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De nombreuses bactéries et de nombreux champignons utilisent la voie non ribosomale pour produire des peptides ou d'autres petites molécules. Cette voie, nommée NRPS pour " non-ribosomal peptide synthesis ", fait appel à des mégaenzymes modulaires qui catalyse nt l'assemblage de peptides à partir d'acides aminés protéinogéniques ou non protéinogéniques. Les petites molécules synthétisées par cette voie peuvent intervenir dans des processus très variés tels que "adaptation aux environnements défavorables, la communication ou la compétition avec d'autres microorganismes dans leur habitat naturel, ou encore l'interaction avec un hôte. Xanthomonas albilineans est l'agent causal de "échaudure des feuilles, une des principales maladies bactériennes de la canne à sucre. Le séquençage de son génome a conduit à la découverte d'un nouveau locus NRPS, appelé META-B, qui est également présent dans le génome de souches appartenant à Xanthomonas oryzae ou Xanthomonas /rans/ucens. Les analyses in silico indiquent que ce locus ne ressemble à aucun autre locus décrit à ce jour et que chaque souche séquencée produit un peptide META-B différent. La présence du locus META-B chez trois espèces de Xanthomonas phylogénétiquement distantes et associées à des plantes monocotylédones suggère que la nouvelle famille de petites molécules produites par ce locus pourrait jouer un rôle dans les interactions plante-bactérie. Un protocole permettant de surproduire et d' isoler le peptide META-B chez la souche GPE PC73 de X. abilineans a été développé. Deux approches sont actuellement mises en oeuvre pour trouver la fonction de ce peptide META-B. La première est basée sur l'étude du peptide META-B purifié (tests in vitro pour évaluer les activités antibactériennes ou antifongiques ou pour mettre en évidence un rôle dans les interactions avec la canne à sucre). La seconde est basée sur l'étude de mutants affectés dans l'expression de gènes du locus META-B (expérimentations sur canne à sucre). (Texte intégral)

Xanthomonas albilineans est l'agent causal de "échaudure des feuilles, une des principales maladies bactériennes de la canne à sucre. L'étude de son génome a permis de confirmer que X albilineans est une bactérie originale au regard des autres espèces de Xanthomonas . En effet, elle ne possède ni les gènes du système de sécrétion de type III de la famille Hrp ("Hypersensit ive response and pathogenicity"), ni les gènes gum responsables de la biosynthèse de la gomme x3ll thane. De plus, X albilineans présente une grande variabilité génétique intra-espèce qui a déjà été mise en évidence à l'aide de plusieurs marqueurs (PFGE pour "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" et MLSA pour "Multi Locus Sequence Analysis"). Le génome de la souche OPE PC73 de X albilineans comprend deux loci CRISPR (pour "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"). Les loci CRISPR sont présents chez de nombreuses bactéries et la quasi-totalité des archéobactéries décrites à ce jour. Ils sont bordés de gènes dits CAS (pour "Crispr ASsociated") et présentent une structure répétitive comportant des séquences uniques appelées espaceurs. Le premier locus CRISPR de la souche OPE PC73 de X. albilineans, appelé CRISPR-I , est associé à 7 gènes CAS et comprend des séquences répétées de 31 pa ires de bases. Le second, appelé CRISPR-2, est associé à 6 gènes CAS et contient des séquences répétées de 28 paires de bases. Au cours de cette étude, nous avons analysé le polymorphisme des espaceurs du CRIPSR- I parmi des souches appartenant au groupe PFGE-B afin de retracer l'histoire des souches de X albilineans responsables de la recrudescence de l'échaudure des feuilles observée dans les années 80 aux Antilles, en Floride et au Texas. Nous avons également analysé le polymorphisme des espaceurs du CRIPSR-2 au sein de souches représentatives de la diversité génétique de X. albilineans afin de mieux comprendre l'histoire évolutive de cette espèce. (Texte intégral)

Xanthomonas is a large genus of Gram-negative bacteria that cause disease in hundreds of plant species. To date, the only known small molecule synthesized by non-ribosomal peptide synthesis (NRPS) in this genus is albicidin produced by Xanthomonas albilineans. The DNA gyrase inhibitor albicidin is not only an important virulence factor but also a possible lead structure for novel antibiotics. This study aims to estimate the biosynthetic potential of Xanthomonas spp. by in silico analyses of NRPS genes with unknown function recently identified in the sequenced genomes of X. albilineans and related species of Xanthomonas. We performed in silico analyses of NRPS genes present in all published genome sequences of Xanthomonas spp., as well as in unpublished draft genome sequences of Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain BAI3 and Xanthomonas spp. strain XaS3. The most unexpected result of these analyses is that these two latter strains, together with X. albilineans strain GPE PC73 and X. oryzae pv. oryzae strains X8-1A and X11-5A, possess novel NRPS gene clusters. Furthermore, these Xanthomonas spp. strains share related NRPS-associated genes such as those required for the biosynthesis of non-proteinogenic amino acids or for the secretion of peptides. In silico prediction of peptide structures according to the NRPS architecture accounts for eight different peptides, each specific to its producing strain. Interestingly, these eight peptides cannot be assigned to any known gene cluster or related to known compounds from natural product databases. PCR screening of a collection of 94 plant pathogenic bacteria indicates that these novel NRPS gene clusters are specific to the genus Xanthomonas and are also present in Xanthomonas transluscens and X. oryzae pv. oryzicola. Further genome mining revealed (i) novel NRPS genes shared by Xanthomonas spp. strains GPE PC73 and XaS3 with the plant-associated bacterium Bradyrhizobium spp. strain BTAi and (ii) novel NRPS genes specific to X. oryzae pv. oryzicola or Xanthomonas sacchari. This study revealed the significant potential of the genus Xanthomonas of producing new non-ribosomally synthesized peptides. Interestingly, this biosynthetic potential seems to be specific to strains of Xanthomonas associated with monocotyledonous plants, suggesting a putative involvement of new non-ribosomally synthesized peptides in plant-bacteria interactions.

La famille des Xanthomonadaceae comprend deux bactéries phytopathogènes dont l'habitat in planta est limité au xylème, Xanthomonas albilineans et Xylella fastidiosa. Le génome complet de X. albilineans a été séquencé, apportant des indices importants pour identifier de nouveaux facteurs de pathogénie chez cet agent pathogène responsable de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre, ainsi qu'un éclairage nouveau sur l'évolution des Xanthomonadaceae. Les analyses phylogénétiques de cette famille publiées à ce jour ont conduit à classer les genres Xanthomonas et Stenotrophomonas dans un même clade excluant X. fastidiosa. Une analyse phylogénétique réalisée avec 7 gènes de ménage incluant les séquences de X. albilineans a généré un arbre différent. Dans ce nouvel arbre, X. albilineans et X. fastidiosa dérivent d'un même parent du genre Xanthomonas, qui lui-même dérive du même parent que Stenotrophomonas. Une analyse génomique comparative révèle que X. albilineans et X. fastidiosa ont subi une évolution réductionnelle similaire de leur génome. Cette réduction, plus prononcée chez X. fastidiosa, découle-t-elle de l'adaptation de ces deux agents pathogènes aux vaisseaux du xylème qui constituent une niche très cloisonnée et un environnement très pauvre en éléments nutritifs ? L'étroite parenté observée entre ces 2 agents est également illustrée par les caractéristiques communes et uniques de leurs enzymes de dégradation de la cellulose. Par ailleurs, X. albilineans, tout comme X. fastidiosa, ne possède pas de système de sécrétion de type 3 (SST3) Hrp qui joue un rôle très important dans la pathogénie des autres Xanthomonas. Cependant, cette espèce a acquis un SST3 de la famille SPI-1 ("Salmonella Pathogenicity Island-1") spécifique des pathogènes animaux, ainsi que 10 gènes codant des mégaenzymes NRPSs ("Non Ribosomal Peptide Synthetases") pouvant intervenir dans la biosynthèse de molécules favorisant les interactions avec les plantes. (Texte intégral)

Xanthomonas albilineans (Xa) est l'agent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre. Cette bactérie colonise les vaisseaux du xylème et provoque des symptômes de lignes blanches foliaires, de chlorose et de nécrose. Le génome complet de la souche de Xa GPE PC73, originaire de Guadeloupe, a récemment été séquencé et annoté. Xa ne possède pas de système de sécrétion de type III de la famille des injectisomes Hrp, et sa pathogénie repose donc sur d'autres systèmes de sécrétion. Les métabolites secondaires, qui n'utilisent que des pompes pour sortir de la bactérie et pour entrer dans la cellule végétale, pourraient jouer un rôle important dans la pathogénie de Xa. Le génome de Xa comprend 12 gènes codant des méga-enzymes NRPSs ("Non Ribosomal Peptide Synthetases") qui permettent l'assemblage non ribosomal d'acides aminés et donc la biosynthèse de métabolites secondaires. Trois de ces gènes NRPS (albl, alblV et alblX) interviennent dans la biosynthèse d'une toxine appelée albicidine. Celle-ci, en bloquant la réplication des chloroplastes, induit l'apparition des symptômes foliaires de l'échaudure des feuilles. Les enzymes NRPSs sont activées par une phosphopantéthéinyl-transférase codée chez Xa par un seul gène nommé albXXl dont l'inactivation bloque la biosynthèse de l'albicidine et d'autres molécules synthétisées par les NRPSs. Les gènes albl, alblV, alblX et albXXl ont été inactivés individuellement par délétion chez la souche Xa GPE PC73, puis des tiges de canne à sucre ont été inoculées avec chacun des quatre mutants par la méthode de décapitation-dépôt. Le mutant albXXl colonise la tige de canne à sucre de façon moins intense que la souche sauvage et les mutants albl, alblV et alblX. Au moins deux métabolites secondaires synthétisés par des NRPSs sont donc impliqués dans la pathogénie de Xa GPE PC73: (i) l'albicidine, responsable de l'induction de symptômes foliaires et (ii) au moins une autre molécule nécessaire à la colonisation de la tige. (Texte intégral)

L'albicidine est une molécule à activité phytotoxique et antibiotique produite par la bactérie Xanthomonas albilineans, l'agent causal de la maladie de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre. L'albicidine, qui est un composant-clé de la pathogénie de X. albilineans, est synthétisée par un système hybride PKS/NRPS ("PolyKetide Synthase/NonRibosomal Peptide Synthetase"). Il s'agit d'un puissant inhibiteur de l'ADN gyrase de plantes et de bactéries. Son mode d'action est original car, au contraire de celui d'autres antibiotiques connus, l'albicidine bloque la partie C-terminale du site de fixation à l'ADN de la gyrase A. La caractérisation de l'albicidine a jusqu'à présent été ralentie à cause des faibles rendements de production de cette molécule par X. albilineans. C'est pourquoi, l'ensemble des gènes nécessaires à la biosynthèse de l'albicidine ont été transférés dans la bactérie à croissance rapide X. axonopodis pv. vesicatoria. Ce transfert de gènes a conduit à une production d'albicidine beaucoup plus élevée. Une combinaison de méthodes biochimiques et chromatographiques a permis la purification de l'albicidine. De plus, plusieurs techniques de spectrométrie de masse (ESI-MALDI-TOF, FTICR-MS) ont permis (i) de déterminer la masse exacte de l'albicidine (842.2 Da) et (ii) de proposer un nombre limité de formules chimiques compatibles avec la masse de la molécule. Enfin, plusieurs caractéristiques chimiques de l'albicidine ont pu être déterminées grâce à des analyses préliminaires en RMN. En conclusion, l'augmentation des rendements de production de l'albicidine en système hétérologue, conjuguée à une plus grande efficacité de sa purification, ont permis de réaliser des progrès dans la caractérisation structurale de l'albicidine. De plus grandes quantités d'albicidine purifiée sont en cours de préparation et celles-ci seront prochainement analysées grâce à des techniques de caractérisation structurale performantes. (Texte intégral)

Xanthomonas albilineans est l'agent causal de I'échaudure des feuilles de la canne à sucre. Cette bactérie produit une toxine particulière et spécifique, appelée albicidine, qui joue un rôle clé dans l'apparition des symptômes foliaires. Le génome de la souche PC73 (= CFBP7063) de X. albilineans, originaire de Guadeloupe, a été séquencé et annoté. Il comprend un chromosome circulaire de 3,7 Mb et trois plasmides (25, 27 et 32 kb). Cette taille du génome est nettement inférieure à celle des autres espèces de Xanthomonas (environ 5 Mb) séquencées à ce jour. Contrairement aux autres Xanthomonas, X. albilineans ne possède pas d'injectisome (ou système de sécrétion de type III de la famille Hrp2) impliqué dans les interactions avec la plante hôte. L'analyse de la séquence du génome de la souche PC73 de X. albilineans révèle que X. albilineans se distingue des autres bactéries phytopathogènes par sa capacité à produire des métabolites secondaires. En effet cette souche possède, en plus du groupement de gènes impliqués dans la biosynthèse de l'albicidine, trois autres groupements de gènes de la famille des peptides synthétases non ribosomales (NRPS). Les analyses in silico ont permis de montrer que les peptides synthétisés par ces trois nouveaux groupements de gènes NRPS ne ressemblent à aucun autre peptide décrit à ce jour. L'implication de métabolites secondaires dans la pathogenèse de X. albilineans pourrait expliquer l'absence d'injectisome Hrp2. En effet, ces métabolites secondaires, qui n'ont besoin que de pompes pour sortir de la bactérie et pour entrer dans la cellule végétale, pourraient agir comme des effecteurs. Le groupement de gènes rpf ("regulation of pathogenicity factors") impliqué dans la biosynthèse et la perception du DSF ("diffusible signal factor") qui est présent dans le génome des autres Xanthomonas phytopathogènes est conservé dans le génome de la souche PC73. La taille réduite du génome de X. albilineans et ses autres particularités suggèrent que cette espèce est un intermédiaire au cours de l'évolution du genre Xanthomonas.

En inhibant la différenciation des chloroplastes, l'albicidine joue un rôle majeur dans le pouvoir pathogène de Xanthomonas albilineans sur la canne à sucre. Cette pathotoxine possède aussi des propriétés antibiotiques et inhibe notamment la croissance d'Escherichia coli. Cependant, l'albicidine n'est produite qu'en très faible quantité par X. albilineans et sa structure et sa composition chimique sont encore inconnues. Trois régions génomiques (XALB1, XALB2 et XALB3) impliquées dans la biosynthèse de l'albicidine ont été clonées et séquencées. La région XALB1 (49 kb) comprend 20 ORFs dont trois codent pour des mégasynthases appartenant à la famille des polycétides synthases (PKS) et des peptides synthases non ribosomales (NRPS). L'analyse in silico de ces trois ORFs a permis de proposer un modèle de biosynthèse de l'albicidine, ainsi qu'une structure théorique partielle du squelette de la molécule. Les autres ORFs de XALB1 correspondent à des gènes de résistance, de régulation et de modification. Les régions XALB2 et XALB3 sont plus petites (3kb) et comprennent chacune une seule ORF codant respectivement pour une enzyme responsable de la modification post traductionnelle des PKS et des NRPS et pour la protéine de stress HtpG. Les trois régions impliquées dans la biosynthèse de l'albicidine (XALB1, XALB2 et XALB3) ont été transférées via deux plasmides dans une bactérie à croissance rapide, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria. Après transformation, cette dernière a produit un antibiotique (albicidineXav) actif sur E. coli. Les souches d'E. coli transformées avec différents gènes de résistance à l'albicidine ou spontanément résistantes à l'albicidine sont également résistantes à l'albicidineXav. Inversement, des souches d'E. coli spontanément résistantes à l'albicidineXav sont également résistantes à l'albicidine. Ces résistances croisées suggèrent fortement que l'albicidineXav produite par l'hôte hétérologue est identique à l'albicidine produite par X. albilineans, mais des analyses structurales seront nécessaires pour le confirmer. Sous réserve de cette confirmation, les régions XALB1, XALB2 et XALB3 comprennent donc l'ensemble des gènes spécifiques à X. albilineans et nécessaires pour la biosynthèse de l'albicidine. La caractérisation des bases génétiques de la biosynthèse de l'albicidine, ainsi que l'obtention d'un système de production hétérologue, devraient permettre de modifier les facteurs limitant la production de toxine et de déboucher sur un système recombinant de surproduction de l'albicidine. Celui-ci devrait conduire à l'obtention d'une quantité d'albicidine purifiée suffisante pour les études structurales de ce polycétide complexe. Par ailleurs, ce système hétérologue de biosynthèse de l'albicidine facilitera également la caractérisation fonctionnelle de l'ensemble des gènes concernés et devrait permettre de compléter le modèle de biosynthèse de la toxine. (Texte intégral)