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The epididymis, a key organ of male fertility, is the place of maturation and storage of sperm. However, the massive and late arrival of these cells at puberty, long after the setting of self-tolerance, makes them potential targets for the immune system which risks to destroy them. At the same time, the male genital tract, in contact with the external environment, is frequently challenged by ascending pathogens, which, if not controlled, impair fertility. Therefore, the epididymis must develop an efficient immune response against pathogens while establishing effective tolerance towards sperm. Alteration of this equilibrium is involved in 10 to 15% of male infertility cases. Nevertheless, the immune system of the epididymis has long been neglected compared to that of the testis, due to the common and admittedly mistaken idea that the testis conferred their immune protection to the whole genital tract. The work carried out during this PhD. aimed to strengthen the available knowledge on cellular and molecular actors involved in the maintenance of the immune balance in the murine epididymis. My first objective was to identify and quantify the mononuclear phagocyte and lymphocyte populations present, at steady state, in the tissue. I identified and located three lymphocyte populations never described in the murine epididymis. The rest of my work focused on Transforming growth factor-beta (TGF-β), whose signaling pathway is involved in sperm tolerance in mice, but, its receptors had not been fully described in the organ. We have shown that the three TGF-β isoforms and their receptors are differently expressed throughout the organ, suggesting various roles in epididymal physiology, in addition to sperm tolerance.These studies have shown the diverse potential mechanisms involved in epididymal immune balance and offer many avenues for research to improve treatments of male infertility of immunological origin.; L’épididyme, organe clé de la fertilité masculine, est le lieu de maturation et de stockage des spermatozoïdes. Cependant, l’arrivée massive et tardive de ces cellules à la puberté, longtemps après la mise en place du répertoire du soi, en fait des cibles potentielles pour le système immunitaire qui risque de les détruire. Dans le même temps, l’épididyme est fréquemment la cible d’infections rétrogrades qui, non contrôlées, altèrent la fertilité. Par conséquent, l’épididyme doit mettre en place une réponse immunitaire efficace contre les agents pathogènes tout en établissant une tolérance envers les spermatozoïdes. Une altération de cet équilibre est impliquée dans 10 à 15% des cas d’infertilité masculine. Le testicule a longtemps été considéré, à tort, comme le seul organe possédant une immunité dans le tractus génital mâle, induisant un retard dans l’étude des autres organes, dont l’épididyme.Les travaux menés au cours de cette thèse visaient à compléter les connaissances disponibles sur les acteurs cellulaires et moléculaires potentiellement impliqués dans les mécanismes de maintien de l’équilibre immun dans l’épididyme murin. Mon premier objectif était d’identifier et de quantifier les populations de phagocytes mononucléaires et de lymphocytes, présents dans le tissu en contexte physiologique. J’ai ainsi identifié et localisé trois populations lymphocytaires jamais décrites dans l’épididyme murin. La suite de mes travaux a porté sur l’étude du Transforming growth factor-beta (TGF-β), dont la voie de signalisation est impliquée dans la tolérance aux spermatozoïdes chez la souris, sans que la molécule ou ses récepteurs y soient totalement décrits. Nous avons ainsi montré que les 3 isoformes du TGF-β et de ses récepteurs sont exprimées de manière différentielle tout au long de l’organe, suggérant des rôles variés dans la physiologie épididymaire, en plus de la tolérance aux spermatozoïdes.Ces études ont montré la richesse des mécanismes potentiellement impliqués dans l’équilibre immun épididymaire et offrent de nombreuses pistes de recherche qui viseraient à améliorer les traitements de l’infertilité masculine d’origine immunologique.

This review describes necrospermia, its diagnosis, causes and management. Sperm vitality is commonly assessed in the laboratory of reproductive biology, with the eosin test or with the hypo-osmotic swelling test. Necrospermia is defined by a percentage of living spermatozoa inferior to 58%, and can be related to male infertility. Several pathological mechanisms may be involved and can be classified either in testicular causes (hyperthyroidism, local hyperthermia, varicocele), or post-testicular causes (epididymal necrospermia, dysregulation of seminal plasma, adult polycystic kidney disease, vasectomy reversal, anti-sperm antibodies) or both (infection, toxic, age, spinal cord injury). The first treatment is to correct the underlying cause, if possible. Repetitive ejaculation has demonstrated to be effective as well. Many drugs would also improve the sperm vitality (antioxidants, non-and-steroidal anti-inflammatory drugs) but there is currently no guideline to recommend their use. With necrospermia, fertilization rates are lower but in vitro fertilization (IVF) with Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) improves the chances of conception.

The acquisition of fertile spermatozoa is a long and multi-stage process, beginning with the production of male gametes in the testis. Spermatozoa then undergo two successive maturation steps, first during the epididymal transit and then in the female genital tract during the capacitation process. The post-testicular maturation particularly impacts sperm lipid composition, leading to a higher membrane fluidity considered to be essential for fertilization.The results presented in this work show the importance of epididymal lipid homeostasis for sperm lipid maturation and acquisition of fertilizing ability. At the molecular level, lipid homeostasis is regulated by the LXRs (α and β isoforms), the oxysterol nuclear receptors (NR1H3 and NR1H2, respectively). A cholesterol-enriched diet in young LXR-null mice leads to infertility with a specific epididymal alteration. Sperm epididymal maturation is altered, leading to defects in lipid and protein composition of the spermatic plasma membrane. These defects have detrimental effects on the capacitation process, characterized by disturbances of calcium flows and tyrosine phosphorylation.In addition to their endocrine effects, dyslipidemia also appear to affect post-testicular maturation. These results have to be considered in the context of ART protocols, since the plasma lipid status is not part of the routine examinations for couples in ART protocols. Concomitantly, in France, 55% of men aged 30-54 are dyslipidemic, suggesting that these lipid metabolic disorders could alter sperm post-testicular maturation, causing a number of infertility and / or ART failures.; L’obtention de spermatozoïdes fécondants est un processus long et multi étapes, débutant par la production des gamètes mâles dans le testicule. Les spermatozoïdes sont ensuite successivement maturés au cours du transit épididymaire puis lors de leur passage dans les voies génitales femelles au cours du processus de capacitation. Ces étapes de maturation post-testiculaires concernent notamment la composition lipidique du gamète pour lui permettre d’acquérir une fluidité membranaire essentielle à la fécondation.Les résultats présentés dans cette thèse mettent en évidence l’importance de l’homéostasie lipidique épididymaire pour la maturation lipidique des spermatozoïdes et l’acquisition du pouvoir fécondant. Au niveau moléculaire cette homéostasie lipidique est régulée par les isoformes α et β des LXRs, les récepteurs nucléaires des oxystérols (NR1H3 et NR1H2, respectivement). Un régime alimentaire enrichi en cholestérol chez des souris jeunes invalidées pour les LXRs entraîne une infertilité avec une atteinte spécifique de l’épididyme. La maturation épididymaire des spermatozoïdes est alors altérée, entraînant des défauts de compositions lipidiques et protéiques de la membrane plasmique spermatique. Ces défauts ont des répercussions délétères sur la capacitation, issues de perturbations des flux calciques et de la tyrosine phosphorylation.En plus de leurs répercussions endocriniennes, les dyslipidémies semblent également affecter la maturation post-testiculaire. Ces résultats sont à considérer dans le cadre des protocoles de PMA puisque le bilan lipidique plasmatique ne fait pas partie des examens classiques des couples en PMA. Or en France, 55% des hommes entre 30 et 54 ans sont atteints d’une dyslipidémie. Ces désordres métaboliques lipidiques pourraient altérer la maturation post-testiculaire des gamètes, provoquant un certain nombre d’infertilités et/ou d’échecs en PMA.

The acquisition of fertile spermatozoa is a long and multi-stage process, beginning with the production of male gametes in the testis. Spermatozoa then undergo two successive maturation steps, first during the epididymal transit and then in the female genital tract during the capacitation process. The post-testicular maturation particularly impacts sperm lipid composition, leading to a higher membrane fluidity considered to be essential for fertilization.The results presented in this work show the importance of epididymal lipid homeostasis for sperm lipid maturation and acquisition of fertilizing ability. At the molecular level, lipid homeostasis is regulated by the LXRs (α and β isoforms), the oxysterol nuclear receptors (NR1H3 and NR1H2, respectively). A cholesterol-enriched diet in young LXR-null mice leads to infertility with a specific epididymal alteration. Sperm epididymal maturation is altered, leading to defects in lipid and protein composition of the spermatic plasma membrane. These defects have detrimental effects on the capacitation process, characterized by disturbances of calcium flows and tyrosine phosphorylation.In addition to their endocrine effects, dyslipidemia also appear to affect post-testicular maturation. These results have to be considered in the context of ART protocols, since the plasma lipid status is not part of the routine examinations for couples in ART protocols. Concomitantly, in France, 55% of men aged 30-54 are dyslipidemic, suggesting that these lipid metabolic disorders could alter sperm post-testicular maturation, causing a number of infertility and / or ART failures.; L’obtention de spermatozoïdes fécondants est un processus long et multi étapes, débutant par la production des gamètes mâles dans le testicule. Les spermatozoïdes sont ensuite successivement maturés au cours du transit épididymaire puis lors de leur passage dans les voies génitales femelles au cours du processus de capacitation. Ces étapes de maturation post-testiculaires concernent notamment la composition lipidique du gamète pour lui permettre d’acquérir une fluidité membranaire essentielle à la fécondation.Les résultats présentés dans cette thèse mettent en évidence l’importance de l’homéostasie lipidique épididymaire pour la maturation lipidique des spermatozoïdes et l’acquisition du pouvoir fécondant. Au niveau moléculaire cette homéostasie lipidique est régulée par les isoformes α et β des LXRs, les récepteurs nucléaires des oxystérols (NR1H3 et NR1H2, respectivement). Un régime alimentaire enrichi en cholestérol chez des souris jeunes invalidées pour les LXRs entraîne une infertilité avec une atteinte spécifique de l’épididyme. La maturation épididymaire des spermatozoïdes est alors altérée, entraînant des défauts de compositions lipidiques et protéiques de la membrane plasmique spermatique. Ces défauts ont des répercussions délétères sur la capacitation, issues de perturbations des flux calciques et de la tyrosine phosphorylation.En plus de leurs répercussions endocriniennes, les dyslipidémies semblent également affecter la maturation post-testiculaire. Ces résultats sont à considérer dans le cadre des protocoles de PMA puisque le bilan lipidique plasmatique ne fait pas partie des examens classiques des couples en PMA. Or en France, 55% des hommes entre 30 et 54 ans sont atteints d’une dyslipidémie. Ces désordres métaboliques lipidiques pourraient altérer la maturation post-testiculaire des gamètes, provoquant un certain nombre d’infertilités et/ou d’échecs en PMA.

L’infertilité affecte jusqu’à 15-20% des couples en âge de se reproduire. C’est pourquoi, mieux comprendre les mécanismes à la base de la fécondation est essentiel pour l’identification de nouvelles causes d’infertilité et l’optimisation des techniques de reproduction assistée. La capacitation est une étape de la maturation des spermatozoïdes qui se déroule dans le tractus génital femelle. Elle est requise pour la fécondation d’un ovocyte. Notre laboratoire a démontré que des protéines du plasma séminal bovin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP), se lient aux phospholipides portant des groupements choline à la surface de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et promeuvent la capacitation. Ces protéines exprimées par les vésicules séminales sont ubiquitaires chez les mammifères et ont été étudiées chez plusieurs espèces dont l’étalon, le porc, le bouc et le bélier. Récemment, l’expression de gènes homologues aux BSP a été découverte dans les épididymes d’humains (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). Notre hypothèse est que les BSP chez ces deux espèces sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de la maturation épididymaire et ont des rôles dans les fonctions spermatiques, similaires à ceux des protéines BSP bovines. Les protéines BSP humaines et murines représentent une faible fraction des protéines totales du plasma séminal. Pour cette raison, afin d’étudier leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles, des protéines recombinantes ont été produites. Les protéines recombinantes ont été exprimées dans des cellules Escherichia coli origami B(DE3)pLysS en utilisant un vecteur d’expression pET32a. Suivant la lyse cellulaire, les protéines ont été dénaturées avec de l’urée et purifiées par chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés. Une fois liées à la colonne, les protéines ont été repliées à l’aide d’un gradient d’urée décroissant avant d’être éluées. Cette méthode a mené à la production de trois protéines recombinantes (rec-BSPH1 humaine, rec-BSPH1 murine et rec-BSPH2 murine) pures et fonctionnelles. Des expériences de chromatographie d’affinité et de co-sédimentation nous ont permis de démontrer que les trois protéines peuvent se lier à des ligands connus des protéines BSP comme la gélatine et l’héparine en plus de pouvoir se lier aux spermatozoïdes. Nos études ont également révélées que les deux protéines rec-BSPH1 peuvent se lier aux liposomes de phosphatidylcholine (PC) et sont capable de promouvoir la capacitation des spermatozoïdes. À l’opposé, rec-BSPH2 ne peut ni se lier aux liposomes de PC, ni stimuler la capacitation. Finalement, les protéines recombinantes n’ont aucun effet sur la réaction acrosomique ou sur la motilité des spermatozoïdes. Chez les bovins, les protéines BSP induisent la capacitation grâce des interactions avec les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les glycosaminoglycanes. Puisque le HDL est également un joueur important de la capacitation chez la souris, le rôle de la protéine native BSPH1 murine au niveau de la capacitation induite par le HDL a été étudié. Les résultats obtenus suggèrent que, in vivo, la protéine BSPH1 de souris serait impliquée dans la capacitation via une interaction directe avec le HDL. Comme les protéines BSPH1 humaines et murines sont orthologues, ces résultats pourraient aussi s’appliquer à la fertilité humaine. Les résultats présentés dans cette thèse pourraient mener à une meilleure compréhension de la fertilité masculine et aider à améliorer les techniques de reproduction assistée. Ils pourraient également mener au développement de nouveaux tests diagnostiques ou de contraceptifs masculins., Infertility can affect as much as 15-20% of couples of reproductive age. Therefore, elucidating mechanisms occurring during fertilization is needed to resolve cases of infertility and optimize assisted reproductive technology procedures. Sperm capacitation is a maturation step that takes place in the female genital tract and is deemed to be essential for sperm to fertilize an oocyte. Our laboratory has demonstrated that proteins from bovine seminal plasma called Binder of SPerm (BSP) proteins bind to choline phospholipids on the sperm membrane upon ejaculation and promote capacitation. These proteins expressed in seminal vesicles are ubiquitous amongst mammals and have been studied in many species including stallion, boar, ram and goat. More recently, the expression of BSP-homologous genes has been discovered in the epididymis of humans (BSPH1) and in mice (Bsph1 and Bsph2). We hypothesized that the BSP homologs in these two species are added to sperm during epididymal maturation and play similar roles in sperm functions as bovine BSP proteins. BSP proteins in humans and mice constitute only a minute percentage of the seminal plasma proteins. Thus, to study their biochemical and functional characteristics recombinant proteins were produced. Recombinant proteins were expressed in Escherichia coli origami B(DE3)pLysS cells using a pET32a expression vector. Following cell lysis, proteins were denatured using urea and purified by immobilized metal ion affinity chromatography. Once bound to the resin, proteins were refolded using a decreasing urea gradient after which they were eluted. This method led to the production of three pure, functional recombinant proteins (human rec-BSPH1, mouse rec-BSPH1 and mouse rec-BSPH2). Using affinity chromatography and co-sedimentation experiments, we were able to demonstrate that all three recombinant proteins bind known ligands of BSP proteins including gelatin, heparin and have the ability to bind to sperm. Studies also revealed that both rec-BSPH1 proteins bind to phosphatidylcholine (PC) liposomes and promote sperm capacitation. However, rec-BSPH2 neither binds to PC liposomes nor stimulates capacitation. Recombinant proteins had no effect on acrosome reaction or sperm motility. In bovine, BSP proteins promote sperm capacitation through interactions with high-density lipoproteins (HDL) and glycosaminoglycans. Since in mice HDL is also a major factor implicated in capacitation, the role of the native murine BSPH1 protein in HDL-induced capacitation was investigated. Results obtained suggest that, in vivo, murine BSPH1 protein could act in capacitation via a direct interaction with HDL. As human and murine BSPH1 are orthologs, these results could possibly also apply to human fertility. The results presented in this thesis could lead to a better understanding of male fertility and help improve assisted reproduction technology procedures. They could also lead to the development of diagnostic tests as well male contraceptives.

The spermatozoa acquire their fertilizing ability and their motility through the epididymis. Paradoxically, this epididymal maturation needs reactive oxygen species (ROS) to condense the sperm chromatin permitting to protect the DNA against these molecules. We studied how the epididymis ensure the equilibrium between deficit and excess of ROS by characterizing the epididymal phenotype of mice lacking two antioxidant activities of the glutathione peroxidase family, GPx5 & snGPx4. The epididymis of these mice produce a strong antioxidant response and also increase the disulfide bridging activity by adjusting the gene expression of antioxidant enzymes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) and disulfide isomerase proteins (Pdia). This protection is efficient for tissue and sperm membranes but not for sperm chromatin which is susceptible to decondensation. The sperm cells show oxidative damage in the nucleus, which worsen with the decrease of the antioxidant activity upon aging. Immunological and biochemical approaches indicated that oxidative damage occurred only on the sperm DNA at the periphery of the nucleus, which is enriched with persisting nucleosomes and associated to the nuclear matrix. Finally, to determine if these oxidative damages on the spermatozoa can be lowered, we studied the effects of an oral antioxidant supplement on wild type and gpx5-/- mice (Chabory et al., 2009)., Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant et leur mobilité lors de leur transit le long de l’épididyme. Paradoxalement, cette maturation épididymaire nécessite la présence d’espèces oxygénées réactives (EOR) pour condenser la chromatine spermatique afin de mieux protéger l’ADN de ces mêmes molécules. Nous avons étudié la façon dont l’épididyme parvient à assurer l’équilibre entre un déficit et un excès d’EOR en caractérisant le phénotype épididymaire de souris dont la production de deux enzymes antioxydantes glutathion peroxydases a été invalidée, GPx5 et snGPx4. L’épididyme de ces souris génère une réponse antioxydante élevée et augmente l’activité de pontage disulfure sur les gamètes en modulant l’expression génique d’enzymes antioxydantes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) et de protéines disulfide isomérases (Pdia). Bien que ce sursaut d’activité soit efficace pour protéger les membranes du tissu et des spermatozoïdes, la chromatine des spermatozoïdes présente un défaut de condensation, laissant l’ADN spermatique vulnérable face aux EOR. Les gamètes présentent alors des dommages oxydants dans le noyau qui s’aggravent avec la diminution de l’activité antioxydante lors du vieillissement. Des approches immunologiques et biochimiques ont montré que les dommages oxydants se produisent préférentiellement sur l’ADN spermatique situé à la périphérie du noyau, qui est enrichi en nucléosomes persistants et qui est associé à la matrice nucléaire. Afin de déterminer s’il est possible de diminuer ces atteintes oxydantes sur les gamètes, nous avons étudié les effets d’une supplémentation orale antioxydante sur des souris sauvages et sur l’un de nos modèles murins mutant.

Spermatozoa leave the testis in an immature functional state and are devoid of self defense mechanisms. They will become motile and ready to fertilize only after their descent and their progressive maturation within the epididymal tubule. The epididymis also ensures the survival and the protection of male gametes while they go through the epididymis and during their storage in between two ejaculations. Amongst common stresses that concern spermatozoa, oxidative stress occupies a peculiar and dual position. While the events of epididymal sperm maturation necessitate a given level of oxidation, spermatozoa are particularly sensitive to oxidative damage. A fine balance between beneficial oxidation versus detrimental oxidative damage has to be maintained in the epididymal environment. Antioxidant enzymes of the glutathione peroxidase family play a key role in controling such a situation in the epididymis.

To list clinical and ethiopathogenical elements relevant to the analysis of an epididymal and testicular pain.Review of published articles on the subject in the Medline(®) (PubMed(®)) database, selected according to their scientific relevance.Assessment of a chronic epididymal and testicular pain is mostly clinical and should: (1) eliminate local urological disorder; (2) suggest a neurological problem, based on signs and semiology; (3) suggest injury of nervous truncus according to medical history and scars; (4) detect referred pains, primarily back and thoracolumbar pains. The causal link between epididymal cysts, surgical aftereffect, local infection and chronic epididymal and testicular pain is not established with certainty. Spermatic cord nerve block, as a diagnostic test, should be done before undergoing any invasive procedure.The fundamental notion is being able to distinguish epididymal and testicular pain and scrotal pain, because the testis has an abdominal origin, and therefore a sympathetic instead of sacral innervation. An absence evident somatic or iatrogenous cause should suggest hypersensibility to pain. Assessment of an epididymal and testicular pain requires a global clinical examination, which should take into account every aspect of the pain, including its functional and emotional components.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins., Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

Using various molecular approaches, we found that the mouse gpx5 gene gives rise to at least three different transcripts in the mouse epididymis. In addition to the major gpx5 transcript coding the mature GPx5 protein, two minor gpx5 transcripts exist. Furthermore, we demonstrate that variants of the GPx5 protein that are correlated with the shorter gpx5 transcripts are subject to differential post-transcriptional maturation processes in the mouse epididymis that essentially involve the addition of O-glycosyl extensions. We have demonstrated that the gpx5 gene is also expressed in other tissues of the male genital tract, including the testis and prostate. Finally, obtaining various stages of mouse embryos, we present evidence suggesting that the gpx5 gene is expressed during early embryonic development. This embryonic gpx5 expression relates to a 4th variant whose 3' UTR sequence could not be determinate. Other complementary immunohistochemistry analyses are necessary to confirm the GPx5 protein expression in early mouse embryo and its localization in parietal endoderm.; En utilisant des approches moléculaires variées, nous avons montré que le gène gpx5 possède au moins trois transcrits dans l'épididyme de souris adulte. A coté d'un messager long codant pour la protéine GPX5 mature, existent en effet deux transcrits tronqués. Les variants de la protéine GPx5, qui correspondent à ces transcrits courts, subissent dans l'épididyme de souris, une maturation post-transcriptionnelle qui repose essentiellement sur des processus de O-glycosylation. Ce travail a aussi permis de préciser que l'expression du gène gpx5 dépasse le territoire épididymaire puisque les transcrits gpx5 peuvent détectés à des niveaux faibles dans d'autres tissus de la sphère génitale chez la souris adulte. C'est le cas par exemple au niveau du testicule ou de la prostate. L'obtention, par des gestations datées, d'embryons de souris à différents stades, a permis de mettre en évidence une expression du gène gpx5 pendant les phases précoces du développement embryonnaire. Cette expression embryonnaire de gpx5 concerne un quatrième variant dont la séquence 3' UTR n'a pu être précisée. Des analyses immunohistochimiques complémentaires sont nécessaires pour confirmer la détection de la protéine GPx5 dans l'embryon précoce de souris et sa localisation dans l'endoderme pariétal.

Using various molecular approaches, we found that the mouse gpx5 gene gives rise to at least three different transcripts in the mouse epididymis. In addition to the major gpx5 transcript coding the mature GPx5 protein, two minor gpx5 transcripts exist. Furthermore, we demonstrate that variants of the GPx5 protein that are correlated with the shorter gpx5 transcripts are subject to differential post-transcriptional maturation processes in the mouse epididymis that essentially involve the addition of O-glycosyl extensions. We have demonstrated that the gpx5 gene is also expressed in other tissues of the male genital tract, including the testis and prostate. Finally, obtaining various stages of mouse embryos, we present evidence suggesting that the gpx5 gene is expressed during early embryonic development. This embryonic gpx5 expression relates to a 4th variant whose 3' UTR sequence could not be determinate. Other complementary immunohistochemistry analyses are necessary to confirm the GPx5 protein expression in early mouse embryo and its localization in parietal endoderm., En utilisant des approches moléculaires variées, nous avons montré que le gène gpx5 possède au moins trois transcrits dans l'épididyme de souris adulte. A coté d'un messager long codant pour la protéine GPX5 mature, existent en effet deux transcrits tronqués. Les variants de la protéine GPx5, qui correspondent à ces transcrits courts, subissent dans l'épididyme de souris, une maturation post-transcriptionnelle qui repose essentiellement sur des processus de O-glycosylation. Ce travail a aussi permis de préciser que l'expression du gène gpx5 dépasse le territoire épididymaire puisque les transcrits gpx5 peuvent détectés à des niveaux faibles dans d'autres tissus de la sphère génitale chez la souris adulte. C'est le cas par exemple au niveau du testicule ou de la prostate. L'obtention, par des gestations datées, d'embryons de souris à différents stades, a permis de mettre en évidence une expression du gène gpx5 pendant les phases précoces du développement embryonnaire. Cette expression embryonnaire de gpx5 concerne un quatrième variant dont la séquence 3' UTR n'a pu être précisée. Des analyses immunohistochimiques complémentaires sont nécessaires pour confirmer la détection de la protéine GPx5 dans l'embryon précoce de souris et sa localisation dans l'endoderme pariétal.

Primary epididymal leiomyosarcoma is uncommon: only 16 cases has been reported in the literature. We present an additionnal case in a 78-year-old man, treated for a prostatic adenocarcinoma by gonadorelin (LH-RH) analogue, who had an epididymal tumor. A right orchidectomy with high ligation of the spermatic cord was performed. The diagnostic of primary leiomyosarcoma of the epididymis was made. The patient is dead 2 years later with no recurrence of disease. A review of reported cases is made.

The authors report the case of a 44-year-old man in whom a poorly differentiated primary carcinoma of the head of the epididymis was discovered incidentally. Due to the rarity of this diagnosis, a comprehensive assessment was performed looking for a primary tumour, but without success. Despite early surgical resection, the patient developed lymph-node metastases. This exceptional tumour showed low sensitivity to chemotherapy. Malignant tumours of the epididymis are exceptional and require investigations to detect a primary tumour. Treatment is based on surgical resection, ideally via an inguinal incision, combined with chemotherapy adapted to the histological type.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans la majeure partie des communications intercellulaires. Un grand nombre de RCPG ont été découverts en comparant la séquence des récepteurs connus avec les données fournies par le séquençage du génome humain. Pour plus d'une centaine de ces récepteurs, le ligand activateur ou agoniste est inconnu. Ces récepteurs sont dès lors qualifiés d'orphelins.Les LGR forment une sous-famille de RCPG structurellement proches de la rhodopsine qui comprend les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, hCG, FSH) et à la relaxine. LGR4 est un membre de cette famille dont ni la fonction précise, ni l'agoniste ne sont connus.Dans un premier temps, une cartographie détaillée de l'expression de Lgr4 chez la souris a été obtenue. Nous avons tiré parti de l'existence d'une lignée de souris transgéniques dont le gène Lgr4 a été interrompu par l'introduction d'une cassette comportant deux marqueurs histologiques. L'activité beta-galactosidase d'un de ces marqueurs a été analysée chez les souris hétérozygotes. Ces dernières ne présentent pas de phénotype particulier, ce qui permet d'estimer que l'expression des marqueurs rend effectivement compte de l'expression normale du gène Lgr4. Lgr4 est exprimé dans un grand nombre de structures, notamment dans le cartilage, le rein, les appareils reproducteurs mâle et femelle et certaines cellules du système nerveux.Ensuite, le phénotype des souris homozygotes pour l'inactivation de Lgr4 (LGR4KO) a été exploré. Ces souris présentent à la naissance un poids inférieur à leurs congénères des autres phénotypes. Les mâles sont stériles à cause d'une malformation des tubules efférents et de l'épididyme. Un blocage au niveau des tubules efférents reliant le testicule à l'épididyme contraint les spermatozoïdes à s'accumuler à la sortie du testicule, dans la région du rete testis. De plus, les tubes de l'épididyme, pourtant normaux à la naissance, ne s'allongent pas pour former la structure convolutée habituelle. L'épithélium de ces tubes est aplati et est entouré d'une quantité anormalement élevée de mésenchyme.Dans un troisième temps, des outils nécessaires aux futures tentatives d'identification de l'agoniste naturel de LGR4 ont été réalisés. Il s'agit :(1) d'anticorps monoclonaux dirigés contre la partie extracellulaire du récepteur humain. (2) d'un appât moléculaire pour la ‘pêche au ligand’. Cet appât est constitué du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à un marqueur histologique. (3) d'une construction peptidique constituée du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à une queue poly-histidine. Cette construction est destinée à servir de greffon lors de chromatographies d'affinités devant permettre de purifier le ligand. (4) de lignées cellulaires exprimant le récepteur LGR4 humain ainsi que le système æquorine devant permettre de détecter l'activation de ce récepteur.Les données apportées par ce travail montrent un rôle important du récepteur LGR4 au cours du développement et permettent de circonscrire le champ des recherches futures. Ceci, ainsi que les outils moléculaires développés, constitue une base pour l'identification future de l'agoniste et la détermination précise de la fonction de LGR4., Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Desmoplastic small round cell tumors are rare aggressive cancers of adolescence and early adulthood. It has recently been separated from other small round cell tumors because of its pathological characteristics and clinical features. They are usually intra-abdominal tumors affecting young people and have classically been associated with a bad prognosis. However, in recent years there have been reports on desmoplastic small round cell tumors affecting other body regions, including the paratesticular area. We report the case of a 27-year-old male who consulted on a progressive enlargement of the right hemiscrotum. He referred no previous urological symptoms and had no systemic symptomatology. Physical examination revealed a round elastic firm 1-cm mass of the epididymis, which was excised. A computed tomography scan showed a para-aortic mass of 1cm. Histological and immunohistochemical diagnosis confirmed a desmoplastic small round cell tumor. The patient received chemotherapy. Today, 6 months after diagnosis the patient remains well and free of disease. Recent reviews on desmoplastic small round cell tumors affecting the paratesticular area have shown a better prognosis for tumors of this origin compared to abdominal ones. We should include this lesion among the differential diagnosis of paratesticular tumors, mainly in children and adolescents.