Search

Le neuroblastome pédiatrique à haut risque est incurable malgré l’intensification des traitements. Chez le patient, les cellules de neuroblastome échappent à l’activité anticancéreuse des cellules immunitaires Natural Killer (NK). Or, lorsque cultivées in vitro en monocouche (2D), les cellules de neuroblastomes redeviennent sensibles à l’activité cytotoxique des cellules NK ce qui ne reflètent pas leur résistance dans les tumeurs in situ. Nous faisons l'hypothèse que lorsque cultivées en 3D sous forme de sphéroïdes, les cellules de neuroblastome pourraient retrouver certaines caractéristiques qui les rendraient plus représentatives des tumeurs in situ au niveau immunologique. Ainsi, un tel modèle préclinique pourrait mieux refléter la résistance aux cellules NK et servir de modèle de criblage pour la découverte de médicaments potentialisant la cytotoxicité des cellules NK. Pour répondre à cette question, nous avons développé un système de culture cellulaire 3D utilisant plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome. À ce système, une co-culture en 3D avec une lignée de cellules Natural Killer (NK92) a été mise en place. Nous avons mis en évidence que les sphéroïdes de neuroblastome présentent des changements d’expression de certains gènes qui sont retrouvées chez les patients ainsi qu’une plus grande résistance à l’activité cytotoxique des cellules NK92 en comparaison avec les lignées en monocouche. Les co cultures de sphéroïdes ont été exposées à des inhibiteurs de protéines impliquées à différents niveaux de l’épigénome afin de découvrir des médicaments qui sensibiliseraient les cellules de neuroblastome à l’activité cytotoxique des NK92. Une différence dans la sensibilité aux médicaments entre les sphéroïdes et les cellules en 2D ainsi qu’en monoculture ou en co-culture a été observée et certains composés ont été identifiés en vue de potentialiser l’activité des cellules NK92. Ainsi, nos études ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la résistance des cellules du neuroblastome à l’activité cytotoxique des cellules NK dans un modèle plus représentatif de la tumeur in situ., High-risk pediatric neuroblastoma remains incurable despite intensified treatments. In patients, neuroblastoma cells evade the anti-cancer activity of Natural Killer (NK) immune cells. However, when cultured in vitro in a monolayer (2D), neuroblastoma cells become sensitive to the cytotoxic activity of NK cells, which does not reflect their resistance in tumors in situ. We hypothesize that when cultured in 3D in the form of spheroids, neuroblastoma cells could regain certain characteristics that would make them representative of tumors in situ at the immunological level. Thus, such a preclinical model could better reflect NK cell resistance and serve as a screening model for drug discovery to discover a treatment that can potentiate NK cell cytotoxicity. To answer this question, we developed a 3D cell culture system using several neuroblastoma cell lines. To this system, a 3D coculture model with a Natural Killer (NK92) cell line was set up. We have shown that neuroblastoma spheroids develop changes in the expression of certain genes that are found in patients as well as greater resistance to NK92 cells compared to monolayer cell lines. Spheroid cocultures were exposed to inhibitors of proteins involved at different levels of the epigenome to discover drugs that would sensitize neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK92. A difference in drug sensitivity between spheroids and cells in 2D as well as in monoculture or coculture was observed and some compounds were identified to potentiate the activity of NK92 cells. Thus, our studies have provided a better understanding of the mechanisms involved in the resistance of neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK cells in a more representative model of the tumor in situ.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur extra-crânienne la plus fréquente du jeune enfant. Malgré une thérapie multimodale très agressive, 40% des patients atteints de NB à haut risque rechutent. Le traitement de ces patients consiste à éliminer la tumeur par chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, à reconstituer la moelle osseuse par une greffe de cellules souches autologues et enfin à éliminer la maladie résiduelle (MRD) par une immunothérapie visant l’antigène GD2 exprimé par les neuroblastes. Notre étude préclinique a examiné l’efficacité de deux stratégies de traitements qui visent à potentialiser les thérapies actuelles et réduire leur toxicité. La première consiste à réduire la masse tumorale par la radiothérapie ciblée combinée à des radiosensibilisants. La deuxième approche est basée sur l’activation des cellules natural killer (NK) pour potentialiser l’effet de l’immunothérapie anti-GD2 et éliminer la MRD. L’autophagie est un processus catabolique qui élimine les protéines et organelles endommagées par différents stress incluant les irradiations. Par conséquent, inhiber l’autophagie pourrait sensibiliser les neuroblastes aux irradiations. Or, nous avons montré qu’étant très radiosensibles, les neuroblastes ne sont pas davantage éliminés par les irradiations quand ils sont traités avec un inhibiteur de l’autophagie. De plus, l’absence d’un inhibiteur efficace de l’autophagie à usage thérapeutique ne permet pas actuellement d’adopter cette approche. Notre étude a également permis de révéler une nouvelle approche de stimulation des cellules NK par les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) activées par un ligand du récepteur Toll-like, capable d’éradiquer la MRD et prévenir les rechutes de NB. Nos résultats ont permis, d’une part, d’élucider les mécanismes impliqués dans la lyse des cellules NK activées par les pDC contre les neuroblastes et, d’une autre part, de démontrer que l’axe pDC-NK chez le patient est fonctionnel, augmente l’efficacité de l’anti-GD2 et élimine efficacement les neuroblastes. Ainsi, l’immunothérapie par les cellules NK est une stratégie très prometteuse pour traiter le NB. Cette étude préclinique servira de base à l’élaboration d’un essai clinique pour traiter les enfants atteints de NB au CHU Sainte Justine., Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumor in childhood. Despite aggressive multimodal therapy, 40% of patients with high-risk NB relapse. The current therapy comprises an induction treatment with chemotherapy and surgery, a consolidation treatment including radiotherapy and high-dose chemotherapy followed by bone marrow rescue with autologous hematopoietic stem cell transplantation and finally anti-GD2 immunotherapy targeting the disialoganglioside (GD2) antigen expressed by neuroblasts to treat minimal residual disease (MRD). Our preclinical study proposes two treatment strategies to potentiate current therapies and reduced toxicities. The first aim to reduce tumor mass by targeted radiotherapy combined with radiosensitizers. The second approach is based on the activation of natural killer (NK) cells to potentiate the effect of anti-GD2 therapy and eliminate MRD. Autophagy is a catabolic process that recycle damaged proteins and organelles, induced under various conditions of cellular stress including irradiation. Therefore, inhibiting autophagy could sensitize neuroblasts to irradiation. However, our study showed that neuroblasts were highly sensitive to irradiation and autophagy inhibitor failed to increase neuroblasts sensitization to irradiation. In addition, the absence of a potent autophagy inhibitor for therapeutic use does not allow this approach to be adopted. Our preclinical study demonstrated a novel approach based on NK cell stimulation with Toll-like activated plasmacytoid dendritic cells (pDC) that enhances the efficacy of anti-GD2 immunotherapy and prevent NB relapse. We elucidated the mechanisms involved in pDC-activated NK cells killing of neuroblasts. We further demonstrated that neuroblasts were efficiently killed by patient’s NK cells after stimulation by activated pDC. This is further increased by the addition of anti-GD2 antibody. Altogether, our study demonstrates that NK cell-based immunotherapy has a real potential to enhance anti-GD2 immunotherapy effect and prevent NB relapse. This preclinical study will serve as a basis for the development of a clinical trial to treat children with NB at CHU Sainte Justine.

Les cellules tueuses naturelles (NK) font partie du système immunitaire inné et participent activement à l’immunosurveillance antivirale et antitumorale. Celles-ci sont principalement cytotoxiques et induisent la lyse des cellules cibles par de multiples fonctions effectrices telles que la production de cytokines et de granules cytotoxiques ou l’expression de ligands de mort. Alors que la différenciation des cellules hématopoïétiques en cellules NK se fait dans la moelle osseuse, l’acquisition de leurs fonctions cytotoxiques se fait principalement en périphérie au cours d’un processus séquentiel en quatre étapes appelé maturation fonctionnelle. Cette maturation est caractérisée par l’expression de la molécule de costimulation CD27 et de l’intégrine CD11b (CD27loCD11blo --> CD27hiCD11blo --> CD27hiCD11bhi --> CD27loCD11bhi). Ce processus est essentiel à la génération ainsi qu’au maintien d’une population de cellules NK fonctionnelles. La réponse cytotoxique des cellules NK peut grandement varier d’un individu à l’autre et d’une lignée murine à l’autre. Il a été démontré à plusieurs reprises que la population de cellules NK de la souris Non-obese diabetic (NOD) est caractérisée par de profonds défauts fonctionnels. Afin de comprendre la provenance d’un tel déficit, le processus de maturation fonctionnelle des cellules NK de la lignée murine NOD a été caractérisé et comparé à celui de la lignée B6. Des études de cytométrie en flux ont pu révéler une accumulation de cellules NK dans les stades les moins fonctionnels, témoignant d’un défaut de ce processus chez la NOD. Des études de liaisons génétiques et l’exploitation de la lignée murine B6.Trp53-/- ont aussi permis de valider l’implication de la protéine antitumorale p53 dans ce processus. De plus, des essais de stimulation ex vivo ont pu mettre en lumière chez les cellules NK de la lignée NOD un défaut dans l’acquisition des effecteurs clés IFNγ, TNFα etii granzyme B au cours des différents stades de la maturation fonctionnelle. De manière générale, ces études sont les premières à étudier exhaustivement les défauts fonctionnels des cellules NK de la lignée NOD au cours de leur processus d’acquisition fonctionnelle., Natural killer (NK) cells are potent innate lymphoid cells that play an important role in both tumoral immunosurveillance and viral clearance by producing vast amounts of cytokines and cytotoxic effectors and by expressing death ligands on their surface. These effector functions have been shown to be sequentially acquired along a 4-stage peripheral maturation process called functional maturation that can be identified by the expression of the costimulation molecule CD27 and the integrin CD11b (CD27loCD11blo --> CD27hiCD11blo --> CD27hiCD11bhi --> CD27loCD11bhi). As such, this process is required for the generation and the maintenance of potent cytotoxic NK cells. However, NK cell population functions can greatly vary between individuals and between mouse strains. For the last 30 years, NK cells coming from the Non-Obese Diabetic (NOD) background, a type 1 diabetes-prone mouse strain, have been shown to exhibit profound functional defects. To understand the cause of such defect, we compared the functional maturation process of NOD NK cells with B6 NK cells. Flow cytometry analyses revealed that the former accumulate in the earlier stages of the process, implying a defect in the progression of the maturation. Moreover, genetic linkage analyses and the use of the Trp53 mouse strain allowed us to identify the antitumor protein p53 as being involved in the functional maturation process. Finally, ex vivo stimulation assays demonstrated profound acquisition defects of the key effectors IFNγ, TNFα and granzyme B in NOD NK cells compared to their B6 counterparts. Ultimately, this work is the first to explicitly study the functional defects of NOD NK cells in a functional maturation stage-dependent manner.

L’élimination des cellules sénescentes met en jeu le SASP et les cellules immunitaires de l’immunité innée et adaptative tels que les macrophages (Mφ). Dans le cadre de ce projet, nous rapportons que le SASP a un effet pléiotropique sur l’activité des cellules immunitaires incluant leur recrutement, leur activation et leur différenciation. Nos données montrent que les Mφ humains mis en culture avec le SASP de fibroblastes humains développement un profil inflammatoire spécifique au SASP caractérisé par une sécrétion pro-inflammatoire (M1) (ex : IL- 1β, GM-CSF) et des marqueurs de surface anti-inflammatoires (M2) (cellules CD23+CD206+). Le SASP est aussi capable d’augmenter les capacités d’invasion des Mφ, tel que montré via des essais d’invasion, mais n’a pas d’effet sur la différentiation des monocytes. Nos modèles de co- culture montrent que, quoique les cellules NK sont probablement responsables de l’élimination directe et spécifique des cellules sénescentes, leur activité peut être modulée par d’autres cellules immunitaires tels que les Mφ qui réduisent l’élimination faite par les cellules NK, suggérant un profil M2. Les lymphocytes T CD8+ sont aussi essentiels pour l’élimination des cellules sénescentes puisque leur retrait retarde le processus. De plus, nous démontrons que les cellules T CD4+ mises en culture pendant 48h dans le SASP sécrètent de hauts niveaux d’IL-4, indiquant une polarisation Th2. Somme toute, ces données montrent que le SASP peut moduler l’activité des Mφ tout comme celle d’autres cellules immunitaires impliquées dans l’élimination des cellules sénescentes et peut promouvoir, étonnamment, une réponse immunosuppressive pouvant être importante pendant la réparation tissulaire., Senescent cell clearance brings into play the senescence-associated secretory phenotype (SASP) and immune cells from the innate and adaptive immunity including macrophages (Mφ). In this study, we report that the SASP has a pleiotropic effect on immune cell activity including recruitment, activation and differentiation. We show that human Mφ exposed to the SASP of human fibroblasts develop a SASP-specific inflammatory profile characterized by pro- inflammatory (M1) secretion (e.g. IL-1β, GM-CSF) and anti-inflammatory (M2) surface markers (CD23 and CD206). The SASP also increases Mφ invasion but has no effect on monocyte differentiation. Co-culture models show that while NK cells are likely the direct effectors of senescent cell specific killing, their activity is modulated by other immune cells including Mφ, which reduced NK-mediated killing, suggesting a M2 profile. Alternatively, CD8+ T lymphocytes are essential for senescent cell killing by NK cells. Finally, CD4+ T cells cultured for 48h in the SASP secrete high-levels of IL-4, indicating a Th2 polarization. Overall, our data reveal that the SASP can modulate Mφ and other immune cells involved in senescent cell clearance and surprisingly promote an immunosuppressive response that could be important in tissue repair.

Les cellules Natural Killer (NK), un sous-type de lymphocytes, sont cruciales dans l’immunité innée de par leur cytotoxicité directe envers les tumeurs, les cellules infectées et les cellules stressées. Elles contribuent également à l’orchestration de la réponse immunitaire adaptative de par leur capacité à produire des cytokines immunorégulatrices. Pour développer ces fonctions effectrices, les cellules NK requièrent l’intégration d’une multitude de signaux. De là, les cellules NK matures (mNK) sont considérées comme appartenant à quatre sous-types conséquents et concordants avec la polarisation vers la prolifération, la production de cytokines ou les propriétés cytotoxiques. Dans certaines maladies auto-immunes, tel le diabète de type 1 (T1D), un bloc dans leur maturation, et conséquemment des défauts en nombre et en fonctions, peut être observé. Ainsi, afin de découvrir la régulation génétique derrière la proportion et la maturation des cellules NK, des études de liaison génétique ont été produites sur des souris F2 (B10.BR x NOD.H2k) et F2.Rag (B6.Rag1-/- x NOD.Rag1-/-), où le fond génétique NOD est un modèle de T1D. Ces analyses ont révélé des locus potentiellement impliqués dans la régulation de la proportion, des nombres absolus ainsi que dans la maturation fonctionnelle des cellules mNK. Les chromosomes 8, 9 et 17 ont été liés à la proportion des cellules mNK tandis que les chromosomes 2, 4, 7, 10, 11 et 18 ont été liés aux sous-types fonctionnels de ces mêmes cellules. De là, nous avons validé l’influence du locus du chromosome 9 sur la proportion des cellules mNK en générant des souris sous-congéniques avec des insertions de segment génétique B10.BR dans des souris de fond génétique NOD. La proportion et le nombre absolu de cellules mNK ont ensuite été analysés par cytométrie en flux et comparés à ceux de souris contrôles. Pour la maturation fonctionnelle, nous avons retenus certains gènes candidats, et régulateurs associés, liés à un ou plusieurs sous-types de mNK, dont Tbx21, Zeb2, c-Myb, Trp53 et Pmaip1. Par association de voies de signalisation, nous sommes également allés vérifier certaines protéines associées, dont Bim et Eomesodermin. Nous avons alors validé leur implication par l’utilisation de modèles murins knock-out, qPCR, essais de prolifération et d’apoptose. Enfin, nos résultats supportent un rôle pour le locus du chromosome 9 dans la régulation de la proportion de cellules mNK ainsi qu’un rôle pour Trp53, Bim et Pmaip1 dans la maturation fonctionnelle de celles-ci. Nos études révèlent donc de nouveaux gènes candidats potentiels dans la régulation des cellules NK, dont les mécanismes pourront être approfondis dans la perspective de développement de thérapies cellulaires et génétiques dans le combat contre les cancers et les infections chroniques., Natural Killer (NK) cells, a subset of lymphocytes, are crucial in innate immunity due to their direct cytotoxicity towards tumors, viral infected cells and stressed cells. NK cells also contribute to the orchestration of the adaptive response by their ability to produce immunoregulatory cytokines. To develop those effector functions, NK cells require the integration of multiple signals. As of now, mature NK cells (mNK) can be separated into a four-stage model of functional maturation that concords with a polarization either toward proliferation and cytokine production or cytotoxic functional properties. In autoimmune diseases, like type 1 diabetes (T1D), a block in their maturation, and consequently an impaired functionality and diminished numbers, can be observed. Thus, in order to uncover the genetic regulation behind the proportion and functional maturation of NK cells, a linkage analysis was performed by our lab on F2 (B10.BR x NOD.H2k) and F2.Rag (B6.Rag1-/- x NOD.Rag1-/- intercross) mice, where the NOD genetic background is a model of T1D. This analysis revealed loci that were potentially involved in the regulation of mNK cells proportion, absolute numbers or functional maturation. Loci on chromosomes 8, 9 and 17 were linked to the proportion of mNK cells while loci on chromosomes 2, 4, 7, 10, 11 and 18 were linked to different subsets of functional mNK cells. Hence, we validated the influence of the chromosome 9 locus on the proportion of mNK cells by generating congenic sub-strains of mice with insertion of B10.BR genetic segments and NOD genetic background. The proportion and absolute numbers of mNK cells were assessed by flow cytometry and compared to those of wild-type mice. Regarding the functional maturation of mNK cells, we considered potential candidate genes, and their upstream regulators, that were linked to one or more mNK subsets, namely Tbx21, Zeb2, Myb, Trp53 and Pmaip1. From those, we also looked further their associated pathway with proteins such as Bim and Eomesodermin. We proceeded to the in vivo validation of their implication by qPCR, proliferation and apoptosis assays and the use of knock-out mice. Indeed, our results support a role for a locus on chromosome 9 in the regulation of mNK cells proportion and for Trp53, Bim and Pmaip1 in NK cell functional maturation. As such, our study has revealed new candidate genes in NK cell regulation. Further explorations of the mechanisms by which those genes act could lead to the development of cellular and genetic therapies for cancers and chronic infections.

The ability of natural killer (NK) cells to kill tumor cells without the need to recognize a tumor-specific antigen provides advantages over T cells and makes them appealing for a use as effectors for adoptive immunotherapy. However, the full therapeutic potential of NK cell-based immunotherapy has not been fully investigated in the context of leukemic relapse after hematopoietic stem cell transplantation. Today, patients relapsing after hematopoietic stem cell transplantation are often treated with donor lymphocyte infusion (DLI) based on small cell fractions frozen at the time of the stem cell transplantation. Since peripheral blood stem cells are increasingly used as stem cell source and as source of cells for DLI, we aimed to evaluate the impact of G-SCF mobilization on NK cell phenotype and functions. Therefore, we compared the expansion capacity, the phenotype and the function of NK cells from blood for healthy donors, from allogeneic HSCT healthy donors or from autologous HSCT from patients. We also determine the impact of G-CSF on NK cell subset repartition before and after expansion in presence of IL-15. Our results showed that G-CSF administration to patients decreases CD56brightCD16+ NK cell population, proliferation and function. Overcoming this impairment in lymphoid capacity may be important to facilitate post-transplant immunotherapy., Les cellules Natural Killer (NK) sont capables de lyser les cellules tumorales sans la nécessité de reconnaitre un antigène tumoral spécifique. Cette propriété leur confère un avantage par rapport aux lymphocytes T et les rend intéressantes à utiliser en tant que cellules effectrices pour l’immunothérapie adoptive. A ce jour, le potentiel thérapeutique des cellules NK n’a pas été complétement exploré notamment dans le contexte du traitement de la rechute post-allogreffe de cellules souches hématopoïétiques. Actuellement, les patients en rechute post-greffe sont traités avec des injections de lymphocytes du donneur (DLI) parfois issues de petites fractions du greffon de cellules souches hématopoïétiques congelées. Les cellules souches périphériques étant fréquemment utilisées comme source de cellules souches et parfois utilisées comme DLI, nous avons souhaité évaluer l’impact du G-CSF sur le phénotype et les fonctions des cellules NK présentes dans ces fractions. Dans cet objectif, nous avons comparé différentes sources de cellules NK isolées à partir de sang de donneurs sains, de sang mobilisé de donneurs sains ou de patients et observé l’évolution des différentes sous-populations de cellules NK issues de ces prélèvements au décours d’une expansion en présence d’IL-15. Nos résultats ont montré que l’administration de G-CSF diminuait la proportion de cellules NK CD56brightCD16+ au profit d’une population CD16-, diminuait la prolifération des cellules NK lors de l’expansion en culture, et modifiait les propriétés fonctionnelles des cellules NK.

NK cells are innate lymphocytes involved in the recognition and elimination of tumor or infected cells. The biology of NK cells is regulated by intrinsic factors such as transcription factors but also by cytokines produced at steady state or under inflammatory conditions. Some of these cytokines like IL-15, IL-12 or IL-18 are known to increase NK cells functions. IL-15 allows NK cell survival via STAT5 and, via mTOR, increase NK cell proliferation, metabolism and acquisition of functions. In the other hand, cytokines like TGF-ß are known to inhibit NK cell function. TGF-ß1 is a major immunosuppressive cytokine, often secreted by tumor cells and participates to tumor escape. The inhibitory effects of TGF-ß in vitro on IL-2/15 mediated NK cell activation have long been shown, but the mechanism remains unknown. The objective of this work was to characterize the effects of TGF-ß at a molecular level. We have observed that TGF-ß induces a rapid blockade of IL-15 induced mTOR activation, in vitro. TGF-ß and the mTOR inhibitor rapamycin have similar effects. Finally, using genetic mouse models in vivo, constitutive TGF-ß signaling or mTOR deletion results in similar developmental arrests in NK cells; Les cellules NK sont des lymphocytes de l'immunité innée impliqués dans la reconnaissance et l'élimination de cellules tumorales ou infectées par des pathogènes intracellulaires. La biologie des cellules NK est régulée par des facteurs intrinsèques comme les facteurs de transcription ainsi que par des facteurs environnementaux comme les cytokines, produites en condition homéostatique ou inflammatoire. Certaines cytokines, comme l'IL-15, l'IL-12 ou l'IL-18 sont connues pour potentialiser les fonctions effectrices des cellules NK. L'IL-15, en activant la voie STAT5 permet, d'une part, d'assurer la survie des cellules NK et, d'autre part via la kinase mTOR, d'induire leur prolifération, d'augmenter leur métabolisme ainsi que leurs fonctions effectrices. D'autres cytokines comme le TGF-ß sont connues pour inhiber les fonctions des cellules NK. Le TGF-ß1 est une des cytokines les plus immunosuppressives du système immunitaire et, en étant secrété´ par différents types de cancers, il participe a` l'échappement tumoral. Depuis longtemps, les effets du TGF-ß in vitro sont connus pour contrer ceux de l'IL-15. L'objectif de ce travail a été´ d'étudier les effets du TGF-ß sur la biologie des cellules NK. Nous avons observé´ que l'ajout de TGF-ß, in vitro, induit un blocage rapide de l'activation de la voie mTOR par l'IL-15, que le TGF-ß a des effets très proches de ceux de la rapamycine, un inhibiteur spécifique de mTOR et que, in vivo chez la souris, l'activation constitutive des voies de signalisation activées par le TGF-ß induit un phénotype proche de celui de la délétion de mTOR dans les cellules NK

Streptococcus du Groupe B (GBS) et Streptococcus suis sont deux pathogènes encapsulés qui induisent des pathologies similaires dont la méningite et la septicémie chez les animaux et/ou les humains. Les sérotypes III et V du GBS et les sérotypes 2 et 14 du S. suis (utilisés dans cette étude) sont parmi les plus prévalents et/ou les plus virulents. La capsule polysaccharidique (CPS) définit le sérotype et est considérée comme un facteur de virulence essentiel pour les deux espèces bactériennes. Malgré que plusieurs études aient été réalisées au niveau des interactions entre ces streptocoques et les cellules de l’immunité innée, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire contre ces pathogènes par les cellules dendritiques (DCs) et leur interactions avec d’autres cellules, notamment les cellules ‘natural killer’ (NK). Dans cette étude, différentes approches (in vitro, ex vivo et in vivo) chez la souris ont été développées pour caractériser les interactions entre les DCs, les cellules NK et GBS ou S. suis. L’utilisation de mutants non encapsulés a permis d’évaluer l’importance de la CPS dans ces interactions. Les résultats in vitro avec les DCs infectées par GBS ou S. suis ont démontré que ces deux pathogènes interagissent différemment avec ces cellules. GBS est grandement internalisé par les DCs, et ce, via de multiples mécanismes impliquant notamment les radeaux lipidiques et la clathrine. Le mécanisme d’endocytose utilisé aurait un effet sur la capacité du GBS à survivre intracellulairement. Quant au S. suis, ce dernier est très faiblement internalisé et, si le cas, rapidement éliminé à l’intérieur des DCs. GBS et S. suis activent les DCs via différents récepteurs et favorisent la production de cytokines et chimiokines ainsi que l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation. Cette activation permet la production d’interferon-gamma (IFN-y) par les cellules NK. Cependant, GBS semble plus efficient à activer les DCs, et par conséquent, les cellules NK que S. suis. La production d’IFN-y, en réponse à la stimulation bactérienne, est principalement assurée par un contact direct entre les DCs et les cellules NK et ne dépend qu’en partie de facteurs solubles. De plus, nos résultats in vivo ont démontré que ces deux streptocoques induisent rapidement la libération d'IFN-y par les cellules NK lors de la phase aiguë de l'infection. Ceci suggère que les interactions entre les DCs et les cellules NK pourraient jouer un rôle dans le développement d’une réponse immune T auxiliaire de type 1 (T ‘helper’ 1 en anglais; Th1). Cependant, la capacité de S. suis à activer la réponse immunitaire in vivo est également plus faible que celle observée pour GBS. En effet, les CPSs de GBS et de S. suis jouent des rôles différents dans cette réponse. La CPS de S. suis empêche une activation optimale des DCs et des cellules NK alors que c’est l’opposé pour la CPS de GBS, indépendamment du sérotype évalué. En résumé, cette étude adresse pour la première fois la contribution des DCs et des cellules NK dans la réponse immunitaire innée lors d’une infection à GBS ou à S. suis et, par extension, dans le développement d’une réponse Th1. Nos résultats renforcent davantage le rôle central des DCs dans le contrôle efficace des infections causées par des bactéries encapsulées., Group B Streptococcus (GBS) and Streptococcus suis are two encapsulated pathogens that induce similar pathologies, including septicemia and meningitis in animals and/or humans. Serotypes III and V of GBS and serotypes 2 and 14 of S. suis (evaluated in this study) are the most prevalent and/or virulent types. The capsular polysaccharide (CPS) defines the serotype and is considered as a key virulence factor for both bacterial species. Although several studies have addressed the interactions of these streptococci and various cells of the innate immune system, no information is available on the regulation of the immune response against these pathogens by dendritic cells (DCs), and their interactions with other cells, including natural killer (NK) cells. In this study, different approaches (in vitro, ex vivo and in vivo) in mice were developed to characterize the interactions between DCs, NK cells and GBS or S. suis. Non-encapsulated mutants were used to evaluate the importance of the CPS in these interactions. In vitro results with GBS- or S. suis-infected DCs showed that these two pathogens differently interact with these cells. GBS is largely internalized by DCs through multiple endocytosis mechanisms, mainly involving lipid rafts and clathrin. The use of a specific endocytosis pathway might help GBS to survive intracellularly. In contrast, S. suis is poorly internalized and, if the case, rapidly eliminated within the DCs. GBS and S. suis activate DCs through different receptors leading to the release of cytokines and chemokines and increased expression of co-stimulatory molecules. This activation allows the production of IFN- by NK cells. Yet, S. suis capacity to activate DCs and NK cells is lower than that observed for GBS. IFN- release in response to bacterial stimulation was mainly mediated by direct DC-NK cell contact and only partially dependant on soluble factors. In addition, our in vivo results showed that these two streptococcal species rapidly induce the release of IFN- by NK cells during the acute phase of the infection. This suggests that the DC-NK crosstalk might play a role in the development of a T helper 1 (Th1) response. Yet, S. suis capacity to activate the in vivo immune response was also lower than that observed for GBS. In fact, GBS and S. suis CPSs play different roles in this response. S. suis CPS prevents optimal activation of DCs and NK cells whereas it is the opposite for GBS, independently of the serotype tested. In summary, this study addresses for the first time the contribution of DCs and NK cells to the innate immune response against GBS and S. suis infections, and by extension, to the development of a Th1 response. Our results further highlight the central role of DCs in the effective control of infections caused by encapsulated bacteria.

Auto-immune diseases (AID) form a broad spectrum of heterogeneous and chronic pathologies, most commonly affecting young adults. The etiopathogenesis of AID corresponds to a breakdown of the immunological tolerance: the result of complex mechanisms, implicating every component of the immune system. While adaptive immune cells has been extensively studied in this context, the role of innate immune cells, including Natural Killer (NK) cells, is much less understood. Using Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Antisynthetase Syndrome (ASS) as model pathologies, the main objective of this work is to demonstrate the involvement of NK cells in AID and to study the relevant mechanisms. Patients with AID showed numerous anomalies in the phenotypical and functional analysis of their NK cells, as compared to healthy controls. These differences are more pronounced in active rather than inactive patients. Moreover, the infiltration of target tissues by NK cells in ASS as well as the activation of these cells by SLE specific auto-antigens confirm the involvement of NK cells in AID. Additionally, interactions of NK cells with different immune cells, known to be involved in AID pathogenesis, seem to be the cause of the observed anomalies. These anomalies differ among both AID: NK cells from patients with SLE are immature and devoted to cytokine production, whereas those from patients with ASS have reached a highly differentiated but hypofunctional stage. Taken as a whole, these data suggest that NK cells are involved in the immuno-pathogenesis of AID. This involvement seems conditioned by the effect of different stimuli and different cellular interactions, which are distinct from one form of AID to another., Les maladies auto-immunes (MAI) correspondent à un large ensemble de pathologies cliniquement hétérogènes, affectant le plus souvent des adultes jeunes, de façon volontiers chronique. Du point de vue physiopathologique, ces maladies correspondent à la survenue d’une rupture de tolérance au soi, dont les mécanismes sont complexes et font appel à l’ensemble des acteurs du système immunitaire. Si l’implication des cellules de l’immunité adaptative est largement documentée dans ce contexte, celle des cellules appartenant à l’immunité innée, comme les cellules Natural Killer (NK) est peu étudié. A travers deux exemples de MAI systémiques, le Lupus Systémique (LS) et le Syndrome des Antisynthétases (SAS), l’objet de ce travail est de montrer l’implication des cellules NK au cours des MAI et d’étudier les mécanismes en cause.L’étude phénotypique et fonctionnelle des cellules NK chez des patients présentant une MAI révèle de nombreuses anomalies comparativement aux sujets contrôles. Ces dernières sont plus marquées chez les patients en phase active plutôt qu’en rémission. De plus, l’infiltration des tissus cibles au cours du SAS par les cellules NK d’une part, et l’activation in vitro de ces cellules par les auto-antigènes au cours du LS d’autre part, confirme l’implication des cellules NK au cours de ces deux MAI. Par ailleurs, des interactions des cellules NK avec plusieurs types cellulaires impliqués dans l’immunopathologie de ces maladies semblent conditionner les anomalies observées. Ces dernières sont différentes selon la maladie étudiée : le profil des cellules NK des patients atteints de LS étant plutôt immature et tourné vers la production de cytokines, tandis que celui des patients atteints de SAS correspond à un stade de différentiation terminal mais hypofonctionnel.L’ensemble des résultats suggère que les cellules NK participent à l’immunopathologie des MAI. Leur implication est conditionnée par l’effet de certains stimuli et certaines interactions cellulaires, qui sont de nature différente d’une MAI à l’autre.

Chikungunya (CHIKV) and Dengue (DENV) virus are both re-emerging viruses transmitted by Aedes mosquitoes and responsible of widespread outbreaks in tropical and subtropical country. Recently, transmission of both viruses had emerged in urban and peri-urban area infecting millions of persons. Chikungunya and Dengue are both acute infections where innate immunity rapidly takes place and play a crucial role in the control and in the evolution of the disease. Natural Killer cells (NK) represent one of the major cellular population of innate immunity and play a crucial role in defense mechanism. By way of ex vivo and in vitro studies, we characterized NK cells by (i) a phenotypic and functional study of NK cells in CHIKV, DENV-2 infected patients or CHIKV/DENV-2 co-infected patients and (ii) characterization of NK cells interactions with infected target cells. During last outbreaks, several cases of co-infected patients were reported. Moreover, geographic spread of Aedes mosquitoes could increase number of coinfection cases without underlying mechanisms being explored. In order to respond to certain questions regarding coinfections, we realized a co-infected CHIKV and DENV-2 experimental model in Rhesus macaques.Together, these data will contribute to better identify NK cells implication in the control of CHIKV and DENV-2 infections allowing a better comprehension of mechanisms that causes immune system disorder., Les virus du Chikungunya (CHIKV) et de la dengue (DENV) sont deux virus émergents qui sévissent dans les régions tropicales et subtropicales du monde entier et qui sont transmis par les moustiques du genre Aedes. Ces dernières années, leur transmission a surtout progressé dans les zones urbaines et périurbaines touchant des millions d’individus et faisant de ces deux pathogènes des sujets majeurs de préoccupation pour la santé publique. Le Chikungunya et la Dengue sont des infections dites aiguës entrainant une mise en place rapide de la réponse immunitaire innée qui joue un rôle majeur dans le contrôle et l’évolution de la maladie. Les cellules Natural Killer (NK) représentent une population cellulaire clé de la réponse innée et jouent un rôle crucial dans les mécanismes de défense mis en place. A travers une étude ex vivo et in vitro, nous nous sommes intéressées à la caractérisation des cellules NK à travers (i) une étude phénotypique et fonctionnelle des cellules NK chez des patients infectés en phase aiguë par le CHIKV, DENV-2 ou par les deux virus et (ii) à la caractérisation des interactions entre les cellules NK et les cellules cibles infectées par le virus. L’ensemble de ces données contribue à mieux identifier l’implication des cellules NK dans le contrôle des infections par le CHIKV et DENV-2 permettant ainsi de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des dérèglements de la réponse immunitaire. Au cours des dernières épidémies, plusieurs cas de patients coinfectés par les deux virus ont été répertoriés. De plus, l’expansion géographique des moustiques Aedes pourrait amener à une augmentation du nombre de cas de coinfections sans que les mécanismes sous jacents aux coinfections ne soient étudiés. Afin de pouvoir réponse à certaines questions concernant ce phénomène, nous avons mis en place un modèle expérimental de coinfection par CHIKV et DENV-2 chez le macaque Rhésus.

L’idée qu’une cellule puisse effectuer la cytolyse de cellules transformées, comme une cellule Natural Killer (NK), tout en ayant la capacité de présenter des antigènes, comme une cellule dendritique (DC), peut sembler fantaisiste. Cependant, de telles cellules furent bel et bien identifiées chez la souris en 2006. Ces cellules, nommées Interferon-producing Killer Dendritic Cells (IKDC), furent l’objet d’une caractérisation extensive qui révéla leur énorme potentiel immunologique. La combinaison de fonctions associées à des cellules NK et à des DC a doté les IKDC d’un pouvoir antitumoral remarquable. D’ailleurs, il a été démontré que les IKDC sont plus efficaces que les cellules NK pour limiter la croissance tumorale. Ainsi, suite à leur découverte, les IKDC ont suscité beaucoup d’intérêt. Cependant, une controverse émergea sur la nature des IKDC. Plusieurs groupes indépendants tentèrent de reproduire les expériences attestant les fonctions de DC des IKDC, sans y parvenir. De plus, des études additionnelles révélèrent que les IKDC possèdent des similitudes très importantes avec les cellules NK. Ces observations ont mené la communauté scientifique à suggérer que les IKDC sont des cellules NK en état d’activation (aNK). Malgré cette controverse, les caractéristiques antitumorales des IKDC sont si uniques et considérables qu’il est primordial de poursuivre l’étude de ces cellules. Pour y arriver, il est essentiel de déterminer la nature des IKDC et de mettre fin à ce débat. Par la suite, il sera important d’identifier des façons de cibler spécifiquement les IKDC pour permettre leur usage dans le cadre de thérapies antitumorales. Ainsi, l’objectif de cette thèse est de définir l’identité des IKDC, puis de déterminer les facteurs génétiques responsables de la régulation de ces cellules. Nous avons démontré que les IKDC ne sont pas des cellules aNK, contrairement à ce qui avait été suggéré. Nous avons constaté que les IKDC prolifèrent activement et possèdent un phénotype unique, des caractéristiques associées à des cellules NK très immatures. Afin de déterminer si les IKDC peuvent acquérir un phénotype mature, nous avons effectué des expériences de transfert adoptif. Suite à leur injection in vivo, les IKDC acquièrent un phénotype de cellules matures, mais étonnamment, elles se différencient aussi en cellules NK. Ainsi, nous avons révélé que les IKDC sont un intermédiaire dans la différenciation des cellules NK. En parallèle, nous avons démontré que la proportion d’IKDC varie grandement entre des souris de fond génétique différent, indiquant que des facteurs génétiques sont impliqués dans la régulation de ces cellules. Nous avons alors effectué une analyse génétique qui a révélé que les IKDC sont régulées par des facteurs génétiques compris dans une région distale du chromosome 7. Les résultats présentés dans cette thèse constituent une avancée importante pour la recherche sur les IKDC. Ils ont permis de définir la nature des IKDC et d’identifier un intervalle génétique impliqué dans la régulation de ces cellules. Ces découvertes sont des connaissances précieuses pour l’identification des IKDC chez l’Homme et la création de nouvelles thérapies dans la lutte contre le cancer., The idea that a cell could kill transformed cells, like a Natural Killer (NK) cell, all the while exhibiting also the capacity to present antigens to T cells, like a Dendritic Cell (DC), may seem farfetched. However, in mice, a cell presenting these specific properties was identified in 2006. These cells were named Interferon-producing Killer Dendritic Cells (IKDC) and extensive studies revealed that they were endowed with an important immunological potential. Indeed, the fact that IKDCs exhibit properties of both DC and NK cells conferred them with an exceptional anti-tumor potential. Notably, on a per cell basis, the in vivo anti-tumor activity of IKDCs is more efficient than NK cells. Therefore, following their identification, IKDCs showed great therapeutic promise. However, a debate on the cell lineage origin of IKDCs emerged. Several independent groups could not replicate the finding that IKDCs showed functional antigen-presentation properties similar to DCs. Also, additional studies revealed that IKDCs are very similar to NK cells. These and other observations led the scientific community to believe that IKDCs were activated NK cells. Despite this controversy, IKDCs clearly exhibit a unique and outstanding anti-tumor potential, highlighting the relevance to further explore these cells. We must first close the debate regarding the lineage origin of IKDCs. We subsequently need to identify a means to specifically target IKDCs to facilitate their use in novel anti-tumor therapies. Thus, the objective of my thesis is first, to define the identity of IKDCs and second, to determine the genetic factors implicated in the regulation of these cells. For the first objective, we demonstrated that IKDCs do not represent activated NK cells, as previously suggested. We show that IKDCs are highly proliferative and exhibit a unique phenotype associated with very immature NK cells. In an attempt to verify if IKDCs could acquire a mature phenotype, we conducted an adoptive transfer experiment. We found that, after adoptive transfer, IKDCs adopt a mature phenotype, but also surprisingly differentiate into NK cells. These findings indicate that IKDCs represent an intermediate in NK-cell differentiation. For the second objective, we demonstrated that the IKDC proportion was highly variable between strains of different background origins, indicating that these cells are regulated by genetic factors. A genetic study revealed that genetic factors in distal arm of chromosome 7 associate with the proportion of IKDCs. The results presented in this thesis represent an important breakthrough for the research on IKDCs. They allowed to define the cell lineage origin of IKDCs and to identify a genetic region involved in the regulation of this cell type. These discoveries are valuable knowledge for the identification of human IKDCs and the development of novel anti-tumor therapies.

Natural killer (NK) cells are critical mediators of anti-tumor immunity. A high-calorie diet inducing obesity is associated with breast cancer development. NK cells are modulated by dietary and metabolic factors and a decrease in their lytic activity promotes mammary tumor development. In the breast microenvironment, high concentration of leptin can be secreted by mammary adipocytes and thereby could stimulate tumor growth and control immune cells. Arginine, strongly consumed by tumor and myeloid-derived suppressor cells, could be lacking to NK cells. The aim of this work is to characterize the functional and metabolic activities of NK cells in response to nutritional stress. Initially, we explored in vivo the impact of a high-calorie diet on NK cells activity and mammary tumor development. Then, we identified potential functional alterations in NK cells by mimicking the conditions found in the tumor microenvironment such as the presence of high leptin concentration and arginine depletion. Female Balb-c nude mice were fed a high-caloric diet (HC) versus a standard caloric diet (SC) for 6 months. After five months, mammary tumor cells (MCF-7, SCT, HCT) or MatrigelTM (SC, HC) were implanted into the fourth mammary fat pads. The tumor development in HC diet-fed mice was associated with a decrease in body weight, body fat and lean mass and an increase in volume and weight of tumors. This diet induced tumor over-expression, at the transcriptional level, of enzymes involved in glycolysis and a down-expression of citrate cycle actors. Protein tumor levels of cleaved caspase 3, estrogen β and progesterone receptors were reduced while Ki67 was increased in the HC diet-fed mice. NK cell cytotoxicity of HC diet-fed mice was reduced. Although the presence of tumor stimulated NK cell lytic activity, this later was lower in the HCT group compared to the one of SCT mice. In vitro, leptin stimulated, in dose-dependent manner, the metabolic activity of NK cells. High leptin concentrations enhanced NK cell cytotoxicity against the MDA-MB-231 target cells. This phenomenon involved the increase of expression of TRAIL and IFN-γ in NK cells. However, against the MCF-7 target cells, NK cell lytic activity was reduced in the presence of high concentrations of leptin, probably in link to the decreased perforin expression. NK cell proliferation and cytotoxicity were impaired in response to arginine depletion. This inhibition of NK cell cytotoxicity could be linked to a low target cells recognition by NKp46 and NKp30, a reduced activating signal transmission by ζ chain and a low production of IFN-γ. Thus, high energy intake promotes mammary tumor development in particular by inhibiting NK cell cytotoxicity. In vitro, high leptin concentrations stimulate or reduce NK cell cytotoxicity according to the breast cancer cell targets. Furthermore, arginine depletion inhibits NK cell proliferation and cytotoxicity in vitro. These findings provide insight into the microenvironment impacts on NK cell antitumor response in tumor development.; Les cellules Natural Killer (NK), actrices majeures de la vigilance anti-tumorale, sont modulées par des facteurs nutritionnels et métaboliques. L'inhibition de leur activité favorise le développement tumoral. Un régime alimentaire hypercalorique induisant l'obésité est un facteur de risque de développer un cancer du sein. Au niveau du micro-environnement tumoral mammaire, la biodisponibilité en certaines molécules contrôle non seulement les cellules néoplasiques mais, également les cellules immunes infiltrées. Ainsi, la leptine, sécrétée à forte concentration par les adipocytes mammaires, pourrait favoriser la croissance tumorale et altérer les cellules NK. L'arginine fortement consommée par les cellules tumorales et les cellules suppresseurs dérivées des myéloïdes pourrait faire défaut aux cellules NK. L'objectif de cette thèse est de caractériser les activités fonctionnelles et métaboliques des cellules NK en situation de stress nutritionnel. Dans un premier temps, nous avons exploré, in vivo, l'impact d'un régime hypercalorique sur l'activité des cellules NK et sur le développement tumoral mammaire. Ensuite, nous avons cherché à identifier les potentielles altérations fonctionnelles des cellules NK en mimant, in vitro, les conditions retrouvées au niveau du micro-environnement tumoral telles que la présence de concentration élevée en leptine et la déplétion en arginine. Des souris Balb-c "nude" femelles ont été soumises à un régime hypercalorique (HC) versus une diète normo-calorique (NC) pendant 6 mois. Au bout de 5 mois, des cellules tumorales mammaires (MCF-7 ; groupes NCT et HCT) ou le véhicule (groupes NC et HC) ont été implantés au niveau de la quatrième paire de glandes mammaires. Sous régime HC, le développement tumoral s'accompagne d'une perte de masse grasse, de masse maigre et de poids corporel avec un volume et un poids de tumeur augmentés. Cette diète induit au niveau tumoral une sur-expression des ARNm d'enzymes impliquées dans la glycolyse et une sous-expression des acteurs du cycle de Krebs. Sous régime HC, l'expression de la caspase 3 clivée et des récepteurs des oestrogènes β et de la progestérone est réduite alors que celle du Ki67 est accrue. Les cellules NK des souris HC ont une cytotoxicité diminuée. Bien que la présence de tumeur stimule l'activité lytique des cellules NK, la cytotoxicité de ces cellules reste inférieure dans le groupe HCT comparativement à celle du groupe NCT. La leptine stimule, in vitro, de façon dose-dépendante l'activité métabolique des cellules NK. A fortes concentrations, elle active leur cytotoxicité vis-à-vis des cellules cibles MDA-MB-231. Cet effet passe par une stimulation de l'expression de TRAIL et de l'IFN-γ par les cellules NK. En revanche, vis-à-vis des cellules cibles MCF7, les cellules NK présentent une activité lytique réduite en présence de fortes concentrations de leptine, probablement en lien avec une réduction de l'expression de la perforine. En réponse à une déplétion en arginine dans le milieu de culture, la prolifération et la cytotoxicité des cellules NK sont abaissées. L'altération de la reconnaissance des cellules cibles par les récepteurs NKp46 et NKp30, la moindre transmission du signal activateur par la chaine ζ et la faible production d'IFN-γ peuvent expliquer l'inhibition de la cytotoxicité des cellules NK. Ainsi, un apport énergétique élevé favorise le développement tumoral mammaire notamment eninhibant la cytotoxicité des cellules NK. De plus, la leptine à fortes concentrations stimule ou réduit, in vitro, la cytotoxicité des cellules NK selon la nature des cellules cancéreuses mammaires cibles. Une déplétion en arginine, in vitro, quant à elle, inhibe la prolifération et la cytotoxicité des cellules NK. Ces travaux contribuent à mieux comprendre l'impact du micro-environnement sur la réponse antitumorale des cellules NK.

The prevalence and severity of allergic diseases are increasing in western countries. Known pathophysiological mechanisms involve the induction of Th2 response by dendritic cells, leading to IgE production and inflammation. The innate immunity was recently highlighted in the control of adaptive immunity, which is antigen specific. However, the role of Natural Killer (NK) cells, innate cells mainly known for their anti-tumoral and anti-microbial functions, is still unknown in allergic pathology. Nevertheless, several studies have shown modifications of some NK cell subsets in asthmatic and allergic patients. The global aim of thesis was to study the role of NK cells in allergic asthma. Firstly, quantitative and qualitative variations of NK cells as well as the effect of NK cell depletion were analyzed in mouse models of asthma. Secondly, we compared the effect of CCL18, chemokine involved in allergic asthma, on NK cells isolated from peripheral blood of non allergic and allergic subjects. In mouse model of allergic asthma, we first used the widely described BALB/cByJ mouse model, which consists of two systemic sensitizations of ovalbumin (OVA) and alum followed by three OVA aerolized challenges. OVA sensitized and challenged mice exhibited an increased number of NK cell precursors, NK cells, and more particularly immature NK cells, as well as proliferating NK cells in mediastinal lymph nodes (lung draining lymph nodes). NK cells showed signs of recent activation, as measured by the increased expression of CD86. In lungs, NK cell numbers were not significantly modified in OVA sensitized and challenged mice compared to control mice (PBS sensitized and challenged mice). However, NK cell numbers, and more particularly most mature NK cell numbers, decreased in OVA sensitized and challenged mice. As in mediastinal lymph nodes, lung NK cells showed signs of recent activation. We then analyzed the effect of NK cell depletion on allergic airway inflammation using anti-ASGM1 antibodies. NK cell depletion led to a significant decrease of bronchoalveolar eosinophilia, but did not modify airway hyperresponsiveness and OVA-specific Ig levels (IgE, IgG2a and IgG1) in OVA sensitized and challenged mice. As NK cell depletion by anti-ASGM1 antibodies was inferior to 73%, we decided to reproduce these experiments in NKDTR mice (mice expressing Diphteria toxin in NKp46 promoter, NKp46 being expressed by all NK cells), allowing a specific and effective (>90%) NK cell depletion (Collaboration with Pr E Vivier and Dr T Walzer). As NKDTR mice are on a C57BL/6 background, we developed another model of allergic airway sensitization. C57BL/6 mice received two systemic sensitizations of OVA and alum, followed by two sets of three OVA intranasal administrations. In contrast to the previous model in BALB/cByJ mice, no modification of NK cell number and subset distribution was observed in the mediastinal lymph nodes of OVA sensitized challenged mice. However, phenotypically, NK cells were activated and surface expression of CD107a was increased indicating previous NK cell degranulation. In lungs, the percentage of the most mature NK cells decreased in OVA sensitized and challenged mice. Lung NK cells were also activated and surface expression of CD107a increased, whilst the percentage of IFN-g expressing NK cells decreased. Concerning CCL18 chemokine, this latter is preferentially produced in lungs. In our laboratory, it was shown that CCL18 production was increased in asthmatic patients and that this chemokine recruited Th2 lymphocytes and basophils, suggesting a role of this chemokine in allergic asthma. Our objective was to evaluate the response to CCL18 of NK cells isolated from peripheral blood of allergic patients and compared to that of non allergic subjects. Because the CC18 receptor is still unknown, we analyzed its expression on NK cells by the detection of biotinyled CCL18 binding. Flow cytometry study showed that some NK cells from allergic and non allergic subjects expressed CCL18 receptor. In addition, we observed that NK cells from allergic and non allergic donors migrated in response to CCL18 in a G protein-dependent manner. NK cell attraction by CCL18 was donor-dependent, but independent of the allergic status. No preferential NK cell subset attraction (CD56high or CD56low) was observed. CCL18 was also able to stimulate cytotoxicity of NK cells from allergic and non allergic donors towards Jurkat target cells. Responses were donor-dependent, but again independent of the allergic status. Finally, CCL18 did not induce cytokine production (IFN-g and TNF-a) by NK cells from allergic and non allergic donors. Altogether, we can conclude that NK cells from allergic donors may be attracted and activated by CCL18 similarly to NK cells from non allergic donors. In summary, our work showed that NK cells accumulate in mediastinal lymph nodes and seem to regulate airway eosinophilia in a murine model of allergic asthma. We also found that NK cells from allergic donors did not exhibit dysfunction in response to CCL18 compared to non allergic donors.; Les maladies allergiques sont en constante augmentation tant en prévalence qu'en gravité. Les mécanismes physiopathologiques connus impliquent l'induction d'une réponse Th2 par les cellules dendritiques, conduisant à une production d'IgE et une inflammation. L'immunité innée a récemment été mise en avant dans le contrôle de l'immunité adaptative, spécifique de l'antigène. Cependant, le rôle des cellules Natural Killer (NK), cellules de l'immunité innée connues essentiellement pour leurs fonctions anti-tumorales et anti-microbiennes, est encore inconnu dans la pathologie allergique. Néanmoins, quelques études ont montré une modification de certaines sous-populations de cellules NK chez les patients asthmatiques allergiques. Le but général du travail de thèse était d'étudier le rôle des cellules NK dans l'asthme allergique. Dans un premier temps, les variations quantitatives et qualitatives des cellules NK, ainsi que l'effet de leur déplétion ont été évalués dans l'asthme expérimental. Dans un deuxième temps, l'effet de CCL18, chimiokine impliquée dans l'asthme allergique, a été étudié sur les cellules NK de sujets non allergiques et de sujets allergiques. Tout d'abord, le premier modèle murin d'asthme expérimental utilisé était celui très largement décrit chez les souris BALB/cByJ, consistant en deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de trois provocations allergéniques d'OVA par aérosols. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, une augmentation du nombre de précurseurs de cellules NK, mais également du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK immatures, a été observé dans les ganglions médiastinaux (ganglions drainant les poumons). Celle-ci était accompagnée d'une augmentation du pourcentage de cellules NK ayant incorporé du BrdU. Outre ces variations quantitatives, nous avons également montré que les cellules NK étaient activées. Dans les poumons, le nombre de cellules NK n'était pas significativement modifié chez les souris sensibilisées et challengées à l'OVA comparativement aux souris contrôle. Néanmoins, une diminution non significative du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK les plus matures chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA a été observée. De plus, comme dans les ganglions médiastinaux, les cellules NK pulmonaires étaient activées. Nous avons ensuite évalué l'effet de la déplétion des cellules NK par administration de l'anticorps anti-ASGM1 avant les provocations allergéniques sur l'inflammation pulmonaire allergique. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, la déplétion en cellules NK diminuait significativement l'éosinophilie dans les lavages bronchoalvéolaires, sans affecter pour autant l'hyperréactivité bronchique et les taux sériques d'immunoglobulines spécifiques de l'OVA (IgE, IgG2a et IgG1) (Article soumis). La déplétion des cellules NK par l'anti-ASGM1 n'étant pas totale (73%), nous avons choisi de reproduire ces expériences chez les souris NKDTR qui expriment le récepteur de la toxine diphtérique dans le promoteur du gène NKp46, permettant la déplétion spécifique et plus efficace (>90%) des cellules NK (Collaboration Pr E Vivier et Dr T Walzer). Ces souris étant de fond génétique C57BL/6, nous avons mis au point un autre modèle de sensibilisation allergique pulmonaire. Les souris ont reçu deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de deux séries de trois provocations allergéniques d'OVA par voie intranasale. Dans les ganglions médiastinaux, contrairement au modèle précédent, aucune modification du nombre de cellules NK et de la distribution des sous-populations n'a été observée chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. D'un point de vue phénotypique, chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, les cellules NK étaient activées et l'expression membranaire du CD107a augmentée témoignant ainsi d'une dégranulation. Dans les poumons, le pourcentage de cellules NK les plus matures était diminué chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. Les cellules NK pulmonaires étaient également activées et l'expression membranaire de CD107a augmentée. Le pourcentage de cellules NK exprimant l'IFN-g était diminué. Concernant CCL18, cette dernière est une chimiokine produite préférentiellement au niveau du poumon. Dans le laboratoire, il a été montré que la production de CCL18 était augmentée chez les patients asthmatiques, et qu'elle recrutait les lymphocytes Th2 et les basophiles, suggérant le rôle de cette chimiokine dans l'asthme allergique. Notre objectif était d'évaluer la réponse des cellules NK isolées du sang périphérique de sujets allergiques vis-à-vis de CCL18 et de la comparer à celle de sujets non allergiques. Le récepteur de CCL18 étant encore inconnu, nous avons analysé son expression par les cellules NK par la fixation de CCL18 biotinylé. L'étude en cytométrie en flux a révélé que des cellules NK de donneurs allergiques et non allergiques exprimaient un récepteur pour CCL18. De plus, nous avons montré que les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques migraient en réponse à CCL18, et ce dans une voie dépendante des protéines G. L'attraction des cellules NK par CCL18 était dépendante du donneur, mais indépendante du statut allergique. Aucune attraction préférentielle d'une sous-population de cellules NK (CD56hi ou CD56lo) par CCL18 n'a été mise en évidence. CCL18 était également capable de stimuler la cytotoxicité des cellules NK de sujets allergiques et de donneurs non allergiques, vis-à-vis des cellules cibles Jurkat. Les réponses étaient variables en fonction du donneur, mais une fois encore étaient indépendantes du statut allergique. Enfin, CCL18 n'induisait pas de production de cytokines (IFN-g et TNF-a) par les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques. Au vu de l'ensemble de ces résultats, nous pouvons conclure que les cellules NK de sujets allergiques sont attirées et activées par CCL18 de façon similaire aux cellules NK de sujets non allergiques. En résumé, ces travaux ont permis de montrer que, dans un modèle murin d'asthme allergique, les cellules NK s'accumulent dans les ganglions médiastinaux et semblent réguler l'éosinophilie pulmonaire. Nous avons également montré que les cellules NK de sujets allergiques ne présentaient pas de dysfonctionnement dans la réponse vis-à-vis de CCL18 comparativement aux sujets non-allergiques.

The prevalence and severity of allergic diseases are increasing in western countries. Known pathophysiological mechanisms involve the induction of Th2 response by dendritic cells, leading to IgE production and inflammation. The innate immunity was recently highlighted in the control of adaptive immunity, which is antigen specific. However, the role of Natural Killer (NK) cells, innate cells mainly known for their anti-tumoral and anti-microbial functions, is still unknown in allergic pathology. Nevertheless, several studies have shown modifications of some NK cell subsets in asthmatic and allergic patients. The global aim of thesis was to study the role of NK cells in allergic asthma. Firstly, quantitative and qualitative variations of NK cells as well as the effect of NK cell depletion were analyzed in mouse models of asthma. Secondly, we compared the effect of CCL18, chemokine involved in allergic asthma, on NK cells isolated from peripheral blood of non allergic and allergic subjects. In mouse model of allergic asthma, we first used the widely described BALB/cByJ mouse model, which consists of two systemic sensitizations of ovalbumin (OVA) and alum followed by three OVA aerolized challenges. OVA sensitized and challenged mice exhibited an increased number of NK cell precursors, NK cells, and more particularly immature NK cells, as well as proliferating NK cells in mediastinal lymph nodes (lung draining lymph nodes). NK cells showed signs of recent activation, as measured by the increased expression of CD86. In lungs, NK cell numbers were not significantly modified in OVA sensitized and challenged mice compared to control mice (PBS sensitized and challenged mice). However, NK cell numbers, and more particularly most mature NK cell numbers, decreased in OVA sensitized and challenged mice. As in mediastinal lymph nodes, lung NK cells showed signs of recent activation. We then analyzed the effect of NK cell depletion on allergic airway inflammation using anti-ASGM1 antibodies. NK cell depletion led to a significant decrease of bronchoalveolar eosinophilia, but did not modify airway hyperresponsiveness and OVA-specific Ig levels (IgE, IgG2a and IgG1) in OVA sensitized and challenged mice. As NK cell depletion by anti-ASGM1 antibodies was inferior to 73%, we decided to reproduce these experiments in NKDTR mice (mice expressing Diphteria toxin in NKp46 promoter, NKp46 being expressed by all NK cells), allowing a specific and effective (>90%) NK cell depletion (Collaboration with Pr E Vivier and Dr T Walzer). As NKDTR mice are on a C57BL/6 background, we developed another model of allergic airway sensitization. C57BL/6 mice received two systemic sensitizations of OVA and alum, followed by two sets of three OVA intranasal administrations. In contrast to the previous model in BALB/cByJ mice, no modification of NK cell number and subset distribution was observed in the mediastinal lymph nodes of OVA sensitized challenged mice. However, phenotypically, NK cells were activated and surface expression of CD107a was increased indicating previous NK cell degranulation. In lungs, the percentage of the most mature NK cells decreased in OVA sensitized and challenged mice. Lung NK cells were also activated and surface expression of CD107a increased, whilst the percentage of IFN-g expressing NK cells decreased. Concerning CCL18 chemokine, this latter is preferentially produced in lungs. In our laboratory, it was shown that CCL18 production was increased in asthmatic patients and that this chemokine recruited Th2 lymphocytes and basophils, suggesting a role of this chemokine in allergic asthma. Our objective was to evaluate the response to CCL18 of NK cells isolated from peripheral blood of allergic patients and compared to that of non allergic subjects. Because the CC18 receptor is still unknown, we analyzed its expression on NK cells by the detection of biotinyled CCL18 binding. Flow cytometry study showed that some NK cells from allergic and non allergic subjects expressed CCL18 receptor. In addition, we observed that NK cells from allergic and non allergic donors migrated in response to CCL18 in a G protein-dependent manner. NK cell attraction by CCL18 was donor-dependent, but independent of the allergic status. No preferential NK cell subset attraction (CD56high or CD56low) was observed. CCL18 was also able to stimulate cytotoxicity of NK cells from allergic and non allergic donors towards Jurkat target cells. Responses were donor-dependent, but again independent of the allergic status. Finally, CCL18 did not induce cytokine production (IFN-g and TNF-a) by NK cells from allergic and non allergic donors. Altogether, we can conclude that NK cells from allergic donors may be attracted and activated by CCL18 similarly to NK cells from non allergic donors. In summary, our work showed that NK cells accumulate in mediastinal lymph nodes and seem to regulate airway eosinophilia in a murine model of allergic asthma. We also found that NK cells from allergic donors did not exhibit dysfunction in response to CCL18 compared to non allergic donors., Les maladies allergiques sont en constante augmentation tant en prévalence qu'en gravité. Les mécanismes physiopathologiques connus impliquent l'induction d'une réponse Th2 par les cellules dendritiques, conduisant à une production d'IgE et une inflammation. L'immunité innée a récemment été mise en avant dans le contrôle de l'immunité adaptative, spécifique de l'antigène. Cependant, le rôle des cellules Natural Killer (NK), cellules de l'immunité innée connues essentiellement pour leurs fonctions anti-tumorales et anti-microbiennes, est encore inconnu dans la pathologie allergique. Néanmoins, quelques études ont montré une modification de certaines sous-populations de cellules NK chez les patients asthmatiques allergiques. Le but général du travail de thèse était d'étudier le rôle des cellules NK dans l'asthme allergique. Dans un premier temps, les variations quantitatives et qualitatives des cellules NK, ainsi que l'effet de leur déplétion ont été évalués dans l'asthme expérimental. Dans un deuxième temps, l'effet de CCL18, chimiokine impliquée dans l'asthme allergique, a été étudié sur les cellules NK de sujets non allergiques et de sujets allergiques. Tout d'abord, le premier modèle murin d'asthme expérimental utilisé était celui très largement décrit chez les souris BALB/cByJ, consistant en deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de trois provocations allergéniques d'OVA par aérosols. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, une augmentation du nombre de précurseurs de cellules NK, mais également du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK immatures, a été observé dans les ganglions médiastinaux (ganglions drainant les poumons). Celle-ci était accompagnée d'une augmentation du pourcentage de cellules NK ayant incorporé du BrdU. Outre ces variations quantitatives, nous avons également montré que les cellules NK étaient activées. Dans les poumons, le nombre de cellules NK n'était pas significativement modifié chez les souris sensibilisées et challengées à l'OVA comparativement aux souris contrôle. Néanmoins, une diminution non significative du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK les plus matures chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA a été observée. De plus, comme dans les ganglions médiastinaux, les cellules NK pulmonaires étaient activées. Nous avons ensuite évalué l'effet de la déplétion des cellules NK par administration de l'anticorps anti-ASGM1 avant les provocations allergéniques sur l'inflammation pulmonaire allergique. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, la déplétion en cellules NK diminuait significativement l'éosinophilie dans les lavages bronchoalvéolaires, sans affecter pour autant l'hyperréactivité bronchique et les taux sériques d'immunoglobulines spécifiques de l'OVA (IgE, IgG2a et IgG1) (Article soumis). La déplétion des cellules NK par l'anti-ASGM1 n'étant pas totale (73%), nous avons choisi de reproduire ces expériences chez les souris NKDTR qui expriment le récepteur de la toxine diphtérique dans le promoteur du gène NKp46, permettant la déplétion spécifique et plus efficace (>90%) des cellules NK (Collaboration Pr E Vivier et Dr T Walzer). Ces souris étant de fond génétique C57BL/6, nous avons mis au point un autre modèle de sensibilisation allergique pulmonaire. Les souris ont reçu deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de deux séries de trois provocations allergéniques d'OVA par voie intranasale. Dans les ganglions médiastinaux, contrairement au modèle précédent, aucune modification du nombre de cellules NK et de la distribution des sous-populations n'a été observée chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. D'un point de vue phénotypique, chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, les cellules NK étaient activées et l'expression membranaire du CD107a augmentée témoignant ainsi d'une dégranulation. Dans les poumons, le pourcentage de cellules NK les plus matures était diminué chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. Les cellules NK pulmonaires étaient également activées et l'expression membranaire de CD107a augmentée. Le pourcentage de cellules NK exprimant l'IFN-g était diminué. Concernant CCL18, cette dernière est une chimiokine produite préférentiellement au niveau du poumon. Dans le laboratoire, il a été montré que la production de CCL18 était augmentée chez les patients asthmatiques, et qu'elle recrutait les lymphocytes Th2 et les basophiles, suggérant le rôle de cette chimiokine dans l'asthme allergique. Notre objectif était d'évaluer la réponse des cellules NK isolées du sang périphérique de sujets allergiques vis-à-vis de CCL18 et de la comparer à celle de sujets non allergiques. Le récepteur de CCL18 étant encore inconnu, nous avons analysé son expression par les cellules NK par la fixation de CCL18 biotinylé. L'étude en cytométrie en flux a révélé que des cellules NK de donneurs allergiques et non allergiques exprimaient un récepteur pour CCL18. De plus, nous avons montré que les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques migraient en réponse à CCL18, et ce dans une voie dépendante des protéines G. L'attraction des cellules NK par CCL18 était dépendante du donneur, mais indépendante du statut allergique. Aucune attraction préférentielle d'une sous-population de cellules NK (CD56hi ou CD56lo) par CCL18 n'a été mise en évidence. CCL18 était également capable de stimuler la cytotoxicité des cellules NK de sujets allergiques et de donneurs non allergiques, vis-à-vis des cellules cibles Jurkat. Les réponses étaient variables en fonction du donneur, mais une fois encore étaient indépendantes du statut allergique. Enfin, CCL18 n'induisait pas de production de cytokines (IFN-g et TNF-a) par les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques. Au vu de l'ensemble de ces résultats, nous pouvons conclure que les cellules NK de sujets allergiques sont attirées et activées par CCL18 de façon similaire aux cellules NK de sujets non allergiques. En résumé, ces travaux ont permis de montrer que, dans un modèle murin d'asthme allergique, les cellules NK s'accumulent dans les ganglions médiastinaux et semblent réguler l'éosinophilie pulmonaire. Nous avons également montré que les cellules NK de sujets allergiques ne présentaient pas de dysfonctionnement dans la réponse vis-à-vis de CCL18 comparativement aux sujets non-allergiques.