Search

In recent decades, foldamers have emerged as a promising tool for developing bioactive molecules that mimic the secondary structures of proteins. These foldamers are mainly used to modulate protein-protein interactions involved in many diseases, including amyloidoses such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and type II diabetes (T2D). Amyloidosis is a disease characterized by the presence of insoluble protein deposits in tissues. Islet amyloid polypeptide (hIAPP) aggregation is linked to beta-cell degeneration and to the pathogenesis of type 2 diabetes. hIAPP is a 37-residue polypeptide secreted by pancreatic beta cells. Amyloid deposits of hIAPP are found in the pancreas of many patients with T2D. hIAPP is one of the most amyloidogenic polypeptides known, and aggregates of hIAPP are toxic for pancreatic beta cells. Worldwide, approximately 483 million people currently have type 2 diabetes (T2D), a prevalence that is predicted to reach 579 million by 2030. The increasing prevalence of type 2 diabetes, and the associated adverse cardiovascular risks, is now considered a major public health challenge. Currently, the treatments available for diabetes are symptomatic and have many side effects. Targeting hIAPP has become a promising strategy to find an etiological treatment for T2D. In this context, we have designed foldamers based on fluorinated 1,2,3-triazoles that can modulate the aggregation process of hIAPP. The 1,2,3-triazoles were used for their properties as peptide bond isosteres with improved metabolic stability. The fluorine atom, by its properties, allows to induce conformations and constitutes a ¹⁹F NMR probe, useful for studying ligand-protein interactions, metabolic stability, membrane crossing or even the in vivo distribution of compounds. Firstly, we carried out the synthesis of homo- and heterotriazolamers based on N-difluoromethylated 1,2,3-triazoles. Secondly, we have carried out preliminary works on 5-fluoro-1,2,3-triazoles as a new architecture to design fluorinated foldamers. Conformational studies were carried out by NMR, and molecular dynamics for the triazolamers of N-difluoromethylated 1,2,3-triazoles. The conformational study of 5-fluoro-1,2,3-triazoles was performed by X-ray diffraction. In addition, preliminary studies were performed by thioflavin-T fluorescence spectrometry to assess the modulation of hIAPP aggregation by these foldamers. The thesis work aims to develop the knowledge around fluorinated foldamers to design bioactive molecules. To our knowledge, none of the fluorinated foldamers described in the literature has been used for medicinal applications., Ces dernières décennies, les foldamères ont émergé comme un outil prometteur pour développer des molécules bioactives mimant les structures secondaires des protéines. Ces foldamères sont principalement utilisés pour moduler les interactions protéine-protéine impliquées dans de nombreuses maladies, notamment les amyloïdoses telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et le diabète de type II (DT2). Les amyloïdoses sont des maladies qui se caractérisent par la présence de dépôts de protéines insolubles dans les tissus. L'agrégation du polypeptide amyloïde des îlots (hIAPP) est liée à la dégénérescence des cellules bêta et à la pathogenèse du diabète de type 2. hIAPP est un polypeptide de 37 résidus sécrété par les cellules bêta du pancréas. On trouve des dépôts amyloïdes de hIAPP dans le pancréas de nombreux patients atteints de DT2. hIAPP est l'un des polypeptides les plus amyloïdogènes connus, et les agrégats de hIAPP sont toxiques pour les cellules bêta du pancréas. Dans le monde, environ 483 millions de personnes sont actuellement atteintes de diabète de type II (DT2), une prévalence qui, selon les prévisions, devrait atteindre 579 millions d'ici 2030. La prévalence croissante du diabète de type II, et les risques cardiovasculaires indésirables qui lui sont associés, sont désormais considérés comme un défi majeur de santé publique. Actuellement, les traitements disponibles pour le traitement du diabète sont symptomatiques et induisent de nombreux effets secondaires. Le ciblage de hIAPP est devenu une stratégie prometteuse pour trouver un traitement étiologique contre le DT2. Dans ce contexte, nous avons conçu des foldamères basés sur les 1,2,3-triazoles fluorés pouvant moduler le processus d’agrégation de hIAPP. Les 1,2,3-triazoles ont été utilisés pour leurs propriétés d’isostères de liaison peptidique avec une meilleure stabilité métabolique. L’atome de fluor, par ses propriétés particulières, permet d’induire des conformations et constitue une sonde en RMN du ¹⁹F, utile pour étudier les interactions ligand-protéine, la stabilité métabolique, le passage de membranes ou même la distribution d’un composé in vivo. D’une part, nous avons réalisé la synthèse d’homo- et d’hétérotriazolamères se basant sur les 1,2,3-triazoles N-difluorométhylés. D’autre part, nous avons effectué des travaux préliminaires sur les 5-fluoro-1,2,3-triazoles comme nouvelle architecture pour concevoir des foldamères fluorés. Les études conformationnelles ont été réalisées par RMN et dynamique moléculaire pour les triazolamères des 1,2,3-triazoles N-difluorométhylés. L’étude conformationnelle des 5-fluoro-1,2,3-triazoles a été réalisée par diffraction aux rayons X. De plus, des études préliminaires ont été réalisées par spectrométrie de fluorescence à la thioflavine-T pour évaluer la modulation de l’agrégation de hIAPP par ces foldamères. L’ensemble de ces travaux de thèse a pour objectif de développer le savoir autour des foldamères fluorés pour concevoir des molécules bioactives. À notre connaissance, aucun des foldamères fluorés décrit dans la littérature n’a d’application médicinale.

Protein-protein interactions (PPI) have a key role in physiological processes. The inhibition of these PPI may lead to new therapeutic strategies. Secondary structures in α-helix are frequently involved in protein interactions where they may contribute significantly to binding. Designing molecules which mimic the helical motif for protein surface recognition and inhibition of the natural partner represents an innovative path to discover new drug candidates. Aliphatic urea oligomers, a class of foldamers that adopt a well-defined H-bonded helical secondary structure with good similarity to the α-helix have been proposed as possible α-helix mimics to inhibit protein-protein interactions. The first part of this PhD project was dedicated to the design and synthesis of oligoureas and oligourea/α-peptide chimeras for specific protein surface recognition. We have selected the vitamin D receptor as a potential target, mainly because (i) it is therapeutically relevant; (ii) its protein partner (coactivators) interact through a short region which adopts an α-helical structure upon binding and (iii) structures at atomic resolution were available to enable the design of effective mimetics. In the second part, we investigated methods to generate foldamer covalent dimers that could potentially be used to cover larger interaction surfaces. The rationale is that the binding interface is often more complex than a single helix and may involve tertiary and quaternary structures such as coiled coils which in turns may also serve as a basis for the design of new classes of inhibitors.; Les interactions protéine–protéine (IPP) jouent un rôle primordial dans les processus physiologiques. L’inhibition de ces interactions ouvre la voie à la conception de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Les structures secondaires en hélice α sont fréquemment impliquées dans les interactions entre protéines auxquelles elles peuvent contribuer de manière significative. La conception de molécules, mimant ce motif de reconnaissance et pouvant interagir avec la protéine cible tout en inhibant la reconnaissance avec le partenaire naturel, représente une voie innovante pour trouver de nouveaux candidats médicaments. Les oligomères d’urée aliphatique, une classe de foldamères qui adoptent une structure secondaire en hélice bien définie et proche de l’hélice α, ont été proposés comme mimes d’hélice α pour inhiber les IPP. Au cours de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à la conception de foldamères d’oligourée et de chimères oligoamide/oligourée pour cibler des surfaces de protéine. Nous avons sélectionné le récepteur nucléaire de la vitamine D (VDR) comme modèle d’étude en raison de son intérêt thérapeutique, et des connaissances structurales disponibles. Les protéines partenaires de VDR (coactivateurs) interagissant via une courte région structurée en hélice α, nos recherches ont portés sur des mimes d’hélices inspirés des séquences de coactivateurs. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à la génération et à l’étude de dimères covalents de foldamères, qui pourraient être utilisés pour couvrir des surfaces d’interaction plus larges. En effet, les interactions protéine-protéine montrent souvent un mode d’interaction plus complexe qu’une simple hélice, faisant intervenir des structures tertiaires et quaternaires de type coiled coils, qui peuvent aussi servir de point de départ pour la conception de nouvelles classes d’inhibiteurs.

In the crowded cell, proteins interact with their functional partners, but also with a large number of non-functional partners that compete with the functional ones. The goal of this thesis is to characterize the physical properties and the evolution of protein surfaces in order to understand how selection pressure exerts on proteins, shaping their interactions and regulating this severe competition.To do this I developed a framework based on docking calculations to characterize the propensity of protein surfaces to interact with other proteins. Molecular cartography enables the visualization and the comparison of surface properties of proteins. I implemented a new theoretical framework based on the representation of interaction energy landscapes by 2-D energy maps. These maps reflect in a synthetic manner the propensity of the surface of proteins to interact with other proteins. These maps are useful from a practical point view for determining the regions of protein’s surface that are more prone to interact with other proteins. Our new theoretical framework enabled to show that the surface of proteins harbor regions with different levels of propensity to interact with other proteins (hot regions, intermediate and cold regions to favorable, intermediate and unfavorable regions respectively).A large part of this thesis work consisted in characterizing the physico-chemical properties and the evolution of these regions. The other part of this thesis work consisted in applying this methodology on several study systems: homomeric complexes, cytosolic proteins from S. cerevisiae, families of interologs. This work opens the way to numerous practical applications in structural bioinformatics, such as binding site prediction, functional annotation and the design of new interactions.To conclude, the strategy implemented in this work enable the exploration of the propensity of a protein to interact with hundred of protein partners. It thus enables the investigation of the behavior of a protein in a crowded environment. This application goes beyond the classical use of protein docking as a, because our strategy provides a systemic point of view of protein interactions at an atomic resolution.; Dans la cellule, les protéines évoluent dans un environnement très dense et interagissent ainsi avec un grand nombre de partenaires spécifiques et non-spécifiques qui entrent en compétition. L’objectif de ma thèse est de caractériser les propriétés physiques et évolutives des surfaces protéiques pour comprendre comment la pression de sélection s’exerce sur les protéines, façonnant leurs interactions et régulant ainsi cette sévère compétition.Pour cela, j’ai développé une méthodologie permettant de caractériser la propension des protéines à interagir avec les protéines de leur environnement, par des approches de docking. La cartographie moléculaire permettant la visualisation et la comparaison des propriétés de la surface des protéines, j’ai donc mis en place un nouveau cadre théorique basé sur une représentation des paysages énergétiques d'interaction par des cartes d'énergies. Ces cartes (en deux dimensions) reflètent de manière synthétique la propension des surfaces protéiques à engager des interactions avec d’autres protéines. Elles sont donc d’un grand intérêt pratique pour déterminer les régions des surfaces protéiques les plus enclines à engager des interactions avec d’autres molécules.Ce nouveau cadre théorique a permis de montrer que les surfaces des protéines comprennent des régions de différents niveaux d'énergies de liaison (régions chaudes, intermédiaires et froides pour les régions d'interaction favorables, intermédiaires et défavorables respectivement).Une partie importante de la thèse a consisté à caractériser les propriétés physico-chimiques et évolutives de ces différentes régions. L'autre partie a consisté à appliquer cette méthode sur plusieurs systèmes : complexes homomériques, protéines du cytosol de S. cerevisiae, familles d'interologues. Ce travail ouvre la voie à un grand nombre d'applications en bioinformatique structurale, telles que la prédiction de sites de liaison, l’annotation fonctionnelle ou encore le design de nouvelles interactions.En conclusion, la stratégie mise en place lors de ma thèse permet d’explorer la propension d’une protéine à interagir avec des centaines de partenaires d'intérêts, et donc d'investiguer le comportement d’une protéine dans un environnement cellulaire spécifique. Cela va donc au-delà de l'utilisation classique du docking "binaire" puisque notre stratégie fournit une vision systémique des interactions protéiques à l’échelle des "résidus".

Complex and dynamic protein-protein interactions are the core of protein-based networks in cells. At excitatory synapses, the postsynaptic density (PSD) is a typical example of protein-based network whose nanoscale structure and composition determines the cellular function. For instance, the dynamic regulation of PSD composition and glutamate receptors movements into or out of the PSD are the base of current molecular theories of learning and memory. In this context, during my PhD, I focused on a class of protein-protein interactions mediated by PDZ domains. Indeed, over the last decade, numerous studies have shown the critical implication of PDZ domain-mediated interactions from the PSD95 scaffolding protein family in the synaptic targeting and anchoring of glutamate receptors. However, in part due to the lack of adapted tools, the molecular mechanisms that dynamically govern their respective synaptic retention remain poorly understood. In order to investigate these PDZ domain-mediated interactions, I developed several selection strategies by phage-display based on the fibronectin type III (FN3) scaffold in order to either target the PDZ domain-binding motifs of the receptors complexes (e.g., stargazin for AMPARs and GluN2A for NMDARs) or the PDZ domains themselves. Using a multidisciplinary approach, my main objectives were to engineer small synthetic antibodies that will allow us to acutely and specifically disrupt or stabilize these protein complexes, as well as monitor endogenous interactions.; Les interactions protéine-protéine (IPPs), complexes et dynamiques, sont le cœur des réseaux protéiques cellulaires. Au niveau des synapses excitatrices, la densité post-synaptique (PSD) est un exemple typique de réseau protéique dont la structure et la composition à l’échelle nanoscopique détermine la fonction cellulaire. Ainsi, la régulation dynamique de la composition de la PSD et des mouvements des récepteurs au glutamate dans ou hors de la PSD constitue la base des théories moléculaires actuelles sur l’apprentissage et la mémoire. Dans ce contexte, durant ma thèse, j’ai étudié une classe d’IPPs faisant intervenir les domaines PDZ. En effet, durant ces dernières années, de nombreuses études ont démontré l’implication de ces interactions impliquant les domaines PDZ de la famille de PSD95 dans le ciblage synaptique et l’ancrage des récepteurs au glutamate. Cependant, en partie dû au manque d’outils adaptés, les mécanismes moléculaires sous-jacents qui contrôlent de façon dynamique leur rétention à la synapse restent mal compris. Dans le but d’étudier ces interactions impliquant des domaines PDZ, j’ai développé plusieurs stratégies de sélection par phage display basées sur l’utilisation du dixième domaine de type III de la fibronectine humaine (10Fn3) dans le but de cibler les motifs d’interaction aux domaines PDZ des récepteurs (Stargazin pour les rAMPA et GluN2A pour les rNMDA) ou les domaines PDZ eux-mêmes. En utilisant une approche multidisciplinaire, mes objectifs principaux ont été de concevoir de petits anticorps synthétiques qui nous permettront de rompre ou de stabiliser spécifiquement ces complexes protéiques, ainsi que d’observer les interactions endogènes.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes., Bacterial Type IV secretion systems (T4SSs) are complexes that are constituted of 8 to 12 conserved proteins and used by many Gram-negative bacteria for the translocation of proteins and DNA-protein complexes as well as for the transport of DNA-protein complexes across their cell envelope. T4SS are excellent model targets for the development of antivirulence drugs as they are essential virulence factor for many bacterial pathogens, such as Brucella suis. Antivirulence drugs that deprive the pathogen of its essential virulence factor, the T4SS, would constitute alternatives to or enhancements of current antibiotic treatment. VirB8, a conserved core assembly factor in T4SS, forms homo- and heterodimers that are very important for T4SS function in these pathogens. Due to its multiple interactions, we hypothesized that VirB8 is an excellent model for the analysis of assembly factors but also a potential target for drugs that could target its protein–protein interactions, which would disarm bacteria by depriving them of their essential virulence functions. The existence of a monomer-dimer equilibrium and self-association of VirB8 were previously demonstrated as being essential for T4SS biological activity. Guided by quantitative interaction assays, we here identified (i) potential interaction sites with other T4SS components and (ii) isolated small molecules inhibitors as probes for protein function. To further determine the residues important for heterodimerization of VirB8 with VirB10, we conducted alanine-scanning mutagenesis, phage display and in silico docking. These experiments demonstrated that residues located on the β sheet R160, S162, T164 and I165. are involved in the association of VirB8 and VirB10 and mutagenesis of these residues led to a decrease in the heterodimer formation. The general objective of our research is to gain quantitative insights into the role VirB8 plays in T4SS assembly. Based on a structure-inspired high-throughput screening approach, we identified a promising compound BAR-068 that inhibits VirB8 interactions in the nM range. We used spectroscopy by fluorescence, a bacterial two-hybrid assay, chemical cross-linking and crystallography in order to decipher the mechanism of interactions of this inhibitor with VirB8. Ultimately, this may lead to advance the understanding of T4SS inhibition. Our ultimate objective is to characterize the sequence of events between VirB8 and other VirB factors that guides T4SS complex assembly and function. Our research will reveal general principles of membrane protein complex assembly that will enhance our knowledge of a number of different areas including bacterial protein secretion. In addition, this research will inform an innovative strategy for the development of novel antimicrobial drugs.

The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme.; La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats.

Complex and dynamic protein-protein interactions are the core of protein-based networks in cells. At excitatory synapses, the postsynaptic density (PSD) is a typical example of protein-based network whose nanoscale structure and composition determines the cellular function. For instance, the dynamic regulation of PSD composition and glutamate receptors movements into or out of the PSD are the base of current molecular theories of learning and memory. In this context, during my PhD, I focused on a class of protein-protein interactions mediated by PDZ domains. Indeed, over the last decade, numerous studies have shown the critical implication of PDZ domain-mediated interactions from the PSD95 scaffolding protein family in the synaptic targeting and anchoring of glutamate receptors. However, in part due to the lack of adapted tools, the molecular mechanisms that dynamically govern their respective synaptic retention remain poorly understood. In order to investigate these PDZ domain-mediated interactions, I developed several selection strategies by phage-display based on the fibronectin type III (FN3) scaffold in order to either target the PDZ domain-binding motifs of the receptors complexes (e.g., stargazin for AMPARs and GluN2A for NMDARs) or the PDZ domains themselves. Using a multidisciplinary approach, my main objectives were to engineer small synthetic antibodies that will allow us to acutely and specifically disrupt or stabilize these protein complexes, as well as monitor endogenous interactions., Les interactions protéine-protéine (IPPs), complexes et dynamiques, sont le cœur des réseaux protéiques cellulaires. Au niveau des synapses excitatrices, la densité post-synaptique (PSD) est un exemple typique de réseau protéique dont la structure et la composition à l’échelle nanoscopique détermine la fonction cellulaire. Ainsi, la régulation dynamique de la composition de la PSD et des mouvements des récepteurs au glutamate dans ou hors de la PSD constitue la base des théories moléculaires actuelles sur l’apprentissage et la mémoire. Dans ce contexte, durant ma thèse, j’ai étudié une classe d’IPPs faisant intervenir les domaines PDZ. En effet, durant ces dernières années, de nombreuses études ont démontré l’implication de ces interactions impliquant les domaines PDZ de la famille de PSD95 dans le ciblage synaptique et l’ancrage des récepteurs au glutamate. Cependant, en partie dû au manque d’outils adaptés, les mécanismes moléculaires sous-jacents qui contrôlent de façon dynamique leur rétention à la synapse restent mal compris. Dans le but d’étudier ces interactions impliquant des domaines PDZ, j’ai développé plusieurs stratégies de sélection par phage display basées sur l’utilisation du dixième domaine de type III de la fibronectine humaine (10Fn3) dans le but de cibler les motifs d’interaction aux domaines PDZ des récepteurs (Stargazin pour les rAMPA et GluN2A pour les rNMDA) ou les domaines PDZ eux-mêmes. En utilisant une approche multidisciplinaire, mes objectifs principaux ont été de concevoir de petits anticorps synthétiques qui nous permettront de rompre ou de stabiliser spécifiquement ces complexes protéiques, ainsi que d’observer les interactions endogènes.

Molecular docking is a method that predicts orientation of one molecule with respect to another one when forming a complex. The first computational method of molecular docking was applied to find new candidates against HIV-1 protease in 1990. Since then, using of docking pipelines has become a standard practice in drug discovery. Typically, a docking protocol comprises different phases. The exhaustive sampling of the binding site upon rigid-body approximation of the docking subunits is required. Clustering algorithms are used to group similar binding candidates. Refinement methods are applied to take into account flexibility of the molecular complex and to eliminate possible docking artefacts. Finally, scoring algorithms are employed to select the best binding candidates. The current thesis presents novel algorithms of docking protocols that facilitate structure prediction of protein complexes, which belong to one of the most important target classes in the structure-based drug design. First, DockTrina - a new algorithm to predict conformations of triangular protein trimers (i.e. trimers with pair-wise contacts between all three pairs of proteins) is presented. The method takes as input pair-wise contact predictions from a rigid-body docking program. It then scans and scores all possible combinations of pairs of monomers using a very fast root mean square deviation (RMSD) test. Being fast and efficient, DockTrina outperforms state-of-the-art computational methods dedicated to predict structure of protein oligomers on the collected benchmark of protein trimers. Second, RigidRMSD - a C++ library that in constant time computes RMSDs between molecular poses corresponding to rigid-body transformations is presented. The library is practically useful for clustering docking poses, resulting in ten times speed up compared to standard RMSD-based clustering algorithms. Third, KSENIA - a novel knowledge-based scoring function for protein-protein interactions is developed. The problem of scoring function reconstruction is formulated and solved as a convex optimization problem. As a result, KSENIA is a smooth function and, thus, is suitable for the gradient-base refinement of molecular structures. Remarkably, it is shown that native interfaces of protein complexes provide sufficient information to reconstruct a well-discriminative scoring function. Fourth, CARBON - a new algorithm for the rigid-body refinement of docking candidates is proposed. The rigid-body optimization problem is viewed as the calculation of quasi-static trajectories of rigid bodies influenced by the energy function. To circumvent the typical problem of incorrect stepsizes for rotation and translation movements of molecular complexes, the concept of controlled advancement is introduced. CARBON works well both in combination with a classical force-field and a knowledge-based scoring function. CARBON is also suitable for refinement of molecular complexes with moderate and large steric clashes between its subunits. Finally, a novel method to evaluate prediction capability of scoring functions is introduced. It allows to rigorously assess the performance of the scoring function of interest on benchmarks of molecular complexes. The method manipulates with the score distributions rather than with scores of particular conformations, which makes it advantageous compared to the standard hit-rate criteria. The methods described in the thesis are tested and validated on various protein-protein benchmarks. The implemented algorithms are successfully used in the CAPRI contest for structure prediction of protein-protein complexes. The developed methodology can be easily adapted to the recognition of other types of molecular interactions, involving ligands, polysaccharides, RNAs, etc. The C++ versions of the presented algorithms will be made available as SAMSON Elements for the SAMSON software platform at http://www.samson-connect.net or at http://nano-d.inrialpes.fr/software.; Le docking moléculaire est une méthode permettant de prédire l'orientation d'une molécule donnée relativement à une autre lorsque celles-ci forment un complexe. Le premier algorithme de docking moléculaire a vu jour en 1990 afin de trouver de nouveaux candidats face à la protéase du VIH-1. Depuis, l'utilisation de protocoles de docking est devenue une pratique standard dans le domaine de la conception de nouveaux médicaments. Typiquement, un protocole de docking comporte plusieurs phases. Il requiert l'échantillonnage exhaustif du site d'interaction où les éléments impliqués sont considérées rigides. Des algorithmes de clustering sont utilisés afin de regrouper les candidats à l'appariement similaires. Des méthodes d'affinage sont appliquées pour prendre en compte la flexibilité au sein complexe moléculaire et afin d'éliminer de possibles artefacts de docking. Enfin, des algorithmes d'évaluation sont utilisés pour sélectionner les meilleurs candidats pour le docking. Cette thèse présente de nouveaux algorithmes de protocoles de docking qui facilitent la prédiction des structures de complexes protéinaires, une des cibles les plus importantes parmi les cibles visées par les méthodes de conception de médicaments. Une première contribution concerne l‘algorithme Docktrina qui permet de prédire les conformations de trimères protéinaires triangulaires. Celui-ci prend en entrée des prédictions de contacts paire-à-paire à partir d'hypothèse de corps rigides. Ensuite toutes les combinaisons possibles de paires de monomères sont évalués à l'aide d'un test de distance RMSD efficace. Cette méthode à la fois rapide et efficace améliore l'état de l'art sur les protéines trimères. Deuxièmement, nous présentons RigidRMSD une librairie C++ qui évalue en temps constant les distances RMSD entre conformations moléculaires correspondant à des transformations rigides. Cette librairie est en pratique utile lors du clustering de positions de docking, conduisant à des temps de calcul améliorés d'un facteur dix, comparé aux temps de calcul des algorithmes standards. Une troisième contribution concerne KSENIA, une fonction d'évaluation à base de connaissance pour l'étude des interactions protéine-protéine. Le problème de la reconstruction de fonction d'évaluation est alors formulé et résolu comme un problème d'optimisation convexe. Quatrièmement, CARBON, un nouvel algorithme pour l'affinage des candidats au docking basés sur des modèles corps-rigides est proposé. Le problème d'optimisation de corps-rigides est vu comme le calcul de trajectoires quasi-statiques de corps rigides influencés par la fonction énergie. CARBON fonctionne aussi bien avec un champ de force classique qu'avec une fonction d'évaluation à base de connaissance. CARBON est aussi utile pour l'affinage de complexes moléculaires qui comportent des clashes stériques modérés à importants. Finalement, une nouvelle méthode permet d'estimer les capacités de prédiction des fonctions d'évaluation. Celle-ci permet d‘évaluer de façon rigoureuse la performance de la fonction d'évaluation concernée sur des benchmarks de complexes moléculaires. La méthode manipule la distribution des scores attribués et non pas directement les scores de conformations particulières, ce qui la rend avantageuse au regard des critères standard basés sur le score le plus élevé. Les méthodes décrites au sein de la thèse sont testées et validées sur différents benchmarks protéines-protéines. Les algorithmes implémentés ont été utilisés avec succès pour la compétition CAPRI concernant la prédiction de complexes protéine-protéine. La méthodologie développée peut facilement être adaptée pour de la reconnaissance d'autres types d'interactions moléculaires impliquant par exemple des ligands, de l'ARN… Les implémentations en C++ des différents algorithmes présentés seront mises à disposition comme SAMSON Elements de la plateforme logicielle SAMSON sur http://www.samson-connect.net ou sur http://nano-d.inrialpes.fr/software.

Molecular docking is a method that predicts orientation of one molecule with respect to another one when forming a complex. The first computational method of molecular docking was applied to find new candidates against HIV-1 protease in 1990. Since then, using of docking pipelines has become a standard practice in drug discovery. Typically, a docking protocol comprises different phases. The exhaustive sampling of the binding site upon rigid-body approximation of the docking subunits is required. Clustering algorithms are used to group similar binding candidates. Refinement methods are applied to take into account flexibility of the molecular complex and to eliminate possible docking artefacts. Finally, scoring algorithms are employed to select the best binding candidates. The current thesis presents novel algorithms of docking protocols that facilitate structure prediction of protein complexes, which belong to one of the most important target classes in the structure-based drug design. First, DockTrina - a new algorithm to predict conformations of triangular protein trimers (i.e. trimers with pair-wise contacts between all three pairs of proteins) is presented. The method takes as input pair-wise contact predictions from a rigid-body docking program. It then scans and scores all possible combinations of pairs of monomers using a very fast root mean square deviation (RMSD) test. Being fast and efficient, DockTrina outperforms state-of-the-art computational methods dedicated to predict structure of protein oligomers on the collected benchmark of protein trimers. Second, RigidRMSD - a C++ library that in constant time computes RMSDs between molecular poses corresponding to rigid-body transformations is presented. The library is practically useful for clustering docking poses, resulting in ten times speed up compared to standard RMSD-based clustering algorithms. Third, KSENIA - a novel knowledge-based scoring function for protein-protein interactions is developed. The problem of scoring function reconstruction is formulated and solved as a convex optimization problem. As a result, KSENIA is a smooth function and, thus, is suitable for the gradient-base refinement of molecular structures. Remarkably, it is shown that native interfaces of protein complexes provide sufficient information to reconstruct a well-discriminative scoring function. Fourth, CARBON - a new algorithm for the rigid-body refinement of docking candidates is proposed. The rigid-body optimization problem is viewed as the calculation of quasi-static trajectories of rigid bodies influenced by the energy function. To circumvent the typical problem of incorrect stepsizes for rotation and translation movements of molecular complexes, the concept of controlled advancement is introduced. CARBON works well both in combination with a classical force-field and a knowledge-based scoring function. CARBON is also suitable for refinement of molecular complexes with moderate and large steric clashes between its subunits. Finally, a novel method to evaluate prediction capability of scoring functions is introduced. It allows to rigorously assess the performance of the scoring function of interest on benchmarks of molecular complexes. The method manipulates with the score distributions rather than with scores of particular conformations, which makes it advantageous compared to the standard hit-rate criteria. The methods described in the thesis are tested and validated on various protein-protein benchmarks. The implemented algorithms are successfully used in the CAPRI contest for structure prediction of protein-protein complexes. The developed methodology can be easily adapted to the recognition of other types of molecular interactions, involving ligands, polysaccharides, RNAs, etc. The C++ versions of the presented algorithms will be made available as SAMSON Elements for the SAMSON software platform at http://www.samson-connect.net or at http://nano-d.inrialpes.fr/software.; Le docking moléculaire est une méthode permettant de prédire l'orientation d'une molécule donnée relativement à une autre lorsque celles-ci forment un complexe. Le premier algorithme de docking moléculaire a vu jour en 1990 afin de trouver de nouveaux candidats face à la protéase du VIH-1. Depuis, l'utilisation de protocoles de docking est devenue une pratique standard dans le domaine de la conception de nouveaux médicaments. Typiquement, un protocole de docking comporte plusieurs phases. Il requiert l'échantillonnage exhaustif du site d'interaction où les éléments impliqués sont considérées rigides. Des algorithmes de clustering sont utilisés afin de regrouper les candidats à l'appariement similaires. Des méthodes d'affinage sont appliquées pour prendre en compte la flexibilité au sein complexe moléculaire et afin d'éliminer de possibles artefacts de docking. Enfin, des algorithmes d'évaluation sont utilisés pour sélectionner les meilleurs candidats pour le docking. Cette thèse présente de nouveaux algorithmes de protocoles de docking qui facilitent la prédiction des structures de complexes protéinaires, une des cibles les plus importantes parmi les cibles visées par les méthodes de conception de médicaments. Une première contribution concerne l‘algorithme Docktrina qui permet de prédire les conformations de trimères protéinaires triangulaires. Celui-ci prend en entrée des prédictions de contacts paire-à-paire à partir d'hypothèse de corps rigides. Ensuite toutes les combinaisons possibles de paires de monomères sont évalués à l'aide d'un test de distance RMSD efficace. Cette méthode à la fois rapide et efficace améliore l'état de l'art sur les protéines trimères. Deuxièmement, nous présentons RigidRMSD une librairie C++ qui évalue en temps constant les distances RMSD entre conformations moléculaires correspondant à des transformations rigides. Cette librairie est en pratique utile lors du clustering de positions de docking, conduisant à des temps de calcul améliorés d'un facteur dix, comparé aux temps de calcul des algorithmes standards. Une troisième contribution concerne KSENIA, une fonction d'évaluation à base de connaissance pour l'étude des interactions protéine-protéine. Le problème de la reconstruction de fonction d'évaluation est alors formulé et résolu comme un problème d'optimisation convexe. Quatrièmement, CARBON, un nouvel algorithme pour l'affinage des candidats au docking basés sur des modèles corps-rigides est proposé. Le problème d'optimisation de corps-rigides est vu comme le calcul de trajectoires quasi-statiques de corps rigides influencés par la fonction énergie. CARBON fonctionne aussi bien avec un champ de force classique qu'avec une fonction d'évaluation à base de connaissance. CARBON est aussi utile pour l'affinage de complexes moléculaires qui comportent des clashes stériques modérés à importants. Finalement, une nouvelle méthode permet d'estimer les capacités de prédiction des fonctions d'évaluation. Celle-ci permet d‘évaluer de façon rigoureuse la performance de la fonction d'évaluation concernée sur des benchmarks de complexes moléculaires. La méthode manipule la distribution des scores attribués et non pas directement les scores de conformations particulières, ce qui la rend avantageuse au regard des critères standard basés sur le score le plus élevé. Les méthodes décrites au sein de la thèse sont testées et validées sur différents benchmarks protéines-protéines. Les algorithmes implémentés ont été utilisés avec succès pour la compétition CAPRI concernant la prédiction de complexes protéine-protéine. La méthodologie développée peut facilement être adaptée pour de la reconnaissance d'autres types d'interactions moléculaires impliquant par exemple des ligands, de l'ARN… Les implémentations en C++ des différents algorithmes présentés seront mises à disposition comme SAMSON Elements de la plateforme logicielle SAMSON sur http://www.samson-connect.net ou sur http://nano-d.inrialpes.fr/software.

The aim of this thesis is to develop tools for predicting interactions between proteins that can be applied to the human proteins forming a network with the CFTR protein. This protein, when defective, is involved in cystic fibrosis. The development of in silico prediction methods can be useful for biologists to suggest new interaction targets and to better explain the proteins' functions in the network. We propose a new method to solve the link prediction problem. To benefit from the information of unlabeled data, we place ourselves in the semi-supervised learning framework. Link prediction is addressed as an output kernel learning task, referred as Output Kernel Regression. An output kernel is assumed to encode the proximities of nodes in the target graph and the goal is to approximate this kernel by using appropriate input features. Using the kernel trick in the output space allows one to reduce the problem of learning from pairs to learning a single variable function with output values in a Hilbert space. By choosing candidates for regression functions in a reproducing kernel Hilbert space with operator valued kernels, we develop tools for regularization as for scalar-valued functions. We establish representer theorems in the supervised and semi-supervised cases and use them to define new regression models for different cost functions, called IOKR-ridge and IOKR-margin. We first tested the developed approach on transductive link prediction using artificial data, benchmark data as well as a protein-protein interaction network of the yeast S. Cerevisiae and we obtained very good results. Then we applied it to the prediction of protein interactions in a network built around the CFTR protein.; L'objectif de cette thèse est de développer des outils de prédiction d'interactions entre protéines qui puissent être appliqués en particulier chez l'homme, sur les protéines qui constituent un réseau avec la protéine CFTR. Cette protéine, lorsqu'elle est défectueuse, est impliquée dans la mucoviscidose. Le développement de méthodes de prédiction in silico peut s'avérer utile pour suggérer aux biologistes de nouvelles cibles d'interaction et pour mieux expliquer les fonctions des protéines présentes dans ce réseau. Nous proposons une nouvelle méthode pour le problème de la prédiction de liens dans un réseau. Afin de bénéficier de l'information des données non étiquetées, nous nous plaçons dans le cadre de l'apprentissage semi-supervisé. Nous abordons ce problème de prédiction comme une tâche d'apprentissage d'un noyau de sortie, appelée régression à noyau de sortie. Un noyau de sortie est supposé coder les proximités existantes entre les noeuds du graphe et l'objectif est d'approcher ce noyau à partir de descriptions appropriées en entrée. L'utilisation de l'astuce du noyau dans l'ensemble de sortie permet de réduire le problème d'apprentissage à partir de paires à un problème d'apprentissage d'une fonction d'une seule variable à valeurs dans un espace de Hilbert. En choisissant les fonctions candidates pour la régression dans un espace de Hilbert à noyau reproduisant à valeur opérateur, nous développons, comme dans le cas de fonctions à valeurs scalaires, des outils de régularisation. Nous établissons en particulier des théorèmes de représentation dans le cas supervisé et dans le cas semi-supervisé, que nous utilisons ensuite pour définir de nouveaux modèles de régression pour différentes fonctions de coût, appelés IOKR-ridge et IOKR-margin. Nous avons d'abord testé l'approche développée sur des données artificielles, des problèmes test ainsi que sur un réseau d'interaction protéine-protéine chez la levure S. Cerevisiae et obtenu de très bons résultats. Puis nous l'avons appliquée à la prédiction d'interactions entre protéines dans le cas d'un réseau construit autour de la protéine CFTR.

Artificial mini-proteins able to target catalytic sites of matrix metalloproteinases (MMPs) were designed using a functional motif grafting approach. The motif corresponded to the 4 N-terminal residues of TIMP-2, a broad-spectrum natural protein inhibitor of MMPs. Scaffolds able to reproduce the functional topology of this motif as described in the TIMP-2/MMP-14 complex were obtained by exhaustive screening of the Protein Data Bank (PDB) using the STAMPS software (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Ten artificial protein binders satisfying all topologic, steric and electrostatic criteria applied for selection were produced for experimental evaluation. These binders targeted catalytic sites of MMPs with affinities ranging from 450 nM and 590 μM prior to optimization. The crystal structures of two artificial binders in complex with the catalytic domain of MMP-12 showed that the intermolecular interactions established by the functional motif in these artificial binders corresponded to those found in the TIMP-2/MMP-14 complex, albeit with some differences in their geometry. Molecular dynamics simulations of the 10 binders in complex with MMP-14 suggested that these scaffolds could allow reproducing in part the native intermolecular interactions, but some differences in geometry and stability could contribute to the lower affinity of the artificial protein binders as compared to the natural one. Nevertheless, these results show that the in silico design method used can provide sets of starting protein binders targeting a specific binding site with a good rate of success. This approach could constitute the first step of an efficient hybrid computational-experimental protein binder design approach.; Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d’ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d’acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l’aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d’association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d’un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d’entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d’intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d’une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Artificial mini-proteins able to target catalytic sites of matrix metalloproteinases (MMPs) were designed using a functional motif grafting approach. The motif corresponded to the 4 N-terminal residues of TIMP-2, a broad-spectrum natural protein inhibitor of MMPs. Scaffolds able to reproduce the functional topology of this motif as described in the TIMP-2/MMP-14 complex were obtained by exhaustive screening of the Protein Data Bank (PDB) using the STAMPS software (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Ten artificial protein binders satisfying all topologic, steric and electrostatic criteria applied for selection were produced for experimental evaluation. These binders targeted catalytic sites of MMPs with affinities ranging from 450 nM and 590 μM prior to optimization. The crystal structures of two artificial binders in complex with the catalytic domain of MMP-12 showed that the intermolecular interactions established by the functional motif in these artificial binders corresponded to those found in the TIMP-2/MMP-14 complex, albeit with some differences in their geometry. Molecular dynamics simulations of the 10 binders in complex with MMP-14 suggested that these scaffolds could allow reproducing in part the native intermolecular interactions, but some differences in geometry and stability could contribute to the lower affinity of the artificial protein binders as compared to the natural one. Nevertheless, these results show that the in silico design method used can provide sets of starting protein binders targeting a specific binding site with a good rate of success. This approach could constitute the first step of an efficient hybrid computational-experimental protein binder design approach.; Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d’ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d’acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l’aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d’association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d’un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d’entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d’intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d’une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Protein-protein interactions play a central role in the regulation of biological processes and represent a promissing class of therapeutic targets. It has been recently reported that disrupting the interaction between the PDZ protein PSD-95 and the serotonin receptor 5-HT2A induced an antihyperalgesic effect in diabetic rats. In this context, the development of original ligands capable to inhibit specifically this interaction could lead to a new class of analgesic compounds.We carried out the synthesis of three generations of ligands possessing an indole moiety in order to interact with the highly conserved carboxylate-binding loop (GLGF loop) of PSD-95. Two generations of compounds were developed to find out the position and the nature of the substituents furnishing the best interactions. One generation consists of a family of 15 biligands possessing a substituted indole moiety, coupled with a linker (having from 2 to 6 carbon atoms) via an amid function, ended with various amino acids to interact with the S1 site of the protein, in order to obtain specific ligands.By various biological evaluations, NMR HSQC 1H/15N, chromatography affinity assays and in vivo experiments, we identified two promising inhibitors of the interaction PSD-95/5-HT2A with strong interactions with S0 site of PSD-95. For these compounds, we determined the structure of the complex protein/ligand by NMR NOESY experiments. The orientation of one of these molecules in the S0 site allows us to envisage a new generation of ligands capable to interact with the S1 site of the protein., Les protéines à domaine PDZ, en très grand nombre dans le génome humain, sont impliquées dans des interactions protéine-protéine. Elles participent ainsi à véhiculer des signaux à l’origine de différentes pathologies (cancer, douleur….). L’interruption de l’interaction entre la protéine à domaine PDZ, PSD-95, et le récepteur de la sérotonine, 5-HT2A, entraîne une réduction de l’hyperalgie chez le rat neuropathique. Le développement de molécules capables d’inhiber cette interaction pourrait donc conduire à une nouvelle classe d’antalgiques.Nous avons réalisé, au cours de ces travaux, la synthèse de trois générations de ligands, comportant un noyau indolique, capables d’interagir avec le site S0, site très conservé des protéines à domaines PDZ. Dans un premier temps, nous avons préparé 15 biligands possédant un noyau indolique polysubstitué lié, via un espaceur de longueur variable (2 à 6 atomes de carbone), à différents acides aminés, dans le but d’interagir avec le site S1, montrant beaucoup de diversité en fonction du domaine. Nous avons ensuite, après une étude de relation structure/activité, développé deux autres générations d’indoles polysubstitués présentant notamment des substituants hydrophobes en position 5.Nous avons montré, par RMN HSQC 1H/15N et chromatographie d’affinité, que deux de ces composés sont des inhibiteurs de l’interaction PSD-95/5-HT2A et présentent de fortes interactions avec le site S0 de PSD-95. Ces molécules présentent également des propriétés antalgiques particulièrement intéressantes in vivo. Nous avons également déterminé, par RMN NOESY, la structure du complexe protéine/ligand pour ces deux composés. L’orientation d’une de ces molécules dans le site de la protéine nous permet d’envisager le développement d’une nouvelle génération d’indoles polysubstitués, pouvant interagir avec le site S1 de la protéine et permettant ainsi d’obtenir des inhibiteurs sélectifs de l’interaction PSD-95/5-HT2A.

La leucémie lymphoïde représente environ 30% des cas de cancer chez l’enfant. Elle est souvent causée par des réarrangements chromosomiques impliquant des gènes encodant des facteurs de transcription, qui contrôlent des programmes génétiques complexes. Par exemple, LMO2 (LIM-only 2) est un facteur de transcription oncogénique fréquemment exprimé de façon aberrante dans les leucémies lymphoblastiques aigues des cellules T (T-ALL). Dans l’hématopoïèse normale, LMO2 est essentiel à la génération des cellules souches hématopoïétiques à l’origine de toutes les cellules sanguines. D’ailleurs, certaines cellules leucémiques possèdent des propriétés normalement réservées aux cellules souches hématopoïétiques. Ainsi, l’étude de la fonction de LMO2 dans les cellules souches hématopoïétiques peut être pertinente autant dans le contexte hématopoïétique normal que leucémique. Afin de mettre en évidence de nouvelles fonctions moléculaires pour LMO2, j’ai choisi d’identifier les protéines qui s’y associent. En plus de ses partenaires connus, j’ai identifié plusieurs protéines de transcription/remodelage de la chromatine, en accord avec son rôle transcriptionnel. Plusieurs nouvelles fonctions potentielles ont été révélées, indiquant que cette protéine adaptatrice pourrait faire partie de complexes non transcriptionnels, régulant d’autres processus cellulaires. Les oncogènes comme LMO2 pourraient être des régulateurs à large spectre. Particulièrement, j’ai identifié des interactions entre LMO2 et des protéines de réplication de l’ADN. J’ai montré que LMO2 contrôle la réplication de l’ADN dans les cellules hématopoïétiques, et possiblement durant la leucémogenèse, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Ensemble, ces études ont donc permis de révéler de nouvelles fonctions pour LMO2, et pourraient servir de paradigme pour d’autres facteurs de transcription oncogéniques, particulièrement aux autres protéines de la famille LMO, qui sont aussi des oncogènes puissants., Lymphoid leukemia represents about 30% of childhood cancer cases. It is often caused by chromosomal rearrangements involving genes coding for transcription factors, controlling complex genetic programs. As an example, the oncogenic transcription factor LMO2 (LIM-only 2) is often aberrantly expressed in T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). In normal hematopoiesis, LMO2 is essential for the generation of hematopoietic stem cells that give rise to all blood cells. Moreover, some leukemic cells possess properties normally reserved to hematopoietic stem cells. Thus, studying the role of LMO2 in hematopoietic stem cells could be relevant to the contexts of normal hematopoiesis and leukemogenesis. To reveal new molecular functions for LMO2, I chose to identify its associated proteins. In addition to its known protein partners, I identified many proteins involved in transcription/chromatin remodeling, in agreement with its transcriptional role. In addition, several new potential functions have been revealed, indicating that this scaffold protein could be part of non-transcriptional protein complexes, regulating different cell processes. Oncogenes like LMO2 could be master regulators in normal hematopoietic and leukemic cells. Particularly, I identified protein-protein interactions between LMO2 and DNA replication proteins. I demonstrated that LMO2 controls S phase progression in hematopoietic cells, independently of its association in transcriptional complexes. LMO2 overexpression in mice induces T-ALL and affects specifically the cell cycle status of thymocyte progenitors, which are targets of transformation by LMO2. Thus, LMO2 promotes DNA replication in hematopoietic cells, and possibly in leukemogenesis. Together, these studies allowed to reveal new functions for LMO2, and could serve as a paradigm for other oncogenic transcription factors, especially for other LMO proteins which are all potent oncogenes.

Box C/D and H/ACA ribonucleoparticles (RNPs) are required for UsnRNA and ribosomal RNA maturation. Their assembly in cells is a complex process, which implicates numerous cellular factors, such as NUFIP, a common assembly factor, and NAF1, which is a specific factor for H/ACA box RNP assembly. The Survival of Motoneurons (SMN) complex is essential for cell survival and is required for the assembly of another class of RNPs, the UsnRNPs, which are essential components of the splicing machinery. Decreased levels of the SMN protein lead to a severe disease, the spinal muscular atrophy. Several studies led to the proposal that the SMN complex also plays a role in the assembly of box C/D and H/ACA RNPs. In order to obtain more information, we analyzed whether some interactions may exist between components of the SMN complex and i) core proteins of mature RNPs, or ii) factors already known to be involved in the assembly. Using a yeast two-hybrid approach, we observed strong interactions between NAF1 and the SMN complex components, Gemin3 and Gemin8. Since the core H/ACA protein GAR1 interacts with the SMN protein, our data suggest that the SMN complex participates to the exchange of NAF1 by GAR1, which is a crucial step of H/ACA box RNP biogenesis. Furthermore, we discovered strong interactions between Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP and Gemin6/NUFIP. Concerning the Gemin6/NUFIP interaction, we showed that is direct, that it exists in both compartments in mammalian cells and we defined domains of both proteins necessary for the interaction in collaboration with the E. Bertrand team (IGM Montpellier). These results open new perspectives concerning functional links between the SMN complex and NUFIP in box H/ACA and C/D RNP assembly, but also in U4 snRNP assembly and in the mechanism of localized translation, Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) à boîtes C/D et H/ACA sont impliquées dans la maturation des UsnRNA et des précurseurs des ARNr. L'assemblage de ces RNP dans les cellules est un processus complexe faisant intervenir de nombreux facteurs cellulaires dont NUFIP, commun aux deux RNP, et NAF1, spécifique aux RNP à boîtes H/ACA. Le complexe de Survie des Motoneurones (SMN) est essentiel à la survie cellulaire et est nécessaire à l'assemblage d'une autre RNP, les UsnRNP, composants des spliceosomes. Un déficit en protéine SMN conduit à une pathologie grave, l'amyotrophie spinale. Plusieurs études suggèrent que le complexe SMN puisse également jouer un rôle dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA. Dans le but d'obtenir de plus amples informations, nous avons testé si des interactions existent entre les constituants du complexe SMN et i) les protéines associées aux RNP matures, ainsi que ii) les autres facteurs d'assemblage déjà connus. Ainsi, par une approche de double hybride chez la levure, nous avons observé des interactions fortes entre NAF1 et les protéines Gemin3 et Gemin8 du complexe SMN. Comme la protéine coeur GAR1 des RNP à boîte H/ACA interagit avec la protéine SMN, ces données suggèrent que le complexe SMN participe à l'échange de NAF1 par GAR1, qui est une étape clé de la biogenèse des RNP à boîtes H/ACA. De plus, nous avons mis en évidence des interactions entre Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP et Gemin6/NUFIP. L'étude de cette dernière interaction a été approfondie. Nous avons montré que l'interaction est directe, qu'elle existe dans les cellules de mammifères à la fois dans le cytoplasme et le noyau, et nous avons défini les domaines de chaque protéine nécessaires à l'interaction, en collaboration avec l'équipe d'E. Bertrand (IGM Montpellier). Ces résultats ouvrent de larges perspectives quant à un lien fonctionnel entre le complexe SMN et NUFIP dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA, mais aussi dans l'assemblage de la snRNP U4 et dans le mécanisme de traduction localisée dans les cellules

Bacterial actin homologues (MreB proteins) play a major role in cell morphogenesis in non-spherical bacteria. The prevailing model postulates that helical, membrane-associated MreB-like filaments organize elongation-specific peptidoglycan-synthesizing complexes along the sidewalls. However, the mechanistic details, as well as the effector proteins of MreBs morphogenetic function, remain to be elucidated. MreB proteins are also involved in DNA segregation, cell polarity, cell motility and, by analogy to eukaryotic actins, possibly in other functions that require the targeting and accurate positioning of proteins and molecular complexes in the cell. Gram-positive bacteria usually have more than one MreB isoform. Our model organism, Bacillus subtilis, has three called MreB, Mbl and MreBH. To explore the roles of the MreB cytoskeleton in B. subtilis, we used genome-wide yeast two-hybrid screens to identify proteins that physically associate with MreB, Mbl and MreBH. Stringent specificity assays were systematically performed to remove false positives and confirm the specificity of all potential interactions identified in the screens. A protein-protein interaction network centered on the three MreBs was generated which includes 16 protein partners. This interaction network provides insights into the links of MreB proteins with proteins belonging to several functional categories as well as proteins of unknown function. An exploratory study was conducted in silico and in vivo for 8 of the partner proteins identified in the network and allowed us to select one interaction for a more in-depth analysis. We next focused in the physical interaction between MreB and DapL, an essential protein presumably involved in the early steps of peptidoglycan biosynthesis. The characterization of DapL confirmed its essential role in cell wall synthesis. The MreB-DapL interaction was confirmed biochemically and we showed that MreB also associates with other proteins involved in the synthesis of the PG precursors (DapG, LysA and MurE). Together, these results suggest that B. subtilis MreB orchestrates the PG biosynthetic cytosolic machineries to achieve and maintain its rod shape.; Le cytosquelette bactérien des homologues d’actine (protéines de la famille MreB) joue un rôle majeur dans la morphogénèse cellulaire. Des homologues de MreB sont retrouvés chez la plupart des espèces bactériennes non sphériques, où ils sont essentiels pour la viabilité cellulaire. Les bactéries à Gram-positif ont généralement plusieurs isoformes. L’organisme modèle Bacillus subtilis en possède trois : MreB, Mbl et MreBH, tous trois impliqués dans la détermination de la forme de la cellule. Le postulat actuel est une organisation, des complexes de synthèse du peptidoglycane, le long des parois latérales par les filaments hélicoïdaux des MreB-like. Cependant, les mécanismes moléculaires et les protéines effectrices impliqués dans cette fonction ne sont pas encore élucidés. Par analogie avec les rôles de l’actine eucaryote, des implications dans d’autres processus cellulaires cruciaux et la présence de partenaires protéiques sont également attendus pour les actines procaryotes. Afin d’explorer les rôles des protéines MreB chez B. subtilis nous avons généré, par des criblages génomiques double hybride chez la levure, un réseau d’interaction protéine-protéine centré sur MreB, Mbl et MreBH. Une vérification systématique et drastique de toutes les interactions obtenues lors des criblages a été réalisée afin d’éliminer les faux positifs. Les interactions identifiées révèlent des liens entre les protéines MreB-like et seize protéines issues de catégories fonctionnelles variées ou de fonction inconnue. Une étude exploratoire a été menée pour huit des protéines partenaires par des approches in silico et in vivo et nous a permis de sélectionner une seule interaction à caractériser plus en détail. Nous nous sommes principalement intéressés à l’interaction physique et directe entre MreB et DapL, une protéine essentielle vraisemblablement impliquée dans la voie de biosynthèse des précurseurs du peptidoglycane, par analogie à DapE d’E. coli. La caractérisation approfondie de DapL a confirmé son essentialité dans la synthèse du peptidoglycane. Bien que l’interaction MreB-DapL ait été confirmée biochimiquement, son rôle biologique exact n’a pas été élucidé. Cependant, nous avons mis en évidence d’autres interactions entre MreB et DapG, LysA et MurE, des enzymes également impliquées dans les étapes précoces de la synthèse du peptidoglycane. L’existence de telles interactions renforce le rôle du cytosquelette MreB de B. subtilis dans l’orchestration des machineries de synthèse de la paroi cellulaire.

A critical step for retroviral replication is the stable integration of the provirus genome into the genome of its host; this integration is realized by a viral enzyme, the integrase. The aim of this work was to better understand the functioning of the integrase, particularly, by identifying host factors that might interact with it, and which could be factors favoring the integration process or, restrictive factors. Therefore, we used two models of retroviral integrases: The integrase of RAV1, an alpharetrovirus belonging to the subgroup A of the family of ALSV. Although this viral enzyme is widely studied, still not enough data are available about its cellular cofactors. The second enzyme studied here is the integrase of PERV, a gammaretrovirus. No studies of either PERV integrase activities in vitro or of proteins interacting with this viral enzyme have been available until now. In the present study, we have expressed the PERV and ALSV integrases as fusion proteins with a 6xHistidine Tag in both Escherichia coli and insect SF9 cells. After that, we analysed their ability to mediate catalytic activities (3’-end processing, strand transfer and disintegration) in vitro. We also investigated the interaction of these two viral enzymes with the cellular protein Brd2, using the Far western blot method. Our results validate Brd2 as a cofactor of PERV integrase and point to the important role of particular domains of the PERV integrase and Brd2 in mediating the interaction. Finally, this study contibute to a better understanding of the precise interaction between cellular proteins and integrase, and may lead in the future to the development of protein-protein interaction inhibitors, Les rétrovirus sont des virus à ARN, enveloppés présents dans de nombreuses espèces animales de rente, chez les animaux de compagnie et chez l’homme. Une des particularités des rétrovirus concerne l’intégration du génome viral au sein du génome de la cellule infectée; cette intégration est réalisée par une enzyme virale, l’intégrase. Le projet de cette thèse vise à mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme notamment en identifiant des facteurs cellulaires interagissant avec celle-ci, facteurs qui pourraient être des agents favorisant le processus intégratif ou, au contraire, des agents restrictifs. Les intégrases de deux modèles de rétrovirus ont été utilisées dans cette étude : L’intégrase de RAV1, un rétrovirus exogène aviaire du genre des alpharétrovirus appartenant au sous-groupe A de la famille des ASLV. Cette enzyme virale est largement étudiée soit au niveau structural ou fonctionnel, mais les données concernant ses partenaires cellulaires sont rares et insuffisantes. La seconde intégrase est celle du PERV A/C, un rétrovirus endogène porcin du genre gammarétrovirus. Aucune information sur cette enzyme n’a été décrite jusqu’à présent. Ces deux enzymes, en fusion avec une étiquette 6xHistidine, ont été donc produites en bactérie, et en cellules d’insecte puis purifiées sur colonne d’affinité en FPLC. Leurs activités catalytiques ont été testées in vitro. Ces tests permettent de valoriser la capacité de l’intégrase à exercer principalement les 2 fonctions dont elle est responsable in vivo, le clivage en 3’ et le transfert de brins, et une activité qu’elle exerce exclusivement in vitro, la désintégration. Les protéines pures et actives ont ensuite servies à la vérification de leur interaction avec une protéine cellulaire, Brd2. La technique ‘Far western blot’ a ainsi permis de valider l’interaction entre l’intégrase de PERV et la protéine cellulaire, puis d’identifier les domaines de l’intégrase et de Brd2 impliqués dans cette interaction. A terme, l’identification de ce facteur cellulaire et la validation de son rôle dans le processus intégratif permettront de mieux comprendre ce processus particulier développé par les rétrovirus et pourront conduire au développement d’inhibiteurs dirigés contre cette interaction

In skeletal muscle, the action potential triggers muscle contraction through a massive calcium release from the sarcoplasmic reticulum (SR). This process, called excitation-contraction coupling (ECC), requires physical interactions between two calcium channels: (1) the dihydropyridine receptor (DHPR), a voltage-dependent channel composed of four subunits among which the 1S subunit, that forms both the pore and the voltage-sensor, and the 1a subunit fully cytoplasmic, and (2) the ryanodine receptor (RyR1) which is responsible of calcium release from SR. 1a subunit interacts with both RyR1 and the 1S subunit. The mechanism whereby the DHPR is functionally coupled to RyR1 is still not clearly understood. During my thesis, I identified new molecular and structural determinants of the interaction between RyR and DHPR. I demonstrated the existence of intramolecular interactions between the cytoplasmic loops of the 1S subunit centered on a domain called domain A. I also localized the site of interaction of the caveoline-3 on the I-II loop of 1S. The study of the interaction of the β1a subunit with RyR1 showed (1) that the C-terminal region of β1a controls this interaction, (2) that the affinity of this interaction is strongly increased by the interaction of β1a with 1S, and 3) that the interaction β1a/RyR1 regulates the closure of RyR1. The use of a toxin, the maurocalcine (MCa) which behaves as an analogue of the domain A allowed me to identify a minimal domain of RyR1 responsible for the binding of the MCa and the domain A. A structural study by NMR of this domain has been realized. Finally, I studied the effect of the MCa on myotubes not expressing the 1S sub-unit. I showed that the MCa is capable of restoring in absence of DHPR, an increase of the cytoplasmic Ca2+ concentration triggered by the depolarization of the plasma membrane.; L'excitation nerveuse d'une cellule musculaire produit une libération massive dans le cytoplasme du Ca2+ stocké dans le réticulum sarcoplasmique (RS). L'augmentation de la concentration cytoplasmique de Ca2+ déclenche la contraction. Ce processus, appelé couplage excitation contraction (CEC), requiert des interactions physiques entre deux canaux calciques : (1) le récepteur des dihydropyridines (DHPR), un canal calcique activé par le voltage ; le DHPR est composé de plusieurs sous-unités, dont la sous-unité α1S, qui forme le canal et le détecteur de potentiel, et la sous-unité β1a, entièrement cytoplasmique; (2) le récepteur à la ryanodine (RyR1) responsable de la libération de Ca2+ hors du RS. La sous unité β1a interagit avec la sous-unité α1S et RyR1. Au cours de ma thèse, j'ai identifié de nouveaux déterminants moléculaires et structuraux de l'interaction DHPR/RyR1. J'ai ainsi démontré l'existence d'interactions intramoléculaires entre les différentes boucles cytoplasmiques de la sous-unité α1S du DHPR, centrées autour d'un domaine appelé domaine A. J'ai également localisé le site d'interaction de la cavéoline-3 sur une boucle cytoplasmique de la sous-unité α1S. L'étude de l'interaction de la sous-unité β1a avec RyR1 a montré (1) que la région C-terminale de β1a contrôle cette interaction, (2) que l'affinité apparente de β1a pour RyR1 est fortement augmentée par l'interaction de β1a avec α1S et (3) que l'interaction β1a/RyR1 régule la fermeture du RyR. L'utilisation d'une toxine, la maurocalcine (MCa) qui se comporte comme un analogue du domaine A m'a permis d'identifier un domaine minimal de RyR1 responsable de la fixation de la MCa et du domaine A. Une étude structurale par RMN de ce site a été réalisée. Enfin, j'ai étudié l'effet de la MCa sur des myotubes n'exprimant pas la sous-unité α1S. J'ai montré que la MCa est capable de restaurer, en absence de DHPR, une augmentation de la concentration de Ca2+ cytoplasmique induite par la dépolarisation de la membrane plasmique.

The human disease neurofibromatosis type 1 is one of the most common genetic disorders because it has a de novo incidence of one in 3500 individuals. The NF1 gene has been identified and it has been demonstrated to be a tumor suppressor. It encodes a protein called neurofibromin (Nf1), which is ubiquitously expressed but most abundant in neurons, astrocytes, Schwann cells and oligodendrocytes. It is of great interest to understand the regulation of this protein. A model study has been developped in yeast in order to characterize the molecular basis of the interaction between Ira2p, the Nf1 homologue, and Tfs1p, a protein which inhibits it. We identified the molecular determinants of Tfs1p involved in the Tfs1p/Ira2p interaction: the accessibility of the surface pocket, its Nterminal region and the specific electrostatic properties of a large surface region containing these two elements. The physiological role of Tfs1p in cells has also been studied. Systematic studies suggest that when Tfs1p is over produced its most important function is the inhibition of Ira2p. We have shown that this inhibitory role is implicated in a negative feedback control of the stress response. On the basis of this study, we wanted to know if the Ira2p/Tfs1p interaction was conserved in human between Nf1 and RKIP, the human homologue of Tfs1p. In parallel, we have performed a two-hybrid screen between Nf1 and a cDNA library of human brain in order to identify new regulators of its functions. 1464 candidates have been isolated. Actually, 8% of the candidates have been identified and we have brought into light three interesting targets.; La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.

The high-throughput characterization of the protein-protein interactions networks laid the bases for the first interaction maps in all model organisms, including human. In contrast, the structures of the protein assemblies are still restricted to a very limited set of interactions. In this work, a specific evolutionary pressure that exerted at protein interfaces has been revealed. To our knowledge, no such effect had been previously described. Based on this finding, a novel bioinformatic approach, called SCOTCH (Surface COmplementarity Trace in Complex History) has been developed to predict the structures of protein assemblies. Coupled to a docking program, such as SCOTCHer also developed in this work, this approach was shown to predict efficiently the structures of many complexes. This work also focused on the inhibition of protein interactions by synthetic peptides, rationally designed on the basis of the complex structure. The results obtained for two examples, the Asf1 – Histone H3/H4 and the gp120 – CD4 complexes emphasize the high interest of rational design of complex interface for the development of novel therapeutic strategies., La caractérisation à haut débit des interactions protéines-protéines a permis d'établir les premières cartes d'interactions de différents organismes modèles, y compris l'homme. Cependant, la caractérisation structurale des assemblages protéiques reste limitée à un nombre très faible de ces interactions. En mettant en évidence une pression de sélection évolutive spécifique aux interfaces de complexes protéiques, ce travail a permis d'élucider certains mécanismes évolutifs essentiels à l'association entre protéines qui n'avaient pas été décrits jusqu'à présent. Sur cette base, une nouvelle approche bioinformatique, nommée SCOTCH (Surface COmplementarity Trace in Complex History), a été développée pour prédire la structure des assemblages macromoléculaires. Couplée à un programme d'amarrage moléculaire, tel que SCOTCHer, également développé au cours de cette thèse, cette approche a permis de prédire efficacement la structure d'un grand nombre de complexes. Ce travail de thèse s'est également concentré sur l'inhibition des interactions protéiques par des mini-protéines, conçues de façon rationnelle sur la base des structures de complexes. Les résultats obtenus pour deux exemples, celui du complexe Asf1 – Histone H3/H4 et du complexe gp120 – CD4 témoignent du fort potentiel du design rationnel d'interfaces de complexes pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

At the interface with the host cell compartment, the parasitophorous vacuole of the intracellular parasite Toxoplasma gondii comprises several membranous systems, including the membranous nanotubular network formed upon secretion of the dense granule protein GRA2. Using biochemical approaches, I have shown that the GRA proteins form oligomeric complexes, which could explain the solubility of these membrane proteins within the dense granules and after secretion into the vacuolar soluble fraction. Using molecular and cellular approaches, I have investigated the involvement of each of the three GRA2 amphipathic alpha-helices in post-secretory membrane association of the protein, likely via association to phosphatidylinositol phosphates, and in the GRA2 induced-formation of the membranous nanotubular network. These studies led us to propose models for the interaction of GRA2 with membranes and for the tubulation of the membranous nanotubular network.; A l'interface avec la cellule hôte, la vacuole parasitophore du parasite intracellulaire Toxoplasma gondii comprend plusieurs systèmes membranaires, dont un réseau de nanotubes formé suite à la sécrétion de la protéine de granules denses GRA2. Mes travaux ont montré, par des approches biochimiques, que les protéines GRA membranaires forment des complexes oligomériques qui pourraient expliquer leur solubilité dans les granules denses et lors de leur sécrétion dans la vacuole. Par des approches moléculaires et cellulaires, j'ai analysé l'importance relative des trois hélices alpha-amphipatiques de GRA2 dans son association post-sécrétoire au réseau de nanotubes, via la liaison potentielle de la protéine à des phosphoinositides, et dans la tubulation du réseau induite par GRA2. Ces travaux ont permis de proposer un modèle d'interaction de GRA2 avec les membranes et de formation des tubules membranaires du réseau de nanotubes.

Proteins involved in signalling pathways are frequently activated and inactivated by weak affinity interactions. In particular, domains that bind specifically short protein fragments, often called Peptide Recognition Modules (PRMs), allow an efficient intra- and inter-molecular regulation of the catalytic domains to whom they are associated. This work focuses on two domain families, the FHA and the tandem BRCT, often involved in the cell responses to DNA damage. Given their major role in the signaling networks, the prediction of their binding properties by bioinformatics is of crucial interest. However, bioinformatic strategies are still limited by methodological problems associated with the intrinsic characteristics of PRMs. They typically harbour very divergent sequences and their affinity for their physiological target is relatively weak despite their high specificity. This work aims at developing predictive approaches for the study of PRMs. Three points have been considered successively : (i) the prediction of the three-dimensional structure of PRMs, (ii) the prediction of their binding sites when the partner is known, (iii) the prediction of the sequence motifs each PRM specifically recognizes based on its three-dimensional structure., Les protéines impliquées dans les voies de signalisation sont souvent activées et inactivées par des interactions de faible affinité. En particulier, les domaines protéiques liant spécifiquement de courts fragments protéiques permettent une régulation intra- et inter-moléculaire efficace des domaines catalytiques auxquels ils sont associés. Citons par exemple les domaines FHA ou des tandems BRCT fréquemment impliqués dans les réponses aux dommages de l'ADN. Etant donnée leur importance dans les réseaux d'interactions et dans la signalisation cellulaire, la prédiction par bioinformatique des propriétés de liaison de ces petits domaines constitue un enjeu majeur. Toutefois, les stratégies bioinformatiques sont jusqu'à présent limitées par des difficultés méthodologiques associées aux caractéristiques intrinsèques de ces domaines. Leurs séquences sont souvent très divergentes et les affinités pour leurs cibles physiologiques sont généralement faibles malgré une excellente spécificité. Le travail présenté dans cette thèse a donc pour objectif de dépasser les limites actuelles des outils de prédictions pour développer de nouvelles méthodologies bioinformatiques performantes. Trois points ont été plus particulièrement abordés : (i) la prédiction de la structure tridimensionnelle de ces domaines ; (ii) la prédiction des sites reconnus par ces domaines lorsque les partenaires sont connus ; (iii) la prédiction des motifs spécifiquement reconnus par ces domaines sur la base de leur structure tridimensionnelle.

At the interface with the host cell compartment, the parasitophorous vacuole of the intracellular parasite Toxoplasma gondii comprises several membranous systems, including the membranous nanotubular network formed upon secretion of the dense granule protein GRA2. Using biochemical approaches, I have shown that the GRA proteins form oligomeric complexes, which could explain the solubility of these membrane proteins within the dense granules and after secretion into the vacuolar soluble fraction. Using molecular and cellular approaches, I have investigated the involvement of each of the three GRA2 amphipathic alpha-helices in post-secretory membrane association of the protein, likely via association to phosphatidylinositol phosphates, and in the GRA2 induced-formation of the membranous nanotubular network. These studies led us to propose models for the interaction of GRA2 with membranes and for the tubulation of the membranous nanotubular network., A l'interface avec la cellule hôte, la vacuole parasitophore du parasite intracellulaire Toxoplasma gondii comprend plusieurs systèmes membranaires, dont un réseau de nanotubes formé suite à la sécrétion de la protéine de granules denses GRA2. Mes travaux ont montré, par des approches biochimiques, que les protéines GRA membranaires forment des complexes oligomériques qui pourraient expliquer leur solubilité dans les granules denses et lors de leur sécrétion dans la vacuole. Par des approches moléculaires et cellulaires, j'ai analysé l'importance relative des trois hélices alpha-amphipatiques de GRA2 dans son association post-sécrétoire au réseau de nanotubes, via la liaison potentielle de la protéine à des phosphoinositides, et dans la tubulation du réseau induite par GRA2. Ces travaux ont permis de proposer un modèle d'interaction de GRA2 avec les membranes et de formation des tubules membranaires du réseau de nanotubes.

The in silico evolution simulation of protein- or tRNAs-encoding genes has recently been paid much attention because it offers the possibility to deduce from simple assumptions striking and unexpected behaviours deriving from the genotype structure in sequence space and the genotype-phenotype mapping. The most elementary evolutionary model, known as the 'neutral theory of molecular evolution' developed and advocated by Kimura from the late 60s on, has given rise to a now well documented phenomenon: genotypes that are robust to mutations and encode fast-folding proteins as evidenced and measured by the folding temperature, turn out to be overrepresented as compared to fragile ones. Many questions still remain unsettled, amongst which whether a realistic model of functionality could change the picture drawn from models mainly based on structure preservation and/or foldability. We have therefore developed a model including a selective constraint imposing that the proteins encoded by two genes must specifically and efficiently dimerise in order to make an individual survive. We shall demonstrate that the neutral networks built upon structural considerations are plastic enough to accommodate the functional requirement without any noticeable impact on stability. The overrepresentation of robust genotypes still holds and appears to be magnified by the epistatic interactions between genes. Is is of interest that such a phenomenon is as well accompanied by an improvement in average functionality resulting from a functional superfunnel organisation in sequence space. This conclusion could have important implications in the way to explain the emergence of new functions. Another issue regards the simplifications involved by the proteins models. Simulations of evolution entail large computations, that have been tackled using lattice protein models. In this dissertation we propose an off-lattice protein model exhibiting more complex contact maps--which supports the conclusions drawn from the lattice model.; La simulation in silico des gènes codant pour des ARN de transfert et des protéines a connu un développement considérable ces dernières années car elle permet de déduire de modèles simples des comportements inattendus qui découlent de la structure des génotypes dans l'espace des séquences et de la correspondance génotype-phénotype. Le modèle d'évolution le plus élémentaire, la théorie dite "de l'évolution neutre" conçue et défendue par Kimura principalement, donne lieu à un phénomène à présent bien documenté: les génotypes robustes aux mutations et exprimant des protéines se repliant efficacement, sont surreprésentés en comparaison des génotypes "fragiles". De nombreuses questions restent en suspens notamment en ce qui concerne l'incidence que peut avoir une modélisation plus réaliste de la fonctionnalité d'une protéine sur le schéma tracé à partir de considérations purement structurales et cinétiques. Pour cela, nous avons développé un modèle incluant une contrainte sélective imposant une dimérisation spécifique minimale de deux protéines codées par deux gènes pour qu'un individu puisse survivre. Nous démontrons que les réseaux neutres construits d'après des critères structuraux sont grandement plastiques et peuvent s'adapter à une fonction vitale sans souffrir de baisse de stabilité. La surreprésentation des génotypes robustes est maintenue, elle est même amplifiée par l'interaction épistatique existant entre les deux gènes. On observe que cela s'accompagne d'une augmentation en moyenne de la fonctionnalité résultant de l'émergence d'un *superfunnel* fonctionnel dans l'espace des séquences. Cette propriété remarquable pourrait avoir d'importantes implications dans l'explication de l'émergence de nouvelles fonctions biologiques. Une autre question concerne les simplifications impliquées par le choix des modèles protéiques. Puisque les simulations évolutives supposent un coût de calcul important, les protéines sur réseau ont eu la préférence de nombreux modélisateurs. Dans ce mémoire, nous proposons un modèle de protéine hors réseau possédant des cartes de contacts plus complexes que les protéines sur réseau. Il confirme les conclusions tirées des simulations sur les protéines sur réseau.

The in silico evolution simulation of protein- or tRNAs-encoding genes has recently been paid much attention because it offers the possibility to deduce from simple assumptions striking and unexpected behaviours deriving from the genotype structure in sequence space and the genotype-phenotype mapping. The most elementary evolutionary model, known as the 'neutral theory of molecular evolution' developed and advocated by Kimura from the late 60s on, has given rise to a now well documented phenomenon: genotypes that are robust to mutations and encode fast-folding proteins as evidenced and measured by the folding temperature, turn out to be overrepresented as compared to fragile ones. Many questions still remain unsettled, amongst which whether a realistic model of functionality could change the picture drawn from models mainly based on structure preservation and/or foldability. We have therefore developed a model including a selective constraint imposing that the proteins encoded by two genes must specifically and efficiently dimerise in order to make an individual survive. We shall demonstrate that the neutral networks built upon structural considerations are plastic enough to accommodate the functional requirement without any noticeable impact on stability. The overrepresentation of robust genotypes still holds and appears to be magnified by the epistatic interactions between genes. Is is of interest that such a phenomenon is as well accompanied by an improvement in average functionality resulting from a functional superfunnel organisation in sequence space. This conclusion could have important implications in the way to explain the emergence of new functions. Another issue regards the simplifications involved by the proteins models. Simulations of evolution entail large computations, that have been tackled using lattice protein models. In this dissertation we propose an off-lattice protein model exhibiting more complex contact maps--which supports the conclusions drawn from the lattice model., La simulation in silico des gènes codant pour des ARN de transfert et des protéines a connu un développement considérable ces dernières années car elle permet de déduire de modèles simples des comportements inattendus qui découlent de la structure des génotypes dans l'espace des séquences et de la correspondance génotype-phénotype. Le modèle d'évolution le plus élémentaire, la théorie dite "de l'évolution neutre" conçue et défendue par Kimura principalement, donne lieu à un phénomène à présent bien documenté: les génotypes robustes aux mutations et exprimant des protéines se repliant efficacement, sont surreprésentés en comparaison des génotypes "fragiles". De nombreuses questions restent en suspens notamment en ce qui concerne l'incidence que peut avoir une modélisation plus réaliste de la fonctionnalité d'une protéine sur le schéma tracé à partir de considérations purement structurales et cinétiques. Pour cela, nous avons développé un modèle incluant une contrainte sélective imposant une dimérisation spécifique minimale de deux protéines codées par deux gènes pour qu'un individu puisse survivre. Nous démontrons que les réseaux neutres construits d'après des critères structuraux sont grandement plastiques et peuvent s'adapter à une fonction vitale sans souffrir de baisse de stabilité. La surreprésentation des génotypes robustes est maintenue, elle est même amplifiée par l'interaction épistatique existant entre les deux gènes. On observe que cela s'accompagne d'une augmentation en moyenne de la fonctionnalité résultant de l'émergence d'un *superfunnel* fonctionnel dans l'espace des séquences. Cette propriété remarquable pourrait avoir d'importantes implications dans l'explication de l'émergence de nouvelles fonctions biologiques. Une autre question concerne les simplifications impliquées par le choix des modèles protéiques. Puisque les simulations évolutives supposent un coût de calcul important, les protéines sur réseau ont eu la préférence de nombreux modélisateurs. Dans ce mémoire, nous proposons un modèle de protéine hors réseau possédant des cartes de contacts plus complexes que les protéines sur réseau. Il confirme les conclusions tirées des simulations sur les protéines sur réseau.

Selenium was considered originally as a poison. It is only in the mid-fifties that the physiological significance of this trace element was correctly evaluated; identification of pathologies related to selenium deficiencies demonstrated its essential nutrient function in livestock and later in humans.Biochemical studies identified selenocysteine as the major biological form of selenium in animals and bacteria. This particular amino acid is specifically incorporated into selenoproteins through a dedicated translation machinery.Most of the known selenoproteins have not been attributed a function yet. Among them is selenoprotein N (SePN), a novel selenium containing protein identified in our laboratory in 1999. In 2001, it was shown that several muscular disorders segregate with a locus containing SEPN1, the SePN encoding gene. These diseases are now collectively classified as SePN-related myopathies. At the beginning of my PhD studies, little was known about selenoprotein N. To identify its function, several approaches were developed concomitantly.First, I contributed to demonstrate that SePN is a 65kDa trans-membrane glycoprotein localized within the endoplasmic reticulum. Then, several successive approaches allowed characterization of SePN interacting partners in the membrane whose identification and further validation are underway.In a second step, we developed two animal models for SePN related myopathies. Owing to an antisense strategy, it was shown that inhibition of SePN expression during zebrafish embryogenesis led to severe muscular defects and abnormal development. In parallel, taking advantage of the Cre-Lox system, we generated either the complete knock-out of the gene in mice or the conditional targeted disruption of the SEPN1 gene in muscle only. Both models showed no apparent defects. Histological studies, however, showed that muscles featured dystrophic muscular fiber patterns. In addition, we showed that SEPN1 knockout mice displayed increased sensitivity to induced oxidative stress. The functional exploration of these models will be pursued in collaboration with several groups.Finally, another project that was tackled consisted in engineering a correction strategy based on the use of a modified tRNASec to force recognition of a mutated Sec codon in a RSMD1 patient with a homozygous point mutation. Successful experiments conducted in cultured cells opened the route toward a possible gene therapy for these patients.Altogether, the studies will help obtaining a better insight into SePN function, especially in muscle physiology, as well as to increase our knowledge regarding selenium role in human health. The final aim of these studies is to develop targeted diagnostic and therapeutic tools that will derive from our predictive models., Longtemps considéré comme un composé toxique, le sélénium est maintenantlargement reconnu comme oligo-élément essentiel. Des carences alimentaires ont étéassociées à de nombreuses pathologies.La sélénocystéine est la forme biologique principale du sélénium. Cet acide aminé particulierest spécifiquement incorporé dans les sélénoprotéines grâce à une machinerie traductionnelledédiée en réponse à un codon UGA, traditionnellement reconnu comme un codon stop.A ce jour, la fonction moléculaire de la plupart des sélénoprotéines demeure inconnue. Parmicelles-ci figure la sélénoprotéine N (SePN), une nouvelle protéine à sélénium identifiée en1999 dans notre laboratoire par une approche bioinformatique.En 2001, il a été démontré que des mutations dans le gène SEPN1 codant pour SePN étaientresponsables de différentes pathologies musculaires regroupées dorénavant sous le terme demyopathies apparentées à la sélénoprotéine N.Au début de ma thèse, peu de choses étaient connues sur la fonction de SePN. Pourcomprendre son rôle, nous avons entrepris son étude selon différentes approches.Dans un premier temps, j'ai contribué à montrer que SePN est une glycoprotéine de 65kDa,associée aux membranes du réticulum endoplasmique. Ensuite, des approches biochimiquessuccessives ont permis de mettre en évidence son interaction avec différentes protéines de lamembrane, et dont l'identification est en cours.Dans un deuxième temps, nous avons mis au point deux modèles animaux des pathologiesmusculaires associées à un dysfonctionnement de SePN. Par une approche antisens, il a étéobservé que l'inhibition de l'expression de SePN au cours du développement embryonnairechez le poisson zèbre entraînait une altération de l'organisation du tissu musculaire.Parallèlement, tirant avantage du système Cre-Lox, nous avons obtenu des souris invalidéespour SEPN1 dans tout l'organisme ou de façon tissu spécifique dans le muscle. De façonsurprenante, les animaux ainsi obtenus ne présentent pas de phénotype apparent, même si lesanalyses histologiques préliminaires permettent d'observer un profil dystrophique classiquedes fibres musculaires. En outre, les animaux semblent présenter une sensibilité accrue austress oxydatif induit. L'exploration fonctionnelle de ce modèle est poursuivie au laboratoireet fait l'objet de plusieurs collaborations.Enfin, une autre étude entreprise au cours de ma thèse concerne une mutation pathologique dugène SEPN1 conduisant à l'apparition de myopathies chez l'homme. Par une approcheoriginale déduite du mécanisme atypique de traduction des sélénoprotéines, une stratégie quipourrait aboutir à terme à une thérapie génique pour certains patients a été mise au point.L'ensemble de ces travaux va permettre d'augmenter nos connaissances sur le rôle dela sélénoprotéine N dans le muscle ainsi que sur la fonction biologique de l'oligo-élémentsélénium dans ce tissu. Le but ultime de l'ensemble de ces travaux est de développer desoutils de diagnostic ainsi que des approches thérapeutiques ciblées.

Targeting the protein-protein interaction surfaces to obtain inhibitors remains one of the most challenging area of the last decade. In that way, we designed and studied a new bi-functional synthetic template named RAFT. The core of the template is composed of a cyclic decapeptide scaffold presenting two distinct adressable domains. These allow the spatial separation of both functions of the template and prevent the molecules from the lower face to interfere with the targeting functions. In order to aim at the protein surfaces, a combinatorial assembly of four peptides on the upper face of the RAFT have been done. Thus, one can get all the possible surface combinations enabling an efficient targeting of the protein surfaces. The multiple presentation of peptides on the template was achieved through a convergent synthesis using efficient chimioselective oxime ligations. Concerning the substituents of the RAFT, four linear and four cyclic peptides, constraints by disulfide bridges, have been synthesized. The last present globally the same sequences except for two positions where the incorporation of different residues (Lys, Asp, Phe, Ser) confer different properties (charge, nature...). The use of those substituents have been done for distinct purposes : (i) the formation of GnRH-receptor mimetics and (ii) a more general targeting of protein surfaces. The total characterisation of the libraries was done using HPLC and LC-MS methods. Finally, the first biological evaluations on on several targets (GnRH, avidine, SHC-Grb2 interface) of those libraries gave encouraging results.; Le développement de molécules ciblant les surfaces d'interaction protéine-protéine constitue l'un des enjeux majeurs de la recherche scientifique académique et des industries pharmaceutiques de cette dernière décennie. A ces fins, nos travaux ont été consacrés à la conception, à la synthèse et à la caractérisation de nouveaux mimes de surfaces sur châssis. Le squelette de ce dernier est un cyclodécapeptide RAFT, pouvant présenter deux surfaces d'adressage indépendantes. La fonction de ciblage est assurée par la présentation de quatre peptides greffés par voie d'assemblage combinatoire sur la face supérieure du RAFT. De cette manière, il sera possible d'obtenir toutes les combinaisons de surfaces à partir des éléments constitutifs permettant un ciblage efficace des surfaces protéiques. L'architecture à présentation multiple a été synthétisée de manière convergente par formation hautement chimiosélective de liens éthers d'oximes, stables in vitro et in vivo. Nous avons synthétisé des substrats linéaires présentant certains motifs identiques ainsi que des substrats cycliques, contraints par la présence d'une liaison dissulfure, de séquences globalement identiques mis à part en deux positions où l'incorporation de résidus (Lys, Asp, Phe, Ser) leur confère des propriétés diverses (charges, natures...). L'utilisation de ces éléments s'inscrit dans deux approches de ciblage distinctes à savoir la réalisation de mimes de la surface de reconnaissance de l'hormone GnRH et la réalisation de surfaces pour un ciblage plus général de surfaces protéiques. L'utilisation des méthodes CLHP et LC-MS pour l'analyse des banques de produits obtenues a permis leur totale caractérisation. Enfin, la réalisation des premières évaluations biologiques sur ces mélanges vis-à-vis de plusieurs cibles (hormone GnRH, avidine, interface SHC-Grb2) a donné des résultats encourageants.

Targeting the protein-protein interaction surfaces to obtain inhibitors remains one of the most challenging area of the last decade. In that way, we designed and studied a new bi-functional synthetic template named RAFT. The core of the template is composed of a cyclic decapeptide scaffold presenting two distinct adressable domains. These allow the spatial separation of both functions of the template and prevent the molecules from the lower face to interfere with the targeting functions. In order to aim at the protein surfaces, a combinatorial assembly of four peptides on the upper face of the RAFT have been done. Thus, one can get all the possible surface combinations enabling an efficient targeting of the protein surfaces. The multiple presentation of peptides on the template was achieved through a convergent synthesis using efficient chimioselective oxime ligations. Concerning the substituents of the RAFT, four linear and four cyclic peptides, constraints by disulfide bridges, have been synthesized. The last present globally the same sequences except for two positions where the incorporation of different residues (Lys, Asp, Phe, Ser) confer different properties (charge, nature...). The use of those substituents have been done for distinct purposes : (i) the formation of GnRH-receptor mimetics and (ii) a more general targeting of protein surfaces. The total characterisation of the libraries was done using HPLC and LC-MS methods. Finally, the first biological evaluations on on several targets (GnRH, avidine, SHC-Grb2 interface) of those libraries gave encouraging results., Le développement de molécules ciblant les surfaces d'interaction protéine-protéine constitue l'un des enjeux majeurs de la recherche scientifique académique et des industries pharmaceutiques de cette dernière décennie. A ces fins, nos travaux ont été consacrés à la conception, à la synthèse et à la caractérisation de nouveaux mimes de surfaces sur châssis. Le squelette de ce dernier est un cyclodécapeptide RAFT, pouvant présenter deux surfaces d'adressage indépendantes. La fonction de ciblage est assurée par la présentation de quatre peptides greffés par voie d'assemblage combinatoire sur la face supérieure du RAFT. De cette manière, il sera possible d'obtenir toutes les combinaisons de surfaces à partir des éléments constitutifs permettant un ciblage efficace des surfaces protéiques. L'architecture à présentation multiple a été synthétisée de manière convergente par formation hautement chimiosélective de liens éthers d'oximes, stables in vitro et in vivo. Nous avons synthétisé des substrats linéaires présentant certains motifs identiques ainsi que des substrats cycliques, contraints par la présence d'une liaison dissulfure, de séquences globalement identiques mis à part en deux positions où l'incorporation de résidus (Lys, Asp, Phe, Ser) leur confère des propriétés diverses (charges, natures...). L'utilisation de ces éléments s'inscrit dans deux approches de ciblage distinctes à savoir la réalisation de mimes de la surface de reconnaissance de l'hormone GnRH et la réalisation de surfaces pour un ciblage plus général de surfaces protéiques. L'utilisation des méthodes CLHP et LC-MS pour l'analyse des banques de produits obtenues a permis leur totale caractérisation. Enfin, la réalisation des premières évaluations biologiques sur ces mélanges vis-à-vis de plusieurs cibles (hormone GnRH, avidine, interface SHC-Grb2) a donné des résultats encourageants.

This work aims at the inhibition of the Ras signaling pathway by protein-protein interaction targeted drug design. Within this frequently implicated in human tumors pathway, the RasGAP protein plays two apparently contrary roles, both as a negative regulator and a positive Ras effector. The SH3 domain of RasGAP has already been identified by independent teams as a relevant therapeutic target (Tocqué et al., 1997). More recently, we have brought a new evidence of this relevance by the identification of Aurora kinases as RasGAP-SH3 binding partners. In the present work in collaboration with Aptanomics, by the use of peptide aptamers, we bring a new validation of this target. Using a yeast two-hybrid screening, we have discovered new synthetic proteins (aptamers) specifically interacting with RasGAP-SH3 domain. Moreover, the expression of these aptamers in tumoral cultured cells leads to antitumoral-like phenotypes : colony forming capacity and cell viability decrease. This aptamers representing only the first step towards rational design of small molecule inhibitors of RasGAP-SH3, we have then synthesized peptides derived from aptamers variable loops which are responsible for their interaction with the SH3 domain, and evaluated their affinity by fluorescence anisotropy experiments. To date, our best molecule is a sub-micromolar-affinity cyclic peptide. Using 15N-enriched purified SH3 domain and its previously solved structure (Yang et al., 1994), we have determined by NMR spectroscopy the binding fingerprint of this molecule on our target. This structural data should lead within a short time to modifications of our peptide inhibitors, in order to increase their affinity, solubility and cell-penetrating capacity. These molecules would then be subjected to in vitro and in vivo evaluation of their anti-tumoral activity. In the meanwhile, the fluorescently-labeled peptides we have synthesized will be used as reference competitors during fluorescence anisotropy-based chemical libraries screenings. Both rational and screening approach will certainly soon lead to the identification of small molecule-inhibitors of the RasGAP-SH3 domain., L'objectif de cette thèse consiste à inhiber la voie de signalisation liée aux protéines Ras, très fréquemment impliquée dans les tumeurs humaines, en concevant des inhibiteurs d'interactions protéine-protéine. Au sein de cette voie, la protéine RasGAP joue un rôle particulier, à la fois régulateur négatif et effecteur de Ras. La cible thérapeutique constituée par le domaine SH3 de la protéine RasGAP avait déjà été identifiée par plusieurs équipes (Tocqué et al., 1997). Plus récemment, notre laboratoire a complété ces travaux par l'identification des protéines Aurora comme partenaires de RasGAP-SH3. En collaboration avec Aptanomics, en mettant en oeuvre la technique des aptamères peptidiques, nous avons apporté une nouvelle validation de cette cible : nous avons obtenu par un crible double-hybride de nouvelles protéines synthétiques (aptamères) interagissant spécifiquement avec le domaine SH3 de RasGAP, et dont l'expression dans des cellules tumorales provoque une diminution de la capacité à former des colonies et de la viabilité cellulaire. Afin d'amorcer une démarche de conception rationnelle d'inhibiteurs de ce SH3, nous avons synthétisé les peptides exposés à la surface de ces aptamères et responsables de leur interaction avec RasGAP-SH3. Nous avons ensuite mesuré l'affinité de ces peptides pour RasGAP-SH3 par anisotropie de fluorescence. Nous avons ainsi obtenu un peptide cyclique dont l'affinité pour le domaine SH3 est de l'ordre de quelques centaines de nanomolaire, et dont nous avons déterminé l'empreinte sur ce domaine enrichi en 15N par RMN, en nous appuyant sur la structure du domaine, déjà résolue au laboratoire (Yang et al., 1994). Les données structurales que nous avons obtenues devraient permettre, dans un court délai, de proposer des modifications de ces peptides, afin d'augmenter l'affinité de nos inhibiteurs et de les vectoriser pour leur conférer une activité sur cellules tumorales en culture. Enfin, ces peptides, rendus fluorescents par leur couplage à un fluorophore, vont être utilisés comme ligands de référence dans un crible de chimiothèque à haut débit, afin de découvrir de petites molécules inhibitrices du domaine SH3 de RasGAP.

Dans les chapitres suivants je présenterai mes travaux dans le domaine de la biologie structurale, qui ont porté, dans un ordre chronologique, sur la neuraminidase du virus de la grippe, le récepteur FcRn du rat, la myrosinase, la protéine P du virus de Sendai et le domaine récepteur de la fibre d’adénovirus. Deux projets n’ont pas pu être achevés à ce jour, et ne seront pas abordés : la base du penton, une protéine de la capside de l’adénovirus, et la protéase du virus Epstein-Barr, une protéine impliquée dans la formation de la capside virale dont la structure est en train d'être résolue.J’ai regroupé ces sujets, et aussi le travail d’installation d’une ligne de lumière à l’ESRF dédiée à la cristallographie des protéines, en trois grands thèmes : méthodes, glycosidases et interactions protéine-protéine.