Search

Most of the active pharmaceutical ingredients (API) can exist, in the solid state, under several crystalline phases (polymorphs, solvates, cocristals…). These phases have different physicochemical properties, which can affect the drug efficacy and its manufacturing process. In the pharmaceutical industry, a solid-state screening is thus carried out in the early stages of a drug development, to identify the existing phases and choose the one to develop. At this step, only a small amount of raw material is available, reducing the number of experiments. Droplet microfluidics is used to reduce the crystallization volumes to nanoliter scale, and thus the amount of product. This makes it possible to increase the number of experiments, bringing a statistical approach to address the stochasticity of nucleation.This thesis presents the development of a modular microfluidic platform, easy to use and compatible with most solvents, for solid-state screening of active pharmaceutical ingredients and fundamental nucleation studies. It enables to generate saturated solutions and droplets starting from powder and their characterization, to measure solubility, to crystallize API by cooling or non-solvent addition processes and to monitor nucleation in time and as a function of the temperature to establish global statistics on nucleation (all phases included). Lastly, the different phases are identified in situ by Raman spectroscopy to perform phase to phase statistics.; La plupart des principes actifs pharmaceutiques peuvent exister à l’état solide sous différentes phases cristallines (polymorphes, solvates, cocristaux…). Celles-ci ont des propriétés physico-chimiques différentes, pouvant affecter l’efficacité d’un médicament, ainsi que son procédé de fabrication. Dans l’industrie pharmaceutique, un criblage de l’état solide a donc lieu dès les premières étapes du développement d’un médicament, afin d’identifier les phases existantes et choisir celle qui sera développée. A ce stade du développement, seulement une petite quantité de produit est disponible, limitant ainsi le nombre de tests réalisés. La microfluidique à base de gouttes permet de réduire les volumes de cristallisation à quelques nL, et donc les quantités de matière nécessaires. Il est ainsi possible de multiplier les expériences, apportant un point de vue statistique afin de répondre à la stochasticité du phénomène de nucléation.Cette thèse présente le développement d’une plateforme microfluidique modulable utilisant des composants compatibles avec la majorité des solvants et facile d’utilisation, pour le criblage de l’état solide de molécules pharmaceutiques et des études fondamentales sur la nucléation. Elle permet de générer des solutions saturées et des gouttes à partir de poudre et de les caractériser, mesurer des solubilités, cristalliser des principes actifs dans les gouttes par refroidissement ou ajout d’un non-solvant et suivre la nucléation au cours du temps et de la température afin d’établir des statistiques globales de nucléation (toutes phases confondues). Enfin, les différentes phases obtenues sont caractérisées in situ par spectroscopie Raman afin d’établir des statistiques de nucléation phase par phase.

National audience; The filamentous yeast Candida albicans is a benign member of the healthy human microbiota but can also turn into an opportunistic pathogen in immunocompromised patients. The morphological plasticity of C. albicans is a major virulence factor. Hyphae i.e. elongated multi-cellular invasive filaments, and unicellular ovaloid yeasts, respectively participate toinvasion and dissemination in the tissues and bloodstream. The reversible yeast-to-hypha phenotypic switches depend on the physicochemical properties of C. albicans environment, notably pH, temperature and growth factors. C. albicans also secretes farnesol, a quorum-sensing molecule that is involved in inhibiting hyphal induction.In contrast to the impact of chemical parameters, little is known about how mechanical forces affect the growth phenotype. To this end, we have developed dedicated microfluidic devices allowing both live-cell imaging and high-throughput experiments to quantify the impact of compressive stress on the yeast-to-hypha transition. The principle of our devices isbased on the emergence of growth-induced pressure when cells proliferate in confined space.Using these devices, we observed expression of the hyphal-specific gene HWP1 under small compressive stress intensities. Yeast-to-hypha transition probability in the confined population seems modulated by the concentration of secreted farnesol and cell-division rate under pressure. To describe the local accumulation of farnesol in the dense population, wepropose a theoretical model of 1D advection-diffusion in a porous medium, based in particular on the Kozeny-Carman approximation. The results obtained suggest a significant underestimation of the hydrodynamic resistance of the porous material. This limitation opens new questions about the transport in a porous environment, composed of deformable and growing yeasts. The model predicts the temporal dynamics when advection is effective. Our results suggest that, taking inhibition into account, the efficiency of induction by pressure is as strong as a known inductive stress such as the addition of serum at 37°C.Single-cell characterization of HWP1 gene expression suggests a regulated mechanism during induction that compensates for biophysical pressure limitation. Single-cell reporter expression also showed that higher compressive stress values (hundreds of kPa) limits hyphal-growth maintenance. In contrast, observation of hyphae in a second uncompressed chamber showed that hyphal epigenetic program is maintained upon mechanical relaxation. Together, the results of this thesis suggest that growth-induced pressure promotes phenotype change in C. albicans, and that this transition is stable. These results pave the way for the investigation of the mechanical regulation of the yeast-to-hypha transition and its link with the pathogenicity of C. albicans.; La levure filamenteuse Candida albicans est un membre bénin du microbiote chez l'humain en bonne santé. Cependant, cet organisme peut devenir un pathogène opportuniste, particulièrement chez les patients immunodéprimés. La plasticité morphologique de C. albicans est un facteur majeur de sa virulence. Les hyphes, de longs filaments multicellulaires et invasifs, et les levures unicellulaires de forme ovaloïde, supportent respectivement l'invasion et la dissémination dans les tissues et le système sanguin. La transition de phénotype réversible levure-vers-hyphe dépend de multiples paramètres physico-chimiques de l'environnement de Candida, notamment le pH, la température et des facteurs de croissance. C. albicans sécrète également du farnésol, une molécule de quorum-sensing qui est impliquée dans l'inhibition de l'induction hyphale. Contrairement à l'impact des paramètres chimiques, la manière dont les for! ces mécaniques peuvent affecter le phénotype adopté reste peu renseignée. Nous avons utilisé des dispositifs microfluidiques permettant l'imagerie de cellules vivantes et des expériences à haut débit afin de quantifier l'impact de contraintes compressives sur la transition levure-hyphe. Le principe de ce dispositif repose sur l'émergence de la pression induite par la croissance des cellules sous confinement spatial. En utilisant ces dispositifs, nous avons observé l'expression d'un gène spécifique à la croissance hyphale (HWP1) sous de faibles intensités de forces compressives. La probabilité d'induction levure-hyphe dans la population confinée semble modulée par la concentration de farnésol sécrété, et par le taux de division sous pression. Pour décrire l'accumulation locale de farnésol dans la population dense, nous proposons un modèle théorique d'advection-diffusion 1D en milieu poreux reposant notamment sur l'approximation de Kozeny-Carman. Les ! résultats obtenus suggèrent une sous-estimation importante de la résistance hydrodynamique du poreux. Cette limitation ouvre de nouvelles questions sur le transport dans un poreux constitué de levures déformables et en croissance. Le modèle prédit la dynamique temporelle lorsque l'advection est efficace. Nos résultats suggèrent qu'en dehors de toute inhibition, l'efficacité d'induction par la pression est aussi forte qu'un stress inductif connu tel que l'addition de sérum à 37°C. La caractérisation de l'expression du gène HWP1 en cellule-unique suggère que la dynamique d'induction est régulée et compense la limitation biophysique de la pression. En parallèle, la maintenance du programme épigénétique hyphal semble limitée sous plus forte pression (centaine de kPa) via un ralentissement de la croissance. En revanche, la croissance hyphale est maintenue lorsque les hyphes accèdent à un second compartiment permettant la relaxation mécanique. Ensemble, ! les résultats de cette thèse suggèrent que la pression induite par l! a croissance confinée favorise le changement de phénotype chez C. albicans et que cette transition est stable. Ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles investigations sur la régulation par la mécanique de cette transition et son lien avec la pathogénicité de C. albicans.

Droplet-based microfluidics allow the study of individual samples in nanoliter-sized compartments. The possibilities offered by the manipulation of droplets have been exploited in many fields such as single-cell biology, requiring massive parallelization and individual tracking.Moreover, there is a growing interest in studying protein samples at high concentrations to better understand the effect of macromolecular crowding, or to screen the viscosity of biopharmaceuticals under various conditions. In many cases, the scarcity and cost of such proteins limit or prohibit the use of standard rheological techniques. As such, there is a pressing need to lower the required sample volumeWe have designed a specific microsystem for investigating viscous features of various hydrophilic compounds. Our experimental strategy, combining microfluidics and emulsion droplets, allows in-situ production, selection and monitoring of water droplets in a PDMS chip.Droplet shrinking causes in-chip solute concentration by a factor of 400. During the concentration process, rheological study of the sample is made possible by continuous viscosity measurements in the range of 1-1000 mPa.s, allowing full characterization of biopharmaceuticals in just one experiment and requiring as low as 1 µL of dilute solution.After introducing the fields of high-concentration protein rheology and microfluidics, this manuscript presents the design and operating ways of our chip. More specifically, the minimization of required volume through the choice of step-dropmaking is detailed, as well as the use of pervaporation-induced shrinking for solute concentration, with discussion on the technical challenges posed by those choices.Subsequently, both the concentration monitoring and multi-particle tracking microrheology techniques are introduced, with a particular interest in quantitative error estimation at each step to evaluate the global precision of the system.Various validation experiments have been conducted, using calibrated samples such as sucrose or model globular proteins such as bovine serum albumin or lysozyme. Their results are used to showcase the capabilities of our experimental system and discuss its limits.After a conclusion summarizing the aforementioned work and opening new perspectives, an appendix gathers technical information and additional data such as detailed experimental protocols., La microfluidique en gouttes permet l’étude d’échantillons individuels dans des volumes de l’ordre du nanolitre. Les possibilités de parallélisation et de suivi individuel offertes par la manipulation de micro-gouttes ont été exploitées dans de nombreux domaines, tels que l’étude de cellules uniques par exemple.Parallèlement, un effort de recherche grandissant cherche à permettre la caractérisation de solutions de protéines hautement concentrées, pour mieux comprendre les effets d’encombrement macromoléculaire par exemple, ou pour cribler le comportement visqueux de protéines thérapeutiques dans diverses conditions. La rareté et le coût des solutions de protéines restreint le plus souvent la faisabilité de ces études expérimentales, motivant le développement de techniques de caractérisation à faible volume.Nous avons conçu un dispositif microfluidique permettant la rhéologie de protéines et plus généralement de tout composé soluble dans l’eau. L’élément central de ce dispositif est une puce microfluidique permettant la production in-situ, la sélection et le suivi de gouttes individuelles.Le rétrécissement des gouttes entraîne la concentration du soluté au sein de la puce, jusqu’à un facteur 400.Pendant le processus de concentration, la viscosité au sein des gouttes est mesurée continuellement sur une large gamme accessible (1-1000 mPa.s). Ainsi, la caractérisation rhéologique complète de biopharmaceutiques est réalisable en une seule expérience, avec une consommation limitée à 1 µL de solution diluée.Le manuscrit commence par une introduction à la rhéologie des protéines et à la microfluidique.L’architecture et le fonctionnement de la puce sont ensuite détaillés. Sont notamment présentés le choix d’un émulsificateur à gradient de confinement et la réduction de volume consommé qui en découle, ainsi que le phénomène de pervaporation de l’eau permettant le rétrécissement des gouttes et la concentration des solutés. Les contraintes techniques participant à ces choix sont également discutées.Les processus permettant le suivi de la concentration et la microrhéologie par suivi vidéo de particules sont ensuite présentés. Pour chaque étape, une estimation systématique de l’erreur de mesure est réalisée, aboutissant à une estimation de la précision globale du système.Plusieurs expériences de validation ont été réalisées, étudiant des solutés au comportement visqueux connu comme le sucrose ou des protéines globulaires modèles comme l’albumine de sérum bovin ou le lysozyme. Leurs résultats sont présentés, permettant la démonstration des capacités expérimentales de notre dispositif et la discussion de ses limites.Après une conclusion synthétisant l’ensemble de ces travaux et ouvrant de nouvelles perspectives, des informations techniques et des données additionnelles sont regroupées en annexe.

Blood vessels are key elements to the treatment of many cancers. On the one hand, they form an obstacle to the effective passage of therapies from the bloodstream to solid tumors. On the other hand, they are also responsible for the formation of new vessels via angiogenesis, a process that promotes tumor development and is the target of several cancer therapies currently used in clinics. The tumor microenvironment plays an essential role in the morphology of vessels. In particular, the composition and physical properties of the extracellular matrix and perivascular cells strongly orient the physiology of endothelial cells and influence the permeability of the vascular barrier. In the context of inflammation, vascular hyperpermeability is a public health concern and is a well-known side effect of some cancer treatments.To study these vascular phenomena, we propose a new model combining microfabrication, tissue engineering and microfluidic technologies. These techniques couple 3D cell culture and perfusion approaches, making it possible to build organs-on-a-chip. We have designed vessel-on-chip devices in which an initial channel is created in a collagen-based hydrogel using a microfluidic approach that relies on the viscosity properties of collagen. This initial channel, which constitutes the future lumen of the vessel, is seeded with human primary endothelial cells which then form a confluent and cohesive monolayer, so as to reproduce the internal face of a blood vessel. This technique can be carried out once or twice and thus makes it possible to change, as required, the diameter of the final vessel and also to create a double cell layer. The integrity of the endothelial barrier was studied by evaluating the quality of the distribution of the vascular endothelial-cadherin at the level of the adherens junctions and of zona-occludens-1 for the tight junctions. On the other hand, the permeability of the endothelium was studied by setting up a videomicroscopy approach to quantify in real-time the diffusion of a fluorescent dextran through the endothelium of the vessels. The ability to activate endothelial cells by pro-inflammatory cytokines and their ability to induce the adhesion of immune cells and of cancer cells to the inner surface of the lumen of the vessels were evaluated. The biomimetic approach of this model was enriched by forming two distinct and concentric cell layers made up of endothelial cells and perivascular fibroblasts in order to more closely mimic the structure and composition of a natural blood vessel and to observe the influence of interactions between the two cell types on the permeability of vessels. The presence of perivascular fibroblasts significantly strengthens the endothelial barrier, in particular in response to thrombin. These vessels-on-a-chip are designed in a standardized multi-well plate format for use in robotic and high-throughput drug screening.Microfluidic devices are a technological turning point for answering complex biological questions. They aim to bridge the gap between overly simple 2D in vitro tests and expensive, time-consuming, species-specific animal models. We propose here a device suitable for screening molecules that modulate vascular activation and permeability, particularly in the context of anti-cancer treatments.; Les vaisseaux sanguins sont centraux pour le traitement de nombreux cancers. D’une part, ils forment un obstacle au passage efficace des thérapies de la circulation sanguine vers les tumeurs solides. D’autre part, ils sont également à l'origine de la formation de nouveaux vaisseaux via l'angiogenèse, un processus qui favorise le développement des tumeurs et qui est la cible de plusieurs thérapies anticancéreuses actuellement utilisées en clinique. Le microenvironnement tumoral joue un rôle essentiel dans la morphologie des vaisseaux. En particulier, la composition et les propriétés physiques de la matrice extracellulaire et les cellules périvasculaires orientent fortement la physiologie des cellules endothéliales et influencent la perméabilité de la barrière vasculaire. Dans le cadre de l’inflammation, l’hyperperméabilité vasculaire est un problème de santé publique et constitue un effet secondaire bien connu de certains traitements anti-cancéreux.Pour étudier ces phénomènes vasculaires, nous proposons un nouveau modèle combinant la microfabrication, l’ingénierie tissulaire et les technologies microfluidiques. Ces techniques allient les approches de culture cellulaire en 3D et de perfusion, permettant de construire des organes-sur-puce. Nous avons conçu des dispositifs de vaisseaux-sur-puce dans lesquels un canal initial est créé dans un hydrogel à base de collagène en utilisant une approche microfluidique qui repose sur les propriétés de viscosité du collagène. Ce canal initial, qui constitue la future lumière du vaisseau, est ensuite ensemencé avec des cellules endothéliales primaires humaines qui forment alors une monocouche confluente et cohésive, de manière à reproduire la face interne d'un vaisseau sanguin. Cette technique peut être réalisée une seule ou deux fois et permet ainsi de varier, à façon, le diamètre du vaisseau final et aussi de créer une double couche cellulaire. L’intégrité de la barrière endothéliale a été étudiée par l'évaluation de la qualité de la répartition de la vascular endothelial-cadherin au niveau des jonctions adhérentes et de zona-occludens-1 pour les jonctions serrées. D'autre part, la perméabilité de l’endothélium a été étudiée par la mise en place d'une approche de vidéomicroscopie pour quantifier la diffusion en temps réel d'un dextran-fluorescent à travers l'endothélium des vaisseaux. La capacité d’activation des cellules endothéliales par des cytokines pro-inflammatoires et leur capacité à induire l'adhérence de cellules immunitaires et de cellules cancéreuses à la face interne de la lumière des vaisseaux ont été évaluées. L’approche biomimétique de ce modèle a été enrichie en formant deux couches cellulaires distinctes et concentriques constituées de cellules endothéliales et de fibroblastes périvasculaires afin d'approcher encore plus fidèlement la structure et la composition d'un vaisseau sanguin naturel et d'observer l’influence des interactions entre les deux types cellulaires sur la perméabilité des vaisseaux. Ainsi, la présence de fibroblastes périvasculaires renforce significativement la barrière endothéliale, notamment en réponse à la thrombine. Ces vaisseaux-sur-puce sont conçus dans un format standardisé de plaque multi-puits dans le but d'être utilisés pour le criblage robotisé et à haut débit de médicaments.Les dispositifs microfluidiques sont un tournant technologique pour répondre à des questions biologiques complexes. Ils visent à combler le fossé entre des tests 2D in vitro trop simples et des modèles animaux coûteux, chronophages et spécifiques aux espèces. Nous proposons ici un dispositif adapté au criblage de molécules effectrices de l’activation et de la perméabilité vasculaire, notamment dans le cadre des traitements anti-cancéreux.

The capture of objects on a solid surface in a laminar flow is involved in many applications, notably in bionanalysis and biological research. Studied since the beginning of the 20th century, this capture involves three mechanisms: convection of the object by the liquid above the capture surface, diffusion of the object towards this surface and finally reaction kinetics at the surface. Until now, the capture models present in he literature are designed for continuously injected molecules. However, many common situations in biotechnology do not correspond to this case. They involve, for example, more complex objects (nano/microparticles, deformable objects,...) or objects injected as small plugs. The objective of this thesis is, thanks to experiments, numerical simulations, and theoretical models, to propose new capture laws adapted to these common situations of modern bioanalysis. It will be shown that three phenomena must respectively be taken into account in these new capture laws in order to understand the specificity of each of these situations: the inertial lift effect (for particles), the elastic lift effect (for deformable objects) and the Taylor-Aris dispersion for small volume samples), La capture d’objets sur une surface solide dans un écoulement laminaire est impliquée dans de nombreuses applications, notamment en bioanalyse et en recherche biologique. Etudié depuis le début du 20ème siècle, cette capture fait intervenir trois mécanismes : convection de l’objet par le liquide au-dessus de la surface captatrice, diffusion de l’objet vers cette surface et enfin cinétique de réaction à la surface. Jusqu'à présent, les modèles de capture présents dans la littérature sont conçus pour des molécules injectées en continu. Or, de nombreuses situations courantes en biotechnologie ne correspondent pas à ce cas de figure. Elles mettent en jeu, par exemple, des objets plus complexes (nano/microparticules, objets déformables, …) ou injectés sous forme de bouchons de faibles volumes. L’objectif de cette thèse est, grâce à des expériences, des simulations numériques, et des modèles théoriques, de proposer de nouvelles lois de captures adaptées à ces situations courantes de la bioanalyse moderne. On montrera notamment que trois phénomènes doivent respectivement être pris en compte dans ces nouvelles lois de capture pour comprendre la spécificité de chacune de ces situations : l’effet de lift inertiel (pour les particules), l’effet de lift élastique (pour les objets déformables) et la dispersion de Taylor-Aris (pour les échantillons de faibles volumes).

The transport properties of a suspension of motile bacteria under flow are a fundamental scientific issue in order to understand the colonisation of new environments by microorganisms. Numerous studies report the singular behaviour of these active suspensions in flow. Accumulation at the walls, collective motion, modification of the rheological behaviour are all phenomena that reveal the richness of these systems. Nevertheless, many questions remain. In this thesis, we present the effect of a flow on the transport of a suspension of motile Escherichia coli bacteria in confined geometries. Experiments were carried out in a Hele-Shaw cell to understand the influence of flow and confinement Peclet numbers on the transport of the suspension in a Poiseuille flow. The swimming properties of E. coli were characterised in a fluid at rest using two non-intrusive optical techniques: tracking and differential dynamic microscopy. In flow, these properties are strongly dependent on shear. Rheotaxis effect has been pointed out at the vicinity of a surface and favours upstream swimming; upstream migration also found in the bulk. We also show that confinement of the suspension influences the thickness of the boundary layer and, with the intensity of the flow, modifie the distribution of bacteria through the Hele-Shaw cell., Les propriétés de transport d'une suspension de bactéries motiles sous écoulement présentent un enjeu scientifique fondamental dans la compréhension de la colonisation de nouveaux milieux par ces microorganismes. De nombreuses études font part du comportement singulier de ces suspensions actives en écoulement. L'accumulation aux parois, les comportements collectifs, la modification du comportement rhéologique sont d'autant de phénomènes qui révèlent la richesse de ces systèmes. Malgré tout, de nombreuses questions subsistent. Dans ce travail de thèse, nous présentons l'effet d'un écoulement sur le transport d'une suspension de bactéries Escherichia coli motiles en milieu confiné. Des expériences ont été menées en cellule de Hele-Shaw pour comprendre l'influence du Péclet hydrodynamique et du Péclet de confinement sur le transport de la suspension en écoulement de Poiseuille. Les propriétés de nage d'E. coli ont été caractérisées dans un fluide à l'équilibre par deux techniques optiques de mesures non-intrusives : le tracking et la microscopie dynamique différentielle. En écoulement, ces propriétés se voient être fortement modifiées et dépendantes du cisaillement. L'effet de rhéotaxie a été mis en évidence et favorise la migration bactérienne à contre-courant aux parois ; migration retrouvée également loin des surfaces. Nous montrons également que le confinement de la suspension influe sur l'épaisseur de la couche limite qui, couplé à l'intensité de l'écoulement, modifient la distribution en bactéries dans la cellule de Hele-Shaw.

Since the 2000s, the demand for reliable and portable biological and chemical analysis tools has increased in several areas (health, environment, agrifood, etc.). To meet this demand, miniaturized analysis tools, written "lab-on-a-chip" have been developed, in particular on a technical level, over the past decade. However, large-scale industrial developments in lab-on-chips have yet to be discovered and exploited. This thesis tries to give an answer to the industrial development of labs-on-chip. Our basic postulate is a mimetic of the development of microelectronics. Indeed, it has been dazzling over the past 50 years thanks to the separation of the skills of manufacturing technology and those of modeling. This separation allowed the free creation of industries specializing in either manufacturing or modeling without interdependence with each other. The aim of this thesis was to develop different simulation tools for labs on chips compatible with an electronic simulation environment. We have been able to develop different approaches at different levels of abstractions in order to allow greater freedom of response to the simulation of a laboratory on a chip., Depuis les années 2000 la demande en outils d’analyses biologiques et chimiques, fiables et portatifs a augmenté dans plusieurs domaines (santé, environnement, agroalimentaire, …). Pour répondre à cette demande, des outils d’analyses miniaturisés, appelés « laboratoires sur puces » se sont développés en particulier sur le plan technique au cours de la dernière décennie. Cependant, les développements industriels à grande échelle des laboratoires sur puces restent encore à découvrir et à être exploités. Cette thèse essaie de donner une réponse au développement industriel des laboratoires sur puce. Notre postulat de base est un mimétique du développement de la microélectronique. En effet, celui-ci a été fulgurant ces 50 dernières années grâce à la séparation des compétences de technologie de fabrication et de celles de modélisation. Cette séparation a permis la libre création d’industries spécialisées soit dans la fabrication, soit dans la modélisation sans interdépendance l’une avec l’autre. Le but de cette thèse a été de développer différents outils de simulation pour les laboratoires sur puces compatibles avec un environnement de simulation électronique. Nous avons pu développer différentes approches à des niveaux d’abstractions différents afin de permettre une plus grande liberté de réponse à la simulation d’un laboratoire sur puce.

International audience; La réaction en chaine par polymérase (PCR), méthode de référence pour la mesure d'acides nucléiques ADN en biologie clinique, est basée sur une amplification chimique du nombre des copies d'une ou plusieurs séquences ADN pour pouvoir les amener à un seuil détectable. Bien que robuste, la méthodologie PCR présente l'inconvénient majeur d'être inadaptée pour la biologie d'urgence car le rendu d'un résultat (préparation, extraction, amplification et quantification) peut atteindre entre 4 et 6 heures. L'autre inconvénient, dans le cas des séquences ARN, est une étape supplémentaire de transcription inverse (RT) (ARN en ADN), étape délicate rallongeant encore le temps du protocole. Enfin, la technologie PCR est très consommatrice en énergie à cause des systèmes de régulation nécessaires pour les cycles de températures jusqu'à 95 °C. Cet article présente la preuve de concept d'un nouveau procédé couplant l'hyperthermie magnétique et la détection électrochimique (HDE) en microfluidique pour le relargage et la détection directe en moins de 3 h, à un seuil de détection de 10-18 M, d'un microARN synthétique et spécifique des lésions du foie (miR 122). L'objectif est d'aboutir à une sorte de biopsie microfluidique liquide rapide (1 h 30) pour le diagnostic d'urgence. Mots-clés Microfluidique, électrochimie, hyperthermie, nanoparticules magnétiques, acides nucléiques, PCR.

International audience; La réaction en chaine par polymérase (PCR), méthode de référence pour la mesure d'acides nucléiques ADN en biologie clinique, est basée sur une amplification chimique du nombre des copies d'une ou plusieurs séquences ADN pour pouvoir les amener à un seuil détectable. Bien que robuste, la méthodologie PCR présente l'inconvénient majeur d'être inadaptée pour la biologie d'urgence car le rendu d'un résultat (préparation, extraction, amplification et quantification) peut atteindre entre 4 et 6 heures. L'autre inconvénient, dans le cas des séquences ARN, est une étape supplémentaire de transcription inverse (RT) (ARN en ADN), étape délicate rallongeant encore le temps du protocole. Enfin, la technologie PCR est très consommatrice en énergie à cause des systèmes de régulation nécessaires pour les cycles de températures jusqu'à 95 °C. Cet article présente la preuve de concept d'un nouveau procédé couplant l'hyperthermie magnétique et la détection électrochimique (HDE) en microfluidique pour le relargage et la détection directe en moins de 3 h, à un seuil de détection de 10-18 M, d'un microARN synthétique et spécifique des lésions du foie (miR 122). L'objectif est d'aboutir à une sorte de biopsie microfluidique liquide rapide (1 h 30) pour le diagnostic d'urgence. Mots-clés Microfluidique, électrochimie, hyperthermie, nanoparticules magnétiques, acides nucléiques, PCR.

Characterizing colloidal dispersions according to their concentration in colloids in a minimum of time is the heart of this thesis project. To reach this goal, measurements of the osmotic pressure of the dispersions, i.e. their resistance to concentration, can be carried out at different concentrations and for various experimental conditions (pH, salts concentration etc.). The common use of dialysis sacks allows such measurements, but with major drawbacks: these so-called "osmotic compression" experiments require weeks to reach the equilibrium and they cannot be in-situ monitored. Therefore, the aim of this work is to implement high throughput osmotic compression experiments, which also allow in-situ observations of the studied colloidal system.To do so, the microfluidic scale seems to be particularly smart. Following the ultra-fast prototyping of PEG-diacrylate-based devices, the issue is to integrate nanoporous membranes inside the channels by photopolymerization of a PEGDA-based hydrogel. The microfluidic chip is then turned into a “membrane micro-osmometer”. Thus, measurements of the osmotic pressure of the dispersions and in-situ observations whenever during the experiment and wherever in the system are then possible, using a simple optical microscope.Thanks to this technology, the equation of state of a colloidal dispersion, i.e. the evolution of its osmotic pressure as a function of its concentration, but also a great deal of information on the physico-chemical state of the particles or on their structural organization during the compression can be obtained, in just a few hours, paving the way to high throughput screening of complex fluids., Caractériser les dispersions colloïdales en fonction de leur concentration en colloïdes en un minimum de temps constitue le cœur du sujet de cette thèse. Pour y parvenir, des mesures de la pression osmotique des dispersions, c’est-à-dire de leur résistance à la compression, peuvent être réalisées à différentes concentrations et pour diverses conditions expérimentales (salinité, pH etc.). L’utilisation classique de sacs de dialyse permet de telles mesures, mais, inconvénients majeurs, ces expériences dites « de compression osmotique » nécessitent des semaines d’équilibrage et ne peuvent pas être suivies in-situ. Le but de ces travaux consiste donc à mettre en œuvre des expériences de compression osmotique à haut débit, permettant également d’observer in-situ le système colloïdal à l’étude.Pour se faire, l’échelle microfluidique (10-100 µm) apparaît comme pertinente. A la suite du prototypage ultra-rapide de dispositifs fabriqués en PEG-diacrylate, l’enjeu est d’y intégrer des membranes nanoporeuses par photopolymérisation in-situ d’un hydrogel de PEGDA. La puce microfluidique ainsi transformée en un « micro-osmomètre à membrane », mesures de la pression osmotique des dispersions et observations in-situ à tout instant de l’expérience et en tout point du système sont alors possibles, à l’aide d’un simple microscope optique.Grâce à cette technologie, l’équation d’état d’une dispersion colloïdale, c’est-à-dire l’évolution de sa pression osmotique en fonction de sa concentration, mais également nombre d’informations sur l’état physico-chimique des particules ou encore sur leur organisation structurale pendant la compression peuvent être obtenues, en seulement quelques heures, ouvrant ainsi la voie à un criblage rapide de divers fluides complexes.

Currently, a high number of drug candidates fail to obtain their marketing authorization or are withdrawn afterwards. This is mostly due to their side effects on the liver, which is the main organ responsible for drug metabolism, that have not been detected by animal testing. The pharmaceutical industry therefore needs new preclinical tools, in order to detect, as early as possible, the potential hepatotoxicity of newly developed molecules. Innovative microsystems providing more physiological conditions for cell culture, including flow generation, have been developed worldwide. However, they do not reproduce all the specificities of the liver, and not least the Hering channel, which is the transition area between hepatocytes, producing the bile, and cholangiocytes, draining it inside bile ducts. Thus, the main goal of this thesis was the development of a new microfluidic system mimicking this structure in vitro. The HepaRG cell line and cells derived from human induced pluripotent stem cells were used. This project was a collaboration between d’Alembert Institute at ENS Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette), and the UMR-S 1193 INSERM group, at Paul Brousse hospital (Villejuif). We demonstrated that our systems were reproducing certain liver functions and were therefore promising tools for drug toxicity assessment., Actuellement, un grand nombre de médicaments développés échouent à obtenir leur autorisation de mise sur le marché ou se la voient retirer. Les causes en sont majoritairement leurs effets secondaires sur le foie, principal organe responsable de leur métabolisation, non détectés par les tests chez l’animal. C’est pourquoi l’industrie pharmaceutique a besoin de nouveaux outils précliniques, afin de détecter le plus tôt possible la potentielle hépatotoxicité des nouvelles molécules thérapeutiques. Des microsystèmes innovants, offrant aux cellules des conditions de culture de plus en plus physiologiques en les soumettant à un flux, sont développés. Cependant, certains aspects du foie n’ont jamais été reproduits dans ces systèmes : c’est le cas du canal de Hering, zone de transition entre les hépatocytes, sécrétant la bile au sein des canalicules, et les cholangiocytes, bordant les canaux biliaires et chargés de l’évacuer. Ainsi, l’objectif de cette thèse était d’élaborer un modèle de puce microfluidique permettant de reproduire cette structure in vitro. La lignée cellulaire HepaRG, puis des cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines, ont été utilisées. Ce projet s’est déroulé en collaboration entre les équipes de l’institut d’Alembert à l’ENS Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette) et de l’UMR_S 1193 de l’INSERM, à l’hôpital Paul Brousse (Villejuif). Nous avons montré que ces nouveaux systèmes permettaient de reproduire certaines fonctions hépatocytaires, en faisant ainsi des outils prometteurs pour l’analyse de la toxicité de médicaments.

This thesis focuses on the localization of moving subcentimetric objects. The growing interest in this topic comes with the development of the field of mobile microrobotics. Indeed, many untethered miniature robots are considered for in vivo medical applications. In parallel, microrobotic techniques are also being studied for various in vitro operations at the level of single biological cells. However, these precise operations imply to guarantee the positioning of the manipulated entities. Access to positional information is therefore essential for these applications of microrobotics in the biomedical domain.To address this need, this thesis proposes innovative localization methods exploiting the electrical impedance variations induced by the presence of the object of interest between several electrodes. Electrical impedance tomography is an emerging medical imaging method that was used to reconstruct a map of the entire workspace of a mobile small-scale robot. Magnetic microrobots moving in this space can be identified on this map and tracked during their motion. In a microfluidic environment, using a system with fewer electrodes, thus giving access to fewer impedance measurements, microparticles moving at high speed can also be localized over time. Without mapping the entire sensing volume, a state observation method (the extended Kalman filter) was used to estimate the position of the particles by combining a known model of their motion with the obtained impedance measurements.As a result, this thesis shows by various methods that the exploitation of impedance variations induced by the presence of a subcentimetric object between several electrodes can be used to determine its position., Cette thèse s'intéresse à la localisation d'objets subcentimétriques en mouvement. L'intérêt croissant pour ce sujet provient de l'émergence du champ de la microrobotique mobile. En effet, de nombreux robots miniatures à actionnement sans contact sont envisagés pour des applications médicales in vivo. De plus, des techniques microrobotiques sont également à l'étude pour des opérations in vitro variées à l'échelle d'une cellule biologique unique. Toutefois, l'exécution précise de ces opérations implique de garantir le positionnement des entités manipulées. L'accès à une information de position est donc essentiel pour ces applications de la microrobotique dans le domaine biomédical.Pour répondre à ce besoin, cette thèse propose des méthodes de localisation innovantes basées sur des mesures d’impédance électrique. La méthode de la tomographie d'impédance électrique a été utilisée pour reconstruire une cartographie de la totalité d'un espace de travail. Des microrobots magnétiques se déplaçant dans cet espace ont pu être identifiés sur cette cartographie et suivis au cours de leurs mouvements. En milieu microfluidique, dans un système comportant moins d'électrodes, donnant donc accès à moins de mesures d'impédance, des microparticules se déplaçant à haute vitesse ont également pu être localisées au cours du temps. Sans cartographier la totalité de l'espace de travail, une méthode d'observation d'état (le filtre de Kalman étendu) a permis de combiner un modèle connu du déplacement des particules avec les mesures d'impédance réalisées pour estimer leur position.Ainsi, cette thèse montre par différents procédés que l’exploitation des variations d’impédance induites par la présence d’un objet subcentimétrique entre plusieurs électrodes peut permettre de déterminer la position de celui-ci.

End-stage lung diseases may result in death either by oxygenation and carbon dioxide exchange insufficiency or by right heart failure. Concerning the therapeutic options currently available, macroscopic blood oxygenators based on extracorporeal membrane (ECMO) technology are currently used. However, the environment of an intensive care unit is still required. Modern oxygenators need to be exchanged within a couple of weeks because of clotting.In this context, the goal of my PhD was the development of a novel microfluidic device for blood oxygenation, which exhibits a large surface area of gas exchange and can support long-term sustainable endothelialization of blood microcapillaries enhancing its hemo-compatibility for clinical applications. Numerical calculations based on the gas exchange model of Potkay et al. helped to best size the three-layer "blood microcapillary / membrane / gas microchannel" system.I then developed a microfabrication protocol that allows the integration of a thin polymer membrane with a very large surface area, producing robust sealed oxygenators.The gas exchange performances achieved with venous pig blood are remarkable both for unit trilayers, and for stacked structures with a low reduced injection volume, high oxygenation (379 ml O2 / min / m²) at a flow rate high (15 ml/min). These experimental results could be compared to numerical calculations. Finally, with an optimized geometry minimizing shear stress, a sustainable endothelialization protocol in blood capillaries has been proposed.; Le poumon est un organe vital dont les pathologies au stade terminal peuvent induire une insuffisance circulatoire avec une défaillance cardiaque droite secondaire. Concernant les options thérapeutiques disponibles, des oxygénateurs sanguins macroscopiques basés sur la technologie des membranes extracorporelles (ECMO) sont actuellement utilisés au sein d'une unité de soins intensifs. Ces oxygénateurs doivent être remplacés en quelques semaines en raison de la coagulation dans le système.Dans ce contexte, le but de mon doctorat était de développer un dispositif microfluidique pour l'oxygénation du sang, qui présente une grande surface d'échange gazeux et capable de soutenir une endothélialisation durable à long terme des microcapillaires sanguins améliorant son hémocompatibilité pour les applications cliniques.Des calculs numériques basés sur le modèle d’échange gazeux de Potkay et coll. ont permisde comprendre le rôle de chaque paramètre géométrique sur l’échange gazeux et, donc, de dimensionner au mieux le système tri-couches « microcapillaire de sang / membrane / microcanal de gaz ».J’ai ensuite mis au point un protocole de microfabrication qui permet d’intégrer une membrane fine de polymère de très grande surface, et de fabriquer des oxygénateurs robustes et étanches sous pression.Les performances d’échange gazeux mesurées avec du sang veineux de cochon sont remarquables, tant pour les tri-couches unitaires que pour les structures empilées, avec un faible volume d’injection et une oxygénation élevée (379 ml O2/min/m²) à débit élevé (15ml/min). Ces résultats expérimentaux ont pu être comparés aux calculs numériques. Enfin, avec une géométrie optimisée pour minimiser la contrainte de cisaillement, un protocole d’endothélialisation durable dans les capillaires sanguins a été proposé.

Bone is a hybrid material that combines a dense and organized organic matrix of collagen fibrils and a mineral network of hydroxyapatite. The formation of this hierarchical material has often been studied biologically. How to study it from a physicochemical point of view and thus be able to reproduce the organization at the suprafibrillar scale? We propose to identify these parameters by applying in vitro constraints to the mesophases of collagen in order to control the 3D spatial arrangement of the oriented domains. Microfluidic chambers mimicking compact bone and emulsion methods mimicking the cancellous bone-bone marrow interaction were used. These models made it possible to highlight the involvement, in particular, of confinement, collagen flow and network geometry in the resulting fibrillar organization. Microscopy techniques reveal that these biological organizations result from the texturization of collagen mesophases on a macroscopic scale through the observation of defects inherent in the geometry of the tissues. This study opens up perspectives in the understanding of the physicochemical mechanisms and the organization of in vivo anisotropic domains involved in morphogenesis and biomineralization. It opens up prospects for tissue engineering to repair larger defects and promote osteoinduction.; L’os est un matériau hybride qui associe une trame organique dense et organisée de fibrilles de collagène et un réseau minéral d’hydroxyapatite. La formation de ce matériau hiérarchisé a été souvent étudié biologiquement. Comment l'étudier d’un point de vue physico-chimique et ainsi pouvoir reproduire l’organisation à l’échelle suprafibrillaire ? Nous proposons d’identifier ces paramètres en appliquant in vitro des contraintes aux mésophases du collagène afin de contrôler l’arrangement spatial 3D des domaines orientés. Des chambres microfluidiques mimant l’os compact et des procédés d’émulsion mimant l’interaction os spongieux-moelle osseuse ont été utilisés. Ces modèles ont permis de mettre en évidence l’implication, notamment, du confinement, du flux en collagène et de la géométrie du réseau dans l’organisation fibrillaire résultante. Les techniques de microscopies révèlent que ces organisations biologiques sont issues de la texturisation des mésophases du collagène à l’échelle macroscopique grâce à l’observation de défauts inhérents à la géométrie des tissus. Cette étude ouvre des perspectives dans la compréhension des mécanismes physico-chimiques et l’organisation des domaines anisotropes in vivo intervenant dans la morphogénèse et la biominéralisation. Elle ouvre des perspectives pour l’ingénierie tissulaire afin de réparer de larges défauts et favoriser l’ostéoinduction.

This thesis, motivated by the industrial challenges of the understanding of the mecanisms of enhanced oil recovery, sheds new light on the more fondamental problem of the transport of suspensions inconfined environments. Our goal is to understand how the interplays between structure, drive anddisorder shape the large-scale dynamics of driven two dimensional suspensions. By developing microfluidic model experiments, we adress the two following fundamental questions: the plastic depinning transition of an emulsion driven in a disordered media and the melting transition of cristalline emulsions induced by hydrodynamic fluctuations.On a first hand, we demonstrate that the mobilization of an emsulsion driven through a quenched disordered environment is a critical depinning transition. The criticality of the transition emerges fromthe interplay between the contact interactions and the focusing of the hydrodynamic drive in the mobilization pattern that takes the shape of a smectic river network. This transition shares common features with classical depinning transitions observed in systems such as Abrikosov vortex lattices orcharged colloïds in two dimensions. But it also displays strong differences which can be explained bythe strong coupling between the hydrodynamic drive and the mobilization structure that it induceslocally.On a second hand, we investigate the melting of crystals in two dimensions. While the stability ofcrystalline phases regarding thermal fluctuations has been elucidated recently, stability regarding outof-equilibrium fluctuations remains an open question. We established the melting of crystals driven by homogeneous hydrodynamic flow. We demonstrate experimentally that the flow does not only lead toa trivial translation of the crystal. The fluctuations of the fluid velocity field induce a first-order transition between a crystal and a disordered liquid. This melting is radically different from the two-steps melting scenario of Kosterlitz, Thouless, Halperin, Nelson and Young at equilibrium. The hydrodynamic fluctuations enable the coexistence between a liquid disordered phase and a cristalline phase withtout the intermediate hexatic one.; Cette thèse, motivée par l'enjeu industriel de la compréhension des mécanismes de récupération assistée du pétrole, apporte un éclairage nouveau sur le problème plus fondamental de la dynamique de transport de suspensions en milieux confinés. Notre objectif est de comprendre comment les couplages entre structure, forçage et désordre conditionnent la dynamique grande échelle de suspensions en écoulement. En développant des expériences microfluidiques modèles, nous avons pu aborder deux questions fondamentales: la transition de dépiégeage plastique d'une émulsion transportée au sein d'un milieu désordonné et la transition de fonte d'émulsions cristallines induite parles fluctuations hydrodynamiques.Nous avons montré dans un premier temps que la mobilisation d'une émulsion au sein d'un désordre gelé est une transition critique de dépiégeage. La criticalité de cette transition émerge du couplage entre les interactions de contact et la focalisation du forçage hydrodynamique au travers du motif de mobilisation qui prend la forme d'un réseau de rivières smectique. Cette transition partage un certain nombre de caractéristiques communes avec les transitions de dépiégeage plastique observées dans les réseaux de vortex d'Abrikosov ou encore dans les dispersions colloïdales à deux dimensions. Mais elle présente aussi des différences fondamentales qui s'expliquent par le couplage intime entre le forçage hydrodynamique et la structure de mobilisation qu’il induit localement.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la fonte de cristaux en deux dimensions. Sile problème familier de la stabilité des cristaux bidimensionnels face aux fluctuations thermiques a été tranché récemment, celui de leur stabilité face à des fluctuations hors équilibre reste un problème ouvert. Nous avons mis en évidence la fonte d'émulsions cristallines forcées par des écoulements homogènes. Nous avons démontré expérimentalement que cet écoulement en apparence simple ne participe pas qu’à la translation triviale du matériau. Les fluctuations du champ de vitesse autour de l’écoulement moyen induisent une transition de phase discontinue entre solide cristallin et liquide désordonné. Ce processus de fonte est radicalement différent du scénario de fonte en deux étapes prédit par Kosterlitz, Thouless, Halperin, Nelson et Young à l’équilibre. Les fluctuations hydrodynamiques permettent la coexistence entre une phase liquide désordonnée et une phase cristalline ordonnée sans intermédiaire hexatique.

The opportunistic pathogen Candida albicans is one of the most important fungi from a clinical point of view, responsible for mucosal diseases in healthy individuals up to severe infections in immunocompromised patients. A striking property of C. albicans is its ability to grow under distinct morphological forms, from the spherical budding yeast form to long filaments called hyphae.The mechanisms of fungal invasion are still poorly understood, but they involve both penetration of hyphae through the epithelial barriers and dissemination of yeasts in the bloodstream. Therefore, the mechanical properties of the fungus appear crucial to its virulence, as well as its ability to sense its environment and respond to various constraints.We developed a microfluidic device for the measurement of bending rigidity of hyphae. Yeasts are placed in front of microchannels and grow as hyphae. Then a flow is applied to bend the filaments and the bending rigidity and Young’s modulus are computed from their deflection. We have found that the modulus of the hyphal cell wall ranges around few micronewtons.By using microfluidic devices, we can implement guidance of hyphae into microchannels of various sizes in order to probe their behavior under confinement. Surprisingly, a 2D confinement can trigger a switch from a normal straight growth to a sinusoidal growth. Studies of the characteristics of these specific trajectories and of different experimental conditions triggering them have been carried out. Helices in 3D have also been observed either in agar gel or immediately upon release of the 2D confinement. Several leads to explain this behavior are explored such as the position at the tip of the Spitzenkörper, a polarity complex in hyphae.Finally, the cell cycle progression in hyphae is quite interesting and very well regulated, but nevertheless poorly studied compared to the one in budding or fission yeasts. The use of microchannels and of various stainings (nucleus, septum, microtubules) allow a precise monitoring of the different events of the cycle, leading to a better understanding of the regulation and dynamics of cell cycle in hyphae.; Le pathogène opportuniste Candida albicans est l’un des plus importants champignons d’un point de vue clinique, responsable d’infections mucosales chez les individus sains ainsi que de sévères infections chez les patients immunodéficients. Une propriété remarquable de C. albicans est sa capacité à croître sous différentes morphologies, de la levure bourgeonnante ronde à de longs filaments appelés hyphes.Les mécanismes d’invasion fongique sont toujours faiblement compris, mais ils impliquent à la fois la pénétration des hyphes à travers les barrières épithéliales et la dissémination des levures dans la circulation sanguine. Ainsi les propriétés mécaniques de ce champignon semblent cruciales à sa virulence, et également sa capacité à percevoir son environnement et à répondre à diverses contraintes.Nous avons développé un dispositif microfluidique pour la mesure du module de flexion des hyphes. Les levures sont positionnées à l'entrée de microcanaux puis croissent sous forme hyphale. Un flux est ensuite appliqué de façon à courber les filaments, et le module de flexion ainsi que le module de Young sont calculés à partir de la déflexion. Nous avons trouvé que le module de la paroi des hyphes était de quelques micronewtons.En utilisant des puces microfluidiques, nous pouvons orienter les hyphes dans des microcanaux de différentes tailles afin d’étudier leur comportement sous confinement. De façon étonnante, un confinement 2D peut déclencher une transition d’une croissance rectiligne à une croissance sinusoïdale. Les caractéristiques de ces trajectoires spécifiques et les différentes conditions expérimentales permettant leur observation ont été étudiées. Des hélices en 3D ont également été observées dans des gels d’agar ou en relâchant la contrainte 2D. Plusieurs pistes pour expliquer ce comportement sont explorées comme la position d’un complexe de polarité à l’apex, le Spitzenkörper.Enfin, la progression du cycle cellulaire chez les hyphes est particulièrement intéressante et très bien régulée, mais pourtant très peu étudiée par rapport à celle des levures à fission ou bourgeonnantes. L’utilisation de microcanaux et de différents marquages (noyau, septum, microtubule) permet un suivi précis des différents événements du cycle, ce qui mène à une meilleure compréhension de la régulation ainsi que de la dynamique du cycle cellulaire chez les hyphes.

The opportunistic pathogen Candida albicans is one of the most important fungi from a clinical point of view, responsible for mucosal diseases in healthy individuals up to severe infections in immunocompromised patients. A striking property of C. albicans is its ability to grow under distinct morphological forms, from the spherical budding yeast form to long filaments called hyphae.The mechanisms of fungal invasion are still poorly understood, but they involve both penetration of hyphae through the epithelial barriers and dissemination of yeasts in the bloodstream. Therefore, the mechanical properties of the fungus appear crucial to its virulence, as well as its ability to sense its environment and respond to various constraints.We developed a microfluidic device for the measurement of bending rigidity of hyphae. Yeasts are placed in front of microchannels and grow as hyphae. Then a flow is applied to bend the filaments and the bending rigidity and Young’s modulus are computed from their deflection. We have found that the modulus of the hyphal cell wall ranges around few micronewtons.By using microfluidic devices, we can implement guidance of hyphae into microchannels of various sizes in order to probe their behavior under confinement. Surprisingly, a 2D confinement can trigger a switch from a normal straight growth to a sinusoidal growth. Studies of the characteristics of these specific trajectories and of different experimental conditions triggering them have been carried out. Helices in 3D have also been observed either in agar gel or immediately upon release of the 2D confinement. Several leads to explain this behavior are explored such as the position at the tip of the Spitzenkörper, a polarity complex in hyphae.Finally, the cell cycle progression in hyphae is quite interesting and very well regulated, but nevertheless poorly studied compared to the one in budding or fission yeasts. The use of microchannels and of various stainings (nucleus, septum, microtubules) allow a precise monitoring of the different events of the cycle, leading to a better understanding of the regulation and dynamics of cell cycle in hyphae.; Le pathogène opportuniste Candida albicans est l’un des plus importants champignons d’un point de vue clinique, responsable d’infections mucosales chez les individus sains ainsi que de sévères infections chez les patients immunodéficients. Une propriété remarquable de C. albicans est sa capacité à croître sous différentes morphologies, de la levure bourgeonnante ronde à de longs filaments appelés hyphes.Les mécanismes d’invasion fongique sont toujours faiblement compris, mais ils impliquent à la fois la pénétration des hyphes à travers les barrières épithéliales et la dissémination des levures dans la circulation sanguine. Ainsi les propriétés mécaniques de ce champignon semblent cruciales à sa virulence, et également sa capacité à percevoir son environnement et à répondre à diverses contraintes.Nous avons développé un dispositif microfluidique pour la mesure du module de flexion des hyphes. Les levures sont positionnées à l'entrée de microcanaux puis croissent sous forme hyphale. Un flux est ensuite appliqué de façon à courber les filaments, et le module de flexion ainsi que le module de Young sont calculés à partir de la déflexion. Nous avons trouvé que le module de la paroi des hyphes était de quelques micronewtons.En utilisant des puces microfluidiques, nous pouvons orienter les hyphes dans des microcanaux de différentes tailles afin d’étudier leur comportement sous confinement. De façon étonnante, un confinement 2D peut déclencher une transition d’une croissance rectiligne à une croissance sinusoïdale. Les caractéristiques de ces trajectoires spécifiques et les différentes conditions expérimentales permettant leur observation ont été étudiées. Des hélices en 3D ont également été observées dans des gels d’agar ou en relâchant la contrainte 2D. Plusieurs pistes pour expliquer ce comportement sont explorées comme la position d’un complexe de polarité à l’apex, le Spitzenkörper.Enfin, la progression du cycle cellulaire chez les hyphes est particulièrement intéressante et très bien régulée, mais pourtant très peu étudiée par rapport à celle des levures à fission ou bourgeonnantes. L’utilisation de microcanaux et de différents marquages (noyau, septum, microtubule) permet un suivi précis des différents événements du cycle, ce qui mène à une meilleure compréhension de la régulation ainsi que de la dynamique du cycle cellulaire chez les hyphes.

Organotypic models as human skin explants are the most complex and among the most representative of in vivo skin existing today to test the efficacy or the safety of molecules of therapeutic interest during preclinical studies. However, the loss of vascularization and lymphatic system in these models remains a major limitation in tissue homeostasis that impedes the prediction of skin responses to a treatment. In addition, exchanges of nutrients and oxygen being limited to diffusion, models lifetime is limited. Different strategies have been implemented to study and improve mass transport mechanism in such models. Microfluidics offers a great potential to control diffusion and convection mechanisms that permit molecular exchanges in skin models.The objective of this project is to develop, characterize and validate an ex vivo perfused human skin model. The purpose of this intra-tissue infusion is to promote the exchanges of nutrients, oxygen or drugs, but also to improve metabolic waste elimination.The first objective of my work consisted in implementing an intra-tissue flow in a human skin explant, and in setting up a process to maintain the perfused model in culture for several days. To this end, a porous device was implanted in the dermis of the ex vivo human skin model NativeSkin, developed by the company Genoskin. The implantable device is then connected to a microfluidic system allowing the infusion of compounds within the tissue.The second objective was to develop analysis methods of the diffusion of compounds in skin explants. Four methods have been developed: macroscopic and qualitative evaluation of the diffusion using a dye, the study of the diffusion in real time by X-ray radiography, the study of the diffusion in three dimensions by X-ray tomography, and finally the analysis of the diffusion of fluorescent dextrans of different molecular weights, on histological sections. A numerical model allowing to simulate the diffusion in the skin model has also been developed using COMSOL software, allowing to predict the diffusion profile of a compound.The third and last objective of my work was to determine perfusion parameters allowing efficient molecular exchanges of compounds in the skin explant, but without damaging the tissue. A first series of experiments (8 donors) was carried out on models perfused with a constant flow-rate (2.5 µL/min) with culture medium, for 10 days. The results showed that at the end of the culture, skin models did not show any alteration in cell viability or tissue integrity, with maintenance of cell proliferation and metabolism. However, diffusion characterization in the model demonstrated a lack of reproducibility in the experiments, with significant inter and intra-donor variability. In addition, the infusion of different molecular weights dextrans has demonstrated that the mass transport of high molecular weight compounds was limited through the implantable device. We demonstrated that the control of the fluid pressure is critical and that imposing a pulsatile injection with slight overpressures improves the efficiency and reproducibility of the molecular species delivery and collection in the explant.These results have shown the potential of the developed FlowSkin model as a new tool to study the efficacy or toxicity of intravenously administered drugs directly onto human skin. In addition, the combination of FlowSkin with perfusion of oxygen carriers offers unique opportunities to extend the lifetime and further improve the relevance of such ex vivo skin model., Les modèles organotypiques tels que les explants de peau humaine sont les modèles les plus complexes et parmi les plus représentatifs de la peau in vivo existants à ce jour pour tester l’efficacité ou l’innocuité de molécules d’intérêts thérapeutiques au stade des études pré-cliniques. Cependant, l’absence de circulation sanguine et lymphatique dans ces modèles reste une limite importante dans l’homéostasie du tissu, notamment pour prédire les réponses de la peau à un traitement. De plus, les échanges en nutriments et en oxygène n’étant possibles que par diffusion, la durée de vie de ces modèles reste limitée. Différentes stratégies ont été mises en place afin de contrôler les mécanismes de transports moléculaires au sein de tissus biologiques. La microfluidique offre un fort potentiel pour contrôler la convection et la diffusion permettant l’échange de composés dans ces modèles de peau.L’objectif de ce projet est de développer, caractériser et valider un modèle de peau humaine ex vivo perfusé. Le but de cette perfusion intra-tissulaire est de favoriser les échanges de nutriments, d’oxygène ou de médicaments, mais également d’améliorer l’élimination des déchets métaboliques.Le premier objectif de mes travaux a consisté à mettre en place un flux intra-tissulaire dans un explant de peau humaine, et à développer un procédé permettant de maintenir l’explant perfusé en culture pendant plusieurs jours. Pour cela, un dispositif poreux a été implanté dans le derme du modèle ex vivo de peau humaine NativeSkin, développé par la société Genoskin, puis relié à un système microfluidique permettant l’infusion de composés au sein du tissu.Le deuxième objectif a consisté à développer des méthodes d’analyse de la diffusion de composés dans des explants de peau. Quatre méthodes ont été développées : l’évaluation macroscopique et qualitative de la diffusion à l’aide d’un colorant, l’étude de la diffusion en temps réel par radiographie à rayons X, l’étude de la diffusion en trois dimensions par tomographie à rayons X, et enfin l’analyse de la diffusion de dextrans fluorescents de différents poids moléculaires, sur coupes histologiques. Un modèle numérique permettant de simuler la diffusion dans le modèle de peau a également été développé sur le logiciel COMSOL, permettant de prédire le profil de diffusion d’un composé.Le troisième et dernier objectif a consisté à déterminer les paramètres de perfusion permettant une bonne diffusion des composés dans l’explant de peau, sans toutefois endommager le tissu. Une première série d’expériences (8 donneurs) a été réalisée sur des modèles perfusés à flux constant (2,5µL/min) avec du milieu de culture, pendant 10 jours. Les résultats ont montré qu’à l’issue de la culture, les modèles de peau ne présentent pas d’altération de la viabilité cellulaire ni de l’intégrité du tissu, avec un maintien de la prolifération et du métabolisme cellulaire. Cependant, la caractérisation de la diffusion dans le modèle a démontré un manque de reproductibilité dans les expériences, avec d’importantes variabilités inter et intra-donneurs. De plus, la perfusion de dextrans de différents poids moléculaires a démontré que la diffusion de composés de hauts poids moléculaires était limitée. Afin de pallier ces limites, nous avons proposé une nouvelle méthode de perfusion basée sur une modulation de la pression au sein du dispositif. L’application d’une légère surpression au sein du dispositif poreux permet d’améliorer la reproductibilité et l’efficacité des échanges moléculaires au sein de l’explant.Les résultats obtenus positionnent le modèle FlowSkin ainsi développé comme un nouvel outil pertinent pour évaluer l’efficacité ou la toxicité de molécules administrées par voie intraveineuse, directement sur de la peau humaine. De plus, la perfusion de transporteurs d’oxygène via ce système pourrait permettre de prolonger la durée de vie et donc d’améliorer encore la pertinence du modèle de peau ex vivo.

Dans la recherche scientifique sur les origines de la vie, la frontière entre l’inerte et le vivant se conçoit de façon graduelle et il existe des entités ayant un degré de vie variable. Afin d’explorer cette transition, des chercheurs du Laboratoire de biochimie de l’ESPCI Paris fabriquent des prototypes de systèmes vivants supposés s’inscrire dans une progression vers la vie. Ces artefacts que l’auteur propose d’appeler protovies incarnent les conceptions de la vie de leurs créateurs et influencent en retour ces dernières par la manifestation de leurs propriétés, imbriquant processus techniques et processus vitaux. Un projet en particulier mobilise la technique de la microfluidique en gouttelettes pour mettre au point une protovie engagée dans une modélisation expérimentale de la transition de l’inerte au vivant. Par la production de gouttes d’eau microscopiques assimilées à des protocellules, les chercheurs imitent des cellules biologiques. L’établissement d’une population interconnectée de ces gouttes dans une dynamique de sélection naturelle aboutit alors à une modélisation de la vie selon les critères retenus. Au fur et à mesure des assemblages techniques, des résultats empiriques, des analyses et des discussions, les chercheurs perçoivent une élévation du degré de vie de leurs artefacts dans un exercice constant d’interprétation des propriétés émergentes du système. L’ethnographie mobilisée est l’aboutissement d’une observation participante menée par un scientifique du même laboratoire engagé dans un projet réflexif anthropologique. La recherche sur les origines de la vie et la synthèse de protovies gagnent à être resituées dans les contextes déterminants de cultures épistémologiques propres aux communautés scientifiques impliquées. In scientific research on the origins of life, the boundary between the non-living and the living is conceived as gradual and there are entities with varying degrees of aliveness. In order to explore this transition, researchers at the Laboratory of Biochemistry of ESPCI Paris are building prototypes of living systems that are supposed to progress towards life. These artefacts, which the author proposes to call protolives, embody their creators' conceptions of life and influence them in return by the manifestation of their properties, interweaving technical and vital processes. One project in particular involves the technique of droplet microfluidics to develop a protolife engaged in experimental modeling of the transition from the non-living to the living. By producing microscopic water droplets assimilated to protocells, the researchers are mimicking biological cells. The establishment of an interconnected population of these drops in a dynamic of natural selection then leads to a model of life according to the selected criteria. As the technical assemblies, empirical results, analyses and discussions progress, the researchers perceive an increase in the degree of aliveness of their artefacts in a constant exercise of interpreting the emerging properties of the system. The ethnography mobilized is the result of a participatory observation conducted by a scientist from the same laboratory engaged in an anthropological reflexive project. Research on the origins of life and the synthesis of protolives benefit from being resituated in the contexts of the determining epistemological cultures specific to the scientific communities involved.

In micro-channel gas flows, velocity slip and temperature jump must be applied at the fluid/solid interface for accounting to the thermodynamic non-equilibrium in the vicinity of the wall. In this work, simulations at the molecular scale have been carried out and show a jump in the conductive heat flux, in agreement with Malsen's work [1]., Dans les écoulements de gaz en micro-conduites, des conditions aux limites de glissement dynamique et de saut de température doivent être utilisées pour tenir compte du déséquilibre thermo-dynamique local rencontré au voisinage des interfaces fluide/solide. Dans ce travail, nous montrons par dynamique moléculaire qu'il existe également un saut dans le flux de chaleur de conduction, conformément aux travaux précurseurs de Maslen [1].

This work is included in an ANR project named CUMBA (Cellular Ultrasonic imaging Modality to assess red Blood cell Aggregation in vivo) whose purpose is to predict the aggregation of red blood cells (“RBCs”). The hyperaggregation of RBCs is a hemorheological disorder which leads to microvascular dysfunctions and venous thromboses. Moreover, RBCs may also aggregate during the organ transplantation due to the increase of inflammatory plasmatic macromolecules. The aim of the project CUMBA is to develop an ultrasonic imaging modality permitting in situ monitoring of RBC aggregation for early diagnosis of hyperaggregation. In this context, RBC-like microparticles are essential for both calibration and preliminary tests on the model. To do this, microparticles must be controlled in size and mechanical properties. In addition, the use of surfactants should be avoided for application in the ultrasound imaging device. This thesis focuses on a droplet-based microfluidic method without the addition of surfactants to prepare RBC-like microparticles. The microparticles are obtained by ionic gelation of a natural polymer, sodium alginate (Na-alginate), with calcium chloride to form a gel of calcium alginate (Ca-alginate). Gelation is studied in situ in the microfluidic system or ex situ after the collection of Na-alginate microparticles. The size, the structure and the alginate concentration of the final microparticles are studied according to the operating parameters of the microfluidic system. The microfluidic method developed throughout this thesis allows to control the size and mechanical properties of Ca-alginate microparticles while avoiding their coalescence, despite the absence of surfactants. Thus, monodispersed Ca-alginate microparticles with a Young’s modulus close to that of RBCs are obtained and the feasibility of their use for ultrasonic measurements is also shown. In addition, alternative methods explored in parallel are presented at the end of the thesis., Ce travail de thèse fait partie d’un projet ANR appelé CUMBA (Cellular Ultrasonic imaging Modality to assess red Blood cell Aggregation in vivo) qui vise à prédire l’agrégation de globules rouges (GRs). En effet, l’hyperagrégation de GRs est un trouble hémorhéologique qui cause des dysfonctions microvasculaires et des thromboses veineuses. De plus, l’hyperagrégation de GRs est liée à l’augmentation de macromolécules plasmatiques inflammatoires, comme lors d’une transplantation d’organe. Ainsi, le but du projet CUMBA est de surveiller in situ l’agrégation de GRs grâce à une modalité d’imagerie ultrasonore mise au point pour du diagnostic précoce de l’hyperagrégation. Dans ce contexte, des microparticules mimes de GRs sont indispensables pour la calibration et les premiers tests sur un modèle. Pour cela, les microparticules doivent être contrôlées en taille et en propriétés mécaniques. De plus, l’utilisation de tensioactifs est à éviter pour l’application dans le dispositif d’imagerie ultrasonore.Cette thèse porte sur une méthode microfluidique à base de gouttes et sans ajout de tensioactifs pour préparer les microparticules mimes de GRs. Les microparticules sont obtenues par gélification ionique d’un polymère naturel, l’alginate de sodium (Na-alginate), avec du chlorure de calcium pour former un gel d’alginate de calcium (Ca-alginate). La gélification est étudiée in situ dans le système microfluidique ou ex situ après la collecte de microparticules de Na-alginate. La taille, la structure et la teneur en alginate des microparticules de Na- et Ca-alginate formées sont étudiées en fonction des paramètres opératoires du montage microfluidique. La méthode microfluidique développée tout au long de cette thèse permet de contrôler la taille et les propriétés mécaniques des microparticules de Ca-alginate tout en évitant leur coalescence, malgré l’absence de tensioactifs. Ainsi, des microparticules de Ca-alginate monodisperses et présentant un module de Young proche des GRs sont obtenues et la faisabilité de leur utilisation pour des mesures ultrasonores est également montrée. Par ailleurs, des méthodes alternatives explorées en parallèle sont présentées à la fin de la thèse.

Blood is a dense suspension of red blood cells (RBCs, about 50% in volume) which are highly deformable cells whose function is oxygen transport from lungs to organs. This gas exchange function in organs involves flow in a dense and ramified capillary network where several coupled phenomena lead to a complex traffic flow (organisation of RBCs in flow, rheology, separation at bifurcations). An essential parameter of microcirculation is the transit time of RBCs in an organ, that can be a limitation to diffusion and disponibility of oxygen and lead to non-optimal desaturation before leaving the microvascular network to reach the veinous system. Depending on mechanical properties of RBCs that can be modified by pathologies, and their en concentration, their transit time can vary in large proportions, and also be quite dispersed around the mean value for the same sample : some RBCs are faster than others. The mechanisms involved are the rheology of blood (the apparent viscosity varies with confinement in capillaries and RBC rigidity), and the hydrodynamic migration dispersion of RBCs due to interactions between cells and with vessel walls. This phenomenon can be qualitatively related to the well known phenomenon of Taylor dispersion of a solute in a channel and is also known for colloidal suspensions.Numerical simulations in the host team have revealed that the dispersion of average transit velocities of RBCs in a microcirculatory network was very sensitive to the mechanical properties of cells, as well as their transverse spatial dispersion in the network. This thesis proposes to explore several aspects of RBC dispersion in different model situations. The first chapter will be dedicated to the study of the transverse migration of RBCs from the walls towards the center of the canal in a very diluted medium, in fact this phenomenon plays a very important role in the establishment of a depletion layer at the walls. The second chapter will be dedicated to the study of structuration dynamics observed in flows, the idea is to measure the evolution of the concentration profile of RBCs along a rectilinear canal after a T intersection. chapter will focus on the evolution of a bolus of RBCs in a rectilinear pseudo-2D channel, it dynamic to observe the influence of the mechanical properties of red blood cells and concentration on the dispersion of transit time.; Le sang est une suspension dense en globules rouges (GR, environ 50% du volume) qui sont des cellules très déformables, leur principal fonction est le transport de l'oxygène des poumons vers les organes. Cet échange gazeux dans les organes fait intervenir un réseau ramifié de capillaires sanguins où de nombreux phénomènes couplés créent un écoulement complexe (organisation des globules rouges dans l'écoulement, rhéologie, séparation de l'écoulement aux intersections). Un paramètre essentiel de la microcirculation est le temps de transit des GRs dans un organe, ce temps de transit est une limitation à la diffusion et à la disponibilité en oxygène et peut conduire à une désaturation non-optimal avant de quitter le réseau microcirculatoire pour rejoindre le système veineux. Suivant les propriétés mécaniques des GRs qui peuvent être modifiés par des pathologies et leur concentration, leur temps de transit peut varier dans de larges proportions, et peut ainsi être très dispersé autour de la valeur moyenne pour le même échantillon : certains GRs sont plus rapides que d'autres. Les mécanismes en jeu font intervenir la rhéologie du sang (la viscosité apparente varie en fonction du confinement des capillaires, de la rigidité des globules rouges) et la migration hydrodynamique des globules rouges due à l'interaction entre les GRs et les parois du vaisseaux. Ce phénomène de dispersion peut être qualitativement relié au phénomène connu de la dispersion de Taylor d'une solution dans un canal et est aussi connu dans le cas des suspensions colloïdales.Des simulations numériques dans l'équipe d'accueil ont montré que la dispersion moyenne de la vitesse de transit des GRs dans un réseau microcirculatoire était très sensible aux propriétés mécaniques des GRs et à leur dispersion transversale dans le réseau. Cette thèse propose ainsi d'explorer plusieurs aspects de la dispersion des globules rouges dans différentes situations modèles. Le premier chapitre sera dédié à l'étude de la migration transversale des globules rouges des parois vers le centre du canal en milieu très dilué, en effet ce phénomène joue un rôle très important dans la mise en place d'une couche de déplétion au niveau des parois. Le second chapitre sera dédié à l'étude de la dynamique de structuration observé dans les écoulements, l'idée est de mesure l'évolution du profil de concentration des globules rouges le long d'un canal rectiligne après une intersection en T. Le dernier chapitre s'intéressera à l'évolution d'un bolus de globules rouges dans un canal pseudo-2D rectiligne, ça dynamique permettre d’observer l'influence des propriétés mécaniques des globules rouges et de la concentration sur la dispersion des temps de transit.

Blood is a dense suspension of red blood cells (RBCs, about 50% in volume) which are highly deformable cells whose function is oxygen transport from lungs to organs. This gas exchange function in organs involves flow in a dense and ramified capillary network where several coupled phenomena lead to a complex traffic flow (organisation of RBCs in flow, rheology, separation at bifurcations). An essential parameter of microcirculation is the transit time of RBCs in an organ, that can be a limitation to diffusion and disponibility of oxygen and lead to non-optimal desaturation before leaving the microvascular network to reach the veinous system. Depending on mechanical properties of RBCs that can be modified by pathologies, and their en concentration, their transit time can vary in large proportions, and also be quite dispersed around the mean value for the same sample : some RBCs are faster than others. The mechanisms involved are the rheology of blood (the apparent viscosity varies with confinement in capillaries and RBC rigidity), and the hydrodynamic migration dispersion of RBCs due to interactions between cells and with vessel walls. This phenomenon can be qualitatively related to the well known phenomenon of Taylor dispersion of a solute in a channel and is also known for colloidal suspensions.Numerical simulations in the host team have revealed that the dispersion of average transit velocities of RBCs in a microcirculatory network was very sensitive to the mechanical properties of cells, as well as their transverse spatial dispersion in the network. This thesis proposes to explore several aspects of RBC dispersion in different model situations. The first chapter will be dedicated to the study of the transverse migration of RBCs from the walls towards the center of the canal in a very diluted medium, in fact this phenomenon plays a very important role in the establishment of a depletion layer at the walls. The second chapter will be dedicated to the study of structuration dynamics observed in flows, the idea is to measure the evolution of the concentration profile of RBCs along a rectilinear canal after a T intersection. chapter will focus on the evolution of a bolus of RBCs in a rectilinear pseudo-2D channel, it dynamic to observe the influence of the mechanical properties of red blood cells and concentration on the dispersion of transit time., Le sang est une suspension dense en globules rouges (GR, environ 50% du volume) qui sont des cellules très déformables, leur principal fonction est le transport de l'oxygène des poumons vers les organes. Cet échange gazeux dans les organes fait intervenir un réseau ramifié de capillaires sanguins où de nombreux phénomènes couplés créent un écoulement complexe (organisation des globules rouges dans l'écoulement, rhéologie, séparation de l'écoulement aux intersections). Un paramètre essentiel de la microcirculation est le temps de transit des GRs dans un organe, ce temps de transit est une limitation à la diffusion et à la disponibilité en oxygène et peut conduire à une désaturation non-optimal avant de quitter le réseau microcirculatoire pour rejoindre le système veineux. Suivant les propriétés mécaniques des GRs qui peuvent être modifiés par des pathologies et leur concentration, leur temps de transit peut varier dans de larges proportions, et peut ainsi être très dispersé autour de la valeur moyenne pour le même échantillon : certains GRs sont plus rapides que d'autres. Les mécanismes en jeu font intervenir la rhéologie du sang (la viscosité apparente varie en fonction du confinement des capillaires, de la rigidité des globules rouges) et la migration hydrodynamique des globules rouges due à l'interaction entre les GRs et les parois du vaisseaux. Ce phénomène de dispersion peut être qualitativement relié au phénomène connu de la dispersion de Taylor d'une solution dans un canal et est aussi connu dans le cas des suspensions colloïdales.Des simulations numériques dans l'équipe d'accueil ont montré que la dispersion moyenne de la vitesse de transit des GRs dans un réseau microcirculatoire était très sensible aux propriétés mécaniques des GRs et à leur dispersion transversale dans le réseau. Cette thèse propose ainsi d'explorer plusieurs aspects de la dispersion des globules rouges dans différentes situations modèles. Le premier chapitre sera dédié à l'étude de la migration transversale des globules rouges des parois vers le centre du canal en milieu très dilué, en effet ce phénomène joue un rôle très important dans la mise en place d'une couche de déplétion au niveau des parois. Le second chapitre sera dédié à l'étude de la dynamique de structuration observé dans les écoulements, l'idée est de mesure l'évolution du profil de concentration des globules rouges le long d'un canal rectiligne après une intersection en T. Le dernier chapitre s'intéressera à l'évolution d'un bolus de globules rouges dans un canal pseudo-2D rectiligne, ça dynamique permettre d’observer l'influence des propriétés mécaniques des globules rouges et de la concentration sur la dispersion des temps de transit.

The opportunistic pathogen Candida albicans is one of the most important fungi from a clinical point of view, responsible for mucosal diseases in healthy individuals up to severe infections in immunocompromised patients. A striking property of C. albicans is its ability to grow under distinct morphological forms, from the spherical budding yeast form to long filaments called hyphae.The mechanisms of fungal invasion are still poorly understood, but they involve both penetration of hyphae through the epithelial barriers and dissemination of yeasts in the bloodstream. Therefore, the mechanical properties of the fungus appear crucial to its virulence, as well as its ability to sense its environment and respond to various constraints.We developed a microfluidic device for the measurement of bending rigidity of hyphae.Yeasts are placed in front of microchannels and grow as hyphae.%Yeasts are first seeded and placed in front of microchannels where they are allowed to grow as hyphae, tThen a flow is applied to bend the filaments and the bending rigidity and Young’s modulus are computed from their deflection.We have found that the modulus of the hyphal cell wall ranges around ten of micronewtons.By using microfluidic devices, we can implement guidance of hyphae into microchannels of various sizes in order to probe their behavior under confinement. Surprisingly, a 2D confinement can trigger a switch from a normal straight growth to a sinusoidal growth. Studies of the characteristics of these specific trajectories and of different experimental conditions triggering them have been carried out. Helices in 3D have also been observed either in agar gel or immediately upon release of the 2D confinement. Several leads to explain this behavior are explored such as the position at the tip of the Spitzenkörper, a polarity complex in hyphae.Finally, the cell cycle progression in hyphae is quite interesting and very well regulated, but nevertheless poorly studied compared to the one in budding or fission yeasts.The use of microchannels and of various stainings (nucleus, septum, microtubules) allow a precise monitoring of the different events of the cycle, leading to a better understanding of the regulation and dynamics of cell cycle in hyphae., Le pathogène opportuniste Candida albicans est l’un des plus importants champignons d’un point de vue clinique, responsable d’infections mucosales chez les individus sains ainsi que de sévères infections chez les patients immunodéficients. Une propriété remarquable de C. albicans est sa capacité à croître sous différentes morphologies, de la levure bourgeonnante ronde à de longs filaments appelés hyphes.Les mécanismes d’invasion fongique sont toujours faiblement compris, mais ils impliquent à la fois la pénétration des hyphes à travers les barrières épithéliales et la dissémination des levures dans la circulation sanguine.Ainsi les propriétés mécaniques de ce champignon semblent cruciales à sa virulence, et également sa capacité à percevoir son environnement et à répondre à diverses contraintes.Nous avons développé un dispositif microfluidique pour la mesure du module de flexion des hyphes.Les levures sont positionnées à l'entrée de microcanaux puis croissent sous forme hyphale.Un flux est ensuite appliqué de façon à courber les filaments, et le module de flexion ainsi que le module de Young sont calculés à partir de la déflexion.Nous avons trouvé que le module de la paroi des hyphes était d’une dizaine de micronewtons.En utilisant des puces microfluidiques, nous pouvons orienter les hyphes dans des microcanaux de différentes tailles afin d’étudier leur comportement sous confinement. De façon étonnante, un confinement 2D peut déclencher une transition d’une croissance rectiligne à une croissance sinusoïdale. Les caractéristiques de ces trajectoires spécifiques et les différentes conditions expérimentales permettant leur observation ont été étudiées. Des hélices en 3D ont également été observées dans des gels d’agar ou en relâchant la contrainte 2D. Plusieurs pistes pour expliquer ce comportement sont explorées comme la position d’un complexe de polarité à l’apex, le Spitzenkörper.Enfin, la progression du cycle cellulaire chez les hyphes est particulièrement intéressante et très bien régulée, mais pourtant très peu étudiée par rapport à celle des levures à fission ou bourgeonnantes. L’utilisation de microcanaux et de différents marquages (noyau, septum, microtubule) permet un suivi précis des différents événements du cycle, ce qui mène à une meilleure compréhension de la régulation ainsi que de la dynamique du cycle cellulaire chez les hyphes.

Vegetable oils are key excipients in the pharmaceutical field thanks to their biocompatibility, biodegradability and solubilizing properties. Indeed, they can be used through numerous routes of administration, they meet growing environmental constraints, and they provide effective solutions for the solubilization of poorly water-soluble active pharmaceutical ingredients. These vegetable oils can also be chemically engineered to provide further properties.The aim of this dissertation is to functionalize vegetable oils using silica-based molecules in order to enable their solidification into microparticles through a sol-gel process. The obtained vegetable oil/silica hybrid microparticles offer interesting insights for the encapsulation of poorly water-soluble active ingredients, allowing the modulation of their release kinetics, and broadening their field of application.The first step in this project was to develop such microparticles using a thermostabilized emulsion process in compliance with pharmaceutical specifications, mainly the exclusive use of biocompatible excipients. The synthesis of such optimized microparticles was explored by modulating silylation ratios and by entrapping a model active pharmaceutical ingredient (ibuprofen) in order to highlight their potential as a reservoir of poorly water-soluble active pharmaceutical ingredients. Besides, the cytocompatibility and biodegradability of these microparticles were evaluated. In order to promote these hybrid microparticles for pharmaceutical applications, two studies were conducted with therapeutically relevant active pharmaceutical ingredients. First, an anti-cancer molecule developed against melanoma (JMV5038) was successfully entrapped into submicron hybrid particles and the latter have allowed the constant and sustained release of JMV5038. Second, a steroid hormone (estradiol) was successfully loaded into microparticles for subcutaneous administration. To achieve that, the chemistry of silylation was redesigned in order to ensure a "100 % green" process and to produce particles that have subsequently demonstrated excellent biocompatibility in a mouse model.The second step of this project was to develop a novel approach for the synthesis of hybrid microparticles by microfluidics. The main advantage of this process lies in the control of particle size and distribution, but its implementation requires overcoming a significant number of constraints. Firstly, the chemistry of sol-gel crosslinking was adapted to the new process, and to do that a catalyst was dissolved in the aqueous continuous phase instead of the oily phase in order to optimize the cross-linking time while reducing the residues within the particles. Secondly, the microfluidic settings (i.e. channel geometry, viscosity of the flowing phases, interfacial tensions) were optimized using polydimethylsiloxane devices that have undergone various hydrophilic treatments in the laboratory, considering that the microparticles are based on an oil-in-water emulsion. Finally, an original microfluidic device was designed, and its manufacturing with photolithography technology on a hydrophilic resin is being finalized, as the context of Covid-19 has slowed down our progress.In conclusion, the project demonstrated the feasibility of synthesizing vegetable oil/silica hybrid microparticles in compliance with the pharmaceutical requirements, and it highlighted the potential of these particles as an innovative and versatile platform dedicated to the formulation of various therapeutic molecules., Les huiles végétales sont devenus des excipients majeurs en industrie pharmaceutique grâce à leur biocompatibilité, leur biodégradabilité et leur pouvoir de solubilisation. En effet, elles trouvent des applications via de nombreuses voies d’administration, répondent à des contraintes environnementales de plus en plus exigeantes et offrent des stratégies efficaces de solubilisation de principes actifs très peu hydrosolubles. Ces huiles végétales peuvent être aussi modifiées chimiquement afin de leur conférer des propriétés supplémentaires. Le sujet de cette thèse consiste à fonctionnaliser des huiles végétales à l’aide de composés à base de silice, afin de rendre possible leur solidification sous forme de microparticules par procédé sol-gel. Les microparticules hybrides huile végétale/silice obtenues ouvrent des perspectives intéressantes pour l’encapsulation de principes actifs peu hydrosolubles, permettant la modulation de leurs cinétiques de libération, et élargissant leur champ d’application. Le premier axe de recherche de ce projet a été de développer ces microparticules par une technique d’émulsion thermostabilisée en respectant un cahier des charges pharmaceutique, ayant pour contrainte principale l’utilisation exclusive d’excipients biocompatibles. La synthèse de ces microparticules optimisées a été explorée en modulant les ratios de silylation et en encapsulant un principe actif modèle (l’ibuprofène) afin de mettre en évidence leur potentiel comme réservoir de principes actifs peu hydrosolubles. Par ailleurs, la cytocompatibilité et la biodégradabilité de ces microparticules ont été évaluées. Afin de valoriser ces microparticules hybrides pour des applications pharmaceutiques, deux études ont été menées avec des principes actifs d’intérêt thérapeutique : d’une part une molécule anticancéreuse développée contre le mélanome (le JMV5038) et d’autre part une hormone stéroïde (l’estradiol). Des particules hybrides submicroniques encapsulant avec succès le JMV5038 ont été développées, et ont permis la libération progressive et prolongée de ce dernier. Les microparticules chargées en estradiol ont été développées, quant à elles, pour une administration par voie sous-cutanée. Pour ce faire, la chimie de silylation a été revue afin de garantir un procédé « 100 % green » et produire des particules qui ont par la suite démontré une excellente biocompatibilité in vivo sur un modèle de souris. Le second axe de recherche de ce projet a consisté à élaborer une nouvelle approche de synthèse des microparticules hybrides par procédé microfluidique. L’intérêt principal de ce procédé réside dans le contrôle parfait de la taille et de la distribution des particules, mais sa mise en œuvre nécessite de lever un nombre conséquent de verrous. Premièrement, la chimie de réticulation sol-gel a dû être adaptée au nouveau procédé, et pour ce faire un catalyseur a été utilisé en phase continue aqueuse afin d’optimiser le temps de réticulation tout en réduisant ses résidus au sein des particules. Deuxièmement, les paramètres microfluidiques (i.e. géométrie des canaux, viscosité des phases circulantes, tensions interfaciales) ont été optimisés au sein de dispositifs en polydiméthylsiloxane ayant subi au laboratoire différents traitements hydrophiles, vu que les microparticules sont issues d’une émulsion qui possède une phase continue aqueuse. Enfin, un dispositif microfluidique innovant a été conçu et sa réalisation par photolithographie avec une résine hydrophile est en cours d’achèvement, le contexte de crise sanitaire liée au Covid-19 ayant ralenti nos avancées. En conclusion, ce projet a démontré qu’il était possible de synthétiser des microparticules hybrides à base d’huile végétale et de silice en respectant des exigences pharmaceutiques, et que ces particules constituent une plateforme innovante et polyvalente dédiée à la formulation de diverses molécules thérapeutiques.

Plastic pollution of surface water is constantly increasing and raises economic and ecological problems. According to recent studies, marine plastic debris breaks down into microparticles and nanoparticles by mechanical and photochemical processes. The nanometric fraction of environmental plastics is still unknown because there are still analytical challenges to characterize nanoparticles at trace concentrations. These particles are potentially toxic due to their composition, size and shape, but can become even more toxic, by aggregation with organic matter, or by surface adsorption of trace metals or organic contaminants. Up to date, there is limited studies about behavior of nanoplastics in transitional waters such as estuaries and mangroves. The aim of this thesis is to (i) characterize physico-chemical behavior of nanoplastic models in a salinity gradient, with an innovative methodology using microfluidics; (ii) study the ecotoxicological impact of these nanoparticles on bivalves, with an exposure representative of in situ conditions.Polystyrene latex, as well as mechanically aged nanoplastics from either pristine polystyrene pellets or from macro-plastics sampled on Guadeloupe beaches (polyethylene, polypropylene), were dispersed across a salinity gradient under dynamic conditions inside a microchip. Results were compared with conventional protocols i.e. dispersing standard nanospheres in a homogeneous saline medium under static conditions. Sizes, concentrations, morphologies, compositions and stability of these nanoparticles were measured as a function of the physicochemical conditions of the medium. Then, the ecotoxicological impact of model nanoplastics dispersed via a salinity gradient was studied on flat tree oysters: Isognomon alatus. Exposures were carried out by direct route at environmental concentrations. Different markers such as metallothionein production and early gene expression have been used to assess the toxicity of nanoplastics. This thesis also allowed the development of one of the most sensitive instruments for the analysis of nanoparticles at ultra-trace concentration: the Laser Induced Breakdown Detection (LIBD). This work highlights the impact of salinity gradients on the behavior of nanoplastics and its importance in the toxicity assessment on bivalves during the transition from freshwater to seawater., La pollution mondiale des eaux de surface par les plastiques ne cesse de croitre et soulève des problèmes économiques et écologiques. D'après de récentes études, les macro-déchets plastiques marins se dégradent en microparticules puis en nanoparticules par des effets mécaniques et photochimiques. La fraction nanométrique des plastiques environnementaux est encore inconnue car cela reste un challenge analytique pour les caractériser à l'état d'ultra-trace. Ces particules sont potentiellement toxiques par leur composition, leur taille et leur forme, mais peuvent le devenir encore plus, par l'agrégation avec de la matière organique, ou bien par l'adsorption de métaux trace ou de polluants organiques à leur surface. Le comportement des nanoplastiques dans les eaux de transition comme les estuaires ou les mangroves est encore méconnu et peu étudié. Le but de cette thèse est de (i) caractériser le comportement physico-chimique de nanoparticules de plastiques modèles dans un gradient de salinité, avec une technique originale utilisant la microfluidique ; (ii) étudier l’impact écotoxicologique de ces nanoparticules sur des bivalves, avec un mode d’exposition représentatif des conditions d’exposition in situ.Des latex de polystyrène, ainsi que des nanoplastiques mécaniquement vieillis provenant soit de pellets de polystyrène, soit de macroplastiques prélevés sur des plages de Guadeloupe (polyéthylène, polypropylène), ont été soumis à un gradient de salinité dans des conditions dynamiques à l'intérieur de micro-puces. Les résultats ont été comparés à ceux des protocoles classiques qui consistent à disperser des nanosphères standards dans un milieu salin homogène en condition statique. Les tailles, concentrations, morphologies et stabilité de ces nanoparticules, ont été mesurées en fonction des conditions physico-chimiques du milieu.L'impact écotoxicologique des nanoplastiques modèles, dispersés via un gradient de salinité, a ensuite été étudié sur des huitres des palétuviers : Isognomon alatus. Les expositions ont été réalisées par voie directe à des concentrations environnementales. Différents marqueurs tels que la production de métallothionéines et l’expression précoce des gènes ont été utilisées pour évaluer la toxicité des nanoplastiques. Cette thèse a également permis le développement d’un des instruments les plus sensibles pour l'analyse de nanoparticules à l'état d'ultra-traces : la détection de plasmas induits par laser (LIBD). Ces travaux mettent en évidence l’impact des gradients de salinité sur le comportement des nanoplastiques et leur importance dans l’évaluation de la toxicité sur les bivalves lors de la transition eau douce-eau de mer.

During the XXst century science fiction literature anticipated the development of robots so small that they could enter a human body to manipulate its cells, or even its DNA. Since the beginning of the XXIst century, this vision has taken shape in the development of micro-robotics. Although far from equaling the prowess of his literary alter-ego, micro-robotics develops in many directions and sees its panel of applications expand. In parallel, the development of microfluidics makes it possible to have a highly controlled environment for carrying out work in biology or chemistry. But this confined feature brings constraints on the manipulation options of microfluidic chip content. Also, without being able to work in-vivo, micro-robotics can offer in-vitro mechanical manipulation options in microfluidics. This thesis aims to develop a micro-robot whose function is to offer functional hydrodynamic vortex manipulations of biological material within microfluidic chips. Wanting to propose a complete system we are interested in the four parts composing our micro-robot. The microscopic swimmer intended to be integrated into the microfluidic chip and to generate the capture vortices. The microfluidic chips used as working environment for this swimmer. The electromagnetic facility used to manipulate the swimmer through magnetic field. And finally the computer software used to drive the robot. The micro-swimmers proposed are able to move in two as in three dimensions while being able to capture, and therefore manipulate, particles of about ten micrometers in diameter over distances of several millimeters. Unfortunately we did not have the opportunity to go to the proof of concept with biological material, but our demonstrations on polystyrene particles are very encouraging. Microfluidic chips have seen two successive developments. One is to make them more suitable for long-term biological work by adding pneumatic valves and oxygenation option on chip with temporary integration of swimmer. A second aimed at making chips faster and easier to manufacture with a definitive integration of the swimmer, which can be used in the case of studies with a strong material need, such as statistical studies. The electromagnetic facility has been studied to be integrated into complex geometrical configurations with, for example, a successful integration in an inverted microscope, a tool widely used in biological laboratories. Finally, we developed control software to provide our robot with an easy-to-use user interface and automated video analysis and swimmer control features with a simple 2D image acquisition. Therefor we believe that the developed system show in this thesis could be an essential step towards biological or biomedical application of micro-robotic.; Au cours du XXe siècle la littérature de science-fiction a anticipé le développement de robots si petits qu'ils puissent entrer dans un corps humain pour y manipuler ses cellules, voire son ADN. Depuis le début du XXIe siècle cette vision prend corps dans le développement de la micro-robotique. Bien que loin d'égaler les prouesses de son alter-ego littéraire, la micro-robotique se développe dans de nombreuses directions et voit son panel d'applications s'étoffer. En parallèle, le développement de la microfluidique permet de disposer d'environnements très contrôlés pour la réalisation de travaux en biologie ou en chimie. Mais cette nature confinée apporte des contraintes quant aux options de manipulation du contenu des puces microfluidiques. Aussi, sans en être à pouvoir travailler in-vivo la micro-robotique peut offrir des options de manipulation mécanique in-vitro en microfluidique. Cette thèse vise le développement d'un micro-robot ayant pour fonction d'offrir des fonctionnalités de manipulations par vortex hydrodynamiques de matériel biologique au sein de puces microfluidiques. Voulant proposer un système complet nous nous sommes intéressés aux quatre parties composant notre micro-robot : le nageur microscopique ayant pour vocation à être intégré dans la puce microfluidique et à générer les vortex de capture ; les puces microfluidiques servant d'environnement de travail pour ce nageur ; l'installation électromagnétique permettant de manipuler le nageur par le biais de champs magnétiques ; et le logiciel informatique pilotant le robot. Les micro-nageurs proposés sont capables de se déplacer en deux comme en trois dimensions tout en étant capables de capturer, et donc de manipuler, des particules d'une dizaine de micromètre de diamètre sur des distances de plusieurs millimètres. Nous n'avons malheureusement pas eu la possibilité d'aller jusqu'à la preuve de concept avec du matériel biologique, mais nos démonstrations sur des particules de polystyrène sont très encourageantes. Les puces microfluidiques ont vu deux développements successifs. Un premier consistant à les rendre plus adaptées à des travaux biologiques à long terme par l'ajout de valves pneumatiques et d'option d'oxygénation sur des puces à intégration temporaire du nageur. Un second visant à rendre les puces plus rapides et faciles à fabriquer avec une intégration définitive du nageur, pouvant servir dans le cas d'études à fort besoin matériel, comme les études statistiques. L'installation électromagnétique a été étudiée pour pouvoir être intégrée dans des configurations géométriques complexes avec comme exemple une intégration réussie dans un microscope inversé, outil très utilisé dans les laboratoires de biologie. Enfin nous avons développé un logiciel de contrôle visant à offrir à notre robot une interface utilisateur facile à employer et des fonctionnalités automatisées d'analyse vidéo et de contrôle du nageur sur une simple acquisition d'image en 2D. Nous espérons que ces travaux pourront servir d'étape significative vers une application de la micro-robotique en biologie ou en médecine.

During the XXst century science fiction literature anticipated the development of robots so small that they could enter a human body to manipulate its cells, or even its DNA. Since the beginning of the XXIst century, this vision has taken shape in the development of micro-robotics. Although far from equaling the prowess of his literary alter-ego, micro-robotics develops in many directions and sees its panel of applications expand. In parallel, the development of microfluidics makes it possible to have a highly controlled environment for carrying out work in biology or chemistry. But this confined feature brings constraints on the manipulation options of microfluidic chip content. Also, without being able to work in-vivo, micro-robotics can offer in-vitro mechanical manipulation options in microfluidics. This thesis aims to develop a micro-robot whose function is to offer functional hydrodynamic vortex manipulations of biological material within microfluidic chips. Wanting to propose a complete system we are interested in the four parts composing our micro-robot. The microscopic swimmer intended to be integrated into the microfluidic chip and to generate the capture vortices. The microfluidic chips used as working environment for this swimmer. The electromagnetic facility used to manipulate the swimmer through magnetic field. And finally the computer software used to drive the robot. The micro-swimmers proposed are able to move in two as in three dimensions while being able to capture, and therefore manipulate, particles of about ten micrometers in diameter over distances of several millimeters. Unfortunately we did not have the opportunity to go to the proof of concept with biological material, but our demonstrations on polystyrene particles are very encouraging. Microfluidic chips have seen two successive developments. One is to make them more suitable for long-term biological work by adding pneumatic valves and oxygenation option on chip with temporary integration of swimmer. A second aimed at making chips faster and easier to manufacture with a definitive integration of the swimmer, which can be used in the case of studies with a strong material need, such as statistical studies. The electromagnetic facility has been studied to be integrated into complex geometrical configurations with, for example, a successful integration in an inverted microscope, a tool widely used in biological laboratories. Finally, we developed control software to provide our robot with an easy-to-use user interface and automated video analysis and swimmer control features with a simple 2D image acquisition. Therefor we believe that the developed system show in this thesis could be an essential step towards biological or biomedical application of micro-robotic.; Au cours du XXe siècle la littérature de science-fiction a anticipé le développement de robots si petits qu'ils puissent entrer dans un corps humain pour y manipuler ses cellules, voire son ADN. Depuis le début du XXIe siècle cette vision prend corps dans le développement de la micro-robotique. Bien que loin d'égaler les prouesses de son alter-ego littéraire, la micro-robotique se développe dans de nombreuses directions et voit son panel d'applications s'étoffer. En parallèle, le développement de la microfluidique permet de disposer d'environnements très contrôlés pour la réalisation de travaux en biologie ou en chimie. Mais cette nature confinée apporte des contraintes quant aux options de manipulation du contenu des puces microfluidiques. Aussi, sans en être à pouvoir travailler in-vivo la micro-robotique peut offrir des options de manipulation mécanique in-vitro en microfluidique. Cette thèse vise le développement d'un micro-robot ayant pour fonction d'offrir des fonctionnalités de manipulations par vortex hydrodynamiques de matériel biologique au sein de puces microfluidiques. Voulant proposer un système complet nous nous sommes intéressés aux quatre parties composant notre micro-robot : le nageur microscopique ayant pour vocation à être intégré dans la puce microfluidique et à générer les vortex de capture ; les puces microfluidiques servant d'environnement de travail pour ce nageur ; l'installation électromagnétique permettant de manipuler le nageur par le biais de champs magnétiques ; et le logiciel informatique pilotant le robot. Les micro-nageurs proposés sont capables de se déplacer en deux comme en trois dimensions tout en étant capables de capturer, et donc de manipuler, des particules d'une dizaine de micromètre de diamètre sur des distances de plusieurs millimètres. Nous n'avons malheureusement pas eu la possibilité d'aller jusqu'à la preuve de concept avec du matériel biologique, mais nos démonstrations sur des particules de polystyrène sont très encourageantes. Les puces microfluidiques ont vu deux développements successifs. Un premier consistant à les rendre plus adaptées à des travaux biologiques à long terme par l'ajout de valves pneumatiques et d'option d'oxygénation sur des puces à intégration temporaire du nageur. Un second visant à rendre les puces plus rapides et faciles à fabriquer avec une intégration définitive du nageur, pouvant servir dans le cas d'études à fort besoin matériel, comme les études statistiques. L'installation électromagnétique a été étudiée pour pouvoir être intégrée dans des configurations géométriques complexes avec comme exemple une intégration réussie dans un microscope inversé, outil très utilisé dans les laboratoires de biologie. Enfin nous avons développé un logiciel de contrôle visant à offrir à notre robot une interface utilisateur facile à employer et des fonctionnalités automatisées d'analyse vidéo et de contrôle du nageur sur une simple acquisition d'image en 2D. Nous espérons que ces travaux pourront servir d'étape significative vers une application de la micro-robotique en biologie ou en médecine.

National audience; Adipose tissue is a rich source of multipotent stem cells: Adipose Stem Cells (or ASCs). Due to their differentiation capabilities, ASCs became cells of considerable interest for regenerative medicine and are of high interest for type II diabetes diagnosis. Known to migrate and circulate in lymph, the hypothesis of their presence in blood is not excluded but no method exists to prove it. The aim of this study is to develop a lab-on-chip able to isolate ASCs from complex biological samples by using passive and label-free microfluidic sorting methods. These methods involve intrinsic properties of fluids and objects. Yet, ASCs do not have specific physical characteristic. We have demonstrated that their diameter is comprised between 10 and 25 µm: they cannot be distinguished from most of other blood cells. In addition, they do not present specific antigen on their membrane. In order to completely isolate ASCs from other cell types, we propose an original ! approach combining two complementary steps. The first step aims at pre-treating the sample by removing, via hydrodynamic filtration, all the cells with a diameter below 10 µm. With this device, red blood cells, which represent more than 99 % of blood cells, platelets and some leukocytes, have to be removed. This study has demonstrated that the device is able to effectively pre-treat pure blood sample (either from human or from mouse) as it removes more than 99.9 % of red blood cells. It has also been demonstrated that filtration does not lead to cell lysis, which is a promising result for cell viability and the reuse of cells after filtration. The obtained sample contains cells of interest and some remaining hematopoietic cells. The second step aims at refining ASCs isolation by separating them from remaining hematopoietic cells. The method used, called immunological exclusion by cell rolling, is based on antigen-antibody specific reaction. As ASCs do not hav! e specific antigen, leukocytes antigens have been involved. Th! e objective is so to deplete the sample of the remaining leukocytes. This study led to the elaboration of an optimised surface functionalization protocol. Moreover, promising results on cell rolling realised on a surface functionalized with anti-CD45 antibodies were obtained.; Le tissu adipeux est une source riche en cellules souches multipotentes : les Cellules Souches Adipeuses (ASCs pour Adipose Stem Cells). Ces cellules, qui possèdent la capacité de se différencier en différents types cellulaires, ouvrent de nombreuses perspectives dans le domaine de la médecine régénératrice et dans des applications telles que le diagnostic du diabète de type 2. Connues pour migrer et circuler dans la lymphe, l’hypothèse de leur présence dans le sang n’est pas exclue mais aucune méthode n’existe afin de le prouver. L’objectif de ces travaux de thèse est alors de développer un laboratoire sur puce capable d’isoler les ASCs à partir d’échantillons biologiques complexes en mettant en application des méthodes microfluidiques de tri passives et sans marquage. Ce sont ainsi les propriétés intrinsèques des cellules qui sont exploitées. Or, les ASCs ne présentent aucune caractéristique physique sp! écifique. En effet, nous avons tout d’abord montré que leur diamètre est compris entre 10 et 25 µm, ce qui ne leur permet pas de se distinguer de la plupart des cellules sanguines. De même, ces cellules ne possèdent pas d’antigène spécifique sur leur membrane. Nous proposons alors un dispositif combinant deux étapes complémentaires afin d’isoler complètement les ASCs des autres types cellulaires. La première étape a pour objectif de prétraiter l’échantillon en retirant, par filtration hydrodynamique, toutes les cellules de diamètre inférieur à 10 µm. Ce dispositif doit ainsi permettre de retirer du milieu les globules rouges qui représentent plus de 99 % des cellules constituant le sang ainsi que les plaquettes et quelques globules blancs. Ces travaux de thèse ont démontré que le dispositif développé est capable de prétraiter efficacement un échantillon sanguin pur (humain ou murin) en éliminant plus de 99,9 % des globules rouges. De plus! , il a été démontré que la filtration n’engendre pas de ! lyse cellulaire, ce qui est encourageant pour des questions de viabilité cellulaire et l’exploitation des cellules après filtration. L’échantillon alors obtenu contient les cellules d’intérêt ainsi que quelques cellules hématopoïétiques restantes. La deuxième étape a pour but de parfaire l’isolement des ASCs en les séparant des cellules hématopoïétiques restantes. Pour ce faire, la méthode employée, l’exclusion immunologique par cell rolling, se base sur la spécificité de la réaction antigène-anticorps. Les ASCs ne possédant pas d’antigène spécifique, ce sont les antigènes spécifiques des leucocytes qui ont été mis à contribution. L’objectif est ainsi de dépléter l’échantillon des leucocytes restants. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’un protocole de fonctionnalisation de surface optimal. De plus, de premiers résultats encourageants sur le cell rolling sur une surface fonctionnalisée avec des ant! icorps anti-CD45 ont été obtenus.

Bottom-up proteomics is the most commonly used approach for protein analysis by mass spectrometry. In this approach, enzymatic digestion is one step of a long and tedious sample preparation protocol. Specific care is needed to study post-translational changes, such as cysteine oxidation, with additional steps which makes the protocol even more complex. The OcSILAC protocol, developed in our laboratory for quantifying cysteine oxidation, is a perfect illustration of this. The miniaturization of the experimental setup is an opportunity for the OcSILAC protocol to be less time and sample consuming. It is the objective of my thesis project.A microfluidic device, inspired by the Filter Aided Sample Preparation (FASP) method, was developed during this project. It is a PDMS device, incorporating a regenerated cellulose molecular filtration membrane and manufactured by gentle photolithography. In the literature, the majority of microfluidic devices dedicated to proteomics stops at proof of concept on standard reference proteins. The microchip developed during this thesis allowed the analysis of biological complex protein samples: with ten times less sample and an eight-times shorter protocol than conventional procedures. Our ChipFilter Proteolysis protocol can identify more proteins and more peptides than the previously reported FASP method. For the miniaturization of the OcSILAC protocol, the development of a biotinylated peptide enrichment unit was started using avidin magnetic beads; RésuméLa protéomique bottom-up est l'approche la plus couramment utilisée pour l'analyse des protéines par spectrométrie de masse. Dance cette approche, la digestion enzymatique s'intègre dans une étape de préparation d'échantillon longue et fastidieuse. Les précautions nécessaires à l'étude des modifications post traductionnelles comme l'oxydation des cystéines introduisent des étapes supplémentaires et rendent le protocole plus complexe. Le protocole OcSILAC, développé dans notre laboratoire pour la quantification de l'oxydation des cystéines, en est une parfaite illustration. La miniaturisation du protocole OcSILAC pour le rendre moins chronophage et consommateur d'échantillon est l'objectif de mon projet de thèse.Un dispositif microfluidique, inspiré de la méthode Filter Aided Sample Preparation (FASP), a été développé durant mes travaux de thèse. C'est un dispositif en PDMS, intégrant une membrane de filtration moléculaire en cellulose régénérée et fabriqué par photolithographie douce. Dans la littérature scientifique, la majorité des dispositifs microfluidiques dédiés à la protéomique s'arrête aux preuves de concept. La micropuce développée au cours de cette thèse a permis l'analyse d'échantillons protéiques complexes en moins de temps et avec moins d'échantillons que les méthodes conventionnelles. Avec 10 fois moins d'échantillon et un protocole 8 fois moins long, la digestion sur puce permet d'identifier plus de protéines et plus de peptide par protéine identifiée par rapport à la méthode FASP. Pour la miniaturisation complète du protocole OcSILAC, une unité d'enrichissement des peptides biotinilés a été mise au point en utilisant des billes aimantées.