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BACKGROUND AND AIMS: In pancreatic ß-cells, Ca2+ influx through voltagedependent Ca2+ channels plays a prominent role in the depolarizationinduced rise in free cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). The contribution of Ca2+ release from the endoplasmic reticulum (ER) to this [Ca2+]c elevation is largely debated and was investigated here [...]

Chronic hyperglycemia exerts deleterious effects on glucose-induced insulin secretion by pancreatic beta cells. In 90% pancreatectomized rats, chronic hyperglycemia induces beta cell hypertrophy and loss of differentiation associated with increased expression of the early response gene c-Myc. Hyperglycemia also stimulates c-Myc expression in vivo in islets from glucose-infused rats and in vitro in cultured rat islets. This effect requires the elevation of cytosolic Ca2+ concentration produced by glucose. Our results suggest that overstimulation of c-Myc expression by chronic hyperglycemia may be the cause of beta cell hypertrophy and loss of differentiation and function observed in animal models of type 2 diabetes.

L’os est un tissu dynamique, en remodelage constant grâce à un processus finement régulé impliquant des facteurs locaux et systémiques. Un déséquilibre entre la formation et la résorption osseuses, assurées respectivement par les ostéoblastes et les ostéoclastes, conduit à une altération de la microarchitecture de l’os, une augmentation du risque de fracture, et à l’apparition de pathologies telles que l’ostéonécrose et l’ostéoporose. Ces deux maladies ont pour caractéristiques communes une diminution du nombre de cellules stromales mésenchymateuses (MSC), les progéniteurs des ostéoblastes, et des anomalies fonctionnelles des MSC et des cellules ostéoblastiques (Ob). De surcroit, elles présentent toutes deux une accumulation d’adipocytes au sein de la moelle osseuse. De récentes publications suggèrent que cette accumulation d’adipocytes médullaires pourrait avoir des conséquences délétères sur la physiologie des cellules ostéoformatrices et de leurs progéniteurs, partageant ce même microenvironnement osseux. Une relation inverse entre l’excès d’adiposité médullaire et la masse osseuse est en effet aujourd’hui clairement établie. Par son importante activité sécrétrice de cytokines et d’adipokines ainsi que sa capacité à stocker et libérer des acides gras libres (AGL), l’adipocyte médullaire est capable de modifier la composition du microenvironnement osseux, et ainsi d’influencer le métabolisme et la fonction des cellules avoisinantes, et notamment des cellules osseuses. Afin d’étudier l’influence des AGL sur la survie et la fonction des cellules ostéogéniques, nous avons utilisé un AGL saturé, le palmitate (Palm ;C16 :0) et un AGL monoinsaturé, l’oléate (Ole ;C18 :1), tous deux étant particulièrement abondants dans l’organisme et l’alimentation de l’homme et couramment utilisés dans les études de lipotoxicité. Dans un premier temps, nous avons travaillé sur des MSC isolées de la moelle osseuse de sujets sains (HV-MSC), qui ont éventuellement été différenciées en Ob. Nous avons démontré que l’exposition de ces cellules à des concentrations physiologiques de Palm entraîne une cytotoxicité dose-et temps-dépendante, via l’initiation d’un stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation des voies ERK et NFκB. En outre, l’AGL saturé induit un état pro-inflammatoire en augmentant l’expression du toll-like receptor 4 et la production des interleukines (IL) 6 et 8. Nous avons montré que les Ob présentent une sensibilité accrue au Palm, associée à une exacerbation du stress du RE et de la réponse pro-inflammatoire. L’Ole n’a pas d’effet délétère sur les MSC et les Ob, et de surcroit, il bloque les différentes voies activées par le Palm, neutralisant ainsi totalement la lipotoxicité induite par l’AGL saturé. Nous avons démontré par ailleurs que l’AGL monoinsaturé favorise l’estérification et le stockage du Palm dans des gouttelettes lipidiques, contrant ainsi ses effets délétères. Nous avons ensuite étudié les effets de ces deux AGL, sur des MSC isolées de patients atteints d’ostéonécrose de la tête fémorale (ON-MSC), comparativement aux HV-MSC. Lors de la procédure d’isolation des MSC, nous avons conservé le surnageant obtenu après la première centrifugation (bone marrow supernatant fluid, BMSF) pour une analyse de sa composition lipidique, celle du sérum étant réalisée en parallèle. Nous avons démontré que l’exposition au Palm favorise la différenciation des MSC vers la lignée adipogénique, au détriment du phénotype ostéoblastique. De plus, nous avons observé que les ON-MSC possèdent une capacité de différenciation adipogénique supérieure à celles des HV-MSC.D’autre part, nos résultats ont montré que les ON-MSC sont plus sensibles à la lipotoxicité que les HV-MSC, cette hypersensibilité étant associée à un dérèglement de plusieurs mécanismes cellulaires impliqués dans la survie ou les processus de protection cellulaire :le niveau d’activation basal de la voie ERK est supérieur à celui des HV-MSC et la régulation de l’expression génique des enzymes stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) et carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1), favorisant respectivement la désaturation des AGL saturés et leur β-oxydation mitochondriale, est altérée dans les ON-MSC. Par ailleurs, dans ces cellules, la production des cytokines IL-6 et IL-8 est triplée par rapport à celle des HV-MSC.La caractérisation du profil lipidique du sérum n’a pas mis en évidence de différence significative entre les sujets sains et ostéonécrotiques. Cependant, de profondes modifications du contenu en AGL du BMSF ont été observées, montrant un enrichissement important en acide palmitique, palmitoléique, oléique, vaccénique et linoléique chez les sujets ostéonécrotiques. Ces modifications reflètent un changement du microenvironnement osseux chez ces patients qui pourrait être lié à l’activité sécrétrice des adipocytes médullaires et altérer le fonctionnement des cellules voisines.L’ensemble de nos travaux suggère qu’au sein du microenvironnement osseux, l’accumulation d’adipocytes médullaires pourrait avoir un effet délétère sur les cellules responsables de la formation osseuse, notamment via la libération d’AGL. Ces AGL étant cytotoxiques pour les cellules ostéoformatrices mais bénéfiques pour les cellules responsables de la résorption osseuse, ils pourraient favoriser un déséquilibre du remodelage osseux. En lien avec ces observations, nos résultats obtenus avec les ON-MSC suggèrent également que la lipotoxicité pourrait participer aux mécanismes pathogéniques qui initient et/ou entretiennent l’ostéonécrose., Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine), info:eu-repo/semantics/nonPublished

Glucose stimulation of insulin secretion by pancreatic β cells is essential to maintain glucose homeostasis. In addition to this short-term effect, glucose is also important to maintain β cell survival and differentiated phenotype. Indeed, both chronic hypo- and hyper-glycemia alter β-cell gene expression, survival and function. Similarly, in vitro, rat β-cell gene expression, function and survival are optimally preserved by culture in the presence of 10 mM glucose (G10) and markedly impaired by culture in either lower (2 or 5 mmol/l glucose, G2 or G5) or higher (30 mmol/l glucose, G30) glucose concentrations. It therefore seems that glucose stimulation exerts beneficial effects on β cell function and survival between G2 and G10 and a deleterious effect on these parameters between G10 and G30. The precise molecular mechanisms behind such phenotypical plasticity are poorly understood, but they could involve an increase in oxidative stress. Indeed, mRNA levels of oxidative stress-response genes like Metallothionein 1a/2a (Mt1a/2a), Heme oxygenase 1 (Hmox1) or c-Mycfollow an asymmetric V-shaped profile similar to that of β cell dysfunction and apoptosis. We therefore hypothesized that extreme glucose concentrations increases oxidative stress in β cells. In a first study, we developed a method to measure the β cell redox status in our experimental conditions. Our results showed that mt-HyPer, besides its expected sensitivity to H2O2, was also highly pH-sensitive. As glucose stimulation increases mitochondrial pH in β cells, that probe could not be used in our experimental model. In contrast, the fluorescence ratio of mt-roGFP1, which measures the thiol/disulfide equilibrium, was only slightly affected by pH. Using that probe, we demonstrated that mitochondrial thiol oxidation in rat β cells reversibly increases when glucose is lowered from 10 to 2 mmol/l. In contrast, acutely increasing glucose concentration from 10 to 30 mmol/l did not increase mt-roGFP1 oxidation in β cell. In a second study, I first demonstrated that 18 to 24h culture of rat islet cell clusters in the présence of G5 or G30 vs. G10 increases mitochondrial glutathione oxidation, thereby confirming our initial hypothesis. I also tested the effect of ZnCl2, a potent inducer of Mt1a, on β cell alterations induced by prolonged exposure to low and high glucose concentrations. My results show that addition of 50μM ZnCl2partially reduced mt-roGFP oxidation after 18-24h culture in G5, and tended to do so after culture in G30.Addition of 100μM ZnCl2also significantly decreased late β-cell apoptosis after prolonged culture in G5 or G30. Theses protective effects of ZnCl2 did not correct β cell dysfunction induced by culture in G5 and G30. In a third study, using islets from Mt1/2 knock-out mice, I wanted to determine the role of MT1/2 on the beneficial effects of Zn2+. I also wanted to test whether the deficiency in Mt1/2 increases β cell apoptosis and mitochondrial glutathione oxidation induced by culture in a low glucose concentration. In contrast with what I observed in rat islets, ZnCl2, despite increasing Mt1expression, did not protect wild-type mouse islets from apoptosis induced by culture in a low glucose concentration, thereby preventing me from studying the role of MT1/2 expression in this effect. Moreover, deficiency in Mt1/2 in mouse islets did not increase apoptosis induced by culture in a low glucose concentration. These results help us to understand the molecular mechanisms underlying the plasticity of the β cell phenotype and may help in the development of new therapeutic strategies for T2D. (BIFA - Sciences biomédicales et pharmaceutiques) -- UCL, 2013