, the potential link between secretion and tumour development remains uninvestigated. Altogether, our results demonstrate for the first time the importance of secretion in tumor development of pheochromocytomas and an alteration of the Rho GTPase pathway, by demonstrating a link between the inhibition of Rac1 and Cdc42 activity observed in pheochromocytomas and the decrease of their activators ARHGEF1 and FARP1 expression., La sécrétion d'hormones et de neuropeptides par les cellules neuroendocrines est assurée par un processus d'exocytose, contrôlé notamment par les GTPases Rho. La compréhension des mécanismes moléculaires régulant la sécrétion neuroendocrine est primordiale. En effet, la majorité des cancers neuroendocrines tels que les phéochromocytomes, sont associés à une perturbation du processus de sécrétion. Actuellement, les mécanismes moléculaires qui induisent de telles perturbations de la sécrétion ainsi que l’impact de l’activité sécrétrice sur le développement des tumeurs neuroendocrines ne sont pas élucidés. Mes travaux de thèse proposent pour la première fois un lien fonctionnel direct entre l'activité sécrétrice des cellules et la vitesse de développement des phéochromocytomes ainsi qu’une altération des voies moléculaires impliquant certaines protéines Rho, en démontrant un lien entre la baisse de l’activité de Rac1 et Cdc42 observée dans les phéochromocytomes et la diminution de l’expression de leurs régulateurs ARHGEF1 et FARP1.

RhoA, Rac1, and Cdc42, the founding members of the Rho subfamily of small GTPases, have been the focus of many research studies since the first discovery of their primary roles in the reorganisation of the actin cytoskeleton. Since then, it is clear that they are involved in a great deal of cellular functions, including cell migration and adhesion, cell growth control, and membrane trafficking. The complete sequencing of the human genome has now highlighted a total of 20 genes encoding Rho-like proteins. Little is known about their distinct cellular functions, however, numerous studies are now beginning to unravel that each of the Rho GTPase must play a specific role in the cell in a timely and spatially regulated fashion. Here, we are presenting a brief overview of the distinct functional roles and similarities known to date for each of the Rho members.

In an attempt to understand the role of Rho GTPases and their regulators in hematopoietic cell lines, expression levels of 300 genes were analyzed for proteins involved in Rho dependent signaling pathways from patients with T-ALL leukemia.It was shown that a group of genes consisting of RacGAP1, Ect2 and Citron varied concomitantly. With the exception of ARHGAP19, all already had a known function during mitosis. Consequently, it was decided to characterize ARHGAP19, which according to databases is specific of hematopoietic cell lines, and whose function was unknown. In order to determine the biological function of ARHGAP19, a specific antibody has been generated. This allowed us to demonstrate that the level of expression of the protein vary during the cell cycle and its localization varies during mitosis. In addition, we have shown that ARHGAP19 plays a central role in regulating cell shapes changes, sister chromatids segregation and RhoA effectors membrane recruitment during mitosis. We have also shown that this occurs by a previously undescribed pathway involving RhoA-ROCK-Vimentin.Finally, we have demonstrated that ARHGAP19 is a substrate of CDK1. It is phosphorylated on two residues located in the C-Terminal region of the protein. For investigating the role of these phosphorylations, we have generated Kit225 cell lines transfected with plasmids coding for the non-phosphorylable forms of the protein. This allowed us to show that phosphorylation of residue T404 and T476 are involved preventing GAP19 recruitment at the equatorial cell cortex during mitosis.In addition, we have observed the formation of chromatin bridges, as well as an increase in multinucleated cells. Thus, we have performed cytogenetic experiments for determining if chromatin bridges are due to chromosome condensation defects, or replicative stress. Finally, a possible tertiary structure of ARHGAP19 has been created de novo, and molecular dynamics simulations were generated in order to understand the role of these phosphorylations by CDK1 at a structural level., Dans le but de déterminer le rôle des Rho GTPases et de leurs régulateurs dans les cellules hématopoïétiques, une analyse des niveaux d’expressions de 300 gènes codant pour des protéines impliquées dans les voies de signalisation dépendantes de Rho a été faite à partir d’échantillons de patients atteints de leucémies de type T-ALL. Il a ainsi pu être mis en évidence qu’un groupe de gènes incluant notamment RacGAP1, Ect2, Citron et ARHGAP19 variaient parallèlement. A l’exception de ARHGAP19, ces gènes avaient une fonction connue au cours de la mitose. Il a donc été entrepris de caractériser ARHGAP19 qui, d’après les banques de données, est spécifique du système hématopoïétique, et pour laquelle aucune fonction n’avait encore été déterminée.Afin de déterminer la fonction biologique de GAP19, un anticorps a été généré. Cet outil nous a permis de montrer que l’expression de la protéine est régulée au cours du cycle cellulaire et que sa localisation varie au cours de la mitose. Par ailleurs, nous avons montré que GAP19, joue un rôle essentiel dans le changement de forme des lymphocytes en mitose, la ségrégation des chromatides sœurs et le recrutement membranaire des effecteurs de RhoA au cours de la mitose. Nous avons aussi mis en évidence le mécanisme par lequel GAP19 permet le changement de forme dans les lymphocytes.Nous avons aussi montré que GAP19 est phosphorylée par CDK1 sur deux résidus présents dans la partie C-Terminale. Afin de mettre en évidence le rôle de ces phosphorylations, nous avons généré des cellules Kit225 transfectées avec des plasmides pour les formes non-phosphorylables de la protéine. Ceci nous a permis de mettre en évidence que la phosphorylation des résidus T404 et T476 permet la localisation cytoplasmique de GAP19 en début de mitose. Nous avons aussi pu observer lors de l’anaphase la formation de ponts de chromatines, ainsi qu’une augmentation significative de cellules multinucléées. Par ailleurs, nous avons procédé à des expériences de cytogénétique et d’immunofluorescence afin de déterminer, si les ponts de chromatines avaient pour origine soit des défauts de condensation de la chromatine, soit un stress réplicatif.Enfin, un possible modèle de la protéine ARHGAP19 a été généré et des simulations de dynamiques moléculaires réalisées afin de comprendre le rôle des phosphorylations par CDK1 a un niveau structurel.

Rnd3 protein is an atypical member of the Rho GTPase family, devoid of GTPase activity and constitutively active and bound to GTP. Rnd3 regulation does not occur through the classical GTPase cycle but is achieved at transcriptional, posttranscriptional or translational level. Rnd3 is underexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC), and this down-regulation increases HCC cell invasion and is linked to HCC progression. The aim of this thesis project was to better decipher the mechanisms involved in Rnd3 expression in tumor cells, and particularly in HCC cells. In a first part, Rnd3 regulation by β-catenin was studied. β-catenin is found mutated in one third of HCC, and activating β-catenin mutations in human HCC correlates with the lowest levels of Rnd3. An original model established in HepG2 cells allowed the study of the involvement of WT β-catenin versus mutated β-catenin in the regulation of Rnd3 expression.Interestingly, our results demonstrated that both forms of ß-catenin independently regulate Rnd3 mRNA expression. The WT β-catenin regulates Rnd3 at the transcriptional level, whereas the mutated β-catenin acts through the 3’UTR of Rnd3 mRNA. The second and main part of this thesis project was the study of the regulation of Rnd3 expression by the mechanotransduction pathway MRTF/SRF. The activation of this signaling pathway is tightly regulated by actin cytoskeleton, and the MRTF/SRF pathway directs in return the expression of a huge number of genes involved in actin dynamics. Our results uncovered Rnd3 as a new direct target of MRTF/SRF pathway in tumor cells. Indeed, upon actin dynamics changes, MRTF/SRF is able to bind Rnd3 promoter in order to favor its expression. As Rnd3 also acts as a regulator of the actin cytoskeleton, our results highlight Rnd3 at the center of a feedback loop of the MRTF/SRF mechanotransduction pathway. Taken together, all of the results obtained helped to better decipher the mechanisms of Rnd3 regulation in tumor cells., La protéine Rnd3 est un membre atypique de la famille des Rho GTPases. Dénuée d’activité GTPasique, elle est ainsi constitutivement sous forme active et liée au GTP. La régulation de cette protéine ne passe donc pas par le cycle classique des Rho GTPases mais par d’autres mécanismes transcriptionnels, post-transcriptionnels ou encore traductionnels. Dans le carcinome hépatocellulaire (CHC), Rnd3 est significativement sous-exprimée, et cette sous-expression procure un avantage invasif aux hépatocytes. Ce projet de thèse avait pour objectif de déterminer plus précisément les mécanismes à la base de la régulation de Rnd3 dans les cellules tumorales, et notamment les cellules dérivées de carcinome hépatocellulaire. Les travaux de cette thèse ont été divisés en deux axes principaux. Dans une première partie, la régulation de Rnd3 par la β-caténine a été étudiée. En effet, la β-caténine est retrouvée mutée dans plus d’un tiers des CHC, et la présence de mutations activatrices de la β-caténine corrèle avec un faible niveau d’expression de Rnd3 dans les CHC. L’établissement d’un modèle original dans les cellules de CHC, HepG2, a permis d’étudier indépendamment l’implication de la β-caténine sauvage et la β-caténine mutée dans la régulation d’expression de Rnd3. Ce modèle a permis de mettre en évidence une régulation différentielle de Rnd3 par les deux formes de la β-caténine, la forme sauvage régulant Rnd3 au niveau transcriptionnel, et la forme mutée régulant Rnd3 au niveau post-transcriptionnel. La deuxième partie de ce travail, qui constitue la partie principale du projet, s’est intéressée à la régulation de Rnd3 par la voie de mécanotransduction MRTF/SRF. L’activation de cette voie de signalisation est très intimement reliée à l’organisation du cytosquelette d’actine, et cette voie régule en retour l’expression de nombreux gènes impliqués dans la dynamique de l’actine. Les résultats obtenus ont permis de déterminer Rnd3 comme une nouvelle cible directe de la voie MRTF/SRF dans les cellules tumorales, et placent Rnd3 au centre d’une boucle de régulation de cette voie de mécanotransduction. L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce projet de thèse ont permis de mieux caractériser la régulation de l’expression de Rnd3 dans les cellules tumorales.

Rnd3 protein is an atypical member of the Rho GTPase family, devoid of GTPase activity and constitutively active and bound to GTP. Rnd3 regulation does not occur through the classical GTPase cycle but is achieved at transcriptional, posttranscriptional or translational level. Rnd3 is underexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC), and this down-regulation increases HCC cell invasion and is linked to HCC progression. The aim of this thesis project was to better decipher the mechanisms involved in Rnd3 expression in tumor cells, and particularly in HCC cells. In a first part, Rnd3 regulation by β-catenin was studied. β-catenin is found mutated in one third of HCC, and activating β-catenin mutations in human HCC correlates with the lowest levels of Rnd3. An original model established in HepG2 cells allowed the study of the involvement of WT β-catenin versus mutated β-catenin in the regulation of Rnd3 expression.Interestingly, our results demonstrated that both forms of ß-catenin independently regulate Rnd3 mRNA expression. The WT β-catenin regulates Rnd3 at the transcriptional level, whereas the mutated β-catenin acts through the 3’UTR of Rnd3 mRNA. The second and main part of this thesis project was the study of the regulation of Rnd3 expression by the mechanotransduction pathway MRTF/SRF. The activation of this signaling pathway is tightly regulated by actin cytoskeleton, and the MRTF/SRF pathway directs in return the expression of a huge number of genes involved in actin dynamics. Our results uncovered Rnd3 as a new direct target of MRTF/SRF pathway in tumor cells. Indeed, upon actin dynamics changes, MRTF/SRF is able to bind Rnd3 promoter in order to favor its expression. As Rnd3 also acts as a regulator of the actin cytoskeleton, our results highlight Rnd3 at the center of a feedback loop of the MRTF/SRF mechanotransduction pathway. Taken together, all of the results obtained helped to better decipher the mechanisms of Rnd3 regulation in tumor cells., La protéine Rnd3 est un membre atypique de la famille des Rho GTPases. Dénuée d’activité GTPasique, elle est ainsi constitutivement sous forme active et liée au GTP. La régulation de cette protéine ne passe donc pas par le cycle classique des Rho GTPases mais par d’autres mécanismes transcriptionnels, post-transcriptionnels ou encore traductionnels. Dans le carcinome hépatocellulaire (CHC), Rnd3 est significativement sous-exprimée, et cette sous-expression procure un avantage invasif aux hépatocytes. Ce projet de thèse avait pour objectif de déterminer plus précisément les mécanismes à la base de la régulation de Rnd3 dans les cellules tumorales, et notamment les cellules dérivées de carcinome hépatocellulaire. Les travaux de cette thèse ont été divisés en deux axes principaux. Dans une première partie, la régulation de Rnd3 par la β-caténine a été étudiée. En effet, la β-caténine est retrouvée mutée dans plus d’un tiers des CHC, et la présence de mutations activatrices de la β-caténine corrèle avec un faible niveau d’expression de Rnd3 dans les CHC. L’établissement d’un modèle original dans les cellules de CHC, HepG2, a permis d’étudier indépendamment l’implication de la β-caténine sauvage et la β-caténine mutée dans la régulation d’expression de Rnd3. Ce modèle a permis de mettre en évidence une régulation différentielle de Rnd3 par les deux formes de la β-caténine, la forme sauvage régulant Rnd3 au niveau transcriptionnel, et la forme mutée régulant Rnd3 au niveau post-transcriptionnel. La deuxième partie de ce travail, qui constitue la partie principale du projet, s’est intéressée à la régulation de Rnd3 par la voie de mécanotransduction MRTF/SRF. L’activation de cette voie de signalisation est très intimement reliée à l’organisation du cytosquelette d’actine, et cette voie régule en retour l’expression de nombreux gènes impliqués dans la dynamique de l’actine. Les résultats obtenus ont permis de déterminer Rnd3 comme une nouvelle cible directe de la voie MRTF/SRF dans les cellules tumorales, et placent Rnd3 au centre d’une boucle de régulation de cette voie de mécanotransduction. L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce projet de thèse ont permis de mieux caractériser la régulation de l’expression de Rnd3 dans les cellules tumorales.

The motility of naive T lymphocytes between the blood and secondary lymphoid organs is essential to the efficiency of the adaptative immune response, and allows those cells to meet their cognate antigen. Numerous signaling pathways are involved in this phenomenon, such as Rho GTPases, modulators of the actin cytoskeleton. We have identified Fam65b as a new regulator of T lymphocytes recirculation. We have shown that a decrease of Fam65b expression in human primary T cells increases the morphological polarization, the adhesion and the in vitro migration of those cells. Looking for a more physiological model, we developed, in the lab, a Fam65b KO (Knock-Out) mouse, specific to the T lineage. In those animals, T cells showed decreased levels of F-actin, an increase in the display of L-selectin and integrins, and a slower and less straight migration, compared to WT (Wild-Type) T cells. On the other hand, we weren't able to see any significant differences in the morphological polarisation, the in vitro migration or the homing capacity of the Fam65b KO T cells. We have identified Rho GTPases as mediators of the effects of Fam65b. We showed, in flow cytometry, that the amount of RhoA-GTP and Rac-GTP are increased in the Fam65b KO cells. The RhoA-GTP levels are also increased in human primary T cells expressing low levels of Fam65b. We have identified, in in vitro experiments, that Fam65b slows down RhoA loading with GTP by its GEF proteins, thus inhibiting RhoA activity. Moreover, we showed that Fam65b dissociates from RhoA after chemokine stimulation of T cells, thus allowing RhoA activation. The phosphorylation of Fam65b is a probable cause to this phenomenon. Fam65b also dissociates from Rac1 in these conditions, although no mechanism is yet known. Furthermore, the transcription factor FOXO1 controls the expression of Fam65b. FOXO1 is also known to control the homing capacity of T cells, since it controls the expression of molecules involved in the entry of lymphocytes in the lymph nodes. Fam65b, an atypical regulator of Rho GTPases activity, thus represents a new connection between the PI3K/FOXO1 and the Rho GTPases pathways., L’efficacité de la réponse immunitaire adaptative repose tout particulièrement sur la motilité des lymphocytes T naïfs entre la circulation sanguine et les organes lymphoïdes secondaires, leur permettant ainsi de rencontrer un antigène spécifique. De nombreuses voies de signalisation sont impliquées dans ce phénomène. En particulier, les Rho GTPases y jouent un rôle central, par leur capacité à moduler le cytosquelette d’actine. Nous avons identifié la protéine Fam65b comme nouveau régulateur de la circulation des lymphocytes T. En effet, nous avons montré que la diminution de l’expression de Fam65b dans des LT primaires humains induit une augmentation de leur polarisation, leur adhésion et leur migration in vitro. Afin d’étudier son rôle dans un contexte plus physiologique, nous avons développé au laboratoire une souris Fam65b-/-, dans laquelle l’expression de Fam65b est supprimée dans le lignage T. Les lymphocytes T issus de ces souris présentent un contenu global en F-actine réduit, une plus grande quantité de L-sélectine et d’intégrines actives à leur surface, et une migration moins rapide et moins rectiligne que leurs équivalents WT. Nous n’avons pu observer, avec nos méthodes, aucune différence significative de polarisation, de migration in vitro ou d’entrée dans les organes lymphoïdes secondaires pour les LT Fam65b-/-. Nous avons identifié les Rho GTPases comme médiateurs de ces effets de Fam65b. Nous avons observé, en cytométrie de flux, que les niveaux de RhoA-GTP et de Rac-GTP sont plus élevés dans les LT murins Fam65b-/-, et que cela est aussi vrai pour RhoA-GTP dans les LT humains exprimant de faibles niveaux de Fam65b. Nous avons identifié, dans des expériences in vitro, le mécanisme par lequel Fam65b inhibe l’activité de RhoA, puisqu’il ralentit sa charge en GTP par les protéines GEF. Nous avons montré, par des techniques de biochimie, que l’activation de RhoA en aval d’une stimulation chimiokine est permise par la dissociation de RhoA et de Fam65b, probable conséquence de la phosphorylation de Fam65b. Cette dissociation a aussi été observée pour Fam65b et Rac1, mais les mécanismes mis en jeu restent à déterminer. D’autre part, l’expression de Fam65b est sous le contrôle du facteur de transcription FOXO1, connu pour son rôle dans le contrôle de l’écotaxie (homing) via la régulation de l’expression de molécules permettant l’entrée dans les ganglions lymphatiques. Fam65b, régulateur atypique de l’activité des Rho GTPases, représente donc un lien inédit entre la voie PI3K/FOXO1 et les Rho GTPases.

The inhibitor of apoptosis protein cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis protein-1) from the IAP family (Inhibitor of Apoptosis Protein) is an oncogene with an E3 ubiquitin ligase activity. cIAP1 is relocalized from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation of many kind of cellular models (macrophages, dendritic cells, colon epithelial cells, hematopoietic stem cells, cardiomyocytes) and this relocalization is associated with a proliferation arrest. The well-known functions of cIAP1 are associated with its cytoplasmic localization, where it regulates the TNFa receptors and NF-?B signaling pathways. However, cIAP1 is mainly expressed in the nucleus on many cell types which is not in accordance with its cell signalling activity. My work identifies a function of cIAP1 in proliferation regulation. cIAP1 interacts with E2F1 transcription factor and favors its recruitment on Cyclins E and A promoters, both involved in G1/S and G2 phases of the cell cycle, which leads to high level of transcript and protein expression of these two targets. It seems that cIAP1 regulates the cellular proliferation and is important for the balance between proliferation and differentiation, two mechanisms tightly connected in cells. In a second work, we showed that cIAP1 is critical for actin cytoskeleton modification upon TNF-a treatment. In fibroblasts, TNF-a induce filipodia formation, a process regulated by cdc42. Our work showed that cIAP1, when associated with its partner TRAF2, interact and control cdc42 activation, a member of Rho GTPases protein family. We also observed that cIAP1 regulates HRas driven oncogenic transformation and increases the motility and invasiveness of the cells. These new functions of cIAP1 in the control of transcription factor and cell cytoskeleton could be important for its oncogenic properties., La protéine cIAP1 (cellular Inhibitor of Apoptosis Protein-1) de la famille des IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) est un oncogène avec une activité E3 ubiquitine ligase. Au cours de la différenciation de nombreux modèles cellulaires (macrophages, cellules dendritiques, cellules épithéliales du colon, cellules souches hématopoïetiques, cardiomyocytes), cIAP1 sort du noyau pour se relocaliser dans le cytoplasme, cette relocalisation étant associée à un arrêt de prolifération. La plupart des fonctions connues de cIAP1 sont liées à sa localisation cytoplasmique où il est un régulateur important des voies de signalisation des récepteurs du TNF-a et de NF-?B. Cependant, cIAP1 est principalement exprimée dans le noyau de différents types cellulaires ce qui n’est pas en accord avec son rôle dans la signalisation cellulaire. Mon travail de thèse a permis d’identifier un rôle de cIAP1 dans la prolifération cellulaire. cIAP1 interagit avec le facteur de transcription E2F1 et favorise son recrutement sur les promoteurs des Cycline E et A impliquées dans les transitions G1/S et G2 du cycle cellulaire, ce qui augmente l’expression des transcrits et des protéines de ces deux cibles. Il semblerait que par cette activité, cIAP1 régule la prolifération des cellules et soit important dans l’équilibre entre la prolifération et la différenciation, deux mécanismes cellulaires étroitement liés. Dans un second travail, nous avons montré que cAIP1 est déterminant dans le remodelage du cytosquelette d’actine en réponse au TNF-a. Dans les fibroblastes, le TNF-a induit la formation de fines protrusions membranaires riches en actine appelées filipodes, cette formation étant régulée par cdc42. Mes travaux ont montrés que cIAP1, associé à son partenaire historique TRAF2, régule la formation de ces filipodes. Il est capable d’interagir directement avec la RhoGTPase Cdc42 et de contrôler son activation après un traitement par le TNF- a, mais aussi par l’EGF. De plus, cIAP1 régule également la transformation oncogénique par HRas en augmentant les propriétés invasives et migratoires des cellules. Ces nouvelles fonctions de cIAP1 pourraient contribuer à ses propriétés oncogéniques.

The type III exoenzyme S toxin of Pseudomonas aeruginosa possesses a GAP domain (GTPase Activating Protein) (ExosGAP) inhibiting the Rho GTPases (Rho, Rac and Cdc42) and phagocytosis in Mammal cell lines. We have used a transgenesis approach in Drosophila melanogaster using a tissue-specific inducible expression system (UAS-Gal4) to express ExoSGAP. We have demonstrated that ExoSGAP targeted in vivo the Rho GTPases Rho, Rac1, Rac2 and Cdc42. The ExoSGAP expression affects fly resistance to infection by inhibiting phagocytosis of bacteria by plasmatocytes, a macrophage cell line, but has no effect on NF-kB signalling pathways. A genetic approach has allowed the identification of new ExoSGAP targets by looking for genes whose misexpression modifies the eye or wing phenotype induced by the toxin expression. We have identified several genes which can be implicated in JNK and NF-kB signalling pathways. All these results validate a new strategy to study type III toxins by transgenesis in Drosophila.In parallel, I have demonstrated GTPase Rac2 specificity in Drosophila resistance to infection. Rac2 participates notably in phagocytosis.The works of Dr. H. Tricoire led to the identification of 180 genes whose misexpression modifies fly response to oxidative stress. We have tested 105 of these lines for their resistance to infections to study a possible correlation between the oxidative and infectious stress response. This screen allows to demonstrate the implication of a protein with a lectin domain called PSLR (Pseudomonas Sensitive Lectin Receptor) in fly immunity., L'exoenzyme S, une toxine de type III, de Pseudomonas aeruginosa possède un domaine GAP (GTPase Activating Protein) (ExoSGAP) inhibant les Rho GTPases (Rho, Rac, Cdc42) et la phagocytose dans les cellules de Mammifères en culture. J'ai utilisé une approche de transgenèse chez Drosophila melanogaster en utilisant un système d'expression tissu-spécifique inductible (UAS-Gal4) afin d'exprimer ExoSGAP. Nous avons montré qu'ExoSGAP cible in vivo les Rho GTPases Rho, Rac1, Rac2 et Cdc42. ExoSGAP affecte la résistance des mouches aux infections en inhibant la phagocytose des bactéries par les plasmatocytes, des cellules de type macrophage, mais n'a pas d'effet sur les voies NF-kB. Une approche génétique a permis d'identifier de nouvelles cibles de la toxine, en recherchant des gènes dont la dérégulation modifie le phénotype d'œil ou d'aile induit par l'expression d'ExoSGAP. Nous avons identifié plusieurs gènes pouvant avoir un rôle dans les voies des JNK et NF-kB Ces résultats valident une stratégie d'étude des toxines de type III par transgenèse chez la drosophile.J'ai parallèlement montré la spécificité de la GTPase Rac2 dans la résistance des mouches aux infections bactériennes. Rac2 participe notamment à la phagocytose.Les travaux du Dr. H. Tricoire ont permis d'identifier 180 gènes dont la dérégulation modifie la réponse des mouches à un stress oxydant. J'ai testé 105 de ces lignées pour leur résistance aux infections, afin d'étudier une corrélation possible entre la réponse aux stress oxydant et infectieux. Ce crible a permis de montrer l'implication d'une protéine à domaine lectine PSLR (Pseudomonas Sensitive Lectin Receptor) dans la réponse immunitaire de la drosophile.

The innate immune detection of pathogenic microbes is crucial to enhance the immune response. During an infection, the activation of the innate immune system is the first step to establish an adaptative immune response. A physiological immune response is defined as adapted to the microbial environment and as an effectively resolved inflammation. To do so, the host must be able to qualitatively and quantitatively detect microbes. The detection of conserved MAMPs allows the host to evaluate the number of microbes. On the other hand, the detection of virulence factors’ activity – pathogen-specific – give a qualitative view of microbes.The discovery of inflammasomes has allowed a major advance in the understanding of the mechanisms of detection of pathogen- and danger associated molecular patterns. Inflammasomes are macromolecular complexes responsible for the activation of Caspase-1 and the maturation of IL-1ß and IL-18. Initially discovered for their involvement in autoinflammatory pathologies, there is growing evidence for the role of inflammasomes in detecting the activity of toxins and microbial effectors including those targeting Rho GTPases.Rho GTPases are located at the crossroads of major cell signaling pathways; by regulating cell migration, phagocytosis or even gene transcription, these are major players in immunity. This makes them preferential targets for pathogenic microorganisms. Indeed, more than 30 bacterial virulence factors manipulate Rho GTPases using various strategies leading to their inhibition or activation.The uropathogenic Escherichia coli (E. coli) is the primary cause of cystitis and pyelonephritis and in the most severe cases of bacteremia. More than a third of uropathogenic E. coli possess the CNF1 toxin, a de-amidase that activates Rho GTPases. This modification destroys the intrinsic GTPase activity stimulated by the GAPs (GTPase-activating protein) of Rho, Rac and Cdc42.Before my arrival at the laboratory, Dr. Laurent Boyer's team showed that the CNF1 toxin induces an immune response. Indeed, during bacteremia in mice or systemic infection in drosophila, E. coli expressing CNF1 are eliminated more quickly than E. coli deleted for CNF1. At the cellular level, the activation of Rho GTPases by CNF1 is responsible for the production of pro-inflammatory cytokines. Alongside this transcriptional response, the CNF1 toxin causes IL-1β to mature in a Caspase-1 dependent fashion, suggesting the involvement of an inflammasome.My thesis project was to identify the inflammasome involved in the detection of the CNF1 toxin and to characterize the signaling pathway leading to this activation.We have identified the NLRP3 inflammasome as being responsible for the detection of GTPase Rac2 activation by the CNF1 toxin. We then studied the role of the kinase Pak1, a major effector of Rac2, in this signaling pathway and we were able to show that Pak1 plays a crucial role in the activation of the inflammasome NLRP3 by CNF1. Pak1 phosphorylates Thr659 of the NLRP3 receptor and this phosphorylation is critical for the recruitment of the regulatory protein Nek7 and the activation of the NLRP3 inflammasome downstream of the detection of CNF1. Finally, we were able to show the major role of the Pak1-NLRP3 pathway in the establishment of an anti-virulence immune response during mice bacteremia.In addition, we used our expertise to study the activation of the NLRP3 inflammasome in patients infected with SARS-CoV-2. This study allowed us to establish the signature of the NLRP3 response in the circulating myeloid cells of COVID-19 patients and to use these parameters to define a score to predict the patients’ outcome.My work on the involvement of the NLRP3 inflammasome in the detection of virulence has provided a better understanding of the mechanisms involved in an anti-infective response., Lors d’une infection, la détection des microorganismes pathogènes est indispensable à la réponse immunitaire innée et à l’initiation de l’immunité adaptative. Une réponse immunitaire physiologique est définie comme une réponse proportionnelle et adaptée à la stimulation microbienne et doit conduire à une résolution de l’inflammation. Pour cela, l’hôte doit être capable de détecter quantitativement et qualitativement les micro-organismes. Du point de vue quantitatif, l’hôte détecte des motifs structuraux conservés au sein d’une classe de micro-organismes. D’autre part, la détection de l’activité des facteurs de virulence – spécifiques aux pathogènes – permet une détection qualitative.La découverte des PRR et plus précisément des inflammasomes a permis une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes de détection des pathogènes et des signaux de danger liés aux dommages cellulaires produits lors de l’infections. Les inflammasomes sont des complexes responsables de l’activation de la Caspase-1 et de la maturation de l’IL-1ß et IL-18. Initialement découverts pour leur implication dans des maladies auto-inflammatoires, les inflammasomes sont également impliqués dans la détection de l’activité des facteurs de virulence notamment ceux ciblant les Rho-GTPases.Les Rho-GTPases sont situées au carrefour de grandes voies de signalisation cellulaire ; en régulant la migration cellulaire, la phagocytose ou encore la transcription des gènes, ceux sont des acteurs majeurs de l’immunité. Cela en fait des cibles préférentielles pour les bactéries pathogènes. En effet, plus de 30 facteurs de virulence bactériens manipulent les Rho GTPases en utilisant diverses stratégies menant à leur inhibition ou leur activation.La bactérie E. coli uropathogène est la première cause de cystites, pyélonéphrites et dans les cas les plus graves de bactériémies. Plus de 30% des E. coli uropathogènes possèdent la toxine CNF1, une dé-amidase activant les Rho-GTPases.Avant mon arrivée au laboratoire, l’équipe du Dr Laurent Boyer a montré que la toxine CNF1 induit une réponse immunitaire. En effet, au cours de la bactériémie chez la souris ou de l’infection systémique chez la drosophile, la détection de la toxine CNF1 induit la clairance bactérienne. Au niveau cellulaire, l’activation des Rho-GTPases par CNF1 est responsable de la production de cytokines pro-inflammatoires. En parallèle de cette réponse transcriptionnelle, la toxine CNF1 provoque la maturation de l’IL-1ß de façon dépendante de la Caspase-1, suggérant l’implication d’un inflammasome.Mon projet de thèse était d’identifier l’inflammasome impliqué dans la détection de la toxine CNF1 et de caractériser la voie de signalisation menant à cette activation.Nous avons identifié l’inflammasome NLRP3 comme étant responsable de la détection de l’activation de la GTPase Rac2 par la toxine CNF1. Nous avons ensuite étudié le rôle de la kinase Pak1, effecteur de Rac2, dans cette voie de signalisation et nous avons pu montrer que Pak1 joue un rôle crucial dans l’activation de l’inflammasome NLRP3 par CNF1. Pak1 phosphoryle la Thr659 du récepteur NLRP3 et cette phosphorylation est déterminante pour le recrutement de la protéine régulatrice Nek7 et l’activation de l’inflammasome NLRP3. Finalement, nous avons pu montrer le rôle majeur de la voie Pak1-NLRP3 dans la mise en place d’une réponse immunitaire anti-virulence au cours de la bactériémie.De plus, nous avons utilisé notre expertise pour étudier l’activation de l’inflammasome NLRP3 chez les patients infectés par le SARS-CoV-2. Cette étude nous a permis d’établir la signature de la réponse NLRP3 dans les cellules myéloïdes circulantes des patients COVID-19 et d’utiliser ces paramètres pour définir un score permettant de prédire l’évolution des patients.Mon travail sur l’implication de l’inflammasome NLRP3 dans la détection de la virulence a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués lors d’une réponse immunitaire anti-infectieuse.

Rho GTPase family comprises 20 members that regulate key cellular functions such as actin cytoskeleton organization and migration. Beside their canonical functions, certain Rho GTPases, including RhoB and Rac1, emerged as early DNA damage-inducible genes. Indeed, RhoB is readily induced in response to various genotoxic stress, including camptothecin (CPT), UV and cisplatin, and primarily protect cells against apoptotic cell death. Whether other Rho GTPases also respond early to genotoxics is largely unknown. In this project, we used camptothecin, a topoisomerase I (TOP1) inhibitor that selectively stabilized TOP1-DNA cleavage complexes (TOP1cc) onto chromatin, to screen for early DNA damage-inducible Rho GTPases. Besides RhoB, we identified RND1 as a gene rapidly induced by CPT. RND1 induction is reversible and closely associated with the presence of TOP1cc induced by CPT. Consistently, UV light and hydrogen peroxide, which indirectly stabilized TOP1cc, induce RND1 as well. CPT increases minimal promoter-independent RND1 transcription. Additionally, CPT increases poly ADP-ribose polymerase (PARP1) activity, whose inhibition prevents RND1 transcription. Overexpression of RND1 also increases PARP1 expression, suggesting a positive regulation between PARP1 and RND1 in response to TOP1cc. Thus, we propose that in response to CPT, TOP1cc activate PARP1, which in turn promotes RND1 transcription resulting in a positive feedback loop. Finally, we found that RND1 protects cells against CPT-induced apoptosis and leads to resistance to CPT. Together, these results highlight RND1 as a new Rho GTPase involved in the response to stress and propose a new mechanism for TOP1cc-induced gene transcription through PARP1 activation. These findings further suggest that inhibiting RND1 signaling could sensitize tumor cells to CPT derivatives.; La famille des GTPases Rho, comprenant 20 membres, contrôle la dynamique du cytosquelette d'actine et différents processus cellulaires comme la migration. En plus de leurs rôles bien établis, certaines GTPases Rho, notamment RhoB et Rac1, ont émergé en tant que gènes de réponse précoce aux dommages à l'ADN. En effet, RhoB est induite en réponse à divers stress génotoxiques, y compris la camptothécine (CPT), les UV et le cisplatine, et protège principalement les cellules de l'apoptose. Le rôle des autres GTPases Rho en réponse précoce aux génotoxiques reste largement méconnu. Dans ce projet, nous avons utilisé la camptothécine, un inhibiteur de la topoisomérase I (TOP1), qui stabilise sélectivement les complexes de clivage TOP1-ADN (TOP1cc) sur la chromatine, afin de cribler les GTPases Rho induites de façon précoce par les dommages à l'ADN. En plus de RhoB, nous avons identifié RND1 comme un gène rapidement induit par la CPT. L'induction de RND1 est réversible et étroitement corrélée à la présence de TOP1cc induit par la CPT. En accord avec ces observations, les rayons UV et le péroxyde d'hydrogène, qui stabilisent indirectement les TOP1cc, induisent également RND1. La CPT augmente la transcription de RND1 indépendamment de l'activité de son promoteur minimal. De plus, la CPT augmente l'activité de la poly ADP-ribose polymérase (PARP1), dont l'inhibition prévient la transcription de RND1. La surexpression de RND1 augmente également l'expression de PARP1, suggérant une régulation positive entre PARP1 et RND1 en réponse aux TOP1cc. Ainsi, nous proposons qu'en réponse à la CPT, les TOP1cc activent PARP1, qui à son tour favorise la transcription de RND1, initiant ainsi une boucle de rétrocontrôle positive. Enfin, nous avons montré que RND1 protège les cellules contre l'apoptose induite par la CPT et entraîne leur résistance à la CPT. L'ensemble de ces résultats ont permis d'identifier RND1 comme nouvelle GTPase Rho impliquée dans la réponse au stress et proposent un nouveau mécanisme de régulation de la transcription des gènes en réponse aux TOP1cc via l'activation de PARP1. Ces résultats suggèrent par ailleurs qu'inhiber la signalisation de RND1 pourrait sensibiliser les cellules tumorales aux dérivés cliniques de la CPT.

Rho GTPase family comprises 20 members that regulate key cellular functions such as actin cytoskeleton organization and migration. Beside their canonical functions, certain Rho GTPases, including RhoB and Rac1, emerged as early DNA damage-inducible genes. Indeed, RhoB is readily induced in response to various genotoxic stress, including camptothecin (CPT), UV and cisplatin, and primarily protect cells against apoptotic cell death. Whether other Rho GTPases also respond early to genotoxics is largely unknown. In this project, we used camptothecin, a topoisomerase I (TOP1) inhibitor that selectively stabilized TOP1-DNA cleavage complexes (TOP1cc) onto chromatin, to screen for early DNA damage-inducible Rho GTPases. Besides RhoB, we identified RND1 as a gene rapidly induced by CPT. RND1 induction is reversible and closely associated with the presence of TOP1cc induced by CPT. Consistently, UV light and hydrogen peroxide, which indirectly stabilized TOP1cc, induce RND1 as well. CPT increases minimal promoter-independent RND1 transcription. Additionally, CPT increases poly ADP-ribose polymerase (PARP1) activity, whose inhibition prevents RND1 transcription. Overexpression of RND1 also increases PARP1 expression, suggesting a positive regulation between PARP1 and RND1 in response to TOP1cc. Thus, we propose that in response to CPT, TOP1cc activate PARP1, which in turn promotes RND1 transcription resulting in a positive feedback loop. Finally, we found that RND1 protects cells against CPT-induced apoptosis and leads to resistance to CPT. Together, these results highlight RND1 as a new Rho GTPase involved in the response to stress and propose a new mechanism for TOP1cc-induced gene transcription through PARP1 activation. These findings further suggest that inhibiting RND1 signaling could sensitize tumor cells to CPT derivatives., La famille des GTPases Rho, comprenant 20 membres, contrôle la dynamique du cytosquelette d'actine et différents processus cellulaires comme la migration. En plus de leurs rôles bien établis, certaines GTPases Rho, notamment RhoB et Rac1, ont émergé en tant que gènes de réponse précoce aux dommages à l'ADN. En effet, RhoB est induite en réponse à divers stress génotoxiques, y compris la camptothécine (CPT), les UV et le cisplatine, et protège principalement les cellules de l'apoptose. Le rôle des autres GTPases Rho en réponse précoce aux génotoxiques reste largement méconnu. Dans ce projet, nous avons utilisé la camptothécine, un inhibiteur de la topoisomérase I (TOP1), qui stabilise sélectivement les complexes de clivage TOP1-ADN (TOP1cc) sur la chromatine, afin de cribler les GTPases Rho induites de façon précoce par les dommages à l'ADN. En plus de RhoB, nous avons identifié RND1 comme un gène rapidement induit par la CPT. L'induction de RND1 est réversible et étroitement corrélée à la présence de TOP1cc induit par la CPT. En accord avec ces observations, les rayons UV et le péroxyde d'hydrogène, qui stabilisent indirectement les TOP1cc, induisent également RND1. La CPT augmente la transcription de RND1 indépendamment de l'activité de son promoteur minimal. De plus, la CPT augmente l'activité de la poly ADP-ribose polymérase (PARP1), dont l'inhibition prévient la transcription de RND1. La surexpression de RND1 augmente également l'expression de PARP1, suggérant une régulation positive entre PARP1 et RND1 en réponse aux TOP1cc. Ainsi, nous proposons qu'en réponse à la CPT, les TOP1cc activent PARP1, qui à son tour favorise la transcription de RND1, initiant ainsi une boucle de rétrocontrôle positive. Enfin, nous avons montré que RND1 protège les cellules contre l'apoptose induite par la CPT et entraîne leur résistance à la CPT. L'ensemble de ces résultats ont permis d'identifier RND1 comme nouvelle GTPase Rho impliquée dans la réponse au stress et proposent un nouveau mécanisme de régulation de la transcription des gènes en réponse aux TOP1cc via l'activation de PARP1. Ces résultats suggèrent par ailleurs qu'inhiber la signalisation de RND1 pourrait sensibiliser les cellules tumorales aux dérivés cliniques de la CPT.

Hairy Cell Leukemia (HCL) is a B-lymphoproliferative disorder of the elderly, which is characterized by medullar and splenic homing of “hairy” cells bearing cytoplasmic protrusions. Efficient first-line therapies against this cancer do exist and the real challenge in biomedical research is now to develop new molecules targeting leukemic cells which are resistant to these first-line treatments. Among some deregulated signaling pathways that have been described in HCL, Rho-GTPases are noteworthy, mediating proliferation and reorganization of actin cytoskeleton, being both disrupted in hairy cells. Former works from our laboratory have shown the underexpression in HCL cells of an atypical Rho-GTPase called RhoH, which reconstitution decreased malignant progression in both in vitro and in vivo models of HCL. In order to determine the molecular targets of RhoH, a microarray study was performed that showed underexpression of the cell surface marker CD38 while RhoH is overexpressed.Not only a differentiation marker of lymphocytes, CD38 is a pleiotropic molecule (being at the same time a receptor, an enzyme and an adhesion protein), which is important in B-cell development. It is also known as a bad prognosis marker in chronic lymphocytic leukemia and a therapeutic target in multiple myeloma. Its role in Hairy Cell Leukemia has not been studied yet, despite its expression in one third of HCL patients.The work presented in this thesis deals with, on the one hand, the study of the regulation of CD38 gene by RhoH in HCL, on the other hand, the impact of CD38 protein on HCL progression. Preliminary data seem to indicate a potential role of Smad1 transcription factor in this mechanism of regulation of CD38 by RhoH. Thanks to genome editing technology, we produced two HCL cell lines knock out for the CD38 gene. These models allowed us to prove that CD38 enhances hairy cells survival and adhesion to endothelium, and modulates their migratory features in vitro. We also showed that CD38 promotes disease progression in vivo in an HCL xenograft mouse model. Finally, data from our collaborators indicated that CD38 is a bad prognosis marker for HCL relapses and could be a potential therapeutic target.Mimicking RhoH effects for therapeutic purposes would be somewhat tricky. Targeting CD38 seems an interesting alternative, as RhoH underexpression favours CD38 expression, which is deleterious for patients by enhancing malignant progression. As therapeutic monoclonal antibodies targeting CD38 are already used in clinics to treat other leukemias, this work brings the evidence of their potential usefulness against refractory HCL cases expressing this marker.; La leucémie à tricholeucocytes (ou HCL pour Hairy Cell Leukemia) est un syndrôme lymphoprolifératif B rare du sujet âgé, caractérisé par une infiltration médullaire et splénique de cellules présentant des protrusions cytoplasmiques. Des thérapies de première ligne efficaces existent contre ce cancer et l’intérêt de la recherche biomédicale dans ce domaine réside désormais dans le développement de nouvelles molécules actives contre les cellules leucémiques réfractaires aux traitements de référence. Parmi les voies de signalisation dérégulées dans l’HCL, celle des Rho-GTPases influe sur les phénomènes de croissance cellulaire et d’organisation du cytosquelette d’actine, perturbés dans les tricholeucocytes. Les travaux précédemment menés au laboratoire ont montré la sous-expression dans l’HCL d’une Rho-GTPase atypique, RhoH, dont l’expression ectopique dans un modèle cellulaire d’HCL atténue la progression tumorale. Afin de déterminer les cibles moléculaires de RhoH dans cette leucémie, une étude transcriptomique a été réalisée et a montré la sous-expression du marqueur de surface CD38 lorsque RhoH est surexprimée.Plus qu’un marqueur de différenciation lymphocytaire, CD38 est une molécule à effets pléïotropiques (à la fois récepteur, enzyme et protéine d’adhérence cellulaire), importante dans le développement des lymphocytes B. CD38 a également été décrit comme un marqueur délétère dans la leucémie lymphoïde chronique et représente une cible thérapeutique dans le myélome multiple. Bien qu’exprimé par un tiers des patients porteurs de l’HCL, son rôle dans cette leucémie restait jusqu’alors inconnu.Les travaux présentés dans cette thèse décrivent, d’une part, l’étude de la régulation du gène CD38 par RhoH dans l’HCL, et d’autre part, l’impact de la protéine CD38 dans la progression de cette leucémie. Des données préliminaires sur l’activité de fragments de promoteur du gène CD38 semblent indiquer un rôle du facteur de transcription Smad1 dans la régulation de ce gène par RhoH. Grâce à une technique de genome editing, nous avons produit deux lignées cellulaires HCL knock out pour le gène CD38. Ces modèles nous ont permis de déterminer que CD38 promeut la survie ainsi que l’adhésion à l’endothélium des cellules HCL, et modifie également leurs propriétés migratoires in vitro. Nous avons également observé que CD38 favorisait la progression tumorale dans un modèle murin de xénogreffe de ces lignées cellulaires. Enfin, des données produites par nos collaborateurs ont montré que CD38 est un marqueur de mauvais pronostic pour la rechute des patients atteints d’HCL et qu’il constitue une cible thérapeutique potentielle pour les 30% de patients qui l’expriment.Mimer l’effet de RhoH dans l’HCL à des fins thérapeutiques s’avèrerait délicat. Le ciblage de CD38 semble donc une alternative de choix. En effet, la sous-expression de RhoH dans l’HCL favorise l’expression de cette protéine, dont l’effet est délétère pour les patients puisqu’elle participe à la progression de la leucémie. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques dirigés contre CD38 étant déjà utilisés en clinique pour traiter d’autres leucémies, ce travail ouvre la voie à l’extension de leur utilisation dans le traitement de l’HCL réfractaire, pour les patients qui l’expriment.

The group I p21-activated kinases (PAK) are involved in many cellular processes such as proliferation, cell movement, adhesion and apoptosis. These kinases are effectors of Rho GTPases Rac1 and Cdc42, and participate in the regulation of the actin cytoskeleton. Both neuronal kinase PAK1 and PAK3, which exhibit high sequence identities, regulate the actin cytoskeleton, thereby controlling the dynamics of dendritic spines and synaptic plasticity. Mutations of the X-linked pak3 are responsible for intellectual disability (ID) in humans, and the molecular and cellular mechanisms associated with cognitive defects are poorly described. It was shown that PAK3 participates in the proneural pathway during early Xenopus embryogenic development, by promoting cell cycle exit and neuronal differentiation of neural precursors. However, the role of PAK3 in the adult neurogenesis has not been studied in mammals. It is now generally accepted that neurogenesis persists during human adulthood and is involved in learning and memory. We are therefore interested in the involvement of PAK3 in the regulation of adult neurogenesis, on the assumption that defects in neurogenesis may be responsible, at least in part, for cognitive defects in ID patients.We showed that PAK3 is not expressed in proliferative neural stem/progenitor cells but its expression increased significantly upon growth factor removal, suggesting a role in adult neurogenesis. We showed that the invalidation of pak3 gene causes an increase in the frequency and in size of primary neurospheres. However Pak3 invalidation does not affect the size of the stem cell reservoir nor the NCS cardinal properties (pluripotency, self-renewal and proliferation). However, the pak3- progenitor cells continue their proliferation in culture conditions normally inducing differentiation, suggesting a defect in cell cycle exit. We then asked whether pak3 ID mutations affect adult neurogenesis. We created a knock-in model expressing the pak3-R67C mutation responsible in humans for a severe form of intellectual impairment. We observed in the knock-in mice, a significant decrease in the number of newborn cells in both neurogenic areas of the brain (the subventricular zone inforebrain, and the dentate gyrus of the hippocampus) and an increase in the proportion of immature newborn neurons. These data suggest that the R67C mutation does not induce a loss of function of the kinase but a change of a function dependent on preferential activation by the Rac1 GTPase.In conclusion, we show that PAK3 play an important role in the regulation of adult neurogenesis in mammals by controlling the cell cycle exit of neural progenitors. The R67C ID mutation impacts both newborn cell proliferation and their maturation. Taken together, these data suggest that defects in adult neurogenesis caused by ID mutations in the pak3 gene may be involved in some cognitive dysfunctions.; Les p21-activated kinases (PAK) du sous-groupe I sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels la prolifération, les mouvements cellulaires, l’adhérence et l’apoptose. Ces kinases sont des effecteurs des Rho-GTPases Rac1 et Cdc42 et participent à la régulation du cytosquelette d’actine. Les deux kinases neuronales PAK1 et PAK3, qui présentent de fortes identités de séquence, régulent le cytosquelette d’actine, contrôlant ainsi la dynamique des épines dendritiques, et la plasticité synaptique.Les mutations du gène pak3, localisé sur le chromosome X, sont responsables de déficience intellectuelle chez l’homme, et les mécanismes moléculaires et cellulaires associés aux défauts cognitifs sont mal connus. Il a été montré que PAK3 participe à la voie proneurale au cours de l’embryogénèse précoce du xénope en favorisant la sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale. Cependant, le rôle de PAK3 dans la neurogenèse adulte n’a pas été étudié. Or depuis maintenant une quinzaine d’années, il est admis que la neurogenèse perdure à l’âge adulte et participe aux processus de mémorisation et d’apprentissage. Nous nous sommes donc intéressés à l’implication de PAK3 dans la régulation de la neurogenèse adulte, posant l’hypothèse qu’un défaut de neurogenèse serait responsable, au moins en partie, des défauts cognitifs chez les patients. Nous avons montré que PAK3 n’est pas exprimée dans les cellules souches neurales/progéniteurs prolifératifs mais son expression augmente fortement dès le retrait des facteurs de croissance, ex vivo, suggérant un rôle dans la neurogenèse adulte. Nous avons montré que l’invalidation de pak3 provoque une augmentation de la fréquence de neurosphères primaires formées ainsi qu’un accroissement de leur taille, ceci sans affecter la taille du réservoir de cellules souches ni les propriétés cardinales de celles-ci (multipotence, auto-renouvellement et prolifération). Toutefois, les cellules progénitrices pak3- poursuivent leur prolifération dans des conditions de culture induisant normalement la différenciation, suggérant un défaut de sortie du cycle cellulaire.Nous nous sommes ensuite demandé si les mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 altèrent la neurogenèse adulte. Nous avons créé pour cela un modèle murin portant la mutation R67C, responsable chez l’homme de la forme la plus sévère de déficience intellectuelle associée aux mutations de ce gène. Nous mettons en évidence, dans cette souris knock-in, une forte diminution du nombre de cellules nouveau-nées dans les deux zones neurogéniques du cerveau (la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de l’hippocampe) et une augmentation de la proportion de neurones nouveau-nés immatures. Ces données suggèrent que la mutation R67C n’induit pas une perte de fonction de la kinase mais un changement de fonction dépendante d’une activation préférentielle par la GTPase Rac1.En conclusion, ce travail de thèse montre que PAK3 participe à la régulation de la neurogenèse adulte chez les mammifères, contrôle la sortie du cycle cellulaire des progéniteurs neuraux et que la mutation R67C impacte la maturation des neurones nouveau-nés. L’ensemble de ces données suggère que les défauts de neurogenèse adulte dus aux mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 sont à l’origine de certains dysfonctionnements cognitifs.

The group I p21-activated kinases (PAK) are involved in many cellular processes such as proliferation, cell movement, adhesion and apoptosis. These kinases are effectors of Rho GTPases Rac1 and Cdc42, and participate in the regulation of the actin cytoskeleton. Both neuronal kinase PAK1 and PAK3, which exhibit high sequence identities, regulate the actin cytoskeleton, thereby controlling the dynamics of dendritic spines and synaptic plasticity. Mutations of the X-linked pak3 are responsible for intellectual disability (ID) in humans, and the molecular and cellular mechanisms associated with cognitive defects are poorly described. It was shown that PAK3 participates in the proneural pathway during early Xenopus embryogenic development, by promoting cell cycle exit and neuronal differentiation of neural precursors. However, the role of PAK3 in the adult neurogenesis has not been studied in mammals. It is now generally accepted that neurogenesis persists during human adulthood and is involved in learning and memory. We are therefore interested in the involvement of PAK3 in the regulation of adult neurogenesis, on the assumption that defects in neurogenesis may be responsible, at least in part, for cognitive defects in ID patients.We showed that PAK3 is not expressed in proliferative neural stem/progenitor cells but its expression increased significantly upon growth factor removal, suggesting a role in adult neurogenesis. We showed that the invalidation of pak3 gene causes an increase in the frequency and in size of primary neurospheres. However Pak3 invalidation does not affect the size of the stem cell reservoir nor the NCS cardinal properties (pluripotency, self-renewal and proliferation). However, the pak3- progenitor cells continue their proliferation in culture conditions normally inducing differentiation, suggesting a defect in cell cycle exit. We then asked whether pak3 ID mutations affect adult neurogenesis. We created a knock-in model expressing the pak3-R67C mutation responsible in humans for a severe form of intellectual impairment. We observed in the knock-in mice, a significant decrease in the number of newborn cells in both neurogenic areas of the brain (the subventricular zone inforebrain, and the dentate gyrus of the hippocampus) and an increase in the proportion of immature newborn neurons. These data suggest that the R67C mutation does not induce a loss of function of the kinase but a change of a function dependent on preferential activation by the Rac1 GTPase.In conclusion, we show that PAK3 play an important role in the regulation of adult neurogenesis in mammals by controlling the cell cycle exit of neural progenitors. The R67C ID mutation impacts both newborn cell proliferation and their maturation. Taken together, these data suggest that defects in adult neurogenesis caused by ID mutations in the pak3 gene may be involved in some cognitive dysfunctions.; Les p21-activated kinases (PAK) du sous-groupe I sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels la prolifération, les mouvements cellulaires, l’adhérence et l’apoptose. Ces kinases sont des effecteurs des Rho-GTPases Rac1 et Cdc42 et participent à la régulation du cytosquelette d’actine. Les deux kinases neuronales PAK1 et PAK3, qui présentent de fortes identités de séquence, régulent le cytosquelette d’actine, contrôlant ainsi la dynamique des épines dendritiques, et la plasticité synaptique.Les mutations du gène pak3, localisé sur le chromosome X, sont responsables de déficience intellectuelle chez l’homme, et les mécanismes moléculaires et cellulaires associés aux défauts cognitifs sont mal connus. Il a été montré que PAK3 participe à la voie proneurale au cours de l’embryogénèse précoce du xénope en favorisant la sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale. Cependant, le rôle de PAK3 dans la neurogenèse adulte n’a pas été étudié. Or depuis maintenant une quinzaine d’années, il est admis que la neurogenèse perdure à l’âge adulte et participe aux processus de mémorisation et d’apprentissage. Nous nous sommes donc intéressés à l’implication de PAK3 dans la régulation de la neurogenèse adulte, posant l’hypothèse qu’un défaut de neurogenèse serait responsable, au moins en partie, des défauts cognitifs chez les patients. Nous avons montré que PAK3 n’est pas exprimée dans les cellules souches neurales/progéniteurs prolifératifs mais son expression augmente fortement dès le retrait des facteurs de croissance, ex vivo, suggérant un rôle dans la neurogenèse adulte. Nous avons montré que l’invalidation de pak3 provoque une augmentation de la fréquence de neurosphères primaires formées ainsi qu’un accroissement de leur taille, ceci sans affecter la taille du réservoir de cellules souches ni les propriétés cardinales de celles-ci (multipotence, auto-renouvellement et prolifération). Toutefois, les cellules progénitrices pak3- poursuivent leur prolifération dans des conditions de culture induisant normalement la différenciation, suggérant un défaut de sortie du cycle cellulaire.Nous nous sommes ensuite demandé si les mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 altèrent la neurogenèse adulte. Nous avons créé pour cela un modèle murin portant la mutation R67C, responsable chez l’homme de la forme la plus sévère de déficience intellectuelle associée aux mutations de ce gène. Nous mettons en évidence, dans cette souris knock-in, une forte diminution du nombre de cellules nouveau-nées dans les deux zones neurogéniques du cerveau (la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de l’hippocampe) et une augmentation de la proportion de neurones nouveau-nés immatures. Ces données suggèrent que la mutation R67C n’induit pas une perte de fonction de la kinase mais un changement de fonction dépendante d’une activation préférentielle par la GTPase Rac1.En conclusion, ce travail de thèse montre que PAK3 participe à la régulation de la neurogenèse adulte chez les mammifères, contrôle la sortie du cycle cellulaire des progéniteurs neuraux et que la mutation R67C impacte la maturation des neurones nouveau-nés. L’ensemble de ces données suggère que les défauts de neurogenèse adulte dus aux mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 sont à l’origine de certains dysfonctionnements cognitifs.

T cells continually sense numerous soluble and cellular signals, which determine their behavior and differentiation pattern. At the steady state, lymphocytes properties rely on a specific network, in which FoxOs transcription factors play a central role. Indeed, FoxOs-induced transcriptome is involved in the maintenance of T cell quiescence and circulation.We identified a new transcriptional target of FoxO1 named Fam65b. We show that Fam65b acts as a brake on T lymphocyte activation downstream of the T cell receptor. Functionally, we demonstrate that Fam65b negatively regulates the threshold of T cell activation downstream of TCR or CCR7 stimulation. These characteristics allow a more efficient secondary response as Fam65b expression is inhibited. Physiologically, the lower expression of Fam65b in memory T cells compared to naïve T cells takes part in their enhanced reactivity. This suggests that Fam65b could be a functional marker of memory T cells. Finally, we demonstrated that the role of Fam65b is mediated by an inhibition of RhoA activity. Therefore, Fam65b is a regulator of T cell quiescence and migration. Because he regulates the activity of RhoA, Fam65b constitutes a functional link between two major families of proteins which control T cell physiology: Rho GTPases and FoxOs.; Les lymphocytes T (LT) perçoivent et intègrent en permanence des signaux solubles et cellulaires, conditionnant leur comportement et leur devenir. A l’état de repos, les propriétés des LT s’appuient sur un réseau moléculaire caractéristique, au sein duquel les facteurs de transcription FoxOs jouent un rôle majeur. En effet, ces derniers sont impliqués dans le maintien de la quiescence et de la capacité circulatoire des LT, de par le profil transcriptionnel qu’ils induisent. Nous avons identifié Fam65b comme une nouvelle cible transcriptionnelle de FOXO1. D’un point de vue fonctionnel, nous avons démontré que Fam65b régule négativement le seuil de prolifération des LT en réponse à une stimulation du récepteur à l’antigène (TCR) ou du récepteur aux chimiokines CCR7. In vivo, dans un modèle de souris transgénique pour le TCR, ces caractéristiques fonctionnelles se traduisent par une réponse secondaire plus efficace en absence de Fam65b. Physiologiquement, la moindre expression de Fam65b que nous avons observé dans les LT mémoires par comparaison aux LT naïfs corrèle avec leur plus grande réactivité. L’ensemble de ces résultats suggère que Fam65b pourrait être un marqueur fonctionnel des LT mémoires. Enfin, nous avons pu démontrer que les effets fonctionnels de Fam65b résultent d’une inhibition de l’activité de RhoA.Fam65b est donc un régulateur de la quiescence et de la migration des LT. De par son rôle de régulateur de l’activité de RhoA, Fam65b constitue un nouveau lien fonctionnel entre deux familles majeures, contrôlant la physiologie des LT : les Rho-GTPases et les FoxOs.

Microtubules (MT) are dynamic structures involved in different essential processes of cell architecture.Particularly, MT plus ends (+ends) can accumulate specific proteins controlling MT dynamics and MT interaction with the cell cortex. These interactions are implicated in the correct positionning of the mitotic spindle. Description of the mechanisms of protein association with MT +ends is important to understand MT functions. C-terminal tyrosine of α-tubulin is crucial for the interaction of CAP-Gly domain containing proteins.Indeed, CLIP-170 and its S. cerevisiae homolog Bik1p bind less efficiently to MT deleted for the C-terminal tyrosine (Glu MT).In this work, we studied the consequences of low Bik1p association with Glu MT +ends.Current models propose that Bik1p is targeted towards MT +ends by the kinesin Kip2p. Dynein (Dyn1p) is,then, recruited by Bik1p at MT +ends and offloaded at the cortex. Here, we show that, in yeast cells expressing onlydetyrosinated tubulin (tub1-Glu strain), Kip2p and Dyn1p are correctly associated with MT +ends, despite thedecreased Bik1p binding. We propose that, in wild type cells, the Kip2p/Bik1p complex transports Dyn1p along MT towards MT +ends. Then, Kip2p, Bik1p and Dyn1p track MT +ends independently.Moreover, we show that constituvely active forms of the small G protein Rho1p favour Bik1p binding to MT +ends. These data will be important to understand the role of Rho GTPases in the regulation of MT, for instance during migration of mammalian cells.Finally, we systematically searched for mutations that are lethal in combination with the tub1-Glu mutation(synthetic lethality). This screen identified components important in the formation of cell membrane and cell wall.These genes could be involved, at the cortex, in the establishment of microtubule-cortex interactions, and could show the importance of the α-tubulin C-terminal tyrosine in this function., Les microtubules (MT) sont des structures dynamiques contrôlant divers aspects essentiels de l'architecturecellulaire. En particulier, les bouts plus des MT (bouts +) sont capables d'accumuler des protéines spécifiques jouant un rôle dans le contrôle de la dynamique microtubulaire et dans l'interaction des MT avec le cortex cellulaire. Ces interactions sont notamment décisives pour le positionnement correct du fuseau mitotique. La description des mécanismes permettant l'accumulation de protéines aux bouts + est donc importante pour la compréhension des fonctions microtubulaires.La tyrosine C-terminale de la tubuline α est cruciale pour l'interaction de protéines à domaine CAP-Gly avec les bouts +. En effet, CLIP-170 et son homologue de S.cerevisiae Bik1p se lient moins bien aux bouts + des MT dépourvus de tyrosine C-terminale (MT Glu).Dans ce travail de thèse, nous avons étudié les perturbations associées au déficit de liaison de Bik1p aux bouts + des MT Glu dans S. cerevisiae.Les modèles actuels proposent que Bik1p est amenée aux bouts + par son association avec la kinésine Kip2p. La dynéine (Dyn1p) est alors recrutée par Bik1p aux bouts + pour être ciblée vers le cortex. Nous montronsque, dans des levures n'exprimant que de la tubuline détyrosinée (souche tub1-Glu), Kip2p et Dyn1p sontcorrectement associées aux bouts +, malgré le déficit de liaison de Bik1p. Nous proposons que, dans les cellulessauvages, le complexe Kip2p/Bik1p transporte Dyn1p le long des MT vers les bouts +. Kip2, Bik1p et Dyn1ps'associent alors aux bouts + de façon indépendante.De plus, nous montrons que des formes constitutionnellement actives de la petite protéine G Rho1p favorisent l'association de Bik1p avec les bouts +. Ces données seront importantes pour comprendre le rôle des Rho GTPases dans la régulation des MT, notamment dans la migration cellulaire.L'ensemble de ce travail suggère de nouveaux modèles pour la formation et la fonction des complexes protéiques associés aux bouts +.Finalement, nous avons recherché de manière systématique les mutations qui, associées avec la mutation tub1-Glu, sont létales chez la levure (létalité synthétique). Ce crible a identifié des composants participant à la formation de la membrane et de la paroi cellulaire. Ces gènes pourraient être impliqués, au niveau cortical, dans la mise en place des interactions des microtubules avec le cortex, et montrent l'importance de la tyrosine C-terminale de la tubuline α dans cette fonction.

Neurons possess a polarized morphology. In general, each neuron has several dendrites but only one axon. Such morphology is the basis for directionalized rapid signaling, information flowing from the short dendrites to the long axon. The mechanisms involved in the establishment of the neuronal polarity remain largely unknown. However, recently, members of Rho family proteins have been implicated in the regulation of neuronal morphology especially development of neuronal polarity, axon outgrowth and guidance, dendritic tree elaboration and synapse formation. Moreover, the Rho GTPases have been reported to be directly or indirectly involved in some neurological conditions such as X-linked mental retardation as well as Alzheimer's and Parkinson's diseases. These findings demonstrate the importance of Rho GTPases in the development, maintenance and function of the nervous system.

Ntroduction: Mosaic cutaneous dyschromia is strongly evocative of an underlying genetic mosaicism. These post-zygotic events are challenging for conventional diagnostic tools. Thus, genetic basis of mosaic cutaneous dyschromia still remained poorly understood. Materials and Methods: The M.U.S.T.A.R.D. cohort gathers DNA from skin biopsies of patients with mosaic cutaneous dyschromia. After a specialised phenotype analysis, they are referred to either trio exome sequencing (ES) at 200X, or targeted ultra-deep sequencing (60,000X) of candidate genes. Data are analysed with a tailored pipeline, allowing detection of both low-rate nucleotidic variations or chromosomal events. Results: From 2013 to 2019, 101 patients were included. ES was performed for 56, with identification of mosaic SNV in 12 patients in 7 new genes, including 4 new genes (RHOA, DOCK1, GNA13, TFE3), and mosaic chromosomal anomalies in 17 patients. A targeted sequencing of these genes was performed for 40 more patients, with a confirmed mosaic SNV in 17, and a global diagnostic yield of 55% (46/84). Conclusion: This work highlights the importance of a versatile bioinformatic approach combined to a clinical expertise, to decipher the chromosomal and molecular aetiologies of developmental anomalies with mosaic cutaneous dyschromia. It also pinpoints the role of the Rho GTPase pathway, which will help enhancing our understanding of mosaic cutaneous dyschromia, and may ultimately result in better patients’ care., Introduction : Les dyschromies cutanées en mosaïque ont fait suspecter de longue date l’implication d’un mosaïcisme génétique sous-jacent. Ces évènements post-zygotiques sont cependant difficilement détectables par les techniques conventionnelles. Ainsi, les bases génétiques des dyschromies en mosaïque étaient restées mal connues. Matériel et méthodes : la cohorte M.U.S.T.A.R.D rassemble des échantillons d’ADN de biopsies cutanées de patients porteurs d’un mosaïcisme pigmentaire. Après une analyse phénotypique spécialisée, ces échantillons sont étudiés en séquençage à forte profondeur, d’exome (ES) en trio, ou ciblé. Les données sont analysées à l’aide d’un pipeline dédié, permettant la détection de variations ponctuelles en mosaïque (mSNV) mais également de diverses anomalies chromosomiques en mosaïque. Résultats : De 2013 à 2019, 101 patients ont été inclus. Un ES a été réalisé pour 56 patients, identifiant un mSNV chez 12 patients, dans 7 gènes dont 4 nouveaux (RHOA, DOCK1, GNA13, TFE3), et une anomalie chromosomique chez 17 patients. Une étude ciblée de ces gènes chez 40 autres patients était positive pour 17, soit un rendement diagnostique global à 55% (46/84). Conclusion : Ce travail illustre l’importance d’une approche bioinformatique polyvalente, combinée à une expertise clinique, pour la détermination des causes génétiques des dyschromies cutanées en mosaïque. Il a également mis en évidence le rôle de la voie de signalisation dépendant des Rho GTPases, faisant progresser notre compréhension de la physiopathologie des dyschromies en mosaïque, une étape nécessaire à l’amélioration de la prise en charge de ces patients porteurs de maladies rares et complexes.

Vascular inflammation is characterized by monocytes recruitment which includes arrest, adhesion and trans-endothelial migration of leukocytes through the vascular endothelium. This process requires an interaction between inflammatory mediators such as chemokines, leukocytes and endothelial cells. In this study, we evaluated the molecular mechanisms induced by the chemokine RANTES/CCL5 on endothelial cells allowing monocytes recruitment.RANTES/CCL5 exerts its biological effects through its interaction with its protein receptors (CCR1 and CCR5) and its interaction with proteoglycans such as syndecan-4. The involvement of the intracellular domain of syndecan-4 (C1, V, C2) in RANTES/CCL5-induced monocytes recruitment demonstrates its role as functional co-receptor. The stimulation of endothelial cells by RANTES/CCL5 strongly increases monocytes recruitment through Rho GTPase, PKCα and PKCδ signaling pathways. PKCα and PKCδ regulate the phosphorylation of inter-endothelial junction proteins, mainly VE-cadherin and β-catenin. Thus, the development of a new therapeutic strategy targeting the endothelial system might be allowing to regulate the initiation of the inflammatory process induced by the chemokine RANTES., L’inflammation vasculaire est caractérisée par le recrutement monocytaire qui englobe l’arrêt, l’adhérence puis la migration trans-endothéliale des monocytes à travers l’endothélium vasculaire. Ce processus nécessite une interaction entre les médiateurs inflammatoires tels que les chimiokines, les leucocytes et les cellules endothéliales. Dans ce projet, nous avons évalué les mécanismes moléculaires induits par la chimiokine RANTES/CCL5 sur les cellules endothéliales permettant le recrutement des monocytes. Sur les cellules endothéliales, RANTES/CCL5 exerce ses effets biologiques grâce à ses interactions avec ses récepteurs protéiques (CCR1 et CCR5) et protéoglycanniques tels que le syndécane-4. L’implication du domaine intracellulaire (C1, V, C2) du syndecane-4 dans le recrutement monocytaire induit par RANTES/CCL5 démontre son rôle de co-récepteur fonctionnel. La stimulation des cellules endothéliales par RANTES/CCL5 augmente fortement, par rapport aux cellules non stimulées, le recrutement monocytaire via les voies de signalisation Rho GTPases, PKCα et PKCδ qui régulent la phosphorylation de protéines de jonctions inter-endothéliales notamment la VE-cadhérine et la β-caténine. Ainsi, le développement d'une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant le système endothélial pourrait permettre de réguler l’initiation du processus inflammatoire induit par la chimiokine RANTES/CCL5.

Triple-negative breast cancer is a subtype of breast cancer that primarily affects women under the age of 40. TNBCs account for 15 to 20% of all diagnosed breast cancers and are defined by tumour cells lacking or weakly expressing the oestrogen receptor, the progesterone receptor and the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). By definition, these cancers cannot benefit from hormonal therapies or targeted therapies against the HER2 that have both proved to be very efficient in other breast cancer subtypes. Hence, therapies against TNBC are based essentially on classical cytotoxic chemotherapies that are not always able to block metastatic dissemination of those cancers. As a consequence, TNBCs are associated with poor prognosis and thus, finding new therapeutic targets for TNBC constitutes a major challenge for breast cancer research. In that context, a new potential TNBC therepeutical target has recently been identified: the serine threonine PKC theta. This novel PKC is highly expressed in TNBC whereas it is not expressed in breast cancer expressing the oestrogen receptor or non-transformed mammary tissues. The aim of my PhD was to study the function of PKC theta in the control of breast cancer cells invasion, a key step to metastasis formation that can be defined as the ability of cells to migrate through an extracellular matrix. We have shown that PKC theta inhibition leads to strong diminution of the invasive abilities of TNBC cell lines in vitro. Accordingly, we show in vivo that PKC theta inhibition strongly impairs metastasis formation in mice. We have identified the molecular mechanisms through which PKC theta controls invasion: PKC theta is able to activate focal adhesion signalling by directly phosphorylating FAK (Focal Adhesion Kinase) at newly identified phosphorylation sites, serines 892 and 893. We observe that this phosphorylated FAK localizes to nascent adhesions at the leading edge of migrating breast cancer cells and that those phosphorylations are essential to PKC theta control of invasion. PKC theta phosphorylations of FAK also modify the dynamic of cell/matrix adhesions and protrusion formation. The effects on protrusion formation are most certainly linked to PKC theta alteration of Rho GTPases activity dynamic. Furthermore, the use of an activatable PKC theta enables us to precisely study the temporality of PKC theta effects on both protrusions and adhesions. Protrusions and adhesions being essential to cell migration, those results explain PKC theta positive effects on invasion. Finally, regarding the upstream control of PKC theta we observe that PKC theta activation, together with its effect on FAK and invasion, depend on CDCP1, a transmembrane receptor that has been linked to the aggressiveness of several cancers, including TNBC. Altogether, my work reveals a new mechanism of FAK pathway activation leading to breast cancer cell invasion. Moreover, it further defines PKC theta as an interesting therepeutical target, whose inhibition could limit metastatic dissemination of TNBC without major secondary effects, as PKC theta has a non-essential physiological function.; Entre 15 et 20% des cancers du sein diagnostiqués sont des cancers du sein triple-négatifs (CSTN). Ce sous-type de cancer du sein est caractérisé par l'absence ou le faible niveau d'expression du récepteur au facteur de croissance épidermique de type 2 (HER2) et des récepteurs hormonaux à l'œstrogène et à la progestérone. Par définition, les patientes atteintes de CSTN ne peuvent bénéficier des traitements antihormonaux ou des thérapies ciblées anti-HER2 qui ont nettement amélioré la prise en charge thérapeutique des autres sous-types de cancers du sein. En marge de ces progrès, les CSTN sont ainsi principalement traités par chimiothérapies cytotoxiques, des thérapies ne parvenant pas toujours à empêcher leur dissémination métastatique. Par conséquent, les CSTN sont aujourd'hui associés à des pronostics relativement mauvais et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques constitue un enjeu majeur de la recherche sur le cancer du sein. C'est dans ce contexte qu'une cible thérapeutique potentielle contre les CSTN a récemment été identifiée: la sérine-thréonine kinase PKC thêta. Cette PKC nouvelle est fortement exprimée dans les CSTN alors qu'elle ne l'est pas, ou très faiblement, dans des cancers du sein exprimant le récepteur aux œstrogènes et dans les tissus mammaires non transformés. L'objectif de ma thèse a été d'étudier la fonction de PKC thêta dans le contrôle de l'invasion de cellules tumorales mammaires, une étape clé de la formation de métastases. Nos travaux montrent qu'une inhibition de PKC thêta aboutit à une nette diminution des capacités invasives de lignées de cellules CSTN in vitro. De même, in vivo cette inhibition limite fortement la formation de métastases chez la souris. Nous identifions le mécanisme moléculaire par lequel PKC thêta contrôle l'invasion: PKC thêta est capable d'activer la voie des adhérences focales en phosphorylant directement la kinase des adhérences focales (FAK) sur des sites de phosphorylations encore jamais identifiés, les sérines 892 et 893. Ces phosphorylations sont essentielles aux effets positifs de PKC thêta sur l'invasion et la FAK phosphorylée de la sorte est retrouvée spécifiquement au front de cellules CSTN en migration. De façon intéressante, ces phosphorylations de FAK par PKC thêta permettent une modification de la dynamique de formation des adhérences cellule/matrice ainsi que celle des protrusions. Le contrôle de ces protrusions passe très certainement par une altération de la dynamique d'activité des RhoGTPases induite par PKC thêta De surcroît, l'utilisation d'une PKC thêta activable par la rapamycine nous permet de finement étudier la temporalité des effets de PKC thêta sur la génération des protrusions et des adhérences cellule/matrice. Enfin, concernant le contrôle de l'activité de PKC thêta en amont, nous constatons que son activation de même que ses effets sur la voie FAK et l'invasion dépendent entièrement de CDCP1 (Cub Domain-Containing Protein 1), un récepteur transmembranaire associé à l'agressivité de plusieurs cancers, dont les CSTN. Mes travaux mettent ainsi en évidence un mécanisme inédit de contrôle de la voie FAK permettant l'invasion de cellules tumorales mammaires. De plus, ils valident PKC thêta en tant que cible thérapeutique potentielle dont l'inhibition pourrait permettre de limiter la dissémination métastatique des CSTN et ce sans effets secondaires majeurs, la fonction physiologique de PKCthêta étant non essentielle.

Triple-negative breast cancer is a subtype of breast cancer that primarily affects women under the age of 40. TNBCs account for 15 to 20% of all diagnosed breast cancers and are defined by tumour cells lacking or weakly expressing the oestrogen receptor, the progesterone receptor and the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). By definition, these cancers cannot benefit from hormonal therapies or targeted therapies against the HER2 that have both proved to be very efficient in other breast cancer subtypes. Hence, therapies against TNBC are based essentially on classical cytotoxic chemotherapies that are not always able to block metastatic dissemination of those cancers. As a consequence, TNBCs are associated with poor prognosis and thus, finding new therapeutic targets for TNBC constitutes a major challenge for breast cancer research. In that context, a new potential TNBC therepeutical target has recently been identified: the serine threonine PKC theta. This novel PKC is highly expressed in TNBC whereas it is not expressed in breast cancer expressing the oestrogen receptor or non-transformed mammary tissues. The aim of my PhD was to study the function of PKC theta in the control of breast cancer cells invasion, a key step to metastasis formation that can be defined as the ability of cells to migrate through an extracellular matrix. We have shown that PKC theta inhibition leads to strong diminution of the invasive abilities of TNBC cell lines in vitro. Accordingly, we show in vivo that PKC theta inhibition strongly impairs metastasis formation in mice. We have identified the molecular mechanisms through which PKC theta controls invasion: PKC theta is able to activate focal adhesion signalling by directly phosphorylating FAK (Focal Adhesion Kinase) at newly identified phosphorylation sites, serines 892 and 893. We observe that this phosphorylated FAK localizes to nascent adhesions at the leading edge of migrating breast cancer cells and that those phosphorylations are essential to PKC theta control of invasion. PKC theta phosphorylations of FAK also modify the dynamic of cell/matrix adhesions and protrusion formation. The effects on protrusion formation are most certainly linked to PKC theta alteration of Rho GTPases activity dynamic. Furthermore, the use of an activatable PKC theta enables us to precisely study the temporality of PKC theta effects on both protrusions and adhesions. Protrusions and adhesions being essential to cell migration, those results explain PKC theta positive effects on invasion. Finally, regarding the upstream control of PKC theta we observe that PKC theta activation, together with its effect on FAK and invasion, depend on CDCP1, a transmembrane receptor that has been linked to the aggressiveness of several cancers, including TNBC. Altogether, my work reveals a new mechanism of FAK pathway activation leading to breast cancer cell invasion. Moreover, it further defines PKC theta as an interesting therepeutical target, whose inhibition could limit metastatic dissemination of TNBC without major secondary effects, as PKC theta has a non-essential physiological function.; Entre 15 et 20% des cancers du sein diagnostiqués sont des cancers du sein triple-négatifs (CSTN). Ce sous-type de cancer du sein est caractérisé par l'absence ou le faible niveau d'expression du récepteur au facteur de croissance épidermique de type 2 (HER2) et des récepteurs hormonaux à l'œstrogène et à la progestérone. Par définition, les patientes atteintes de CSTN ne peuvent bénéficier des traitements antihormonaux ou des thérapies ciblées anti-HER2 qui ont nettement amélioré la prise en charge thérapeutique des autres sous-types de cancers du sein. En marge de ces progrès, les CSTN sont ainsi principalement traités par chimiothérapies cytotoxiques, des thérapies ne parvenant pas toujours à empêcher leur dissémination métastatique. Par conséquent, les CSTN sont aujourd'hui associés à des pronostics relativement mauvais et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques constitue un enjeu majeur de la recherche sur le cancer du sein. C'est dans ce contexte qu'une cible thérapeutique potentielle contre les CSTN a récemment été identifiée: la sérine-thréonine kinase PKC thêta. Cette PKC nouvelle est fortement exprimée dans les CSTN alors qu'elle ne l'est pas, ou très faiblement, dans des cancers du sein exprimant le récepteur aux œstrogènes et dans les tissus mammaires non transformés. L'objectif de ma thèse a été d'étudier la fonction de PKC thêta dans le contrôle de l'invasion de cellules tumorales mammaires, une étape clé de la formation de métastases. Nos travaux montrent qu'une inhibition de PKC thêta aboutit à une nette diminution des capacités invasives de lignées de cellules CSTN in vitro. De même, in vivo cette inhibition limite fortement la formation de métastases chez la souris. Nous identifions le mécanisme moléculaire par lequel PKC thêta contrôle l'invasion: PKC thêta est capable d'activer la voie des adhérences focales en phosphorylant directement la kinase des adhérences focales (FAK) sur des sites de phosphorylations encore jamais identifiés, les sérines 892 et 893. Ces phosphorylations sont essentielles aux effets positifs de PKC thêta sur l'invasion et la FAK phosphorylée de la sorte est retrouvée spécifiquement au front de cellules CSTN en migration. De façon intéressante, ces phosphorylations de FAK par PKC thêta permettent une modification de la dynamique de formation des adhérences cellule/matrice ainsi que celle des protrusions. Le contrôle de ces protrusions passe très certainement par une altération de la dynamique d'activité des RhoGTPases induite par PKC thêta De surcroît, l'utilisation d'une PKC thêta activable par la rapamycine nous permet de finement étudier la temporalité des effets de PKC thêta sur la génération des protrusions et des adhérences cellule/matrice. Enfin, concernant le contrôle de l'activité de PKC thêta en amont, nous constatons que son activation de même que ses effets sur la voie FAK et l'invasion dépendent entièrement de CDCP1 (Cub Domain-Containing Protein 1), un récepteur transmembranaire associé à l'agressivité de plusieurs cancers, dont les CSTN. Mes travaux mettent ainsi en évidence un mécanisme inédit de contrôle de la voie FAK permettant l'invasion de cellules tumorales mammaires. De plus, ils valident PKC thêta en tant que cible thérapeutique potentielle dont l'inhibition pourrait permettre de limiter la dissémination métastatique des CSTN et ce sans effets secondaires majeurs, la fonction physiologique de PKCthêta étant non essentielle.

La protéine d’échafaudage Gab1 amplifie la signalisation de plusieurs récepteurs à fonction tyrosine kinase (RTK). Entre autres, elle promeut la signalisation du VEGFR2, un RTK essentiel à la médiation de l’angiogenèse via le VEGF dans les cellules endothéliales. En réponse au VEGF, Gab1 est phosphorylé sur tyrosine, ce qui résulte en la formation d’un complexe de protéines de signalisation impliqué dans le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration des cellules endothéliales. Gab1 est un modulateur essentiel de l’angiogenèse in vitro et in vivo. Toutefois, malgré l’importance de Gab1 dans les cellules endothéliales, les mécanismes moléculaires impliqués dans la médiation de ses fonctions, demeurent mal définis et la participation du second membre de la famille, Gab2, reste inconnue. Dans un premier temps, nous avons démontré que tout comme Gab1, Gab2 est phosphorylé sur tyrosine, qu’il s’associe de façon similaire avec des protéines de signalisation et qu’il médie la migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Cependant, contrairement à Gab1, Gab2 n’interagit pas avec le VEGFR2 et n’est pas essentiel pour l’activation d’Akt et la promotion de la survie cellulaire. En fait, nous avons constaté que l’expression de Gab2 atténue l’expression de Gab1 et l’activation de la signalisation médiée par le VEGF. Ainsi, Gab2 semble agir plutôt comme un régulateur négatif des signaux pro-angiogéniques induits par Gab1. La migration cellulaire est une des étapes cruciales de l’angiogenèse. Nous avons démontré que Gab1 médie l’activation de la GTPase Rac1 via la formation et la localisation d’un complexe protéique incluant la GEF VAV2, la p120Caténine et la Cortactine aux lamellipodes des cellules endothéliales en réponse au VEGF. De plus, nous montrons que l’assemblage de ce complexe corrèle avec la capacité du VEGF à induire l’invasion des cellules endothéliales et le bourgeonnement de capillaires, deux phénomènes essentiels au processus angiogénique. La régulation des RhoGTPases est également régulée par des inactivateurs spécifiques les « Rho GTPases activating proteins », ou GAPs. Nous décrivons ici pour la première fois le rôle de la GAP CdGAP dans les cellules endothéliales et démontrons son importance dans la médiation de la signalisation du VEGF via la phosphorylation sur tyrosine de Gab1 et l’activation des RhoGTPases Rac1 et Cdc42. Ainsi, dù à son importance sur l’activation de voies de signalisation du VEGF, CdGAP représente un régulateur crucial de la promotion de diverses activités biologiques essentielles à l’angiogenèse telles que la migration cellulaire, et le bourgeonnement de capillaires in vitro et d’aortes de souris ex vivo. De plus, les embryons de souris CdGAP KO présentent des hémorragies et de l’œdème, et ces défauts vasculaires pourraient être responsables de la mortalité de 44% des souris CdGAP knock-out attendues. Nos études amènent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires induits par le VEGF et démontrent l’implication centrale de Gab1 et des régulateurs des RhoGTPases dans la promotion de l’angiogenèse. Cette meilleure compréhension pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles ou approches thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients souffrant de maladies associées à une néovascularisation incontrôlée telles que le cancer., The Gab1 scaffolding protein allows signaling of multiple Receptors Tyrosine Kinase (RTKs). Among other things, it allows VEGFR2 signaling, an essential RTK to mediate angiogenesis via VEGF in endothelial cells. In response to VEGF, Gab1 is tyrosine phosphorylated, resulting in the formation of a signaling protein complex involved in the remodeling of the actin cytoskeleton and the migration of endothelial cells. Gab1 is a key modulator of angiogenesis in vitro and in vivo. However, despite the importance of Gab1 in endothelial cells, the molecular mechanisms involved in mediating its functions remain poorly defined and the participation of the second family member, Gab2, remains unknown. Initially, we demonstrated that as with Gab1, Gab2 is tyrosine phosphorylated, it associates with similar signaling proteins and induces cell migration in response to VEGF in endothelial cells. However, Gab2 does not interact with VEGFR2 and is not essential for the activation of Akt and the promotion of cell survival. In fact, we found that the expression of Gab2 attenuates the expression of Gab1 and activation of VEGF-mediated signaling. In light of these results, we propose that in endothelial cells stimulated with VEGF, Gab2 acts as a negative regulator of pro-angiogenic signals induced by Gab1. Cell migration is a crucial step in angiogenesis, though, few studies have investigated the involvement of Gab1 in regulating different molecular mechanisms for actin remodeling leading to endothelial cell migration. We demonstrated that Gab1 mediates activation of Rac1 GTPase via the formation and localization of a protein complex including the GEF VAV2, p120 Catenin and Cortactin to lamellipodia of endothelial cells in response to VEGF. Furthermore, we show that the assembly of this complex correlates with the ability of VEGF to induce endothelial cell invasion and capillary sprouting, phenomena essential to the angiogenic process. RhoGTPases are also regulated by specific inactivators, "Rho GTPase activating proteins" or GAPs. The involvement of GAPs in promoting angiogenesis is relatively poorly described. Here we describe for the first time the role of the GAP CdGAP in endothelial cells and demonstrate its importance in mediating VEGF signaling via tyrosine phosphorylation of Gab1 and activation of Rac1 and Cdc42 RhoGTPases. Due to its importance in the activation of signaling pathways critical in VEGF signaling, CdGAP is thus an important protein for the regulation of various essential biological activities such as cell migration, sprouting and therefore in vitro and ex vivo angiogenesis. In addition, embryos of CdGAP knock-out mice exhibit vascular defects, excessive branching vessels, haemorrhages and edema which may be responsible for the 44% mortality seen in CdGAP knock-out mice expected. Our studies contribute to a better understanding of the molecular mechanisms induced by VEGF and demonstrate the central involvement of Gab1 and regulators of RhoGTPases in promoting angiogenesis. This understanding could lead to the identification of new targets and therapeutic approaches to improve the treatment of patients with uncontrolled neovascularization associated with diseases such as cancer.

La fonction essentielle d’un neurone est de recevoir, conduire, transmettre et intégrer les influx nerveux. Dans ce but, la majorité des neurones va développer plusieurs dendrites et un unique axone, prolongements qui diffèrent par leur structure moléculaire et par leur rôle: les premières reçoivent l’information, alors que le second la propage. La polarisation structurale et fonctionnelle commence peu après le début de croissance des neurites. Les mécanismes responsables de la mise en place de la polarité neuronale sont dans l’ensemble encore inconnus. Cependant, les membres de la famille des petites GTPases Rho ont récemment été impliqués dans la régulation de la morphologie neuronale, dont le développement de la polarité neuronale, la croissance et le guidage axonal, l’élaboration de l’arbre dendritique, la plasticité synaptique… De plus, les protéines Rho paraissent impliquées, directement ou indirectement, dans certaines maladies neurologiques telles que le retard mental lié à l’X et les maladies d’Alzheimer et de Parkinson. Ces observations suggèrent l’importance de ces protéines dans le développement, le maintien et le fonctionnement du système nerveux., Neurons possess a polarized morphology. In general, each neuron has several dendrites but only one axon. Such morphology is the basis for directionalized rapid signaling, information flowing from the short dendrites to the long axon. The mechanisms involved in the establishment of the neuronal polarity remain largely unknown. However, recently, members of Rho family proteins have been implicated in the regulation of neuronal morphology especially development of neuronal polarity, axon outgrowth and guidance, dendritic tree elaboration and synapse formation. Moreover, the Rho GTPases have been reported to be directly or indirectly involved in some neurological conditions such as X-linked mental retardation as well as Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. These findings demonstrate the importance of Rho GTPases in the development, maintenance and function of the nervous system.