4 results on '"CLOSTRIDIUM acetobutylicum"'
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2. Etude des relations structure-fonctions de l´hydrogénase à fer de Clostridium acetobutylicum et de ses partenaires d'oxydo-réduction
- Author
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Demuez, Marie, Instituto IMDEA Energy [Madrid], Instituto IMDEA Energía, INSA de Toulouse, and Laurence Girbal, Philippe Soucaille(Laurence.Girbal@insa-toulouse.fr)
- Subjects
Hydrogénase ,Centre fer-soufre ,Hydrogène ,Clostridium acetobutylicum ,[SDV.BBM.BC]Life Sciences [q-bio]/Biochemistry, Molecular Biology/Biochemistry [q-bio.BM] ,Iron-sulfur cemter ,Hydrogen - Abstract
The biological production of hydrogen, a "clean" energy carrier, has recently aroused a great interest. The most efficient reported micro-organism for hydrogen production from hexose is the anaerobic bacterium Clostridium acetobutylicum with a chemostat production of 2.4 l H2 l-1 h-1, catalyzed by the HydA [FeFe]-hydrogenase. In order to understand and improve C. acetobutylicum hydrogen potentialities, we have attempted to characterize the structure-function relationships of HydA with its redox partners. By homology with the [FeFe]-hydrogenase of Clostridium pasteurianum, the [4Fe- 4S] FS4C and [2Fe-2S] FS2 clusters located on the protein surface were predicted to be involved in the inter-molecular electron transfer between HydA and its redox partners. Our goal was to determine the implication of the FS4C and FS2 clusters in this transfer. To do so, mutagenesis by amino acid substitutions and domain deletions was performed on FS4C and FS2. In order to stabilize native and modified hydrogenases, the purification protocol was improved. Native hydrogenase was successfully stabilized, while the persisting instability of modified hydrogenase was an obstacle of their catalytic characterization. Decreased activity of modified hydrogenases was due to a loss of active site functionality and to a lower iron content than the theoretical value. The physiological redox partners of HydA, ferredoxine CAC0303 and flavodoxin, were purified. The complete catalytic profile of HydA and its kinetic parameter with different redox partners for hydrogen uptake and hydrogen production were determined. The optimized purification protocol led to a significant increase of both hydrogen uptake and hydrogen production activities. We confirmed that the in vitro hydrogen uptake was more favourable than the hydrogen production. A very high kcat was determined with the artificial substrate methyl viologen for the hydrogen uptake activity. This result might indicate that methyl viologen could be prone to interact more or less directly with the active site, shunting the intra-molecular electron transfer chain. High catalytic efficiencies for both H2 uptake and H2 production activities were observed with either artificial (except for reduced methyl viologen) and physiological redox partners. This result reflects the high potential of HydA for hydrogen-related activities which is conserved with three different electron carriers. Hence, in iron-limited growth conditions, the in vivo substitution of ferredoxin by flavodoxin might not be a limitation for in vivo hydrogenase activity.; Source d'énergie renouvelable et non polluante, le biohydrogène connaît un intérêt croissant. En culture continue sur glucose, la productivité d'hydrogène la plus élevée est réalisée par la bactérie anaérobie Clostridium acetobutylicum avec 2,4 litres d'hydrogène produit l-1 h-1. Cette production d'hydrogène est catalysée par la [FeFe]-hydrogénase HydA. Pour comprendre et améliorer les capacités de ce micro-organisme pour la production d'hydrogène, nous avons voulu caractériser les relations structure-fonctions de HydA avec ses partenaires d'oxydo-réduction. Par homologie avec l'hydrogénase à fer I de Clostridium pasteurianum, les centres [4Fe-4S] FS4C et [2Fe-2S] FS2, situés en surface de la protéine, pourraient être impliqués dans le transfert inter-moléculaire d'électrons entre HydA et ses partenaires d'oxydoréduction. Notre objectif a alors été de déterminer l'implication de FS4C et FS2 dans ce transfert. Pour cela, des mutations par substitutions d'acides aminés et par délétions de domaines ont été effectuées au niveau de FS4C et FS2. Pour palier des problèmes d'instabilité des hydrogénases à fer native et modifiées, le protocole de purification a été amélioré. L'hydrogénase native a nettement été stabilisée, mais l'instabilité persistante des hydrogénases modifiées est restée une limitation importante pour leur caractérisation catalytique. La perte d'activité des hydrogénases modifiées a pu être corrélée à une perte importante de fonctionnalité de leur site actif et à un nombre d'atomes de fer incorporés inférieur à la valeur théorique. Les partenaires physiologiques d'oxydo-réduction de HydA chez C. acetobutylicum, la ferrédoxine CAC0303 et la flavodoxine, ont été purifiés. Le profil catalytique complet et les paramètres cinétiques des activités de consommation et de production d'hydrogène de HydA native avec différents partenaires d'oxydo-réduction ont été déterminés. L'amélioration du protocole de purification a permis d'augmenter significativement les activités de consommation et production d'hydrogène. Nous avons confirmé la préférence in vitro de HydA à catalyser la consommation de l'hydrogène par rapport à la production. Une valeur très élevée de kcat a été obtenue avec le substrat artificiel, méthyl viologène, en consommation d'hydrogène. Cela semble indiquer que le méthyl viologène pourrait interagir plus ou moins directement avec le site actif de l'enzyme, en évitant le transfert intramoléculaire d'électrons. Des efficacités catalytiques élevées de consommation et de production de l'hydrogène ont été obtenues avec le méthyl viologène (sauf sous sa forme réduite), la ferrédoxine et la flavodoxine. Ce résultat reflète le haut potentiel de HydA pour les réactions liées à l'hydrogène, potentiel conservé aussi bien pour ses partenaires redox physiologiques qu'artificiel. Ainsi, en condition de croissance en carence en fer, la substitution de la ferrédoxine par la flavodoxine ne serait pas une limitation pour l'activité hydrogénase in vivo.
- Published
- 2007
3. Structure-function relationships of [FeFe]-hydrogenase from Clostridium acetobutylicum and with its redox partners
- Author
-
Demuez, Marie and Demuez, Marie
- Subjects
Hydrogénase ,Centre fer-soufre ,Hydrogène ,Clostridium acetobutylicum ,Iron-sulfur cemter ,[SDV.BBM.BC] Life Sciences [q-bio]/Biochemistry, Molecular Biology/Biochemistry [q-bio.BM] ,Hydrogen - Abstract
The biological production of hydrogen, a "clean" energy carrier, has recently aroused a great interest. The most efficient reported micro-organism for hydrogen production from hexose is the anaerobic bacterium Clostridium acetobutylicum with a chemostat production of 2.4 l H2 l-1 h-1, catalyzed by the HydA [FeFe]-hydrogenase. In order to understand and improve C. acetobutylicum hydrogen potentialities, we have attempted to characterize the structure-function relationships of HydA with its redox partners. By homology with the [FeFe]-hydrogenase of Clostridium pasteurianum, the [4Fe- 4S] FS4C and [2Fe-2S] FS2 clusters located on the protein surface were predicted to be involved in the inter-molecular electron transfer between HydA and its redox partners. Our goal was to determine the implication of the FS4C and FS2 clusters in this transfer. To do so, mutagenesis by amino acid substitutions and domain deletions was performed on FS4C and FS2. In order to stabilize native and modified hydrogenases, the purification protocol was improved. Native hydrogenase was successfully stabilized, while the persisting instability of modified hydrogenase was an obstacle of their catalytic characterization. Decreased activity of modified hydrogenases was due to a loss of active site functionality and to a lower iron content than the theoretical value. The physiological redox partners of HydA, ferredoxine CAC0303 and flavodoxin, were purified. The complete catalytic profile of HydA and its kinetic parameter with different redox partners for hydrogen uptake and hydrogen production were determined. The optimized purification protocol led to a significant increase of both hydrogen uptake and hydrogen production activities. We confirmed that the in vitro hydrogen uptake was more favourable than the hydrogen production. A very high kcat was determined with the artificial substrate methyl viologen for the hydrogen uptake activity. This result might indicate that methyl viologen could be prone to interact more or less directly with the active site, shunting the intra-molecular electron transfer chain. High catalytic efficiencies for both H2 uptake and H2 production activities were observed with either artificial (except for reduced methyl viologen) and physiological redox partners. This result reflects the high potential of HydA for hydrogen-related activities which is conserved with three different electron carriers. Hence, in iron-limited growth conditions, the in vivo substitution of ferredoxin by flavodoxin might not be a limitation for in vivo hydrogenase activity., Source d'énergie renouvelable et non polluante, le biohydrogène connaît un intérêt croissant. En culture continue sur glucose, la productivité d'hydrogène la plus élevée est réalisée par la bactérie anaérobie Clostridium acetobutylicum avec 2,4 litres d'hydrogène produit l-1 h-1. Cette production d'hydrogène est catalysée par la [FeFe]-hydrogénase HydA. Pour comprendre et améliorer les capacités de ce micro-organisme pour la production d'hydrogène, nous avons voulu caractériser les relations structure-fonctions de HydA avec ses partenaires d'oxydo-réduction. Par homologie avec l'hydrogénase à fer I de Clostridium pasteurianum, les centres [4Fe-4S] FS4C et [2Fe-2S] FS2, situés en surface de la protéine, pourraient être impliqués dans le transfert inter-moléculaire d'électrons entre HydA et ses partenaires d'oxydoréduction. Notre objectif a alors été de déterminer l'implication de FS4C et FS2 dans ce transfert. Pour cela, des mutations par substitutions d'acides aminés et par délétions de domaines ont été effectuées au niveau de FS4C et FS2. Pour palier des problèmes d'instabilité des hydrogénases à fer native et modifiées, le protocole de purification a été amélioré. L'hydrogénase native a nettement été stabilisée, mais l'instabilité persistante des hydrogénases modifiées est restée une limitation importante pour leur caractérisation catalytique. La perte d'activité des hydrogénases modifiées a pu être corrélée à une perte importante de fonctionnalité de leur site actif et à un nombre d'atomes de fer incorporés inférieur à la valeur théorique. Les partenaires physiologiques d'oxydo-réduction de HydA chez C. acetobutylicum, la ferrédoxine CAC0303 et la flavodoxine, ont été purifiés. Le profil catalytique complet et les paramètres cinétiques des activités de consommation et de production d'hydrogène de HydA native avec différents partenaires d'oxydo-réduction ont été déterminés. L'amélioration du protocole de purification a permis d'augmenter significativement les activités de consommation et production d'hydrogène. Nous avons confirmé la préférence in vitro de HydA à catalyser la consommation de l'hydrogène par rapport à la production. Une valeur très élevée de kcat a été obtenue avec le substrat artificiel, méthyl viologène, en consommation d'hydrogène. Cela semble indiquer que le méthyl viologène pourrait interagir plus ou moins directement avec le site actif de l'enzyme, en évitant le transfert intramoléculaire d'électrons. Des efficacités catalytiques élevées de consommation et de production de l'hydrogène ont été obtenues avec le méthyl viologène (sauf sous sa forme réduite), la ferrédoxine et la flavodoxine. Ce résultat reflète le haut potentiel de HydA pour les réactions liées à l'hydrogène, potentiel conservé aussi bien pour ses partenaires redox physiologiques qu'artificiel. Ainsi, en condition de croissance en carence en fer, la substitution de la ferrédoxine par la flavodoxine ne serait pas une limitation pour l'activité hydrogénase in vivo.
- Published
- 2007
4. Etudes cristallographiques d'enzymes impliquées dans les mécanismes de défense contre le stress oxydant : les peptides méthionine sulfoxyde réductases et la NADH rubrédoxine oxydoréductase
- Author
-
Kauffmann, Brice, UL, Thèses, Laboratoire de Cristallographie et modélisation des matériaux minéraux et biologiques (LCM3B), Université Henri Poincaré - Nancy 1 (UHP)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université Henri Poincaré - Nancy 1, and André Aubry
- Subjects
[CHIM.OTHE] Chemical Sciences/Other ,Stress oxydatif ,Rayons X-Diffraction ,Clostridium acetobutylicum ,Flavoprotéines ,[CHIM.OTHE]Chemical Sciences/Other ,Méthionine sulfoxyde réductase - Abstract
This work presents the structural analysis by X-Ray crystallography of two families of enzymes involved in defence mechanism against oxidative stress. The first part is dedicated to peptide methionine sulfoxide reductases (Msr) which catalyse methionine sulfoxide (MetSO) reduction. MetSO are formed by oxidation of the methionine residue by oxygen and nitrogen species. Four structures of oxidised and reduced forms of Msr have been solved, in collaboration with the team directed by Pr. G. Branlant in MAEM and with the team of Pr. J.P. Jacquot in IAM, at the UHP Nancy I. The second part of this work was done in collaboration with the laboratory of "Bactéries Gram +" (directed by Pr. H. Petitdemange) at UHP and concerns the NADH rubredoxin oxidoreductase (NROR) from Clostridium acetobutylicum, a solvantogenic anaerobe. The structure of the native form of NROR was solved at 1.01 ÊA resolution. This enzyme was proposed to be involved in the reduction pathway of the superoxide radical., Ce mémoire présente l'étude structurale par cristallographie des rayons X de deux familles d'enzymes impliquées dans les mécanismes de défense contre le stress oxydant. La première partie est dédiée à l'étude de peptide méthionine sulfoxyde réductases (Msr). Ces enzymes catalysent la réduction des méthionine sulfoxydes, produits de l'oxydation du résidu méthionine par des entités oxygénées (ERO) ou nitrées réactives (NRO). Quatre structures de formes oxydées et réduites de ces enzymes ont été résolues. Les travaux correspondants ont été réalisés en collaboration avec les équipes du professeur G. Branlant au MAEM et du professeur J.-P. Jacquot au laboratoire Interactions Arbres-Microorganismes, à l'UHP de Nancy. La deuxième partie de ce manuscrit présente les travaux réalisés en collaboration avec le laboratoire des bactéries Gram+ dirigé par H. Petitdemange à l'UHP sur la NADH rubrédoxine oxydoréductase (NROR) de Clostridium acetobutylicum, une bactérie solvantogène anaérobie. La forme native de l'enzyme a été résolue à 1.01 ? de résolution. Cette enzyme est proposée intervenir dans une voie de réduction du radical superoxyde.
- Published
- 2003
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