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Dans le contexte actuel, où l’émergence et la réémergence de pathogènes viraux ne cessent de croître et constituent un problème majeur de santé publique, le développement de nouveaux outils thérapeutiques est indispensable. L'ingénierie des virus recombinants est un outil prééminent pour déchiffrer la biologie des agents pathogènes viraux émergents tels que les Coronavirus, les Artérivirus ou encore les Flavivirus. Cependant, la grande taille et la complexité des génomes de certains de ces virus rendent les méthodes actuelles de génétique inverse difficiles. Ici, nous décrivons une méthode simple basée sur la technologie des « amplicons sous-génomiques infectieux » (ISA) pour générer des virus infectieux recombinants, ceci sans avoir besoin de reconstruction de l'ADNc génomique complet ni de clonage. Cette technique a été appliquée avec succès aux virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV), du coronavirus entérique félin (FeCoV), du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SARS-CoV-2) et de l’encéphalite à tiques (TBEV).Nous avons réussi à obtenir des virus recombinants « sauvages » avec des caractéristiques biologiques similaires aux souches d'origine pour l’ensemble de ces virus. Egalement, des mutations spécifiques et des gènes rapporteurs rouges fluorescents (mCherry) ont été incorporés dans le génome du SARS-CoV-2 et du TBEV permettant leur utilisation dans différents domaines de la virologie. En effet, les souches virales générées de novo ont pu être utilisées avec des essais de séroneutralisation ainsi que pour des tests de molécules antivirales. La rapidité et la simplicité de la méthode ISA a le potentiel d’accroître la génération de virus par génétique inverse, afin d'explorer les propriétés biologiques des virus et d'accélérer le développement de composés thérapeutiques efficaces. Cette méthode polyvalente, permettrait aussi de générer des souches génétiquement modifiées et atténuées pour le développement éventuel de candidats vaccins.

Zika virus (ZIKV) is an arbovirus belonging to the Flavivirus genus of the Flaviviridae family. ZIKV emergence in the Pacific islands and in the Americas in the xxx led to demonstrate that ZIKV infection was associated with several neuropathologies including Guillain-Barré syndrome and Zika congenital syndrome. During these pathologies, ZIKV is detected in the central nervous system (CNS) evidencing the neuroinvasive capacity of the virus. The CNS is protected against blood-borne pathogens by several anatomical barriers including the blood-brain barrier (BBB), which is composed of different cell types including endothelial cells that form a continuous capillary sealed with tight-junctions. Crossing the BBB could be the result of the productive infection of these endothelial cells. Hence, we focused our study on the mechanisms of such an infection. In vitro, we found a differential susceptibility to ZIKV infection of a human brain microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3) in two commercially available culture media. We discovered that the gene coding for claudin-7 (CLDN7) was overexpressed when the cells were the most susceptible to ZIKV infection. Moreover, the knock down (KD) of CLDN7 using lentiviral vectors containing shRNAs reduced the susceptibility to ZIKV infection. We confirmed these findings in other endothelial cells originating from umbilical or the bone marrow veins. Interestingly, even if susceptibility to the infection was altered in CLDN7-KD cells, their ability to bind and internalize viral particles remained unchanged. This suggests that CLDN7 is involved in late steps of the infection (sorting of virions within in the endosomal network or viral fusion to the endosomal membrane). On the contrary, CLDN7-KD had no effect on epithelial cells, suggesting compensation mechanisms or other pathways of infection in these tissues. Based on these observations, we next studied claudin-derived (CLDN1 and CLDN7) peptides and their ability to inhibit ZIKV infection. We discovered that claudin N-terminus-derived peptides had inhibitory properties. Our results suggest that these peptides inhibit viral fusion by directly interacting with the viral particles. We also found that the peptides were broad-spectrum antivirals since they can inhibit in vitro infection of other flaviviruses (i.e. yellow fever virus and Japanese encephalitis virus). This work lead to the discovery of CLDN7-involvement in ZIKV infection, the role of claudins had not been shown for ZIKV. Moreover, our characterization of a broad-spectrum inhibitory peptide helps in the understanding of the infection mechanisms and could serve as a template for therapeutic drug development.; Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus du genre Flavivirus et de la famille des Flaviviridae. Son émergence dans la région Pacifique et en Amérique depuis 2007 a permis d'établir un lien entre l'infection par ZIKV et des pathologies neurologiques, telles que le syndrome de Guillain-Barré et la microcéphalie liée à Zika. Ces pathologies sont associées à la détection de virus dans le système nerveux central (SNC) des patients, ce qui traduit une capacité neuroinvasive du virus. Le SNC est protégé contre les pathogènes présentes dans le sang par un ensemble d'interfaces dont la barrière hémato-encéphalique (BHE). Celle-ci est constituée de différents types cellulaires dont des cellules endothéliales qui forment un capillaire continu à jonctions serrées. L'infection productive des cellules endothéliales cérébrales pourrait constituer un des mécanismes du franchissement de la BHE et donc de la neuroinvasion. Nous nous sommes donc intéressés à l'infection des cellules endothéliales cérébrales par le ZIKV. Nous avons mis en évidence une sensibilité différentielle à l'infection par le ZIKV in vitro des cellules endothéliales cérébrales humaines de la lignée hCMEC/D3 en comparant deux milieux de culture commerciaux. Nous avons observé que le gène codant la claudine-7 (CLDN7) est surexprimé dans les conditions favorisant l'infection. De plus, la baisse d'expression (Knock Down, KD) de CLDN7 par transduction de shARN dans ces cellules à l'aide de vecteurs lentiviraux, réduit la sensibilité au ZIKV. Nous avons confirmé ces observations sur d'autres modèles de cellules endothéliales (de cordon ombilical ou de moelle osseuse). Nous avons observé que, malgré une différence de sensibilité à l'infection des cellules CLDN7-KD, leurs capacités d'adsorption et d'internalisation des particules virales étaient conservées. Ceci suggère donc que CLDN7 participerait aux étapes tardives de l'infection dans les cellules endothéliales (au niveau du sorting des endosomes ou de la fusion avec la membrane cellulaire). En revanche, le KD de CLDN7 n'a eu aucun effet sur l'infection de cellules épithéliales, suggérant des phénomènes de compensation ou l'implication d'autres voies d'infection dans ces tissus. Forts de ces observations, nous avons étudié la capacité de peptides dérivés de séquences de claudines (CLDN1 et CLDN7) à inhiber l'infection par le ZIKV. Nous avons montré que des peptides correspondants à l'extrémité N-terminale des claudines ont un effet inhibiteur sur l'infection. Nos résultats suggèrent que ces peptides inhibent la fusion des membranes en interagissant avec le virion. Nous avons également démontré que ces peptides ont un large spectre d'action antivirale, car ils permettent in vitro d'inhiber l'infection par d'autres Flavivirus tels que le virus de la fièvre jaune ou le virus de l'encéphalite japonaise. Notre travail a permis de mettre en évidence l'importance de CLDN7 dans l'infection par le ZIKV ; le rôle des claudines n'avait pas été montré à ce jour pour ce virus. De plus, notre caractérisation d'un peptide antiviral à large spectre contribue à une meilleure compréhension des mécanismes d'infection et pourrait servir de base de développement de molécules thérapeutiques.

Les facteurs exogènes à l’organisme humain peuvent à son contact, provoquer une modulation de sa physiologie. Certains xénobiotiques comme les oxydants, les rayons ionisants, les métaux ou les biotoxines microbiennes génèrent une toxicité dont les effets peuvent être modulés par des composés comme ceux apportés par l’alimentation tels que les composés phénoliques d’origine végétale : l’acide caféique et les vitamines. L’analyse des effets de ces facteurs toxiques et protecteurs dans un système vivant se fait à différents niveaux. Mes travaux ont exploré ces interactions aux échelles moléculaire et cellulaire ainsi qu’au travers d’un modèle préclinique de type rongeur. Ils ont permis d’évaluer le potentiel antioxydant de ces composés sous différent angles et dans le contexte insulaire de l’île de La Réunion.La population réunionnaise et plus largement celles des îles de la zone du sud-ouest de l’océan Indien est exposée à des pathogènes présents dans les zones tropicales, plus particulièrement les arbovirus (alphavirus et flavivirus) et les bactéries leptospires. Ces pathogènes infectent l’homme par l’intermédiaire des moustiques vecteurs pour les arbovirus (dengue, zika) et de petits rongeurs réservoirs excréteurs pour les leptospires. A l’UMR PIMIT, mes recherches portent sur ces pathogènes, leurs facteurs de virulence notamment la protéine NS1 de la dengue, et les conséquences physiopathologiques chez l’homme. Les individus infectés se trouvent, particulièrement à la Réunion, dans des contextes métaboliques aggravants de pathologies diabétiques ou d’obésité. Ces comorbidités doivent être prises à prendre en compte dans l’évaluation du rôle de la pathogénicité dans l’évolution de la maladie. Dans cette vision, mes travaux indiquent que les réactivités moléculaires et les atteintes cellulaires sont variables, tout en étant informatives sur le fonctionnement des pathogènes (bactériens et viraux) et de leurs déterminants microbiens dont les PAMPs permettant d’envisager une thérapie adaptée.

Les facteurs exogènes à l’organisme humain peuvent à son contact, provoquer une modulation de sa physiologie. Certains xénobiotiques comme les oxydants, les rayons ionisants, les métaux ou les biotoxines microbiennes génèrent une toxicité dont les effets peuvent être modulés par des composés comme ceux apportés par l’alimentation tels que les composés phénoliques d’origine végétale : l’acide caféique et les vitamines. L’analyse des effets de ces facteurs toxiques et protecteurs dans un système vivant se fait à différents niveaux. Mes travaux ont exploré ces interactions aux échelles moléculaire et cellulaire ainsi qu’au travers d’un modèle préclinique de type rongeur. Ils ont permis d’évaluer le potentiel antioxydant de ces composés sous différent angles et dans le contexte insulaire de l’île de La Réunion.La population réunionnaise et plus largement celles des îles de la zone du sud-ouest de l’océan Indien est exposée à des pathogènes présents dans les zones tropicales, plus particulièrement les arbovirus (alphavirus et flavivirus) et les bactéries leptospires. Ces pathogènes infectent l’homme par l’intermédiaire des moustiques vecteurs pour les arbovirus (dengue, zika) et de petits rongeurs réservoirs excréteurs pour les leptospires. A l’UMR PIMIT, mes recherches portent sur ces pathogènes, leurs facteurs de virulence notamment la protéine NS1 de la dengue, et les conséquences physiopathologiques chez l’homme. Les individus infectés se trouvent, particulièrement à la Réunion, dans des contextes métaboliques aggravants de pathologies diabétiques ou d’obésité. Ces comorbidités doivent être prises à prendre en compte dans l’évaluation du rôle de la pathogénicité dans l’évolution de la maladie. Dans cette vision, mes travaux indiquent que les réactivités moléculaires et les atteintes cellulaires sont variables, tout en étant informatives sur le fonctionnement des pathogènes (bactériens et viraux) et de leurs déterminants microbiens dont les PAMPs permettant d’envisager une thérapie adaptée.

Dengue virus (DENV) is part of the Flaviviridae family and has been classify by the Word Health Organization (WHO) as one of the top 10 health concerns. It is the most widespread mosquito-borne human disease. Considering the increasing number of severe dengue, the expansion of the vector territory due to climate change and population movement, it is urgent to find a way to counteract the virus. Indeed, currently there is no treatment available and despite the large number of molecules that proved efficacy in vitro rare are the compounds that have been further evaluated and lead to clinical trials. Development of antiviral is a promising complementary strategy to vaccine production. This review introduces the DENV antivirals and the notions of direct acting antiviral versus host targeted antiviral. It underlines the importance to develop multiple potent antivirals and the relevance to maintain research on this matter.

Le virus West Nile a été identifié pour la première fois en 1937 en Ouganda, il est transmis essentiellement par des moustiques du genre Culex sp. C'est un arbovirus de la famille des Flaviviridae infectant les oiseaux. Ce virus fait parler de lui dans les pays du pourtour méditerranéen depuis les années 1990. En 1999 ce virus fait son apparition en Amérique du Nord, il se répand sur l'ensemble du territoire nord-américain durant les dix années qui vont suivre. Ce virus va devenir la principale cause d'encéphalites arbovirales aux Etats-Unis. La sévérité des symptômes et sa transmission via transfusion et transplantations d'organes ont nécessité la mise en place de tests de dépistages et des réseaux de surveillance, pour mieux comprendre la biologie, l'écologie et l'épidémiologie de ce virus. En Europe, les épidémies sont plus limitées, mais la récurrence de ces épidémies dans certaines régions est inquiétante. L'infection est souvent asymptomatique, mais des symptômes grippaux et des désordres neurologiques plus graves pouvant entraîner la mort peuvent survenir. Des études sont réalisées afin de mettre au point des solutions thérapeutiques qui sont actuellement absentes et des mesures prophylactiques.

Because of their highly transmission potential, their speed of dissemination that can be dazzling, and the disease severity they might induced, flaviviruses are of great concern. West Nile virus (WNV) is currently one of the most common arboviruses (arthropod-borne virus) in the world and its high ability to (re-)emerge causes a global public health problem. This virus is responsible for many cases of severe neurological diseases, sometimes fatal, especially in humans and horses. No human anti-WNV treatment or vaccine is currently available. The role(s) of the Flavivirus membrane protein (M) is/are still poorly characterized. This glycoprotein is anchored in the viral membrane and plays an important structural role in the processes of fusion and maturation of viral particles. In addition, the M protein has recently been associated with Japanese Encephalitis and Zika-induced pathogenesis (de Wispelaere et al., 2016; Yuan et al., 2017), suggesting that this protein contains viral determinants essential for virulence. In order to study the underlying mechanisms, we substituted the isoleucine residue located in position 36 of the ectodomain of the M protein with a phenylalanine (M-I36F), and demonstrated that this mutation causes a steric hindrance that directly affects the structure of the M protein. The introduction of a second mutation (substitution of the alanine residue at position 43 with a glycine which has no side chain) in the same protein allowed stabilization of the M-I36F mutation. If the M-I36F mutation alone or associated with the M-A43G mutation does not affect the early stages (entry, translation, replication) of the viral cycle, it is however at the origin of a change in the morphology of viral particles in the mammalian host. In addition, our study strongly suggests that the secretion of newly formed WNV particles from the endoplasmic reticulum, a still poorly described stage of the viral cycle, directly depends on their morphology. Finally, this study allowed us to develop a rationally designed WNV attenuation model, which was tested in vivo in a previously described mouse model of WNV-induced encephalitis. The complete protection against a lethal challenge with the wild-type virus of mice previously infected with the double mutant virus makes this mutant virus a potential candidate vaccine. This study is being filed for a patent application.; En raison de leur potentiel élevé de transmission, de leur vitesse de dissémination qui peut être fulgurante et des maladies parfois sévères qu’ils induisent, les Flavivirus sont considérablement préoccupants. Le virus West Nile (WNV) est actuellement l'un des arbovirus (arthropod-borne virus)le plus répandu dans le monde et sa forte capacité de (ré)émergence pose un problème de santé publique important. Ce virus est responsable de nombreux cas de maladies neurologiques sévères, parfois mortelles, notamment chez l’Homme et les chevaux. Aucun traitement ou vaccin humain anti-WNV n’est actuellement disponible sur le marché. Le(s) rôle(s) de la protéine de membrane (M) des Flavivirus est/sont encore peu caractérisé(s). Cette glycoprotéine est ancrée dans la membrane virale et joue un rôle structural important dans les processus de fusion et de maturation des particules virales. De plus, la protéine M a récemment été associée à la pathogénèse induite par les virus de l’encéphalite japonaise et du Zika (de Wispelaere et al., 2016; Yuanet al., 2017), suggérant que cette protéine contient des déterminants viraux essentiels à la virulence. Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents, nous avons substitué le résidu isoleucine localisé en position 36de l’ectodomaine de la protéine M par une phénylalanine (M-I36F), et démontré que cette mutation provoque un encombrement allostérique qui affecte directement la structure de la protéine M.L’introduction d’une seconde mutation (substitution de l’alanine en position 43 par une glycine, résidu ne possédant pas de chaine latérale) dans la même protéine nous a permis de stabiliser la mutation MI36F. Si la mutation M-I36F seule ou associée à la mutation M-A43G n’affecte pas les étapes précoces (entrée,traduction, réplication) du cycle viral, elle est cependant à l’origine d’une modification de la morphologie des particules virales chez l’hôte mammifère. De plus, notre étude suggère que la sécrétion des particules de WNV néo-formées hors du réticulum endoplasmique, une étape encore peu caractérisée du cycle viral, dépend directement de leur morphologie. Enfin, cette étude nous a permis de mettre au point un modèle d’atténuation du WNV rationnellement dessiné, qui a été testé in vivo dans un modèle murin décrit d’encéphalite induite par le WNV. La protection complète induite par le virus double mutant, que nous observons lors d’une épreuve létale avec le virus sauvage, fait de ce virus mutant un potentiel candidat vaccin. Cette étude fait l’objet d’un dépôt de brevet.

La dengue est une maladie vectorielle en pleine expansion géographique et dont l’incidence ne cesse d’augmenter. Infection généralement bénigne, elle se présente parfois sous des formes sévères entraînant de graves troubles et une mise en jeu du pronostic vital. Actuellement aucun traitement antiviral n’est disponible. La prévention contre la maladie reposait essentiellement sur des mesures antivectorielles, jusqu’à la commercialisation en fin 2015, d’un premier vaccin le Dengvaxia®.Cependant trois ans après son homologation, les autorités philippines ont décidé de suspendre l’utilisation du vaccin dans leur territoire pour des raisons de sécurité.Cette thèse a pour but de faire le point sur l’efficacité et la sécurité du vaccin durant les trois années qui ont suivi sa commercialisation, afin d’évaluer l’intérêt et la place du Dengvaxia® dans la stratégie de lutte contre la dengue.

Because of their highly transmission potential, their speed of dissemination that can be dazzling, and the disease severity they might induced, flaviviruses are of great concern. West Nile virus (WNV) is currently one of the most common arboviruses (arthropod-borne virus) in the world and its high ability to (re-)emerge causes a global public health problem. This virus is responsible for many cases of severe neurological diseases, sometimes fatal, especially in humans and horses. No human anti-WNV treatment or vaccine is currently available. The role(s) of the Flavivirus membrane protein (M) is/are still poorly characterized. This glycoprotein is anchored in the viral membrane and plays an important structural role in the processes of fusion and maturation of viral particles. In addition, the M protein has recently been associated with Japanese Encephalitis and Zika-induced pathogenesis (de Wispelaere et al., 2016; Yuan et al., 2017), suggesting that this protein contains viral determinants essential for virulence. In order to study the underlying mechanisms, we substituted the isoleucine residue located in position 36 of the ectodomain of the M protein with a phenylalanine (M-I36F), and demonstrated that this mutation causes a steric hindrance that directly affects the structure of the M protein. The introduction of a second mutation (substitution of the alanine residue at position 43 with a glycine which has no side chain) in the same protein allowed stabilization of the M-I36F mutation. If the M-I36F mutation alone or associated with the M-A43G mutation does not affect the early stages (entry, translation, replication) of the viral cycle, it is however at the origin of a change in the morphology of viral particles in the mammalian host. In addition, our study strongly suggests that the secretion of newly formed WNV particles from the endoplasmic reticulum, a still poorly described stage of the viral cycle, directly depends on their morphology. Finally, this study allowed us to develop a rationally designed WNV attenuation model, which was tested in vivo in a previously described mouse model of WNV-induced encephalitis. The complete protection against a lethal challenge with the wild-type virus of mice previously infected with the double mutant virus makes this mutant virus a potential candidate vaccine. This study is being filed for a patent application., En raison de leur potentiel élevé de transmission, de leur vitesse de dissémination qui peut être fulgurante et des maladies parfois sévères qu’ils induisent, les Flavivirus sont considérablement préoccupants. Le virus West Nile (WNV) est actuellement l'un des arbovirus (arthropod-borne virus)le plus répandu dans le monde et sa forte capacité de (ré)émergence pose un problème de santé publique important. Ce virus est responsable de nombreux cas de maladies neurologiques sévères, parfois mortelles, notamment chez l’Homme et les chevaux. Aucun traitement ou vaccin humain anti-WNV n’est actuellement disponible sur le marché. Le(s) rôle(s) de la protéine de membrane (M) des Flavivirus est/sont encore peu caractérisé(s). Cette glycoprotéine est ancrée dans la membrane virale et joue un rôle structural important dans les processus de fusion et de maturation des particules virales. De plus, la protéine M a récemment été associée à la pathogénèse induite par les virus de l’encéphalite japonaise et du Zika (de Wispelaere et al., 2016; Yuanet al., 2017), suggérant que cette protéine contient des déterminants viraux essentiels à la virulence. Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents, nous avons substitué le résidu isoleucine localisé en position 36de l’ectodomaine de la protéine M par une phénylalanine (M-I36F), et démontré que cette mutation provoque un encombrement allostérique qui affecte directement la structure de la protéine M.L’introduction d’une seconde mutation (substitution de l’alanine en position 43 par une glycine, résidu ne possédant pas de chaine latérale) dans la même protéine nous a permis de stabiliser la mutation MI36F. Si la mutation M-I36F seule ou associée à la mutation M-A43G n’affecte pas les étapes précoces (entrée,traduction, réplication) du cycle viral, elle est cependant à l’origine d’une modification de la morphologie des particules virales chez l’hôte mammifère. De plus, notre étude suggère que la sécrétion des particules de WNV néo-formées hors du réticulum endoplasmique, une étape encore peu caractérisée du cycle viral, dépend directement de leur morphologie. Enfin, cette étude nous a permis de mettre au point un modèle d’atténuation du WNV rationnellement dessiné, qui a été testé in vivo dans un modèle murin décrit d’encéphalite induite par le WNV. La protection complète induite par le virus double mutant, que nous observons lors d’une épreuve létale avec le virus sauvage, fait de ce virus mutant un potentiel candidat vaccin. Cette étude fait l’objet d’un dépôt de brevet.

Emerging and re-emerging vector-borne viral diseases such as dengue, chikungunya or zika are responsible for many severe epidemics worldwide. Recently, the rapid spread of zika virus (ZIKV) worldwide and the serious neurological complications associated with ZIKV infection have prompted the World Health Organization (WHO) to declare ZIKV a public health emergency. Today, preventive or curative measures against ZIKV infection are almost non-existing. On the other hand, the endemic flora of Reunion Island is known as a rich, renewable and promising source of natural anti-infective products. The registration of 19 medicinal plants from Reunion Island in the French pharmacopoeia highlights the therapeutic potential of natural substances derived from local biodiversity. The work was dedicated to the identification of natural anti-ZIKV substances from a selection of seven medicinal plants from La Reunion registered in the French pharmacopoeia. In a first step, in collaboration with a local start-up (Bourbon Extracts), a solvent-free microwave-assisted extraction was applied to the seven selected plants in order to obtain eco-extracts. In a second step, the screening for antiviral activity, using a ZIKV molecular clone with a reporter gene, allowed the identification of two candidate plants: Aphloia theiformis and Psiloxylon mauritianum. After verifying the absence of cytotoxicity and genotoxicity of the active extracts, the antiviral activity was also demonstrated on other types of extracts using traditional extraction methods (infusion, decoction and maceration). The antiviral activity has been validated on different strains of ZIKV (historical and epidemic) as well as on the four serotypes of the dengue virus. Finally, the mode of action of the two active extracts has been studied. It has been shown that the eco-extracts from A. theiformis and P. mauritianum target the early steps of the viral cycle by inhibiting the attachment of the virus to the host cell. Using electron microscopy, it has been shown that the eco-extract of A. theiformis deforms the viral particle preventing its attachment to the membrane of the host cell. These results demonstrate the importance of medicinal plants from Reunion Island as a source of natural anti-infectious substances., Les maladies virales à transmission vectorielle émergentes et ré-émergentes comme la dengue, le chikungunya ou le zika sont responsables de nombreuses épidémies sévères à travers le monde. Récemment, la propagation rapide et très étendue du virus zika (ZIKV) ainsi que les complications neurologiques graves liées à l’infection par ZIKV ont incité l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) à déclarer le ZIKV comme une urgence de santé publique mondiale. Aujourd’hui, les mesures préventives ou curatives de l’infection par ZIKV sont quasiment inexistantes. D’autre part, la flore endémique de La Réunion est connue comme une source riche, renouvelable et prometteuse en produits naturels anti-infectieux. L’inscription à la pharmacopée française de 19 plantes médicinales réunionnaises souligne le potentiel thérapeutique des substances naturelles issues de la biodiversité locale. Les travaux ont été consacrés à l’identification de substances naturelles anti-ZIKV issues d’une sélection de sept plantes médicinales réunionnaises inscrites à la pharmacopée française. Dans une première étape, une extraction sans solvant assistée par micro-ondes a été appliquée sur les sept plantes médicinales sélectionnées afin d’obtenir des éco-extraits. Dans une deuxième étape, le criblage de l’activité antivirale, en utilisant un clone moléculaire du ZIKV avec un gène rapporteur, a permis d’identifier deux éco-extraits actifs provenant de Aphloia theiformis et de Psiloxylon mauritianum. Après avoir vérifié l’absence de cytotoxicité et de génotoxicité des extraits actifs, l’activité antivirale a été aussi démontrée sur d’autres types d’extraits réalisés via des méthodes d’extractions traditionnelles (infusion, décoction et macération). L’activité antivirale a été validée sur différentes souches de ZIKV (historique et épidémique) ainsi que sur les 4 sérotypes du virus de la dengue. Enfin, le mode d’action des deux extraits actifs a été étudié. Il a été montré que les éco-extraits d’A. theiformis et de P. mauritianum ciblent les phases précoces du cycle viral en inhibant l’attachement du virus à la cellule hôte. À l’aide de la microscopie électronique, il a été montré que l’éco-extrait d’A. theiformis déforme la particule virale empêchant cette dernière de s’attacher à la membrane de la cellule hôte. Ces résultats démontrent l’importance des plantes médicinales réunionnaises comme source de substances naturelles anti-infectieuses.

Usutu virus, an arbovirus discovered in Africa in 1959, has spread over a large part of Europe over the last twenty years causing significant bird mortality as reported in France since 2015. The zoonotic risk, associated with this succession of avian epizootics in Europe, deserves to be taken into account even if human cases remain rare to date. Human infections are most often asymptomatic or present a benign clinical expression. However, neurological complications such as encephalitis or meningoencephalitis have been described. In addition, the recent description of an atypical case of facial paralysis in France suggests that the clinical spectrum of infections caused by Usutu virus is not fully characterized. Finally, the recent history of other arboviral outbreaks invites the scientific community to be extremely vigilant.

Among emerging mosquito-borne viruses (arboviruses), flaviviruses like Dengue, Zika and West Nile virus (WNV) are very often involved in outbreaks. WNV causes several neuroinvasive diseases, which can be lethal, in humans and horses each year. This virus is a threat for both, human and animal public health. Furthermore, there is no human vaccine currently or any specific antiviral treatments against WNV.Among viral factors which are essential for flavivirus infection, the nonstructural glycoprotein NS1 is a multifunctional protein. The secreted form sNS1, is released in the extracellular medium from infected cells and is strongly involved in immune system dysregulation. The functions of sNS1 play roles in immune escape and, paradoxically, in pathogenesis which is observed in severe forms of the disease. Because most of this data are about Dengue Virus, we would like to study, in vitro, functional properties of the sNS1WNV during infection of epithelial, glial and neuronal mammalian cells. Based on the high sNS1 protein structure similarities among flaviviruses, our hypothesis suggests a role of sNS1WNV in neuroinvasive infections.The sNS1WNV protein doesn’t seem to modulate viral infection steps. However, it is involved in actin cytoskeleton remodeling in epithelial cells. sNS1WNV is also involved in the activation of antiviral response pathways in non-infected neuronal cells. On the other hand, by targeting sNS1 and envelope protein E of WNV, we performed a screening of aRep molecules (artificial proteins with alphahelicoïdal repeats) and isolated ligands with high affinity for these viral factors. Because this new type of molecules is able to specifically bind to sNS1 and E, they have potential to be used for the development of new diagnostic tools and antiviral therapeutic agents; Parmi les virus émergents transmis par des moustiques (arbovirus), le genre flavivirus est fortement représenté avec les virus Dengue, Zika, et le virus West Nile (WNV). Le WNV est responsable de nombreux cas de maladies neuroinvasives sévères, parfois mortelles, chez l'humain et les chevaux. Ce virus représente donc un problème de santé publique humaine et animale. Il n'existe pour le moment aucun vaccin humain ni aucun traitement spécifique anti-WNV.Parmi les déterminants viraux essentiels à l'infection par les flavivirus, la glycoprotéine non-structurale NS1 possède des propriétés multifonctionnelles. La forme sNS1, sécrétée dans le milieu extracellulaire, est fortement impliquée dans la dérégulation du système immunitaire de l'hôte. Ces mécanismes participent à l'évasion du virus à la réponse antivirale et, paradoxalement, à la pathogenèse observée dans les formes sévères de la maladie. L'essentiel de ces données concernant le virus de la Dengue, nous souhaitions étudier les propriétés fonctionnelles, in vitro, de la protéine sNS1WNV au cours de l'infection de cellules épithéliales, gliales et neuronales de mammifères. En effet, la structure des protéines sNS1 de flavivirus étant très similaire, notre hypothèse suppose un rôle de sNS1WNV dans les infections neuroinvasives.Si la protéine sNS1WNV ne semble pas moduler les étapes de l'infection virale, elle est cependant à l'origine d'un remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules épithéliales. Elle est aussi impliquée dans l'activation de voies antivirales chez les cellules neuronales non infectées. D'autre part, en ciblant sNS1 et la protéine d'enveloppe E du WNV, nous avons pu isoler, par criblage de molécules aRep (protéines artificielles à motifs répétés), des ligands de haute affinité pour ces déterminants viraux. Ces nouvelles molécules, capables de se lier spécifiquement aux protéines sNS1 et E, ont le potentiel pour servir de base au développement de nouveaux outils de diagnostics et d'agents thérapeutiques antiviraux

National audience; Usutu virus (USUV) is an emerging arbovirus, close to the West Nile virus (WNV), which was first isolated in South Africa in 1959. This flavivirus has spread to a large part of the European continent, causing bird deaths, particularly in 2018. Although human infection seems to be mostly asymptomatic, several cases of neurological complications (encephalitis, meningoencephalitis) have been described. The description in Montpellier of an atypical case of Bell's palsy suggests that the clinical spectrum of USUV-related infections may be more extensive than expected and highlights our limited knowledge of the pathophysiology of this emerging virus.; Le virus Usutu (USUV) est un arbovirus émergent, proche du virus West Nile (WNV), isolé pour la première fois en Afrique du Sud en 1959. Ce flavivirus s’est propagé sur une grande partie du continent européen, provoquant des mortalités aviaires importantes, notamment en 2018. Même si l’infection humaine semble le plus souvent asymptomatique, plusieurs cas de complications neurologiques (encéphalites, méningoencéphalites) ont été décrits. La description à Montpellier d’un cas atypique de paralysie faciale a frigore suggère que le spectre clinique des infections liées à l’USUV pourrait être plus étendu qu’attendu et met en lumière nos faibles connaissances concernant la physiopathologie de ce virus émergent.

National audience

Flaviviruses with a major impact in veterinary medicine are widely distributed (e.g. West Nile fever (WNF) has spread across the five continents and Japanese Encephalitis (JE) is reported in South-East Asia) and are mainly responsible for neurological diseases in humans and/or horses.After flavivirus infection, viremia in mammal hosts is generally short and consequently indirect methods are mostly used to diagnose flavivirus infections. However, frequent spatial overlapping in their circulation areas renders the interpretation of serological assays difficult. Indeed, cross-reactions between flaviviruses are observed in rapid serological tests such as in ELISA and immunofluorescence assays (IFA). Serological assay results should thus be confirmed by the tedious comparative virus neutralization test (VNT) using a panel of viruses known to circulate in the area. Moreover, the risk of emergence of new flaviviruses such as reported recently with the Zika virus in Brazil or in North America should be considered when studying flavivirus epidemiology.In the first section, a new strategy aiming at improving the serological diagnosis of flavivirus infections was developed using the multiplexing capacity of microsphere immunoassays (MIA). The flavivirus soluble envelope (sE) glycoprotein ectodomain is composed of three domains (D), e.g. DI, DII and DIII, with EDIII containing virus-specific epitopes. Recombinant EDIIIs of different flaviviruses were synthesized in the Drosophila S2 expression system. The microspheres coupled with rEDIIIs were assayed with equine and ovine sera from natural and experimental flavivirus infections or non-immune samples. Very encouraging results have been obtained and this innovative multiplex immunoassay based on flavivirus rEDIIIs appears to be a powerful alternative to ELISAs and VNTs for veterinary diagnosis of flavivirus-related diseases.MIA with WNV nonstructural 1 protein were also implemented to differentiate Infected from Vaccinated Animals (DIVA). Such a DIVA approach was only successful when horses had been immunized with a recombinant canarypox vaccine, while horses receiving inactivated WNV vaccine developed immune responses close to the ones induced after natural infection.Another pitfall in veterinary medicine is the lack of therapeutics for viral diseases and specifically for flaviviruses. The therapeutic arsenal is indeed rather limited and animals are generally administered supportive treatments only. In the second part, the results of the in vitro testing of a broad spectrum antiviral named sr1057 on WNV and JEV replication are presented. This chemical, identified from a unique screening strategy developed by Pasteur Institute, is probably targeting the host cell and was found to inhibit the replication of varied RNA and DNA viruses belonging to different virus families. The sr1057 compound was not as efficient at inhibiting the replication of flaviviruses as for other RNA+ viruses, with a modest antiviral effect demonstrated for WNV and a higher efficacy on JEV. This antiviral presents however potentials for applications in equine veterinary medicine because it efficiently inhibited equine herpes virus-1 and equine arteritis virus in vitro, as clearly shown by other collaborators.; Les flavivirus ayant un impact en médecine vétérinaire sont largement distribués dans le monde (à l’exemple de la fièvre West Nile (WNF) présente sur les cinq continents ou de l’Encéphalite japonaise (EJ) en Asie du Sud-Est) et sont responsables de maladies à dominante neurologique chez l’homme et/ou le cheval.La virémie étant généralement brève lors de ces infections virales, les méthodes de diagnostic utilisées sont essentiellement sérologiques. Or le chevauchement fréquent des aires de répartition des flavivirus complique le diagnostic sérologique. En effet, des réactions sérologiques croisées entre flavivirus sont observées lors de l’utilisation de méthodes de diagnostic usuelles telles que l’ELISA et l’immunofluorescence (IF). Les résultats sérologiques doivent donc être confirmés par la méthode fastidieuse de séroneutralisation (SNT) virale avec les différents flavivirus existants dans la région. De plus, le risque d’émergence sur un territoire donné de nouveaux flavivirus comme le virus Zika au Brésil ou en Amérique du Nord ne peut être exclu.Nous avons donc développé dans la première partie de ce travail une nouvelle stratégie de diagnostic sérologique multiplexe à l’aide de la méthode d’immuno-essai (MIA) sur billes. Sachant que la glycoprotéine d’enveloppe soluble (sE) des flavivirus est divisée en 3 domaines (D) structuraux, DI, DII et DIII et que les épitopes du DIII sont spécifiques de chaque flavivirus, des protéines EDIII recombinantes de différents flavivirus d’intérêt ont été synthétisées en système d’expression Drosophila S2 et leur antigénicité a été testée sur sérums équins et ovins. Nous avons obtenu des résultats très encourageants en démontrant que l’utilisation des EDIII associée avec la capacité de multiplexage de la méthode MIA apparaît comme une réponse adaptée au défi du diagnostic sérologique des infections à flavivirus.Nous avons en outre utilisé la même méthode de multiplexage mais avec des antigènes NS1 du WNV pour mettre en place un test DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) permettant de différencier les chevaux infectés par le WNV des chevaux vaccinés avec un vaccin recombinant WNV.Un autre écueil en médecine vétérinaire est le traitement des affections à flavivirus. En effet l’arsenal thérapeutique est limité et le traitement est avant tout symptomatique. Nous avons dans la seconde partie de ce travail testé in vitro une molécule antivirale à large spectre, le sr1057 sur nos virus d’intérêt (WNV et JEV). Cette molécule qui provient d’une stratégie de criblage développée par l’Institut Pasteur a probablement pour cible la cellule de l’hôte car elle est capable d’inhiber des virus très différents, à génome à ARN de polarité positive ou négative et ADN.Les résultats que nous avons obtenus avec ce composé sont en demi-teinte pour les flavivirus testés avec une efficacité démontrée pour le JEV mais plus modeste pour le WNV. Ils n’excluent cependant pas une possible utilisation de cet antiviral en médecine vétérinaire équine car une activité inhibitrice in vitro sur les virus de l’Herpes équin de type I et de l’artérite virale a été confirmée par d’autres collaborateurs.

International audience; Since its discovery in 1947 in Uganda, the Zika virus (ZIKV) remained in the shadows emerging in 2007 in Micronesia, where hundreds of dengue-like syndromes were reported. Then, in 2013-2014, it was rife in French Polynesia, where the first neurological effects were observed. More recently, its arrival in Brazil was accompanied by an unusually high number of children with microcephaly born to mothers infected with ZIKV during the first trimester of pregnancy. In 2016, the World Health Organization declared ZIKV infection to be a public health emergency and now talks about a ZIKV pandemic. This review aims to summarize the current knowledge about ZIKV infection, successively addressing its transmission, epidemiology, clinical aspects, diagnosis, treatment, and prevention before discussing some perspectives.; Depuis sa découverte en 1947, en Ouganda, le virus Zika (ZIKV) est resté tapis dans l’ombre pendant près de 60 ans. En 2007, il émerge en Micronésie, où plusieurs centaines de syndromes dengue like sont rapportés. Puis, en 2013-2014, il sévit en Polynésie française, où les premières atteintes neurologiques sont observées. Plus récemment, son introduction au Brésil s’accompagne d’un nombre anormalement élevé de microcéphalies chez des enfants nés de mères infectées par ZIKV au cours du premier trimestre de grossesse. En 2016, l’Organisation mondiale de la santé déclare l’infection à ZIKV comme étant une urgence de santé publique et parle de pandémie à ZIKV. Cette revue a pour objectif de faire une synthèse des connaissances actuelles sur l’infection par ZIKV en abordant successivement sa transmission, son épidémiologie, ses aspects cliniques, diagnostics, thérapeutiques et préventifs avant d’ouvrir sur quelques perspectives.

Since its discovery in 1947 in Uganda, the Zika virus (ZIKV) remained in the shadows emerging in 2007 in Micronesia, where hundreds of dengue-like syndromes were reported. Then, in 2013-2014, it was rife in French Polynesia, where the first neurological effects were observed. More recently, its arrival in Brazil was accompanied by an unusually high number of children with microcephaly born to mothers infected with ZIKV during the first trimester of pregnancy. In 2016, the World Health Organization declared ZIKV infection to be a public health emergency and now talks about a ZIKV pandemic. This review aims to summarize the current knowledge about ZIKV infection, successively addressing its transmission, epidemiology, clinical aspects, diagnosis, treatment, and prevention before discussing some perspectives., Depuis sa découverte en 1947, en Ouganda, le virus Zika (ZIKV) est resté tapis dans l’ombre pendant près de 60 ans. En 2007, il émerge en Micronésie, où plusieurs centaines de syndromes dengue like sont rapportés. Puis, en 2013-2014, il sévit en Polynésie française, où les premières atteintes neurologiques sont observées. Plus récemment, son introduction au Brésil s’accompagne d’un nombre anormalement élevé de microcéphalies chez des enfants nés de mères infectées par ZIKV au cours du premier trimestre de grossesse. En 2016, l’Organisation mondiale de la santé déclare l’infection à ZIKV comme étant une urgence de santé publique et parle de pandémie à ZIKV. Cette revue a pour objectif de faire une synthèse des connaissances actuelles sur l’infection par ZIKV en abordant successivement sa transmission, son épidémiologie, ses aspects cliniques, diagnostics, thérapeutiques et préventifs avant d’ouvrir sur quelques perspectives.

La fièvre West Nile est une maladie virale transmise à l'Homme et au cheval par les moustiques. Les hôtes réservoirs sont des oiseaux sauvages, essentiellement des passereaux. En Europe, l'incidence des cas neurologiques humains et équins a brutalement augmenté dans les années 2000, en particulier à partir de 2010. L'étude présentée ici montre qu'une température excessive en juillet, une anomalie positive de l'indice d'eau à différence normalisée modifié en juin, la présence de zones humides, de couloirs migratoires aviaires, l'occurrence d'une épidémie l'année précédente et la densité de population humaine sont des facteurs de risque d'occurrence de la maladie. Une large part de la variabilité de l'intensité de transmission du virus West Nile en Europe dépend donc des conditions environnementales. Néanmoins, d'autres facteurs entrent en jeu, tels que la densité des oiseaux ou les préférences trophiques des moustiques vecteurs présents. Ces facteurs devront être pris en compte dans l'avenir pour améliorer les performances des modèles prédictifs et ainsi permettre la mise en place d'une surveillance ciblée dans le temps et l'espace, ou de mesures de prévention appropriées.

La fièvre West Nile est une arbovirose émergente endémique au Sénégal, surtout dans la région du fleuve Sénégal et dans le Ferlo. Les oiseaux sont les principaux hôtes-réservoirs et assurent la diffusion du virus des régions infectées vers des régions indemnes à travers les flux migratoires d'oiseaux. La transmission du virus d'un hôte infecté à un hôte sain se fait par le biais de vecteurs qui sont généralement des moustiques. Au Sénégal, bien que plusieurs études aient été faites sur la maladie, beaucoup de questions restent à être élucidées dans les cycles de transmission complexes qui dépendent largement des conditions climatiques et environnementales locales. La région du Ferlo et le Delta du fleuve Sénégal sont deux régions aux faciès écologiques différents. La région agropastorale du Ferlo est constituée de vallées fossiles inondables en saison des pluies et forme des mares temporaires qui disparaissent progressivement avec l'installation de la saison sèche. Tandis que le Delta du fleuve est constitué de vastes étendues aménagées pour la riziculture irriguée dont la principale source en eau est le fleuve Sénégal. Dans ces deux régions aux contextes géographiques et environnementaux différents, l'exploitation des terres par les populations humaines et animales est fortement liée à l'eau qui malheureusement permet le développement de vecteurs d'arbovirus comme ceux de la West Nile. La transmission du virus West Nile est complexe dans ces régions, car elle implique plusieurs intervenants dont des vecteurs (Aedes et/ou Culex) d'écologies différentes, des hôtes résidents ou migrateurs autour d'un environnement favorable (mare temporaire, fleuve). Il en est de même de l'endémisation du virus car les réservoirs sont peu étudiés. Afin de mieux comprendre l'écologie du virus de la West Nile dans ces écosystèmes, nous avons effectué des enquêtes entomologiques par différentes techniques (piège lumineux avec CO2, piège à appât poulet, piège à appât pigeon, piège à appât cheval, aspiration) et des enquêtes sérologiques sur les poulets sentinelles pendant la période à fort risque de transmission. Nous avons aussi, à partir d'observations faites sur le terrain, prélevé des échantillons de sol par raclage au niveau de potentiels gîtes de repos et de ponte du moustique Aedes vexans arabiensis que nous avons comparés avec des expériences effectuées au laboratoire. Les résultats obtenus sont assez encourageants et contribuent à une meilleure connaissance de l'écologie de ce virus dans ces écosystèmes et par conséquent de l'épidémiologie de la maladie. L'intérêt de ce travail est de mettre en évidence le rôle de chacun des acteurs étudiés impliqués dans le cycle épidémiologique de la maladie et les interactions qui peuvent exister entre ces différents intervenants et le milieu. Le schéma de surveillance que nous avons proposé pourra être utilisé pour la détection précoce de la circulation du virus au Sénégal dans le cadre d'un système de surveillance de la West Nile. Cependant, les efforts de recherche doivent être poursuivis pour mieux cerner son épidémiologie et développer des méthodes de prévention et de lutte efficientes.

Dengue is a recent disease in human history, but its strong expansion in recent decades (in 2008, experts estimated that 40% of the world population is exposed), makes of this arbovirose a major problem of public health. While the disease is expressed weakly in most cases (or in the form of a simple fever), dengue gives more and more severe disease with vascular leakage and hemorrhage. The explosion of cases in epidemics has led health authorities to develop effective control measures against dengue. The search for a vaccine has become a priority. The characteristics of the disease, the presence of four serotypes, the role of the immune response in the pathogenesis, the lack of animal models are the difficulties that laboratories have to face. Despite these problems a panel of vaccine candidates including live attenuated vaccines, chimeric vaccines, inactivated vaccines and naked DNA vaccine, vectored vaccine or finally replication incompetent vaccine. Of these, some are at different stages of clinical development is well advanced, the chimeric vaccine VJF17D of Acambis / Sanofi-Pasteur has established itself as the current leader. It entered into clinical phase III, and could be marketed by 4 or 5 years.; La dengue est une maladie récente dans l'histoire de l'homme mais sa forte expansion lors des dernières décennies (en 2008, les experts estimaient que 40% de la population mondiale est exposée), fait de cette arbovirose un problème de santé publique majeur. Alors que la maladie s'exprime faiblement dans la plupart des cas (ou sous la forme d'une simple fièvre), la dengue donne de plus en plus des formes sévères avec fuite vasculaire et hémorragies. L'explosion de ces cas sous forme d'épidémies a conduit les autorités de santé à mettre au point des moyens de lutte efficaces contre la dengue. La recherche d'un vaccin est donc devenue une priorité. Les caractéristiques de la maladie, la présence de quatre sérotypes, le rôle de la réponse immunitaire dans la pathogénèse, l'absence de modèle animal sont des difficultés auxquelles les laboratoires ont dû faire face. Malgré ces problèmes, un panel de candidats vaccins existe comprenant des vaccins vivants atténués, chimériques, inactivés, vaccin ADN nu et vaccin vectorisé ou enfin vaccin à réplication incompétente. Parmi ceux-ci, certains sont à des stades de développement clinique bien avancé, dont le vaccin chimérique VJF17D de Acambis/Sanofi-Pasteur qui s'impose comme le leader actuel. Il est entré en phase clinique III et pourrait être commercialisé d'ici 4 ou 5 ans.

In order to explore the ability of mosquitoes to replicate HCV, we conducted a series of experimentalinfections (four investigations spread between 2006 and 2009) on two different types of mosquito; Aedes(Aedes (Ochlerotatus) caspius Pallas 1771; Aedes (Aedimorphus) vexans Meigen 1830) and Culex Culex(Culex) pipiens Linnaeus 1758 wild (Ae. vexans, Ae. caspius Cx. pipiens) and lab adapted (Ae. vexans). Aftercollecting mosquitoes, females aged between 5 and 10 days were fed by a viremic blood meal, a mixture ofsheep (or rabbit) red blood cells and serum of patients infected with HCV (genotype 1b). The mosquitoeswere then maintained in breeding for several days (15 to 30 days) by making sampling points to monitorthe infection. After development of all stages upstream of the detection conditions (milling and extraction,kits for use…) and detection conditions (choice of method of amplification and detection, kits for use ...)We succeeded to provide evidence of HCV replication in the mosquito Aedes vexans. In the firstexperimental infection, which lasted three weeks and performed on Ae. vexans, we detected HCV RNA in~50% of mosquitoes of the 21st days post-infection (DPI), by endpoint PCR. The second infectionexperiment, conducted on two types of mosquitoes: Aedes sp. and Culex pipiens, has allowed us to: (i)confirmation – by qRT-PCR – the results of the first experiment (presence of HCV RNA in the mosquitoAedes sp. 21 DPI) with an infection rate of ~33%; (ii) demonstrate that only Aedes mosquitoes containedHCV RNA, the Culex mosquitoes were all negative, (iii) show that the RNA detected was issued fromreplication, since adaptive mutations were identified in the sequence of the RdRp (RNA dependent RNApolymerase), Val262 → Ala262, Pro265 → Ser265, and Asn316 → Asp316, with a specificity for the genus ofAedes, since – once again – all Culex mosquitoes at 21 DPI were HCV RNA-negative. Another way todistinguish replication originated RNA from residual RNA was to show dissemination of the virus indifferent mosquito’ tissues. To do this, we conducted a third experimental infection (on Ae. caspius and Ae.vexans), over a period of 15 days and analyzed the presence of HCV RNA separately in the heads andbodies (previously separated by dissection). In conducting samples at different times after infection (0, 4,8 and 15 days), we succeeded to obtain a kinetics of infection separately in heads and bodies, detectionperformed by WTA (whole transcriptome amplification) followed by qPCR. On the day of infection (D0),the infection rate in the heads and bodies of mosquitoes was 9.1% and 100% respectively, the rate rose to57.1% and 85.7% respectively at 15 DPI, after it has been totally negative after eight days post-infection.On the other hand, we have identified adaptive mutations in the IRES sequence of mosquito at 15 DPIcompared to those of day 0. It is interesting to note that HCV RNA-positive mosquitoes all belonged to thevexans species, showing that replication is species specific. Different regions of the HCV genome werethen, amplified. Finally, we made use of lab adapted mosquitoes (lab strain Ae. vexans KK, Team ABFailloux, Bunyavirus Molecular Genetics, Institute Pasteur - Paris). Infection of this strain has also shown,using different approaches for detection (qRT-PCR, qPCR-WTA, HCV-GA namely), that HCV RNA waspresent at 30 DPI in ~33% of heads and ~66% of the mosquito’ bodies, while infection rates were at~28% and ~ 71% in the head and body respectively at 0 DPI. These results were based on sequencingperformed on the amplified regions of the HCV genome. Taken together; these results show that HCV isable to replicate in Ae. vexans mosquitoes, suggesting that HCV, like other flaviviruses, can alternatebetween two hosts (primates and mosquitoes) and has lost its potential for replication in the mosquitoover time, the primate providing a more stable replication environment (longer lifetime)., dans la séquence de la RdRp (ARN Polymérase ARN dépendante), Val262→Ala262, Pro265→Ser265, etAsn316→ Asp316, avec une spécificité pour le genre Aedes, puisque tous les moustiques Culex à 21 JPIétaient ARN VHC-négatifs. Un autre moyen de distinguer l’ARN issu de la réplication de l’ARN résiduel aété de montrer l’existence d’une dissémination au sein du moustique. Pour ce faire, nous avons réalisé unetroisième expérience d’infections (genres Ae. caspius et Ae. vexans), sur une durée de 15 jours et avonsanalysé la présence de l’ARN du VHC distinctement dans les têtes et les corps (préalablement séparés pardissection). En effectuant des prélèvements à différentes dates après infection (0, 4, 8 et 15 jours), nousavons réussi à obtenir une cinétique d’infection, séparément, dans les têtes et dans les corps, détectionréalisée par WTA (Whole Transcriptome Amplification) suivie de qPCR. Au jour de l’infection (J0), le tauxd’infection dans les têtes et les corps des moustiques était de 9,1% et 100% respectivement, ce taux estpassé à 57,1% et 85,7% respectivement à J15 après une négativation huit jours après infection. D’autrepart, nous avons identifié des mutations d’adaptation dans la séquence de l’IRES des moustiques à J15comparés à ceux à J0. Il est intéressant de noter que les moustiques ARN VHC-positifs appartenaient tous àl’espèce vexans, montrant ainsi que la réplication est spécifique d’espèce. Différentes régions du génomedu VHC ont, ensuite, étaient amplifiées. Enfin, nous avons eu recours à des moustiques d’élevage, adaptésaux conditions de laboratoire (souche d’élevage Ae. vexans KK, équipe A-B Failloux, Génétique Moléculairedes Bunyavirus, Institut Pasteur - Paris). L’infection de cette souche a également montré, en utilisantdifférentes approches de détection (qRT-PCR, WTA-qPCR, HCV-GA notamment), qu’à 30 JPI, l’ARN du VHCétait présent dans ~33% des têtes et ~66% des corps, alors que les taux d’infection à J0 étaient de ~28%et ~71% dans les têtes et les corps respectivement. Les résultats se sont appuyés sur des séquençageseffectués sur les régions amplifiées du génome du VHC. L’ensemble de ces résultats montrent que le VHCest capable de se répliquer dans les moustiques du genre Ae. vexans, ce qui suggère que le VHC, à l’imaged’autres Flavivirus, puisse alterner entre deux hôtes (primates et moustiques) et qu’il ait perdu sonpotentiel de réplication chez le moustique au fil du temps, le primate lui fournissant un environnement deréplication plus stable (durée de vie plus longue).

Les surveillances humaine et vétérinaire du virus West Nile (WN) mises en place dès 2002 en Guadeloupe, ont permis de détecter un épisode de circulation virale dans la population équine de l'archipel cette même année. Une surveillance entomologique du WN est nécessaire car elle permettrait de déterminer le(s) vecteur(s) enzootique(s) et épizootique(s) et d'améliorer les connaissance de son cycle épidémiologique afin d envisager des méthodes de luttes adéquates. La thèse présente les modalités de sa mise en place avec les services de Lutte Anti-Vectorielle de la Direction de la Santé et du Développement Social (DSDS), entre avril et août 2004. Après la présentation des principaux résultats, nous discuterons d'une part du fonctionnement de la surveillance et des améliorations proposées; d'autre part, des vecteurs potentiels du WN en Guadeloupe.

To date tick-borne flaviviruses causing hemorrhagic fevers in humans have been isolated in Siberia (Omsk hemorrhagic fever virus), India (Kyasanur Forest disease virus), and Saudi Arabia (Akhurma virus). Because of their potential use as biological weapons for bioterrorism, these 3 viruses require level 4 biosafety handling facilities and have been listed as hypervirulent pathogens by the Center for Disease Control and Prevention. Alkhurma virus was isolated in 1995 from patients with hemorrhagic fever in Saudi Arabia. Current evidence suggests that transmission to humans can occur either transcutaneously either by contamination of a skin wound with the blood of an infected vertebrate or bites of an infected tick or orally by drinking unpasteurized contaminated milk. To date a total of 24 symptomatic human cases have been recorded with a mortality rate at 25% (6/24). Pauci-symptomatic or asymptomatic cases are likely but epidemiologic data are currently unavailable. The complete coding sequence of the prototype strain of Alkhurma virus was determined and published in 2001 based on international research project involving investigators from France, Great Britain, and Saudi Arabia. Phylogenetic studies demonstrate that closest known relative of Alkhurma virus is Kyasanur Forest disease virus and that both viruses share a common ancestor. Genetic analysis of several human strains sequentially isolated over a 5-year period showed a very low diversity. This finding has important potential implications for diagnosis and vaccination.

Since 1998, bluetongue virus has spread in the Mediterranean basin. In 2000, an outbreak of West Nile virus has been reported in horses in the Camargue area in France. In 2003, West Nile was reported in human and horses in the South of France. In the USA, West Nile, which was first reported in New York in 1999, spread all over the country (more than 47 States were infected in 2003). As far as bluetongue is concerned, vaccination with live mono or bivalent vaccines is used in Spain, France and Italy. Concerning West Nile, an inactivated vaccine has been developed but recombinant vaccines will be soon introduced in the American market., La prévention contre les maladies infectieuses à transmission vectorielle repose sur différentes mesures (notamment sanitaires) mais surtout sur la vaccination. En effet, cette stratégie est plus efficace et moins onéreuse que la lutte contre les insectes vecteurs. La dynamique d’évolution et la situation épidémiologique de deux arboviroses (la fièvre catarrhale du mouton et la fièvre du Nil occidental) sont décrites. La prévention vaccinale utilisée ainsi que les types de vaccins utilisés contre ces deux infections sont présentés., Zientara Stéphan. Prévention vaccinale de deux maladies émergentes à vecteur : la fièvre catarrhale du mouton et l'infection à virus West Nile. In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 156 n°3, 2003. pp. 59-62.

Surveillance of the West-Nile's virus in the camargue The epizootie of West-Nile’s infection wich raged in the Camargue in 2000, was the origin of the implementation of a program of surveillance concerning all the animal species involved in the cycle of the virus. This program had for objective to put in evidence the factors susceptibles to favor the re-emergence of this zoonose and to establish a network of alert to prevent any human infection. The program of surveillance of avifaune, placed under Jean HARS’s responsability of the National Office of the Hunting and Wild Fauna (ONCFS) was one of the points particularly remarkable of this study, notably thanks to the excellent coordination of the numerous partners involved in the protocol., L’épizootie de West-Nile qui a sévi en Camargue en 2000 a été l’origine de la mise en place d’un programme de surveillance portant sur l’ensemble des espèces animales impliquées dans le cycle du virus. Ce programme avait pour objectif de mettre en évidence les facteurs susceptibles de favoriser la réémergence de cette zoonose et constituer un réseau d’alerte pour prévenir toute infection humaine. Le programme de surveillance de l’avifaune, placé sous la responsabilité de Jean HARS de l’Office National de la Chasse et de la Faune Sauvage (ONCFS) fut un des points particulièrement remarquable de cette étude, notamment grâce à l’excellente coordination des nombreux partenaires associés au protocole., Schott Pascale. Surveillance du virus West-Nile en Camargue. In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 155 n°3-4, 2002. pp. 245-251.

West Nile fever. epidemiological situation. Riskes for man. epizootic in france 2000-2001 West Nile fever is caused by a positive RNA virus which belongs to the Flaviviridiae family. First described in 1937 in Africa, this virus has been isolated in America, Asia and Europe. The virus is transmitted from birds to birds by hematophagous arthropods (in particular mosquitoes). West Nile infection is usually asymptomatic in humans but can cause severe nervous disorders (encephalitis). In France, during summer 2000, 76 cases of equine infection were reported in South of France. A serological survey has shown that 8,3 % of horses were seropositive. The surveillance of the virus was performed in birds and mosquitoes., Zientara Stéphan. Infection à virus “West Nile”. Situation épidémiologique. Risques pour l’homme. Épizootie en France en 2000-2001. In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 155 n°1-2, 2002. pp. 67-72.

Côte d'Ivoire is an endemic country for yellow fever, but no case was officially notified in recent years. In July 1999, however, one fatal case was reported. A German citizen was infected in the national park of Comoe, in the north eastern area of the country. In order to evaluate the extent of amaril virus circulation and the risk for local people, a virological, entomological and epidemiological investigation was carried out by the ministry of health, the OCCGE, the Côte d'Ivoire Pasteur Institute (IPCI) and the World Health Organisation in the area where the fatal case had been staying. 18 suspected and 24 confirmed mosquito catchers were identified by interview and a blood specimen was collected from each of them. In addition, 159 batches of mosquitoes from which 94 batches of potential vectors were collected; among the suspected cases, 22% were immunised against yellow fever. Serological and virological analyses were made at IPCI and the Paris Pasteur Institute by ELISA technique and isolation on cells cultures and newborn mice. All the suspicious sera and 87.5% of the catchers were positive for IgG anti-amaril virus. One catcher's serum was positive for IgM anti-amaril virus. 11 suspected sera were positive for IgG anti-dengue virus with 1 positive for IgM. 1 strain of amaril virus and 3 strains of Zika virus were isolated from mosquitoes at IPCI and confirmed by CRORA in Dakar. These results indicated that there is a yellow fever and dengue virus are prevalent among the human and vector populations in the study area. Preventive measures must be adopted to protect human beings at risk for amaril infection.

Le virus de la fièvre jaune est un #Flavivirus$ de singe transmis par des moustiques. Les cycles de transmission et les vecteurs sont différents en Afrique de l'Ouest, en Afrique de l'Est et en Amérique du Sud. On distingue les aires d'endémicité où se maintient le virus, en forêt humide et en zone d'émergence, et les aires d'épidémicité où surviennent les épidémies de type intermédiaire ou urbain. Sur les deux continents, le virus circule en forêt par des épizooties mouvantes d'une région à une autre entre singes non immuns. Le virus peut également se maintenir dans une zone, enzootique ou épidémique, par transmission verticlae d'une femelle à sa descendance. Ce type démontré expérimentalement dès 1903 par MARCHOUX et SIMOND chez #Aedes aegypti$, le vecteur urbain de la fièvre jaune, n'a été observé chez ce moustique dans la nature qu'en 1995. Cependant, l'isolement du virus de mâles d'#Ae. furcifer-taylori$ en 1977 au Sénégal avait déjà suggéré que ce mode de transmission se produisait dans a nature. La transmission verticale du virus de la fièvre jaune lui permet de se maintenir, d'une saison des pluies à la suivante, dans les oeufs quiescents d'#Aedes$ et permet d'augmenter le nombre de repas contaminants et la proportion de femelles aptes à transmettre puisqu'elles sont infectantes plus jeunes. (Résumé d'auteur)

The problem of arbovirus infections in Maghreb has been relatively neglected in the pst in spite of a rich diversity of biotopes, the presence of potential reservoirs and vectors, and their position on the flight path of the Palearctic-african bird migration systems, western branch. Moreover, West Nile virus has been isolated from southern Algeria since 1968. From 1979 to 1989, ticks were collected from wild birds, pigeons, bats, rodents, poultry, camels, wild boars, domestic mammals and man, and assayed for viruses. On the whole, 424 ticks were virologically studied from Morocco, 582 from Algeria and 601 from Tunisia. Four tick-borne arboviruses have been isolated so far: three from Morocco, Soldado (Nairovirus), Essaouria (Orbivirus) and Kala Iris (Orbivirus) from Ornithodoros (A.) maritimus ticks parasitizing marine birds, and one from Tunisia, Tunis (Phlebovirus), from Argas reflexus hermanni infesting domestic pigeons. Soldado virus may infect man working into colonies of gulls for ornithological or entomological purposes and this infection is associated with a self-limited febrile illness and pruritus. In addition, antibody to Essaouira virus was detected in a wild rodent in Morocco. On the contrary it is unlike that Tunis virus may infect man because A. r. hermanni is a strickly ornithophilic tick. However, Uukuniemi group antibody has been previously evidenced in wild rodents in Tunisia. Finally, it is not excluded that other, more pathogenic, arboviruses such as Congo-Crimean haemorrhagic fever might be accidentally introduced in this sensitive geographical area.

Les auteurs rappellent les faits historiques, cliniques et épidémiologiques concernant l'infection par les virus de la dengue en Afrique. Ils énumèrent les lieux, les hôtes et les circonstances de l'isolement de différentes souches africaines et rappellent le cycle sauvage du virus dengue 2 au Sénégal. L'isolement de deux souches humaines, pendant l'épizootie de 1990, est en faveur d'un cycle selvatique. Il s'agit en effet des premiers cas humains concomitants d'une épizootie au Sénégal. Les observations cliniques de ces deux cas sont celles d'une arbovirose mineure, sans syndrome de choc ni manifestations hémorragiques, soulignant la pathogénicité atténuée du virus dengue 2 au Sénégal comme dans les autres pays d'Afrique. De récents travaux d'épidémiologie moléculaire ont mis en évidence des caractères génotypiques particuliers de certaines souches africaines par rapport à celles rencontrées dans les régions Pacifique ou Caraïbes. (Résumé d'auteur)

Wesselsbron virus, an African arbovirus group flavivirus, has been isolated in 1989 for the first time in MADAGASCAR from Aedes circumluteolus collected inside primary forest near the village of MAROVITSIKA. Serological studies in man using haemagglutination inhibition test have permitted to think that Wesselsbron virus have circulated quietly in MADAGASCAR. The detection of Wesselsbron antibodies in Lemurs sets the problem of the biological cycle.