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G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies., Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies.

Antibiotics use against bacterial infections has led to the emergence of resistance. Understanding the mechanisms underlying resistance to antibiotics is critical to fight against these pathogens. This thesis presents a structural study of a multidrug efflux pump in Pseudomonas aeruginosa, composed of a transporter MexB, an exit duct OprM and an adaptor protein MexA. The proteins reconstituted in nanodiscs allowed tripartite complex formation in vitro. Optimization of yield led to the identification of key parameters governing complex assembly. Structural cryo-EM study revealed a 30 nm long complex in a resting state. The study of membrane protein stabilization by nanodisks led to the development of a minimal system devoid of lipids. This system showed a lipid phase around MexB is required for complex formation., L'utilisation d'antibiotiques pour lutter contre les infections bactériennes a favorisé l'émergence de souches résistantes. Comprendre les mécanismes de résistance est crucial pour lutter contre ces pathogènes. Cette thèse propose une étude structurale d'une pompe à efflux multidrogues de Pseudomonas aeruginosa qui se compose d'un transporteur MexB, d'une protéine canal OprM et d'une protéine adaptateur MexA. Les partenaires du complexe tripartite stabilisés en nanodisques ont permis la formation du complexe in vitro. L'optimisation des conditions de production du complexe a permis de cribler les différents paramètres régissant son assemblage. L'étude structurale par cryo-ME révèle un complexe de 30 nm de long en conformation de repos. L'étude de la stabilisation des protéines membranaires par nanodisques a conduit au développement d'un système minimal, débarrassé des lipides. Ce système minimal a révélé la nécessité d'une phase lipidique autour de MexB pour l'assemblage du complexe.

Antibiotics use against bacterial infections has led to the emergence of resistance. Understanding the mechanisms underlying resistance to antibiotics is critical to fight against these pathogens. This thesis presents a structural study of a multidrug efflux pump in Pseudomonas aeruginosa, composed of a transporter MexB, an exit duct OprM and an adaptor protein MexA. The proteins reconstituted in nanodiscs allowed tripartite complex formation in vitro. Optimization of yield led to the identification of key parameters governing complex assembly. Structural cryo-EM study revealed a 30 nm long complex in a resting state. The study of membrane protein stabilization by nanodisks led to the development of a minimal system devoid of lipids. This system showed a lipid phase around MexB is required for complex formation.; L'utilisation d'antibiotiques pour lutter contre les infections bactériennes a favorisé l'émergence de souches résistantes. Comprendre les mécanismes de résistance est crucial pour lutter contre ces pathogènes. Cette thèse propose une étude structurale d'une pompe à efflux multidrogues de Pseudomonas aeruginosa qui se compose d'un transporteur MexB, d'une protéine canal OprM et d'une protéine adaptateur MexA. Les partenaires du complexe tripartite stabilisés en nanodisques ont permis la formation du complexe in vitro. L'optimisation des conditions de production du complexe a permis de cribler les différents paramètres régissant son assemblage. L'étude structurale par cryo-ME révèle un complexe de 30 nm de long en conformation de repos. L'étude de la stabilisation des protéines membranaires par nanodisques a conduit au développement d'un système minimal, débarrassé des lipides. Ce système minimal a révélé la nécessité d'une phase lipidique autour de MexB pour l'assemblage du complexe.

Membrane proteins represent around 2/3 of therapeutic targets. However, the development of new drugs is hampered by the lack of structural data for many proteins. Membrane proteins are indeed difficult to handle and to maintain stable in solution, which complicates their study by structural methods. Proteins are usually stabilized by surfactants like detergents, amphipols, hemifluorinated compounds and peptergents. It is also possible to study those proteins in an environment mimicking their native conditions by incorporating them in lipid membranes such as liposomes, bicelles or nanodiscs.Nanodiscs are self-assembled proteolipidic particles, composed of a scaffold protein and lipids. This technology is a top-notch model membrane system, which provides a detergent free environment to study membrane proteins in solution. Further advantages are the possibility to vary the lipid composition and the accessibility of the incorporated protein from both sides of the membrane.During my PhD project, I have achieved the insertion of several membrane proteins into nanodiscs for functional, biophysical and structural characterizations. In particular, we have studied Bmra, an ABC transporter involved in multidrug resistance and tried to identify the conformational changes of the protein in nanodiscs by electron microscopy. The interaction of YedZ, a NADPH oxidase homologue, with potential soluble partners has been studied by various methods such as cross-linking, surface plasmon resonance and native mass spectrometry. In parallel, the mechanism of nanodiscs assembly has been investigated. An interaction between the scaffold protein and divalent cations has been revealed. This interaction influences the oligomerization of the scaffold protein but also the nanodiscs homogeneity. Those observations allowed us to improve the preparation of the nanodiscs, which was an essential step torward the success of many structural approaches. In particular, we were able to explore their accessibility to protein crystallography., Les protéines membranaires représentent environ 2/3 des cibles thérapeutiques. Le développement de nouveaux médicaments est toutefois limité par l'absence de données structurales pour de nombreuses protéines. Les protéines membranaires s'avèrent en effet difficiles à manipuler et à maintenir en solution ce qui complique leur étude structurale. Les protéines sont en général solubilisées grâce à des surfactants comme les détergents, les amphipols, les hémifluorés et les peptergents. Il est aussi possible de les étudier dans des conditions plus physiologiques en les insérant dans des membranes lipidiques telles que des liposomes, des bicelles, ou des nanodisques.Les nanodisques sont des particules protéolipidiques autoassemblées, composées de protéines d'assemblages et de lipides, qui constituent un système de membranes modèles très prometteur permettant de solubiliser des protéines membranaires dans un milieu dépourvu de détergent. D'autres avantages sont aussi la variabilité de la constitution en lipides et l'accessibilité des deux côtés de la membrane.Dans le cadre de ma thèse, j'ai mis au point l'insertion de plusieurs protéines membranaires en nanodisques afin de permettre leur caractérisation fonctionnelle, biophysique et structurale. Nous avons en particulier étudié le transporteur ABC BmrA impliqué dans la résistance aux antibiotiques et cherché à identifier les changements conformationnels de la protéine en nanodisques par microscopie électronique. Les interactions de la protéine YedZ, un homologue de NADPH oxydases, avec ses partenaires solubles potentiels ont été étudiés par différentes méthodes telles que le pontage chimique, la résonance plasmonique de surface et la spectrométrie de masse native. En parallèle, le mécanisme d'assemblage des nanodisques a été investigué. Une interaction entre les protéines d'assemblages et des cations divalents a été mise en évidence. Cette interaction a un effet sur l'oligomérisation de la protéine d'assemblage mais également sur l'homogénéité des nanodisques. Ces observations nous ont permis d'améliorer les conditions de préparation des nanodisques, condition déterminante pour le succès de nombreuses approches structurales. Nous avons pu en particulier explorer la possibilité de cristalliser ces particules en vue d'études cristallographiques.