Search

Gray mould, caused by Botrytis cinerea, is a severe disease on a wide range of crops. Disease control generally relies on chemicals, although biological control strategies have been intensively studied over the last decades. This pathogen can withstand a wide variety of fungitoxic compounds including fungicides and natural molecules. This capacity to adapt to different stress might, potentially, compromise the durability of biological control methods. The global purpose of that work was to estimate the potential of B. cinerea to overcome the efficacy of biological control agents. Knowledge on the potential development of resistance to biological control agents can help to devise or improve resistance management strategies. In this work, efforts have been focused on the antibiotic pyrrolnitrin produced by various bacteria described as potential biological control agents against B. cinerea. The specific objectives of the study were (i) to evaluate the diversity in susceptibility to pyrrolnitrin among natural population of B. cinerea, (ii) to estimate the risk of loss of efficacy of pyrrolnitrinproducing biological control agent due to selection pressure exerted by pyrrolnitrin and (iii) to study the mechanism of resistance to pyrrolnitrin in B. cinerea. An important range of sensitivity to pyrrolnitrin with an 8.4-fold difference in EC50 values between the most sensitive and the least sensitive isolates was observed within the 204 isolates tested. The production of 20 generations, for 4 isolates of B. cinerea, on increasing doses of pyrrolnitrin, resulted in the development of mutants of B. cinerea with high levels of resistance to the antibiotic and a reduced sensitivity in vitro to the pyrrolnitrin-producing Pseudomonas chlororaphis PhZ24. Comparison of the pyrrolnitrin-resistant mutants and their sensitive parent isolates for mycelial growth, sporulation and aggressiveness on plant tissues revealed that the high level of resistance to pyrrolnitrin has resulted in a high fitness cost. Additional cytohistological investigations revealed that while the sensitive isolate spread throughout the petiole and rapidly invaded the stem via the abscission zone, the pyrrolnitrinresistant mutant failed to extend beyond petiole to invade the stem. Moreover, the pyrrolnitrin-resistant mutant formed abnormal mycelium and chlamydospore-like cells. The comparison of resistance to pyrrolnitrin and to the iprodione fungicide in B. cinerea revealed that fungicide pressure exerted on the fungus is able to build-up resistance to pyrrolnitrin. Comparison of sequences of the osmosensing class III histidine kinase encoding gene bos1 revealed different mutations in pyrrolnitrin- and iprodione-resistant mutants. However, resistance to pyrrolnitrin and to iprodione was not systematically associated with a point mutation in the Bos1 gene. Finally, no changes were observed in the allele size at nine microsatellite loci whatever the four selective pressure endured by the fungus despite their phenotypic changes. This study provides evidence that a fungal plant pathogen is able to gradually build-up resistance to an antibiotic produced by a biocontrol agent; La pourriture grise, causée par le champignon Botrytis cinerea, est l'une des principales maladies aériennes fongiques sur diverses cultures d’importance agronomique. La diversité génétique de B. cinerea est très forte et la capacité rapide d’adaptation de ce champignon à une pression sélective est également avérée. Ce champignon est ainsi capable de développer des résistances à une grande variété de composés fongicides de synthèse ou d'origine naturelle. Des méthodes alternatives de lutte ont de ce fait été développées ces dernières années : divers agents de lutte biologique (ALB) présentant différents modes d’actions ont été identifiés et pour certains d’entre eux commercialisés pour contrôler B. cinerea. Cependant la durabilité de la lutte biologique est un domaine encore très peu étudié. La perte d'efficacité d'un ALB pourrait résulter de la préexistence d’isolats moins sensibles de pathogènes dans les populations naturelles et/ou de la capacité de l’agent pathogène à produire, sous une pression de sélection continue exercée par l’ALB, des mutants ayant une sensibilité réduite. L'objectif global de la présente étude est d'évaluer le risque potentiel de perte d'efficacité de la lutte biologique vis-à-vis de B. cinerea. Dans cette étude, les efforts ont été concentrés sur la pyrrolnitrine, un antibiotique produit par divers ALBs, dont certains sont efficaces contre B. cinerea. Les objectifs spécifiques de l'étude étaient (i) d’évaluer la diversité de la sensibilité à la pyrrolnitrine au sein de la population naturelle de B. cinerea, (ii) d'estimer le risque de perte d'efficacité des ALBs produisant la pyrrolnitrine due à la pression de sélection exercée par la pyrrolnitrine et (iii) d'étudier le mécanisme de résistance à la pyrrolnitrine chez B. cinerea. Parmi 204 isolats de B. cinerea, une gamme importante de sensibilité à la pyrrolnitrine a été observée, avec un facteur de résistance de 8,4 entre l’isolat le plus sensible et l'isolat le moins sensible. La production de 20 générations successives pour 4 isolats de B. cinerea, sur des doses croissantes de pyrrolnitrine, a abouti au développement de mutants avec des niveaux élevés de résistance à l'antibiotique, et à une réduction in vitro de la sensibilité à la bactérie productrice de pyrrolnitrine Pseudomonas chlororaphis PhZ24. La comparaison entre les mutants résistants à la pyrrolnitrine et leurs parents sensibles pour la croissance mycélienne, la sporulation et l'agressivité sur plantes a révélé que la résistance à la pyrrolnitrine est associée à un fort coût adaptatif. Des observations cytohistologiques sur tomates ont confirmé que l’isolat sensible à la pyrrolnitrine attaque le pétiole rapidement et envahit la tige, alors que le mutant résistant à la pyrrolnitrine ne s'étend pas au-delà du pétiole. De plus, ce dernier mutant forme un mycélium anormal et des cellules ressemblant à des chlamydospores. Les résultats ont d'autre part révélé que les mutants de B. cinerea résistants à la pyrrolnitrine sont résistants au fongicide iprodione, suggérant ainsi qu'une pression exercée par la pyrrolnitrine sur le champignon conduit à une résistance au fongicide. Réciproquement, la production de générations successives sur iprodione conduit à une résistance à l'antibiotique. Afin d'étudier les déterminants moléculaires de la résistance de B. cinerea à la pyrrolnitrine, le gène histidine kinase Bos1, impliqué entre autres dans la résistance aux fongicides chez B. cinerea a été séquencé chez les souches sensibles et les mutants résistants. La comparaison des séquences a mis en évidence des mutations ponctuelles différentes chez les mutants de B. cinerea obtenus sur la pyrrolnitrine et ceux obtenus sur l'iprodione. De plus, les résistances à la pyrrolnitrine et à l'iprodione ne sont pas systématiquement associées à une mutation ponctuelle dans le gène Bos1. Enfin, aucune modification n'a été détectée dans la taille des allèles de neuf locus microsatellites quelle que soit la pression sélective exercée et quelle que soit le phénotype du mutant produit. Cette étude montre qu'un champignon pathogène des plantes est capable de développer progressivement une moindre sensibilité à un agent de lutte biologique mais que cette moindre sensibilité est associée à une forte perte de fitness

Gray mould, caused by Botrytis cinerea, is a severe disease on a wide range of crops. Disease control generally relies on chemicals, although biological control strategies have been intensively studied over the last decades. This pathogen can withstand a wide variety of fungitoxic compounds including fungicides and natural molecules. This capacity to adapt to different stress might, potentially, compromise the durability of biological control methods. The global purpose of that work was to estimate the potential of B. cinerea to overcome the efficacy of biological control agents. Knowledge on the potential development of resistance to biological control agents can help to devise or improve resistance management strategies. In this work, efforts have been focused on the antibiotic pyrrolnitrin produced by various bacteria described as potential biological control agents against B. cinerea. The specific objectives of the study were (i) to evaluate the diversity in susceptibility to pyrrolnitrin among natural population of B. cinerea, (ii) to estimate the risk of loss of efficacy of pyrrolnitrinproducing biological control agent due to selection pressure exerted by pyrrolnitrin and (iii) to study the mechanism of resistance to pyrrolnitrin in B. cinerea. An important range of sensitivity to pyrrolnitrin with an 8.4-fold difference in EC50 values between the most sensitive and the least sensitive isolates was observed within the 204 isolates tested. The production of 20 generations, for 4 isolates of B. cinerea, on increasing doses of pyrrolnitrin, resulted in the development of mutants of B. cinerea with high levels of resistance to the antibiotic and a reduced sensitivity in vitro to the pyrrolnitrin-producing Pseudomonas chlororaphis PhZ24. Comparison of the pyrrolnitrin-resistant mutants and their sensitive parent isolates for mycelial growth, sporulation and aggressiveness on plant tissues revealed that the high level of resistance to pyrrolnitrin has resulted in a high fitness cost. Additional cytohistological investigations revealed that while the sensitive isolate spread throughout the petiole and rapidly invaded the stem via the abscission zone, the pyrrolnitrinresistant mutant failed to extend beyond petiole to invade the stem. Moreover, the pyrrolnitrin-resistant mutant formed abnormal mycelium and chlamydospore-like cells. The comparison of resistance to pyrrolnitrin and to the iprodione fungicide in B. cinerea revealed that fungicide pressure exerted on the fungus is able to build-up resistance to pyrrolnitrin. Comparison of sequences of the osmosensing class III histidine kinase encoding gene bos1 revealed different mutations in pyrrolnitrin- and iprodione-resistant mutants. However, resistance to pyrrolnitrin and to iprodione was not systematically associated with a point mutation in the Bos1 gene. Finally, no changes were observed in the allele size at nine microsatellite loci whatever the four selective pressure endured by the fungus despite their phenotypic changes. This study provides evidence that a fungal plant pathogen is able to gradually build-up resistance to an antibiotic produced by a biocontrol agent, La pourriture grise, causée par le champignon Botrytis cinerea, est l'une des principales maladies aériennes fongiques sur diverses cultures d’importance agronomique. La diversité génétique de B. cinerea est très forte et la capacité rapide d’adaptation de ce champignon à une pression sélective est également avérée. Ce champignon est ainsi capable de développer des résistances à une grande variété de composés fongicides de synthèse ou d'origine naturelle. Des méthodes alternatives de lutte ont de ce fait été développées ces dernières années : divers agents de lutte biologique (ALB) présentant différents modes d’actions ont été identifiés et pour certains d’entre eux commercialisés pour contrôler B. cinerea. Cependant la durabilité de la lutte biologique est un domaine encore très peu étudié. La perte d'efficacité d'un ALB pourrait résulter de la préexistence d’isolats moins sensibles de pathogènes dans les populations naturelles et/ou de la capacité de l’agent pathogène à produire, sous une pression de sélection continue exercée par l’ALB, des mutants ayant une sensibilité réduite. L'objectif global de la présente étude est d'évaluer le risque potentiel de perte d'efficacité de la lutte biologique vis-à-vis de B. cinerea. Dans cette étude, les efforts ont été concentrés sur la pyrrolnitrine, un antibiotique produit par divers ALBs, dont certains sont efficaces contre B. cinerea. Les objectifs spécifiques de l'étude étaient (i) d’évaluer la diversité de la sensibilité à la pyrrolnitrine au sein de la population naturelle de B. cinerea, (ii) d'estimer le risque de perte d'efficacité des ALBs produisant la pyrrolnitrine due à la pression de sélection exercée par la pyrrolnitrine et (iii) d'étudier le mécanisme de résistance à la pyrrolnitrine chez B. cinerea. Parmi 204 isolats de B. cinerea, une gamme importante de sensibilité à la pyrrolnitrine a été observée, avec un facteur de résistance de 8,4 entre l’isolat le plus sensible et l'isolat le moins sensible. La production de 20 générations successives pour 4 isolats de B. cinerea, sur des doses croissantes de pyrrolnitrine, a abouti au développement de mutants avec des niveaux élevés de résistance à l'antibiotique, et à une réduction in vitro de la sensibilité à la bactérie productrice de pyrrolnitrine Pseudomonas chlororaphis PhZ24. La comparaison entre les mutants résistants à la pyrrolnitrine et leurs parents sensibles pour la croissance mycélienne, la sporulation et l'agressivité sur plantes a révélé que la résistance à la pyrrolnitrine est associée à un fort coût adaptatif. Des observations cytohistologiques sur tomates ont confirmé que l’isolat sensible à la pyrrolnitrine attaque le pétiole rapidement et envahit la tige, alors que le mutant résistant à la pyrrolnitrine ne s'étend pas au-delà du pétiole. De plus, ce dernier mutant forme un mycélium anormal et des cellules ressemblant à des chlamydospores. Les résultats ont d'autre part révélé que les mutants de B. cinerea résistants à la pyrrolnitrine sont résistants au fongicide iprodione, suggérant ainsi qu'une pression exercée par la pyrrolnitrine sur le champignon conduit à une résistance au fongicide. Réciproquement, la production de générations successives sur iprodione conduit à une résistance à l'antibiotique. Afin d'étudier les déterminants moléculaires de la résistance de B. cinerea à la pyrrolnitrine, le gène histidine kinase Bos1, impliqué entre autres dans la résistance aux fongicides chez B. cinerea a été séquencé chez les souches sensibles et les mutants résistants. La comparaison des séquences a mis en évidence des mutations ponctuelles différentes chez les mutants de B. cinerea obtenus sur la pyrrolnitrine et ceux obtenus sur l'iprodione. De plus, les résistances à la pyrrolnitrine et à l'iprodione ne sont pas systématiquement associées à une mutation ponctuelle dans le gène Bos1. Enfin, aucune modification n'a été détectée dans la taille des allèles de neuf locus microsatellites quelle que soit la pression sélective exercée et quelle que soit le phénotype du mutant produit. Cette étude montre qu'un champignon pathogène des plantes est capable de développer progressivement une moindre sensibilité à un agent de lutte biologique mais que cette moindre sensibilité est associée à une forte perte de fitness