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L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle des protéines qui consiste à attacher, d’une manière covalente, le groupement ubiquitine sur un résidu lysine de la protéine cible. Cette modification peut avoir un impact considérable sur la fonction, la localisation et la stabilité de ces cibles. Une fois établie par des enzymes appelées E3 ligases, l’ubiquitination peut être enlevée par des enzymes spécifiques appelées déubiquitinases, modulant ainsi les effets causés par cette modification. BAP1 (BRCA1-Associated Protein 1) est une déubiquitinase de la famille des UCH (Ubiquitin C-terminal Hydrolases) qui a été initialement identifiée comme partenaire du suppresseur de tumeurs BRCA1 (BReast Cancer Associated gene 1). De nombreux groupes de recherche, incluant le nôtre, ont montré que BAP1 est associée avec d’autres cofacteurs formant un large complexe multiprotéique. Ce dernier est impliqué dans plusieurs processus cellulaires comme la transcription des gènes, la régulation de la chromatine, la coordination du cycle cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. La cible majeure de BAP1 est l’histone H2A ubiquitinée sur la lysine 119, une marque d’histone qui a été souvent associée avec une conformation répressive de la chromatine. Quels sont les mécanismes régulant le complexe BAP1 lui permettant d’exécuter ces fonctions biologiques? Cela implique-t-il des modifications post-traductionnelles touchant les partenaires de BAP1 ? Ces questions restent encore sans réponse définitive. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser le mécanisme et la fonction du complexe BAP1 en étudiant les modifications post-traductionnelles de ses partenaires. Pour répondre à ces questions nous avons étudié les modifications post-traductionnelles touchant BAP1 et ses cofacteurs mutuellement exclusifs ASXL1 et ASXL2 (Additional Sex Comb-like 1,2). Nous avons démontré qu’ASXL1 et ASXL2 sont monoubiquitinés uniquement lorsqu’ils sont associés à BAP1. Sachant que les complexes BAP1/ASXLs sont conservés au cours de l’évolution, nous avons aussi démontré que la monoubiquitination des ASXLs est conservée chez la Drosophile. En utilisant des méthodes de déplétion de protéines par siARN et CRISPR/Cas9 ainsi que des mutants de perte de fonction de BAP1 et ASXL2, nous avons identifié les enzymes responsables de la monoubiquitination des ASXLs ainsi que leur effet sur l’activité catalytique de BAP1. D’autre part, nous avons étudié le développement chez la Drosophile ainsi que le cycle cellulaire des cellules humaines pour identifier la fonction biologique de la monoubiquitination de ASXL2. Nos résultats démontrent que la monoubiquitination d’ASXL2 sur la lysine 370 en présence de BAP1 est une modification post-traductionnelle conservée et catalysée directement par la famille UBE2Es des enzymes de conjugaison de l’ubiquitine (UBE2E1,2,3 chez les mammifères et UbcD2 chez la Drosophile). Cette monoubiquitination stimule l’activité catalytique de BAP1 chez les mammifères et de son orthologue Calypso chez la Drosophile envers H2Aub. Le blocage de la monoubiquitination des ASXLs par des mutations ciblant la lysine K370 induit une inhibition de l’activité de BAP1, ce qui cause une dérégulation du cycle cellulaire chez les cellules mammifères et une transformation homéotique haltère-aile chez la Drosophile. De plus, il nous a été possible de constater l’importance de cette monoubiquitination dans le cancer en démontrant la forte corrélation d’expression de BAP1/ASXL2 et les UBE2Es au niveau du mésotheliome, un cancer connu pour la dérégulation de BAP1. Nos résultats indiquent l’importance des modifications post-traductionnelles, dont la monoubiquitination, dans la régulation de la fonction et la stabilité du complexe BAP1. De plus, nous décrivons un nouveau mécanisme d’activation d’une deubiquitinase par la monoubiquitination de son cofacteur. D’autres études seront nécessaires afin de comprendre le lien entre l’activation de BAP1/ASXL2 par monoubiquitination et la fonction suppresseur de tumeurs de BAP1 via la deubiquitination d’H2Aub. D’autre part, nous avons fait l’observation que la déplétion de la deubiquitinase associée à la particule régulatrice du protéasome, PSMD14, induit non seulement une réduction drastique d’H2Aub dans la cellule, mais aussi une mort cellulaire rapide. Ceci nous a poussé initialement à investiguer l’implication de l’activité catalytique du protéasome dans la régulation d’H2Aub en lien avec la mort cellulaire. Malgré le fait que nous n’ayons pas trouvé un lien direct entre PSMD14 et la deubiquitination d’H2Aub, nous avons identifié plusieurs candidats (DUBs et E2s) impliqués dans l’induction de la mort cellulaire tout en surmontant une résistance acquise contre des inhibiteurs ciblant l’activité catalytique du protéasome. Ces candidats pourraient représenter des cibles intéressantes pour développer des inhibiteurs spécifiques afin de contrecarrer la résistance aux inhibiteurs du protéasome., Ubiquitination is a post-translational modification of proteins that involves covalently attaching the ubiquitin moiety to the lysine residues of the target protein. This modification has been reported to have a significant impact on the function, localization and stability of these targets. Once established by enzymes called E3 ligases, ubiquitination can be removed by specific enzymes called deubiquitinases, thus modulating the effects caused by this modification. BAP1 (or BRCA1-Associated Protein1) is a deubiquitinase, from the UCH (Ubiquitin C-terminal Hydrolases) family, that was originally identified as a partner of the BRCA1 (BReast Cancer Associated gene 1) tumor suppressor. We and other research groups have shown that BAP1 is associated with other co-factors forming a multi-protein complex involved in several cellular processes such as gene transcription, chromatin regulation, cell cycle regulation and DNA damage response. The major target of BAP1 is ubiquitinated histone H2A, a histone mark that has been frequently associated with a repressive chromatin conformation. What are the mechanisms regulating the BAP1 complex allowing it to perform its biological functions? Does this involve post-translational modifications affecting BAP1 partners? These questions are still incompletely answered. Thus, the objectives of our studies are to characterize the mechanism and the function of the BAP1 complex by studying the post-translational modifications that could affect its obligate partners including ASXLs. To address these questions, we studied the post-translational modifications affecting BAP1 and its two mutually exclusive co-factors ASXL1 and ASXL2 (Additional Sex Comb-like 1,2). We demonstrated that ASXL1 and ASXL2 are mono-ubiquitinated only when associated with BAP1. Taking into account that the BAP1/ASXLs complexes are highly conserved during evolution, we also demonstrated that the mono-ubiquitination of ASXLs is important for Drosophila development. Using RNAi and CRISPR/Cas9 gene depletion methods and loss-of-function mutants of BAP1 and ASXL2, we identified the precise site of ASXLs ubiquitination, the enzymes responsible for establishing this mono-ubiquitination as well as its effect on catalytic activity of BAP1. On the other hand, we investigated Drosophila development as well as human cell cycle progression to identify the biological function of ASXLs mono-ubiquitination. Our results indicate that the mono-ubiquitination of ASXL2 on lysine 370 in the presence of BAP1 is a conserved post-translational modification catalyzed directly by the UBE2E family of ubiquitin-conjugating enzymes (UBE2E1, 2, 3 in mammals and UbcD2 in Drosophila). This mono-ubiquitination event stimulates the catalytic activity of BAP1 in mammals and its Drosophila ortholog Calypso towards H2Aub in vivo and in vitro. Blocking the mono-ubiquitination of ASXLs, by mutations targeting lysine K370, induces an inhibition of BAP1 catalytic activity causing a deregulation of human cell cycle progression and a haltere-to-wing homeotic transformation in Drosophila. In addition, we were able to assess the importance of ASXLs mono-ubiquitination in cancer using the mesothelioma tumor model, demonstrating a strong correlation between the expression of BAP1/ASXL2 and UBE2Es. Our results indicate the importance of post-translational modifications, including mono-ubiquitination, in the regulation of the function and stability of the BAP1 complex. Moreover, we describe a novel mechanism of activation of a deubiquitinase by the mono-ubiquitination of its co-factor. Further studies will be needed to shed more light on the link between BAP1/ASXLs activation by mono-ubiquitination and the tumor suppressor function of BAP1 via H2Aub deubiquitination. On the other hand, we have noticed that the depletion of PSMD14, a deubiquitinase associated with the proteasome regulatory particle, induces not only a drastic reduction of H2Aub in the cell, but also rapid cell death. This prompted us initially to investigate the involvement of the catalytic activity of the proteasome in the regulation of H2Aub in connection with cell death. Although we did not find a direct link between PSMD14 and H2Aub deubiquitination, we identified several candidates (DUBs and E2s) involved in the induction of cell death while overcoming acquired resistance against proteasome catalytic inhibitors. These candidates may represent attractive targets for developing specific inhibitors to counteract resistance to proteasome inhibitors.

En dégradant la majorité des protéines cellulaires, le protéasome se positionne comme un régulateur clé du protéome, vis-à-vis duquel la plupart des tumeurs présentent une forte addiction en raison du débalancement protéique qui les caractérise. Quoique son inhibition se soit avérée être une bonne stratégie anticancer, elle est demeurée limitée aux cancers sanguins. Malheureusement, leur traitement devient tôt ou tard compromis par la résistance cellulaire. Raison pour laquelle l'élucidation du mécanisme de mort en jeu pourrait permettre de mieux cerner cette résistance, ce qui constituerait les fondements pour un traitement plus efficace. L'un des événements les plus spectaculaires et les plus précoces à se manifester dans le cadre de ce traitement, est la déubiquitination massive de l'histone H2A sur la lysine (K) 119. Une corrélation positive plutôt paradoxale entre cet événement, qui est associé à l'expression génique, et la sensibilité cellulaire à l'inhibition du protéasome, a été remarquée. Cela a mené à s'intéresser à sa signification biologique. Des cellules cancéreuses et primaires ont servi de systèmes d'étude protéomique par immunobuvardage et par immunofluorescence, pour analyser l'état de la chromatine et la distribution spatio-temporelle des histones durant l'inhibition du protéasome. Des inhibiteurs chimiques, des ARN interférents et des vecteurs d'expression ont été utilisés à cette fin. Un impressionnant phénomène survenant à la suite de l'inhibition du protéasome a été révélé. En effet, une baisse drastique du niveau d'histones sur la chromatine s'opère simultanément à la déubiquitination de H2A-ub (K119). Le protéasome étant inhibé, celles-ci, et possiblement les histones synthétisées en phase S, subiraient une translocation irréversible dans les nucléoles, et ce avant le déclenchement de l'apoptose. Ce phénomène est reproduit par divers inhibiteurs du protéasome et par siRNA, et il survient autant dans des cellules cancéreuses que primaires, mais pas dans les cellules résistantes, qui ne démontrent d'ailleurs pas de déubiquitination de H2A-ub (K119). Par ailleurs, il a été montré que la surexpression d'histones exogènes mène à leur translocation nucléolaire, et que la combinaison de l'inhibition du protéasome à cette surexpression pourrait être léthale. Quoique majoritairement préliminaires, les résultats révèleraient un surprenant mécanisme de régulation post-traductionnelle des histones endogènes, qui seraient séquestrées dans les nucléoles lorsqu'elles ne sont pas incorporées à la chromatine. En effet, l'inhibition du protéasome occasionne une importante perturbation de la chromatine pendant plusieurs heures. En raison de la cytotoxicité intrinsèque des histones libres et de leur abondance dans les cellules, celles-ci pourraient bien être à l'origine de la mort induite par l'inhibition du protéasome. Enfin, en sa qualité de senseur majeur de stress, le nucléole pourrait bien être le point de départ de la signalisation menant à la mort., By degrading most of cellular proteins, the proteasome is positioned as a key regulator of the proteome, against which most tumors have a strong addiction, due to the protein imbalance that characterizes them. Although its inhibition has been shown to be a good anticancer strategy, it is still limited to blood cancers. Unfortunately, their treatment sooner or later becomes compromised by cellular resistance. This is why the elucidation of the mechanism of death involved could allow a better understanding of this resistance, which would in turn constitute the basis for a more effective treatment One of the most spectacular and early events to manifest during this treatment is the massive deubiquitylation of histone H2A on lysine (K) 119. A rather paradoxical positive correlation between this event, which is associated with gene expression, and cellular sensitivity to proteasome inhibition, has been noticed. This led to an interest in its biological significance. Cancer and primary cells have been used as systems for proteomic study by immunoblot and immunofluorescence, to analyze chromatin status and the spatio-temporal distribution of histones during proteasome inhibition. Chemical inhibitors, interfering RNAs and expression vectors have been used for this purpose. An impressive phenomenon occurring during the proteasome inhibition has been revealed. Indeed, a drastic drop in histones level on chromatin occurs simultaneously with the deubiquitylation of H2A-ub (K119). The proteasome being inhibited, these, and possibly histones synthesized in S phase, would undergo an irreversible translocation in the nucleoli before the onset of apoptosis. This phenomenon is replicated by various proteasome inhibitors and siRNA, and occurs in both cancer and primary cells, but not in resistant cells, which do not demonstrate deubiquitination of H2A-ub (K119). Furthermore, overexpression of exogenous histones has been shown to lead to their nucleolar translocation, and it is thought that the combination of proteasome inhibition with this overexpression could be lethal. Although mostly preliminary, the results would reveal a surprising mechanism of post-translational regulation of endogenous histones, which would be sequestered in nucleoli when not incorporated into chromatin. Indeed, inhibition of the proteasome causes a significant disruption of the chromatin for several hours. Due to the intrinsic cytotoxicity of free histones and to their great cellular abundance, these may well be the cause of the death induced by proteasome inhibition. Finally, as a major stress sensor, the nucleolus could be the starting point of the death signaling.

Introduction: La monoubiquitination de l'histone H2A sur la lysine 119 (H2AK119ub) est une modification épigénomique, catalysée par le complexe Polycomb PRC1 par le biais de l’ubiquitine ligase Ring1B /BMI1. Cette modification joue un rôle important dans la régulation de l’expression génique, et est ainsi requise pour le contrôle de plusieurs processus cellulaires associés au développement et à la prolifération cellulaire. Cette modification est reversée par la déubiquitinase (DUB) BAP1, un suppresseur de tumeurs qui constitue la DUB la plus fréquemment mutée dans les cancers humains. Chez la drosophile, la déubiquitination de H2AK118ub, l’analogue de H2AK119ub, est catalysée par la protéine du groupe Polycomb Calypso, l’orthologue de BAP1, qui se trouve associée à son partenaire ASX, et forme ce qu’on appelle le complexe répresseur Polycomb (PR-DUB). Nous avons précédemment montré que BAP1 forme, chez les mammifères, deux complexes mutuellement exclusifs avec des facteurs de la famille des protéines du groupe Polycomb, ASXL1 et ASXL2 (ASXL1/2), qui sont deux orthologues d'ASX. L’association de BAP1 avec ASXL1/2 stimule son activité DUB et ceci est nécessaire pour une coordination harmonieuse du cycle cellulaire. Mais comment BAP1 agit en tant que suppresseur de tumeurs et comment ces protéines associées sont régulées au niveau moléculaire demeurent des questions importantes. De manière très intéressante, nous avons identifié une monoubiquitination constitutive qui apparait sur ASXL1/2 seulement en présence de BAP1, et nous avons émis l'hypothèse que cet événement de monoubiquitination joue un rôle essentiel dans la stabilité protéique du complexe BAP1/ASXL1/2 et la coordination de la fonction DUB de ce dernier. Méthodes et résultats: Dans notre étude, nous nous sommes intéressés au régulateur transcriptionnel ASXL2, qui interagit, via son domaine ASXM2, avec le domaine C-terminal (CTD) de BAP1. Cette interaction engendre une monoubiquitination qui se produit sur la lysine 370 du domaine ASXM2 et qui régule la fonction du complexe BAP1/ASXL2. De manière intéressante, la monoubiquitination de la lysine K370 stabilise ASXL2, mais peut aussi amorcer sa polyubiquitination et sa dégradation par le protéasome. De plus, nous avons démontré que la monoubiquitination d’ASXL2 stimule l’activité DUB de BAP1 envers H2AK119ub. En conduisant un criblage siRNA des enzymes de conjugaison de l’ubiquitine (E2) et des DUBs du génome humain, nous avons démontré que la monoubiquitination d’ASXM2 est directement catalysé par les membres de la famille UBE2E (UBE2E1, UBE2E2 et UBE2E3) et est reversée par la déubiquitinase protéasomale PSMD14. Au niveau cellulaire, nous avons observé que l’expression d’une forme mutée d’ASXL2 sur son site d’ubiquitination, K370R, retarde la prolifération cellulaire. Un délai de prolifération cellulaire est aussi observé suite à la déplétion d’UBE2E3 par l’approche CRISPR/Cas9. Enfin, nous avons identifié des mutations de BAP1, retrouvés dans certains cancers, qui abolissent la monoubiquitination d’ASXL2 et ceci est observé lorsque ces formes mutées de BAP1 sont exprimées dans des cellules humaines suggérant ainsi l'importance de cette modification post-traductionnelle dans la suppression tumorale. Conclusion et pertinence: Nos résultats indiquent que BAP1 et ASXL2 sont intimement co-régulés par l’ubiquitination de ce dernier. Cela permet au complexe BAP1/ASXL2 de réguler son activité DUB et permettre une prolifération normale des cellules, empêchant ainsi la transformation maligne. Comprendre comment le complexe BAP1 est régulé par ces cofacteurs ASXL1/2 nous permettra de mieux établir son rôle suppresseur de tumeurs, et ainsi conduire au développement de nouvelles thérapies contre le cancer., Introduction: Monobiquitination of histone H2A on lysine 119 (H2AK119ub) is an epigenomic modification catalyzed by the Polycomb complex PRC1 via its ubiquitin ligase Ring1B/BMI1. This modification plays an important role in the regulation of gene expression, and is required for the control of several cellular processes associated with cell development and proliferation. This modification is reversed by the deubiquitinase (DUB) BAP1, a tumor suppressor considered as the most frequently mutated DUB in human cancers. In Drosophila, the deubiquitination of H2AK118ub, the analog of H2AK119ub, is catalyzed by the Polycomb protein Calypso, the ortholog of BAP1, which is associated with its partner ASX, and forms the Polycomb repressor complex (PR-DUB). We have previously shown that BAP1 forms, in mammals, two mutually exclusive complexes with two factors of the Polycomb proteins family, ASXL1 and ASXL2 (ASXL1/2), which are two ASX orthologs. The association of BAP1 with ASXL1/2 stimulates its DUB activity and is necessary for the normal coordination of the cell cycle. But how BAP1 acts as a tumor suppressor, and how these associated proteins are regulated at the molecular level remain important questions to be addressed. Interestingly, we identified a constitutive monoubiquitination that appears on ASXL1/2 only in the presence of BAP1, and we hypothesized that this monoubiquitination event plays an essential role in the protein stability of the BAP1/ASXL1/2 complex and the coordination of its DUB function. Methods and results: In our study, we were interested in the ASXL2 transcriptional regulator, which interacts, via its ASXM2 domain, with the C-terminal domain (CTD) of BAP1. This interaction results in a monoubiquitination event on lysine 370 of the ASXM2 domain and this regulates the function of the BAP1/ASXL2 complex. Interestingly, monoubiquitination of lysine K370 stabilizes ASXL2, but can also initiate polyubiquitination and degradation by the proteasome. In addition, we demonstrated that monoubiquitination of ASXL2 stimulates DUB activity of BAP1 on H2AK119ub. By conducting siRNA screening of ubiquitin conjugating enzymes (E2) and DUBs of all the human genome, we demonstrated that monoubiquitination of ASXM2 is directly catalyzed by members of the UBE2E family (UBE2E1, UBE2E2 and UBE2E3) and is reversed by the proteasomal DUB PSMD14. At the cellular level, we have observed that the expression of a mutated form of ASXL2 on its ubiquitination site, K370R, delays cell proliferation. The same delay of cell proliferation is also observed following the depletion of UBE2E3 by the CRISPR/Cas9 approach. Finally, we have identified cancer mutations of BAP1, which abolish the monoubiquitination of ASXM2 when expressed in human cells, suggesting the importance of this post-translational modification for tumor suppression. Conclusion and relevance: Our results indicate that BAP1 and ASXL2 are tightly co-regulated by ubiquitination. This allows the BAP1/ASXL2 complex to control its DUB activity and function, promoting normal cell proliferation and preventing malignant transformation. In conclusion, understanding how the BAP1 complex is regulated by ASXL1/2 cofactors will allow us to better establish its tumor suppressor role, and this might help in the development of new therapies against cancer.

Plants utilize rapid mechanisms to adapt their physiology and development to changing environments. Their triggering depends greatly on gene expression reprogramming leading to important changes in the epigenome. In numerous organisms, different pathways remove monoubiquitination of histone H2B (H2Bub) to facilitate gene transcription by RNA polymerase II, with H2Bub removal on repeated genomic regions, such as telomeres, prohibiting establishment of a transcription permissive state. This thesis aims to better characterize the pathways that regulate the chromatin mark H2Bub in plants. A new ubiquitin protease from Arabidopsis thaliana was identified as a potential homolog of Ubp8, a protein associated with transcription elongation within a deubiquitination module of the SAGA complex in S. cerevisiae. Identification and functional characterization of the three components of the deubiquitination module in A. thaliana reveals its action on thousands of genes, suggesting a role in basal transcription mechanism. Secondly, it was shown that the quantity of two subunits from this module is regulated during photomorphogenesis by DET1, a central protein involved in light signaling. This developmental transition allows adaptation of metabolism and morphology of the plant in response to the first light exposure, notably during photosynthesis establishment. The post-translational regulation of the histone H2Bub deubiquitination module may allow its adjustment to changes in cell transcription needs during this transition. A genetic approach identified a partial functional redundancy between the deubiquitination module activity and UBP26, a second H2Bub deubiquitinase known to repress the genes PHERES1 and FLC by a Polycomb activity and certain transposable elements. These analyses revealed a positive influence from UBP26 on establishing a repressive transcriptional state on hundreds of genes and on some heterochromatinian contexts. Collectively, this work dissected specificities and functional redundancies of two H2Bub deubiquitination pathways driven by distinct protein complexes., Les plantes disposent de mécanismes rapides d'adaptation de leur physiologie et de leur développement à des conditions environnementales changeantes. Leur mise en œuvre dépend largement d’une capacité de reprogrammation de l'expression des gènes qui implique généralement des changements continus de l'épigénome. Chez de nombreux organismes, différentes voies d’enlèvement de la monoubiquitination de l’histone H2B (H2Bub) participent d'une part à faciliter la transcription des gènes par l'ARN polymérase II et d'autre part à éviter l'établissement d'un état permissif à la transcription par enlèvement de domaines enrichis en H2Bub sur des régions répétées telles que les séquences télomériques. Cette thèse a porté sur l’étude des voies régulant la marque chromatinienne H2Bub chez les plantes, dont la connaissance des mécanismes de contrôle dynamique est très fragmentaire. Une nouvelle ubiquitine protéase de l'espèce Arabidopsis thaliana a été identifiée comme étant un homologue fonctionnel de Ubp8, une protéine associée à l'élongation de la transcription au sein d'un module de déubiquitination d'H2Bub du complexe SAGA chez S. cerevisiae. L'identification et la caractérisation fonctionnelle de trois composants de ce module chez A. thaliana a révélé qu'il agit sur des milliers de gènes, suggérant son implication dans des mécanismes basaux de la transcription. Dans une seconde partie, il a été observé que l'abondance de deux sous-unités de ce module est régulée au cours de la photomorphogenèse par DET1, un acteur central de la signalisation de la lumière. Cette transition développementale permet l'adaptation du métabolisme et de la morphologie de la plante en réponse à la première exposition à la lumière, notamment via l'établissement de l'activité photosynthétique. La régulation post-traductionnelle du module de déubiquitination de l'histone H2B pourrait permettre d'ajuster son activité aux changements d'activité transcriptionnelle de la cellule au cours de cette transition. Une approche génétique a également permis d'identifier une redondance fonctionnelle partielle entre l'activité du module de déubiquitination et UBP26, une seconde déubiquitinase d'H2Bub connue pour son implication dans la répression des gènes PHERES1 et FLC par une activité Polycomb ainsi que de certains éléments transposables. Ces analyses ont permis de révéler une influence positive de UBP26 sur l'établissement d'un état répressif à la transcription sur des centaines de gènes et également dans certains contextes hétérochromatiniens. Collectivement, ce travail a permis de disséquer les spécificités et les redondances fonctionnelles de deux voies de déubiquitination de l'histone H2B portées par des complexes protéiques distincts.

Plants utilize rapid mechanisms to adapt their physiology and development to changing environments. Their triggering depends greatly on gene expression reprogramming leading to important changes in the epigenome. In numerous organisms, different pathways remove monoubiquitination of histone H2B (H2Bub) to facilitate gene transcription by RNA polymerase II, with H2Bub removal on repeated genomic regions, such as telomeres, prohibiting establishment of a transcription permissive state. This thesis aims to better characterize the pathways that regulate the chromatin mark H2Bub in plants. A new ubiquitin protease from Arabidopsis thaliana was identified as a potential homolog of Ubp8, a protein associated with transcription elongation within a deubiquitination module of the SAGA complex in S. cerevisiae. Identification and functional characterization of the three components of the deubiquitination module in A. thaliana reveals its action on thousands of genes, suggesting a role in basal transcription mechanism. Secondly, it was shown that the quantity of two subunits from this module is regulated during photomorphogenesis by DET1, a central protein involved in light signaling. This developmental transition allows adaptation of metabolism and morphology of the plant in response to the first light exposure, notably during photosynthesis establishment. The post-translational regulation of the histone H2Bub deubiquitination module may allow its adjustment to changes in cell transcription needs during this transition. A genetic approach identified a partial functional redundancy between the deubiquitination module activity and UBP26, a second H2Bub deubiquitinase known to repress the genes PHERES1 and FLC by a Polycomb activity and certain transposable elements. These analyses revealed a positive influence from UBP26 on establishing a repressive transcriptional state on hundreds of genes and on some heterochromatinian contexts. Collectively, this work dissected specificities and functional redundancies of two H2Bub deubiquitination pathways driven by distinct protein complexes., Les plantes disposent de mécanismes rapides d'adaptation de leur physiologie et de leur développement à des conditions environnementales changeantes. Leur mise en œuvre dépend largement d’une capacité de reprogrammation de l'expression des gènes qui implique généralement des changements continus de l'épigénome. Chez de nombreux organismes, différentes voies d’enlèvement de la monoubiquitination de l’histone H2B (H2Bub) participent d'une part à faciliter la transcription des gènes par l'ARN polymérase II et d'autre part à éviter l'établissement d'un état permissif à la transcription par enlèvement de domaines enrichis en H2Bub sur des régions répétées telles que les séquences télomériques. Cette thèse a porté sur l’étude des voies régulant la marque chromatinienne H2Bub chez les plantes, dont la connaissance des mécanismes de contrôle dynamique est très fragmentaire. Une nouvelle ubiquitine protéase de l'espèce Arabidopsis thaliana a été identifiée comme étant un homologue fonctionnel de Ubp8, une protéine associée à l'élongation de la transcription au sein d'un module de déubiquitination d'H2Bub du complexe SAGA chez S. cerevisiae. L'identification et la caractérisation fonctionnelle de trois composants de ce module chez A. thaliana a révélé qu'il agit sur des milliers de gènes, suggérant son implication dans des mécanismes basaux de la transcription. Dans une seconde partie, il a été observé que l'abondance de deux sous-unités de ce module est régulée au cours de la photomorphogenèse par DET1, un acteur central de la signalisation de la lumière. Cette transition développementale permet l'adaptation du métabolisme et de la morphologie de la plante en réponse à la première exposition à la lumière, notamment via l'établissement de l'activité photosynthétique. La régulation post-traductionnelle du module de déubiquitination de l'histone H2B pourrait permettre d'ajuster son activité aux changements d'activité transcriptionnelle de la cellule au cours de cette transition. Une approche génétique a également permis d'identifier une redondance fonctionnelle partielle entre l'activité du module de déubiquitination et UBP26, une seconde déubiquitinase d'H2Bub connue pour son implication dans la répression des gènes PHERES1 et FLC par une activité Polycomb ainsi que de certains éléments transposables. Ces analyses ont permis de révéler une influence positive de UBP26 sur l'établissement d'un état répressif à la transcription sur des centaines de gènes et également dans certains contextes hétérochromatiniens. Collectivement, ce travail a permis de disséquer les spécificités et les redondances fonctionnelles de deux voies de déubiquitination de l'histone H2B portées par des complexes protéiques distincts.

L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle importante pour le contrôle de nombreux processus cellulaires, est une réaction réversible. La réaction inverse, nommée déubiquitination est catalysée par les déubiquitinases (DUB). Nous nous sommes intéressés dans nos travaux à étudier l’ubiquitination de l’histone H2A (H2Aub), au niveau des résidus lysines 118 et 119 (K118/K119), une marque épigénétique impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN. Le régulateur transcriptionnel BAP1, une déubiquitinase nucléaire, a été initialement identifié pour sa capacité à promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 forme un complexe multi-protéique avec plusieurs facteurs transcriptionnels et sa fonction principale est la déubiquitination de H2Aub. Plusieurs études ont démontré que BAP1 est un gène suppresseur de tumeurs majeur et qu’il est largement muté et inactivé dans une multitude de cancers. En effet, BAP1 émerge comme étant la DUB la plus mutée au niveau des cancers. Cependant, le ou les mécanismes d’action et de régulation du complexe BAP1 restent très peu connus. Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des partenaires protéiques de BAP1. De manière significative nous avons caractérisé un mécanisme unique de régulation entre deux composants majeurs du complexe BAP1 à savoir, HCF-1 et OGT. En effet, nous avons démontré que HCF-1 est requis pour maintenir le niveau protéique de OGT et que cette dernière est indispensable pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant son clivage par O-GlcNAcylation, une signalisation cellulaire nécessaire au bon fonctionnement de HCF-1. Également, nous avons découvert un nouveau mécanisme de régulation de BAP1 par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. En effet, UBE2O agit comme un régulateur négatif de BAP1 puisque l’ubiquitination de ce dernier induit sa séquestration dans le cytoplasme et l’inhibition de sa fonction suppressive de tumeurs. D’autre part nous nous sommes penchés sur la caractérisation de l’association de BAP1 avec deux facteurs de la famille des protéines Polycombes nommés ASXL1 et ASXL2 (ASXL1/2). Nous avons investigué le rôle de BAP1/ASXL1/2, particulièrement dans les mécanismes de déubiquitination et suppression de tumeurs. Nous avons démontré que BAP1 interagit directement iii via son domaine C-terminale avec le même domaine ASXM de ASXL1/2 formant ainsi deux complexes mutuellement exclusifs indispensables pour induire l’activité déubiquitinase de BAP1. De manière significative, ASXM s’associe avec BAP1 pour créer un nouveau domaine composite de liaison à l’ubiquitine. Ces interactions BAP1/ASXL1/2 régulent la progression harmonieuse du cycle cellulaire. De plus, la surexpression de BAP1 et de ASXL2 au niveau des fibroblastes induit la sénescence de manière dépendante de leurs interactions. D’autre part, nous avons identifié des mutations de cancers au niveau de BAP1 le rendant incapable de lier ASXL1/2, d’exercer sa fonction d’autodéubiquitination et de ce fait d’agir comme suppresseur de tumeurs. Ainsi nous avons révélé un lien étroit entre le gène suppresseur de tumeurs BAP1, son activité déubiquitinase et le contrôle de la prolifération cellulaire., The reverse reaction of ubiquitination, a crucial post-translational modification, is catalyzed by deubiquitinases (DUBs). BAP1 is an ubiquitously expressed nuclear DUB that recently emerged as an important tumor suppressor highly mutated and inactivated in an increasing number of cancers of diverse origins. Both somatic and germline mutations with loss of heterozygosity were observed in tumors, making BAP1 the most mutated DUB in human malignancies. We previously reported that BAP1 is a component of a large multi-protein complex that includes several transcription regulators. The Drosophila homologue of BAP1, Calypso, forms the Polycomb-repressive DUB (PR-DUB) complex with Additional Sex Comb, ASX. This complex catalyzes the deubiquitination of histone H2A, an essential chromatin modification that regulates gene expression. Despite the ever increasing number of findings describing the occurrence of BAP1 mutations in cancers, few studies investigated the mechanisms of action of this DUB as a tumor suppressor. Therefore, the biological function and the mechanism of action and regulation of BAP1 remains largely uncharacterized. In the work described in this thesis, we investigated the roles of BAP1 partners in modulating its catalytic activity and tumor suppressor function. More specifically we discovered a unique mechanism of regulation between two major components of BAP1 complexes, namely HCF-1 and OGT. Indeed, HCF-1 is important for the maintenance of the cellular levels of OGT. OGT, in turn, is required for the proper proteolytic maturation of HCF-1 by promoting its O-GlcNAcylation. This signaling event is required for HCF-1 function as a cell cycle regulator. On the other hand, we deciphered an intricate mechanism of regulation of BAP1 by the atypical E2/E3 ligase, UBE2O. UBE2O, promote the multi-monoubiquitination of BAP1 on its NLS mediating its cytoplasmic sequestration and thus inhibition of its tumor suppressor function. Another aspect of modulation of BAP1 H2Aub catalysis is provided by the association of BAP1 with ASXL1 and ASXL2 (ASXL1/ASXL2), two orthologs of ASX. We investigated the role of BAP1/ASXL1/2, particularly in the mechanisms of deubiquitination and tumor suppression. We have demonstrated that BAP1 interacts directly via its C-terminal domain with the ASXM domain of ASXL1/2, thus forming two mutually exclusive complexes. Significantly, ASXM promote, through assembly with BAP1, the generation of a composite ubiquitin binding domain (CUBI), indispensable for inducing the deubiquitinase activity of BAP1 towards H2Aub. The interactions between BAP1 and ASXL1/2 regulate cell cycle progression. In addition, overexpression of BAP1 or ASXL2 in fibroblasts induces senescence in CTD- and ASXM-dependent manner. We also identified cancer-derived mutation of BAP1 that selectively abolish its interaction with ASXL1 and ASXL2 as well as its H2A deubiquitinase activity. Significantly, this mutant suppressed senescence induced by BAP1 overexpression. Thus we provided a link between the tumor suppressor BAP1, its deubiquitinase activity and the control of cell proliferation.

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique., γ-aminobutyric acid (GABA) is the principal inhibitory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in diverse pathologies such as epilepsy, anxiety, depression and drug addiction. GABAergic modulation of neuronal activity involves two different subsets of receptors: the GABAA receptor chlorine channel and the heterodimer of G protein coupled receptors (GPCR) GABAB. Each of these receptors is responsible for mediating distinct parts of the GABA-induced signaling. Upon stimulation, it is vital for the cell to control the signaling input and prevent overstimulation, using mechanisms such as functional desensitization and down-regulation to achieve this. The processes controlling GABAB receptor activity are atypical for a GPCR and have yet to be fully characterized. The aim of this thesis is to elucidate the mechanisms controlling GABAB activity by discovering novel proteins interactions mediating receptor desensitization, internalization and ubiquitination. In the first study, we identified the N-ethylmaleimide sensitive factor (NSF) as a GABAB interacting protein and characterized its interaction site as the coiled-coil structure on both GABAB sub-units. We also showed that this interaction is sensitive to the ATPase state of NSF and that agonist treatment of GABAB led to dissociation of NSF from the receptor in a protein kinase C (PKC) dependent manner. Interestingly, GABA-induced PKC activation was dependent on the NSF-GABAB interaction, suggesting a feedback mechanism for PKC. Both PKC and NSF were involved in mediating receptor desensitization, suggesting a novel role of NSF in receptor signaling regulation. In the proposed model, NSF interacts with GABAB at the basal state, and upon agonist stimulation, PKC is activated and can phosphorylate the receptor, promoting NSF dissociation and GABAB desensitization. We then studied constitutive GABAB ubiquitination and degradation and its regulation by PKC and the deubiquitinating enzyme USP14 (Ubiquitin-specific protease 14). GABAB shows a high constitutive ubiquitination and internalization level. Activation of PKC promotes both phenomena and accelerates the rate of lysosomal receptor degradation. In contrast, USP14 promotes post-endocytic deubiquitination of the receptor, but also accelerates receptor degradation in a catalytically-independent manner. Our results suggest a mechanism where PKC-induced cell surface ubiquitination promotes GABAB endocytosis and USP14 interaction promotes endosomal sorting toward lysosomal degradation. In the third study, we identified the growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) as a protein interacting with the PEST (proline, glutamate, serine, threonine rich) sequence of GABAB1 through a SH3-domain interaction and forming a ternary complex with the functional GABAB heterodimer. We showed that Grb2 can regulate cell surface density of GABAB by decreasing constitutive endocytosis, suggesting that this interaction can compete for binding of the PEST sequence with proteins such as the GABAA γ2S sub-unit or the COPI complex (1, 2), promoting higher cell surface stability. In proposing novel molecular mechanisms controlling GABAB signaling and cell surface expression through NSF, PKC, USP14 and Grb2, this thesis highlights the complex regulation of GABAB activity by its functional desensitization, ubiquitination, endocytosis and degradation.

The SAGA complex is one of the most studied transcriptional co-activator complexes. To facilitate transcription by RNA Polymerase II, SAGA presents a modular organization and harbours two enzymatic activities. In human cells, these two enzymes are called GCN5 and USP22 and they can respectivelly acetylate histones H3 and deubiquitinate histones H2B. During my PhD thesis, I have worked on the regulation of SAGA deubiquitination activity. In the SAGA complex, USP22 interacts strongly with three other subunits to form a structural and functionnal module, named deubiquitination module (DUBm). We have shown that the free recombinant USP22 enzyme is not active, but that the formation of a stable DUBm triggers a strong stimulation of USP22 catalytic activity. Secondly, in human cells, two subunits of the DUBm, ATXN7 and ATXN7L3, contain a domain, called SCA7, that is not found in any other protein. Our results show that the new structural fold adopted by these two domains is specific to these zinc-fingers. These two SCA7 domains share a common structural heart, but their atomic structures reveal also differences, especially in the spatial organization of secondary structure elements. Indeed, we have shown that ATXN7 SCA7 domain can interact in vitro with a nucleosome which is not the case of ATXN7L3 SCA7 domain. Finally, I could show that in vivo the SCA7 domain of Sgf73, the ortholog of ATXN7 has a role in fine tunning SAGA deubiquitination activity. We hypothesize that the interaction between a nucleosome and the SCA7 domain of ATXN7 or Sgf73 would regulate SAGA deubiquitination activity by an optimal positionning of the module to its substrate., Pour faciliter l’initiation de la transcription par l’ARN Polymérase II, le complexe co-activateur de la transcription SAGA possède une activité d’acétylation des histones H3 et une activité de déubiquitination des histones H2B, catalysée chez l’homme par l’enzyme USP22. Mon travail de thèse a porté sur l’étude de la régulation de cette activité de déubiquitination.Au sein de SAGA, USP22 interagit fortement avec trois protéines pour former un module structural appelé module de déubiquitination (DUBm). Nous avons montré que la formation d’un tel module était requise pour activer USP22. D’autre part, deux sous-unités du DUBm humain, ATXN7 et ATXN7L3, contiennent un domaine SCA7. Nos résultats montrent que le repliement structural adopté par ces deux doigts de zinc n’avait pas encore été décrit. Nous avons démontré que le domaine SCA7 de ATXN7 peut interagir avec un nucléosome in vitro et que cette interaction participe à la régulation fine de l’activité de déubiquitination de SAGA. Nous proposons qu’en interagissant avec le nucléosome, le domaine SCA7 de Sgf73 ou de ATXN7 pourrait positionner le DUBm de façon optimale par rapport à son substrat.

Notch signaling is a highly conserved pathway from Caenorhabditis elegans to Drosophila melanogaster or mammals. It is absolutely required from embryonic development, and it controls many different processes such as cell differentiation, cell fate decision, cell proliferation, stem cells maintenance or apoptosis. The signaling is based on the activity of Notch receptor, which is expressed as an heterodimeric transmembrane protein, and which is activated during intercellular contacts by the binding of its transmembrane ligands expressed by neighboring cells. Consequently to this activation, Notch undergoes two successive proteolytic cleavages, respectively catalyzed by an ADAM metalloprotease and the γ-secretase complex. This last cleavage releases Notch intracellular domain in the cytoplasm, then this activated form is translocated to the nucleus where it finally directly promotes Notch target genes transcription by binding its transcription co-factors CSL and Mastermind. Notch receptor is regulated at several steps by ubiquitination processes : activated Notch monoubiquitination controls its γ-secretase cleavage, non-activated Notch polyubiquitination controls its lysosomal degradation. Ubiquitination processes are reversed by deubiquitination events. No deubiquitination step has been highlighted in Notch signaling yet. My thesis project consisted in identifying the deubiquitinating enzymes - the enzymes responsible for deubiquitination - involved in both ubiquitination processes previously described. To this end, we set up two immunofluorescence screens to test an shRNA library targeting each one of the 91 known or putative deubiquitinating enzymes of the human genome. The first screen allowed me to identify eIF3f, known so far as a subunit of the translation initiation factor 3, as a new protein carrying a deubiquitinating activity. eIF3f is recruited to activated Notch via the E3 ubiquitin ligase Deltex, and eventually enhances Notch signaling by deubiquitinating the activated receptor before the γ-secretase cleavage, thus triggering the production of transcriptionally active Notch. In addition, the second screen identified several candidate deubiquitinating enzymes, whose role in non-activated Notch intracellular trafficking is being validated.; La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée depuis Caenorhabditis elegans jusqu'aux mammifères en passant par Drosophila melanogaster. Elle est requise dès le développement embryonnaire et contrôle de nombreux processus comme la différenciation et le choix du destin cellulaire, la prolifération, ou encore le maintien de stocks de cellules souches et l'apoptose. La voie est basée sur l'activité du récepteur Notch, un hétérodimère transmembranaire qui est activé lors de contacts intercellulaires par la liaison de ses ligands qui sont également des protéines transmembranaires. Suite à cette activation, le récepteur subit une série de deux clivages protéolytiques internes, respectivement catalysés par une métalloprotéase ADAM et par le complexe multi-protéique γ-secrétase. Ce dernier clivage libère le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, cette forme étant ensuite transportée dans le noyau où elle active directement la transcription des gènes cibles de la voie Notch en se liant à ses co-facteurs de transcription, CSL et Mastermind. Le récepteur Notch est régulé à diverses étapes par des processus d'ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé et endocytosé contrôle sa dégradation dans les lysosomes. Les processus d'ubiquitination sont réversiblement contrôlés par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n'a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases - les enzymes responsables de la déubiquitination - impliquées dans les deux processus d'ubiquitination décrits précédemment. Nous avons pour cela mis au point deux cribles en immunofluorescence permettant de tester une banque de shRNA qui cible l'expression des 91 déubiquitinases connues ou putatives du génome humain. Le premier crible m'a permis d'identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d'initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle protéine portant une activité déubiquitinase. eIF3f est recrutée au récepteur Notch via l'E3 ubiquitine ligase Deltex, et régule positivement la voie de signalisation Notch en déubiquitinant le récepteur Notch activé avant le clivage γ-secrétase, favorisant ainsi la production de la forme transcriptionnellement active de Notch. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs déubiquitinases candidates, dont le rôle dans la régulation du trafic intracellulaire du récepteur Notch non activé est en cours de validation.

Notch signaling is a highly conserved pathway from Caenorhabditis elegans to Drosophila melanogaster or mammals. It is absolutely required from embryonic development, and it controls many different processes such as cell differentiation, cell fate decision, cell proliferation, stem cells maintenance or apoptosis. The signaling is based on the activity of Notch receptor, which is expressed as an heterodimeric transmembrane protein, and which is activated during intercellular contacts by the binding of its transmembrane ligands expressed by neighboring cells. Consequently to this activation, Notch undergoes two successive proteolytic cleavages, respectively catalyzed by an ADAM metalloprotease and the γ-secretase complex. This last cleavage releases Notch intracellular domain in the cytoplasm, then this activated form is translocated to the nucleus where it finally directly promotes Notch target genes transcription by binding its transcription co-factors CSL and Mastermind. Notch receptor is regulated at several steps by ubiquitination processes : activated Notch monoubiquitination controls its γ-secretase cleavage, non-activated Notch polyubiquitination controls its lysosomal degradation. Ubiquitination processes are reversed by deubiquitination events. No deubiquitination step has been highlighted in Notch signaling yet. My thesis project consisted in identifying the deubiquitinating enzymes - the enzymes responsible for deubiquitination - involved in both ubiquitination processes previously described. To this end, we set up two immunofluorescence screens to test an shRNA library targeting each one of the 91 known or putative deubiquitinating enzymes of the human genome. The first screen allowed me to identify eIF3f, known so far as a subunit of the translation initiation factor 3, as a new protein carrying a deubiquitinating activity. eIF3f is recruited to activated Notch via the E3 ubiquitin ligase Deltex, and eventually enhances Notch signaling by deubiquitinating the activated receptor before the γ-secretase cleavage, thus triggering the production of transcriptionally active Notch. In addition, the second screen identified several candidate deubiquitinating enzymes, whose role in non-activated Notch intracellular trafficking is being validated.; La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée depuis Caenorhabditis elegans jusqu'aux mammifères en passant par Drosophila melanogaster. Elle est requise dès le développement embryonnaire et contrôle de nombreux processus comme la différenciation et le choix du destin cellulaire, la prolifération, ou encore le maintien de stocks de cellules souches et l'apoptose. La voie est basée sur l'activité du récepteur Notch, un hétérodimère transmembranaire qui est activé lors de contacts intercellulaires par la liaison de ses ligands qui sont également des protéines transmembranaires. Suite à cette activation, le récepteur subit une série de deux clivages protéolytiques internes, respectivement catalysés par une métalloprotéase ADAM et par le complexe multi-protéique γ-secrétase. Ce dernier clivage libère le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, cette forme étant ensuite transportée dans le noyau où elle active directement la transcription des gènes cibles de la voie Notch en se liant à ses co-facteurs de transcription, CSL et Mastermind. Le récepteur Notch est régulé à diverses étapes par des processus d'ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé et endocytosé contrôle sa dégradation dans les lysosomes. Les processus d'ubiquitination sont réversiblement contrôlés par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n'a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases - les enzymes responsables de la déubiquitination - impliquées dans les deux processus d'ubiquitination décrits précédemment. Nous avons pour cela mis au point deux cribles en immunofluorescence permettant de tester une banque de shRNA qui cible l'expression des 91 déubiquitinases connues ou putatives du génome humain. Le premier crible m'a permis d'identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d'initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle protéine portant une activité déubiquitinase. eIF3f est recrutée au récepteur Notch via l'E3 ubiquitine ligase Deltex, et régule positivement la voie de signalisation Notch en déubiquitinant le récepteur Notch activé avant le clivage γ-secrétase, favorisant ainsi la production de la forme transcriptionnellement active de Notch. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs déubiquitinases candidates, dont le rôle dans la régulation du trafic intracellulaire du récepteur Notch non activé est en cours de validation.