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L'entrée en mitose est initiée par le complexe cycline B – Cdk1. La phosphorylation de ses substrats déclenche des transformations incluant la condensation des chromosomes, le bris de l'enveloppe nucléaire et la formation d'un fuseau mitotique. Ces transformations permettent à la cellule de se diviser. La protéine phosphatase 2A (PP2A) en complexe avec sa sous-unité B55/Twins (Tws) reconnaît et déphosphoryle les substrats de cycline B – Cdk1. Pour éviter la déphosphorylation précoce des phosphoprotéines mitotiques, PP2A-B55/Tws est inhibée en entrée de mitose. Cette inhibition de la phosphatase est attribuable au module Greatwall (Gwl) – endosulfines. Activée en entrée de mitose, la kinase Gwl phosphoryle les endosulfines, qui inhibent alors de manière spécifique PP2A-B55/Tws. Gwl est exportée du noyau vers le cytoplasme en prophase, avant le bris de l’enveloppe nucléaire. Les mécanismes de régulation spatiotemporelle du module Gwl – endosulfines – PP2AB55/Tws ne sont pas entièrement élucidés. De plus, les substrats ciblés par PP2AB55/Tws en sortie mitose ne sont pas tous identifiés à ce jour. Dans mon travail de thèse, j’ai trouvé que Tws peut transiter par le noyau via un signal de localisation nucléaire (NLS), mais que ses fonctions essentielles sont au cytoplasme. De plus, j’ai trouvé que l’unique endosulfine présente chez Drosophila melanogaster, Endos, a une localisation cytoplasmique. Cette localisation est requise pour qu’Endos soit efficacement phosphorylée par la forme active et cytoplasmique de Gwl. Endos phosphorylée lie ensuite PP2A-Tws pour l’inhiber. Empêcher la localisation cytoplasmique d’Endos avant le bris de l’enveloppe nucléaire entraîne des défauts mitotiques dépendants de l’activité de PP2A-Tws. Les substrats mitotiques de PP2A-Tws ne sont pas tous connus. Par des cribles de phosphoprotéomique, j’ai identifié des substrats mitotiques potentiels de PP2A-Tws. L’un des candidats hyperphosphorylés suite à la déplétion de Tws, Otefin (Ote), est une protéine de l’enveloppe nucléaire. Les sites de phosphorylation d’Otefin identifiés dans mes cribles sont adjacents à son domaine d’interaction avec BAF, une protéine liant l’ADN et certaines protéines de l’enveloppe nucléaire. L’introduction de mutations phosphomimétiques à ces sites abolit l’association d’Otefin avec BAF, en plus de retarder le recrutement d’Otefin à l’enveloppe nucléaire en sortie de mitose. Par ailleurs, l’association Otefin – BAF dépend de l’activité de PP2A-Tws. Enfin, la perte d’Otefin dans l’embryon syncytial de mouche affecte le développement. En somme, mes travaux ont permis d’approfondir notre compréhension mécanistique de la régulation spatiotemporelle du module Gwl – endosulfines – PP2A et d’identifier de nouveaux substrats potentiels de PP2A-Tws., Mitosis is triggered by the cyclin B – Cdk1 complex that phosphorylates multiple substrates to promote transformations such as chromosome condensation, nuclear envelope breakdown and mitotic spindle formation. These transformations are required for cell division. The protein phosphatase 2A (PP2A) in complex with its B55/Twins (Tws) subunit dephosphorylates cyclin B – Cdk1 substrates. To prevent premature dephosphorylation of the mitotic phosphoproteins, PP2A-B55/Tws is inhibited upon mitotic entry. The Greatwall (Gwl) – endosulfines pathway is responsible for PP2AB55/Tws inhibition. Activated upon mitotic entry, the Gwl kinase phosphorylates small proteins called endosulfines to turn them into specific inhibitors of PP2A-B55/Tws. Gwl is exported from the nucleus to the cytoplasm before nuclear envelope breakdown. However, the mechanisms of spatiotemporal regulation of the Gwl – endosulfines – PP2A module are not entirely elucidated. Moreover, the identity of the proteins targeted by PP2A-Tws during mitotic exit is still unclear. During my PhD training, I found that Tws can transit through the nucleus via a nuclear localization signal (NLS), but its essential functions are cytoplasmic. Moreover, the sole endosulfine present in Drosophila melanogaster, Endos, has a cytoplasmic localization. Such localization is required for efficient phosphorylation of Endos by active and cytoplasmic Gwl. Once phosphorylated, Endos binds PP2A-Tws to inhibit its activity. Preventing the cytoplasmic localization of Endos prior to nuclear envelope breakdown causes mitotic defects that are PP2A-Tws-dependent. The mitotic substrates of PP2A-Tws are not all identified. By phosphoproteomic screening, I identified potential novel PP2A-Tws substrates. Among the hits that are hyperphosphorylated following Tws depletion, there is the nuclear envelope protein Otefin (Ote). The identified phosphosites on Otefin are adjacent to its domain of interaction with BAF, a protein binding DNA and nuclear envelope proteins. Introducing phosphomimetic mutations at these sites abolishes the Otefin – BAF association and delays Otefin recruitment at the reforming nuclear envelope during mitotic exit. Moreover, the Otefin – BAF association is PP2A-Tws-dependent. Finally, loss of Otefin in the syncytial embryo of the fly impairs development. Altogether, my results deepen our understanding of the spatiotemporal coordination of the Gwl – endosulfines – PP2A module and provide potential novel PP2A-Tws substrates.

My thesis aimed at understanding how the female germ cell, or oocyte, resume meiotic divisions. In the animal kingdom, the oocyte is blocked in prophase of the first meiotic division and resumes the division at time of ovulation, in response to an external signal, progesterone in Xenopus. This hormone triggers a signalling pathway that leads to the activation of the Cdk1 kinase after 3 to 5 hours. The first activated molecules of Cdk1 trigger a self-amplification loop allowing its total activation and division. This loop is based on phosphorylations catalyzed by Cdk1 and depends on the inhibition of the phosphatase that antagonizes Cdk1 activity, PP2A-B55δ. This inhibition depends on the protein Arpp19, a specific inhibitor of PP2A-B55δ when phosphorylated at S67 by Greatwall kinase. Arpp19 has a second role during meiosis resumption. In all vertebrates, the prophase arrest is maintained by high PKA activity. In Xenopus, Arpp19 is phosphorylated by PKA on a residue distinct from Greatwall target, S109. In response to progesterone, the inhibition of PKA induces Arpp19 dephosphorylation, which activates the signalling pathway leading to Cdk1 activation. A phosphatase is therefore required to dephosphorylate Arpp19 at S109 and to unlock the Cdk1 activation pathway. My work aimed at elucidating the molecular identity of this unknown phosphatase. Through biochemical and proteomic approaches, I have identified this phosphatase as PP2A-B55δ. By functional approaches in acellular extracts and oocytes, I have established that PP2A-B55δ is active in prophase. Arpp19 phosphorylation at S109 depends on a balance between PKA and PP2A-B55δ activities, in favor of the kinase. In response to progesterone, PP2A-B55δ activity is not affected and PKA inhibition is sufficient for Arpp19 dephosphorylation. PP2A-B55δ therefore orchestrates the release of the prophase arrest and the entry into M-phase by acting at two different periods and at two distinct residues in Arpp19, respectively facing PKA and Greatwall., Ma thèse a visé à comprendre comment la cellule germinale femelle, ou ovocyte, reprend la division méiotique. Dans tout le règne animal, l’ovocyte est bloqué en prophase de première division méiotique et reprend la division au moment de l’ovulation, sous l’effet d’un signal externe, la progestérone chez le xénope. Cette hormone déclenche une voie de signalisation qui aboutit après 3 à 5 heures à l’activation de la kinase Cdk1. Les premières molécules activées de Cdk1 déclenchent une boucle d’auto-amplification permettant son activation totale et l’entrée en division. Cette boucle repose sur des phosphorylations catalysées par Cdk1 et ne fonctionne que si la phosphatase qui contrecarre son activité, PP2A-B55δ, est inhibée. Cette inhibition dépend de la protéine Arpp19, un inhibiteur spécifique de PP2A-B55δ quand elle est phosphorylée sur la S67 par la kinase Greatwall. Arpp19 a un second rôle lors de la reprise de la méiose. Chez tous les vertébrés, l’arrêt en prophase est maintenu par une forte activité de PKA. Chez le xénope, Arpp19 est phosphorylée par PKA sur un résidu distinct de celui ciblé par Greatwall, la S109. En réponse à la progestérone, l’inhibition de PKA provoque la déphosphorylation d’Arpp19, ce qui permet d'enclencher la voie de signalisation conduisant à l'activation de Cdk1. Une phosphatase est donc requise pour déphosphoryler Arpp19 sur S109 et lever le verrou exercé sur l'activation de Cdk1 en prophase. Mon travail a visé à élucider l’identité moléculaire de cette phosphatase inconnue. Par des approches de biochimie et protéomique, j’ai identifié cette phosphatase comme étant PP2A-B55δ. Par des approches fonctionnelles dans des extraits acellulaires et des ovocytes, j’ai établi que PP2A-B55δ est active en prophase. La phosphorylation d’Arpp19 sur la S109 dépend d'une balance entre les activités de PKA et PP2A-B55δ, en faveur de la kinase. En réponse à la progestérone, l’activité de PP2A-B55δ n’est pas affectée et l’inhibition de PKA suffit à la déphosphorylation d’Arpp19. PP2A-B55δ orchestre donc la levée de l’arrêt en prophase et l'entrée en phase M en agissant à deux périodes et sur deux sites distincts d’Arpp19, respectivement ciblés par PKA et Greatwall.

My thesis aimed at understanding how the female germ cell, or oocyte, resume meiotic divisions. In the animal kingdom, the oocyte is blocked in prophase of the first meiotic division and resumes the division at time of ovulation, in response to an external signal, progesterone in Xenopus. This hormone triggers a signalling pathway that leads to the activation of the Cdk1 kinase after 3 to 5 hours. The first activated molecules of Cdk1 trigger a self-amplification loop allowing its total activation and division. This loop is based on phosphorylations catalyzed by Cdk1 and depends on the inhibition of the phosphatase that antagonizes Cdk1 activity, PP2A-B55δ. This inhibition depends on the protein Arpp19, a specific inhibitor of PP2A-B55δ when phosphorylated at S67 by Greatwall kinase. Arpp19 has a second role during meiosis resumption. In all vertebrates, the prophase arrest is maintained by high PKA activity. In Xenopus, Arpp19 is phosphorylated by PKA on a residue distinct from Greatwall target, S109. In response to progesterone, the inhibition of PKA induces Arpp19 dephosphorylation, which activates the signalling pathway leading to Cdk1 activation. A phosphatase is therefore required to dephosphorylate Arpp19 at S109 and to unlock the Cdk1 activation pathway. My work aimed at elucidating the molecular identity of this unknown phosphatase. Through biochemical and proteomic approaches, I have identified this phosphatase as PP2A-B55δ. By functional approaches in acellular extracts and oocytes, I have established that PP2A-B55δ is active in prophase. Arpp19 phosphorylation at S109 depends on a balance between PKA and PP2A-B55δ activities, in favor of the kinase. In response to progesterone, PP2A-B55δ activity is not affected and PKA inhibition is sufficient for Arpp19 dephosphorylation. PP2A-B55δ therefore orchestrates the release of the prophase arrest and the entry into M-phase by acting at two different periods and at two distinct residues in Arpp19, respectively facing PKA and Greatwall.; Ma thèse a visé à comprendre comment la cellule germinale femelle, ou ovocyte, reprend la division méiotique. Dans tout le règne animal, l’ovocyte est bloqué en prophase de première division méiotique et reprend la division au moment de l’ovulation, sous l’effet d’un signal externe, la progestérone chez le xénope. Cette hormone déclenche une voie de signalisation qui aboutit après 3 à 5 heures à l’activation de la kinase Cdk1. Les premières molécules activées de Cdk1 déclenchent une boucle d’auto-amplification permettant son activation totale et l’entrée en division. Cette boucle repose sur des phosphorylations catalysées par Cdk1 et ne fonctionne que si la phosphatase qui contrecarre son activité, PP2A-B55δ, est inhibée. Cette inhibition dépend de la protéine Arpp19, un inhibiteur spécifique de PP2A-B55δ quand elle est phosphorylée sur la S67 par la kinase Greatwall. Arpp19 a un second rôle lors de la reprise de la méiose. Chez tous les vertébrés, l’arrêt en prophase est maintenu par une forte activité de PKA. Chez le xénope, Arpp19 est phosphorylée par PKA sur un résidu distinct de celui ciblé par Greatwall, la S109. En réponse à la progestérone, l’inhibition de PKA provoque la déphosphorylation d’Arpp19, ce qui permet d'enclencher la voie de signalisation conduisant à l'activation de Cdk1. Une phosphatase est donc requise pour déphosphoryler Arpp19 sur S109 et lever le verrou exercé sur l'activation de Cdk1 en prophase. Mon travail a visé à élucider l’identité moléculaire de cette phosphatase inconnue. Par des approches de biochimie et protéomique, j’ai identifié cette phosphatase comme étant PP2A-B55δ. Par des approches fonctionnelles dans des extraits acellulaires et des ovocytes, j’ai établi que PP2A-B55δ est active en prophase. La phosphorylation d’Arpp19 sur la S109 dépend d'une balance entre les activités de PKA et PP2A-B55δ, en faveur de la kinase. En réponse à la progestérone, l’activité de PP2A-B55δ n’est pas affectée et l’inhibition de PKA suffit à la déphosphorylation d’Arpp19. PP2A-B55δ orchestre donc la levée de l’arrêt en prophase et l'entrée en phase M en agissant à deux périodes et sur deux sites distincts d’Arpp19, respectivement ciblés par PKA et Greatwall.

Obesity and type 2 diabetes are associated with a sedentary lifestyle and a diet rich in fat. Indeed, saturated fatty acids accumulate in non-adipose tissue such as skeletal muscle to generate lipids called ceramides (CER). My thesis project was divided into two parts with the objective to prevent CER to act. We have shown that, depending on the structure of the plasma membrane, CER alter the insulin signaling pathway by targeting PKB, a key insulin signalling protein, via a PKCζ pathway in L6 myotubes and a PP2A pathway in C2C12 myotubes. We also demonstrated that CER affect insulin sensitivity via the PKCζ pathway in human muscle cells. Once CER generated in the endoplasmic reticulum (ER), they are transported to the Golgi by a carrier called CERT to be metabolized into sphingomyelin (SM). Studies have shown that the transformation of CER into SM could be a crucial step to prevent CER to act. In several muscle insulin resistance models, expression of CERT is decreased and we demonstrated the importance of the transport of ceramide from the ER to the Golgi by inhibiting artificially the activity or the expression of CERT. In contrast, overexpression of CERT enhances insulin sensitivity in muscle cells in lipotoxiques conditions. Our results show that CERT plays a crucial role in mechanisms leading to the development of muscle insulin resistance since its presence is essential for maintaining normal traffic of CER between the ER and the Golgi., L'obésité et le diabète de type 2 sont associés à la sédentarité et à une alimentation riche en graisses. En effet, les acides gras saturés s'accumulent dans les tissus non adipeux, comme les muscles squelettiques pour générer des lipides appelés céramides (CER). Mon projet de thèse s'est articulé en deux parties dont l'objectif est d'empêcher les CER d'agir. Nous avons montré que, selon la structure de la membrane plasmique, les CER altèrent la voie de signalisation insulinique en ciblant la PKB, protéine clef de la voie insulinique, via la voie PKC? dans les myotubes L6 et la voie PP2A dans les myotubes C2C12. Nous avons aussi mis en évidence que les CER altèrent la sensibilité à l'insuline via la voie PKC? dans les cellules musculaires humaines. Une fois les CER produits au niveau du réticulum endoplasmique (RE), ils sont transportés au Golgi par un transporteur CERT pour y être métabolisés en sphingomyéline (SM) et des études ont montré que la transformation des CER en SM pouvait être une étape cruciale pour empêcher les CER d'agir. Dans plusieurs modèles d'insulino-résistance musculaire, l'expression de CERT est diminuée et nous avons démontré l'importance du transport des céramides du RE vers le Golgi en inhibant artificiellement l'activité ou l'expression de CERT. A l'opposé, la surexpression de CERT améliore la sensibilité à l'insuline dans les cellules musculaires dans des conditions lipotoxiques. Nos résultats montrent que CERT joue un rôle crucial dans les mécanismes conduisant au développement de l'insulinorésistance musculaire puisque sa présence est essentielle pour le maintien d'un trafic normal des CER entre le RE et le golgi.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.