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Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common causes of cancer-related deaths worldwide, and its incidence is rising. HCC develops almost exclusively on the background of chronic liver inflammation, which can be caused by chronic alcohol consumption, viral hepatitis, or an unhealthy diet. HCC exhibits a deregulation of a multitude of pathways, including the PI3K/Akt pathway. Protein kinase B (Akt) exists in 3 isoforms: Akt1, Akt2 and Akt3, transcribed from three different genes and differing in their expression levels throughout the human body. While Akt3 is expressed mainly in the brain and the testes, Akt1 is expressed constitutively in the body and Akt2 is mainly expressed in insulin-sensitive tissues. Targeting Akt through chemical inhibitors has shown potent anti-cancer effect. However, chemical inhibitors fail to show a specificity over either of the isoforms, which converge and diverge in their designated roles in controlling various cellular processes. Thus, selective inhibition is needed to confer the role of each of Akt1 and Akt2 isoforms, in the context of HCC. RNA-interference (RNAi) is a highly specific strategy to target the expression of a gene at the transcriptional level and can be exploited to suppress the expression of a given gene using exogenous small interfering siRNAs (siRNAs). For that, we designed (siRNAs) targeting solely Akt1 or Akt2 isoform in humans and rodents, simultaneously. The specificity of the siRNAs was verified by confirming, in-vitro on human HepG2 cell line, the selective inhibition of the designated Akt1 or Akt2 expression, in addition to the absence of predicted off-target effects upon in-silico analysis. Furthermore, the efficiency of the designed siRNAs was demonstrated; following 6 hours of exposure to designed Akt1 and Akt2 siRNAs, the Akt1 expression and Akt2 expression remained decreased up to 5 and 7 days in HepG2 cells, respectively, and showed efficacy at low concentrations, starting 20pM. The possible inflammatory effect of the siRNAs was also assessed, and the results show that the designed siRNAs do not activate any of the Toll-like receptors. Next, we assessed the phenotypic aspect (cytotoxicity, metabolism and proliferation) of the knockdown of Akt1 and Akt2 or the simultaneous knockdown of both by the designed siRNAs whilst comparing to Sorafenib (a verified treatment of HCC) and ARQ092 (a chemical inhibitor of Akt) on 4 different liver cancer cell lines -PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B and HepG2 cell lines. The results show that targeting a single isoform of Akt – either Akt1 or Akt2 – or the simultaneous knockdown of both isoforms – Akt1 and Akt2 - by the designed siRNAs have no impact on the viability, metabolism or proliferation of the cells that is contradictory to the effect seen upon treatment with inhibitors Sorafenib or ARQ092. Furthermore, the vectorization of the designed siRNAs by the Amphiphilic Dendrimer (AD) and their consequent use to target Akt1 or Akt2 in an in-ovo HepG2 and MV4-11 cell-line graft model showed neither a toxic effect on chick embryos, nor an anti-tumorigenic effect when compared to the control. Altogether, the results show that the knockdown of a single isoform of Akt: Akt1 or Akt2 using the designed siRNAs, is not sufficient to mount an anti-cancer effect. Furthermore, the simultaneous knockdown of both isoforms using the specific siRNAs against Akt1 and Akt2 does not mimic the effect seen by chemical Akt inhibitors. These results suggest the presence of compensatory mechanisms in the case of the targeted single isoform knockdown, and that in addition to the potent global inhibition of Akt, ARQ092 may exert an off-target inhibition leading to its prominent anti-cancer activity., Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l'une des causes les plus courantes de décès liés au cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Le CHC se développe presque exclusivement sur des antécédents inflammatoires chroniques du foie, qui peuvent être causés par une consommation addictive d’alcool, une hépatite virale ou une mauvaise alimentation. Le CHC présente une dérégulation d'une multitude de voies, y compris la voie PI3K/AKT. La protéine kinase B (Akt) existe sous 3 isoformes : Akt1, Akt2 et Akt3, transcrites à partir de trois gènes différant par leurs niveaux d'expression dans le corps humain. Alors qu'AktT3 est exprimé principalement dans le cerveau et les testicules, Akt1 est exprimé de manière constitutive dans tout le corps et Akt2 est principalement exprimé dans les tissus sensibles à l'insuline. Le ciblage d'Akt par des inhibiteurs chimiques a montré un puissant effet anticancéreux. Cependant, ces composés ne présentent pas de spécificité pour les différents isoformes, qui convergent et divergent dans leurs rôles dans le contrôle de divers processus cellulaires. Ainsi, une inhibition sélective est nécessaire pour attribuer le rôle de chacune des isoformes Akt1 et Akt2, dans le contexte du CHC. L'ARN interférence (ARNi) est une stratégie hautement spécifique pour cibler l'expression d'un gène au niveau transcriptionnel. Il est possible de l’utiliser pour supprimer l'expression d'un gène donné en utilisant des siARN interférents courts et exogènes. Ainsi, nous avons conçu des siARN ciblant uniquement l'isoforme Akt1 ou Akt2 chez l'homme et le rongeur, simultanément. La spécificité des siARN a été vérifiée en confirmant, in-vitro, sur la lignée cellulaire HepG2 humaine, l'inhibition sélective de l'expression Akt1 ou Akt2, en plus de l'absence d'effets « off-target » prédits lors de l'analyse in-silico. De plus, l'efficacité des siARN a été observée dès 6 heures après l'exposition aux siARN Akt1 et Akt2 et est restée jusqu'à 5 et 7 jours dans les cellules HepG2. Les siRNA ont montré une efficacité à de faibles concentrations, à partir de 20pM, à la fois au niveau des ARNm et des protéines. L'effet inflammatoire des siARN a également été évalué et les résultats montrent que les siARN conçus n'activent aucun des récepteurs de type Toll-like (TLR). Ensuite, nous avons évalué l'aspect phénotypique (cytotoxicité, métabolisme et prolifération) de l'inactivation d'Akt1 et d'Akt2 ou de l'inactivation simultanée des deux par les siARN en comparaison avec le Sorafenib (un traitement de référence en cours du CHC) et à l'ARQ092 (un inhibiteur chimique d’Akt) sur 4 lignées cellulaires différentes de cancer du foie : PLCϒ/PRF/5, Huh7, Hep3B et HepG2. Les résultats montrent que le ciblage d'une seule isoforme d'Akt ou l'inactivation simultanée des deux isoformes par les siARN conçus n'a aucun impact sur la viabilité, le métabolisme ou la prolifération des cellules, ce qui est contradictoire avec l'effet observé lors d'un traitement avec les inhibiteurs Sorafenib ou ARQ092. De plus, la vectorisation des siARN par le dendrimère amphiphile (AD) et leur utilisation pour cibler Akt1 ou Akt2 dans un modèle de greffe de lignée cellulaire (HepG2 et MV4-11) in-ovo n'ont montré aucun effet toxique sur les embryons de poulet, ni d’effet antitumoral. Dans l'ensemble, les résultats montrent que l'inactivation d'une seule isoforme d'Akt n'est pas suffisante pour monter un effet antitumoral. De plus, l'inactivation simultanée des deux n'imite pas l'effet observé par les inhibiteurs chimiques d'Akt. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes compensatoires dans le cas de l'inactivation d'une seule isoforme d’Akt, et qu'en plus de la forte inhibition globale d'Akt, ARQ092 pourrait exercer une inhibition pléiotrope conduisant à son importante activité anticancéreuse.

International audience; Le fluorouracile (5-FU) est un analogue de base pyrimidique utilisé dans de nombreuses combinaisons de chimiothérapie, notamment contre les cancers colorectaux. Malgré les progrès dans le traitement de ces cancers, le pronostic des formes avancées reste sombre, notamment en raison de la forte prévalence de la chimiorésistance au 5-FU. Les mécanismes impliqués dans cette chimiorésistance sont multiples : modulation du transport du 5-FU dans la cellule (ainsi que son exportation), métabolisme de la molécule, modification de sa cible, modification de l’équilibre entre facteurs apoptotiques et anti-apoptotiques, adaptation au microenvironnement tumoral, et transition épithélio-mésenchymateuse [1]. La plupart des études portant sur la chimiorésistance se sont focalisées sur la cellule cancéreuse elle-même, et l’importance du microenvironnement tumoral a été longtemps minimisée. Des travaux récents, dont ceux de notre laboratoire, montrent cependant que le microenvironnement joue en réalité un rôle beaucoup plus important dans la chimiorésistance des tumeurs.

Technological advances, in particular the development of high-throughput sequencing, have led to the emergence of a new generation of molecular biomarkers for tumors. These new tools have profoundly changed therapeutic management in oncology, with increasingly precise molecular characterization of tumors leading to increasingly personalized therapeutic targeting. Detection of circulating tumor cells and/or circulating tumor DNA in blood samples -so-called 'liquid biopsies'- can now provide a genetic snapshot of the patient's tumor through an alternative and less invasive procedure than biopsy of the tumor tissue itself. This procedure for characterizing and monitoring the disease in real time facilitates the search for possible relapses, the emergence of resistance, or emergence of a new therapeutic target. In the long term, it might also provide a means of early detection of cancer. These new approaches require the treatment of ever-increasing amounts of clinical data, notably, with the goal of calculating composite clinical-biological predictive scores. The use of artificial intelligence will be unavoidable in this domain, but it raises ethical questions and implications for the health-care system that will have to be addressed., Les progrès technologiques, en particulier le développement du séquençage à haut débit, ont conduit à l’émergence d’une nouvelle génération de biomarqueurs tumoraux moléculaires. Ces nouveaux outils ont profondément modifié la prise en charge thérapeutique en oncologie avec une caractérisation moléculaire de plus en plus précise des tumeurs amenant à un ciblage thérapeutique personnalisé. La détection des cellules tumorales circulantes et/ou de l’ADN tumoral circulant dans des prélèvements sanguins, encore appelés « biopsies liquides », peut désormais fournir un instantané du profil génétique de la tumeur du patient grâce à une procédure alternative et moins invasive qu’une biopsie du tissu tumoral lui-même. Cette méthode de caractérisation moléculaire et de suivi de la maladie en temps réel facilite la recherche d’éventuelles rechutes, de l’émergence de résistances ou d’une nouvelle cible thérapeutique. À long terme, les biopsies liquides pourraient également fournir un moyen de détection précoce du cancer. Ces nouvelles approches nécessitent le traitement d’une quantité, toujours croissante, de données, en particulier cliniques, notamment dans l’optique d’élaborer des scores clinico-biologiques composites. L’utilisation de l’intelligence artificielle est un outil d’avenir dans ce domaine, mais elle soulève des questions éthiques et des implications pour l’organisation du système de santé qui devront être abordées.

Lysine methylation is a post-translational modification participating to finely regulate cell signaling pathways. While initially restricted as a histone modification and associated to epigenetic phenomena, lysine methylation has been recently recognized as a modification broadly affecting the proteome. In the last years, there were a growing amount of evidence highlighting the essential role of this modification in many fundamental processes. Thus, the deregulation of actors regulating lysine methylation is a frequent event in human pathologies, as neurodegenerative diseases, and cancers.Actors of lysine methylation signaling include lysine methyltransferases, the writers, that can transfer the methyl moiety on lysine residues, and lysine demethylases, the erasers, that have the capacity to remove the methyl. The biological meaning of lysine methylation generally relies on the ability of some proteins, called readers, to specifically dock to the methylated lysine and to transduce a proper response.During my thesis, I focused my interest in the lysine methyltransferase SMYD2. Structural studies told us that SMYD2 is a promiscuous enzyme able to potentially accommodate a wide range of substrates. Moreover, several reports have suggested that SMYD2 expression is deregulated during tumorigenesis and particularly during breast cancer. Therefore the outline of my work was to decipher the role of SMYD2 during breast cancer progression.First, I observed that SMYD2 did not affect primary tumor growth in a mouse model of breast cancer. Rather, SMYD2 was essential to efficiently drive breast cancer metastatic dissemination. I explored the lysine methylome of SMYD2 using SILAC-proteomics and I found the protein BCAR3 as a genuine substrate of SMYD2 and a decisive mediator of this pro-metastatic function. Mechanistically, I showed that BCAR3 methylation acts as a docking site of a family of actin remodellers, the formins FMNLs. Structural studies highlighted the presence of a potential new lysine methyl binding (reader) domain of lysine methylation, located on regulatory domains of FMNLs. Indeed, the anchoring to methylated BCAR3 regulated FMNLs’ ability to accumulate in lamellipodia, a cellular structure essential for mesenchymal cell migration. Then, I found that this signalization promoted cell migration and invasiveness of breast cancer cells, ultimately accelerating metastatic dissemination. Finally, I demonstrated the therapeutic interest to inhibit SMYD2 with as small molecule as SMYD2 inhibition in different in vivo models, including patient-derived xenograft, efficiently prevented metastatic dissemination.Overall, I characterized a new lysine methylation signaling – SMYD2 / BCAR3 / FMNLs axis – involved in breast cancer metastasis. The novel lysine methyl binding domain will be analyzed more thoroughly with additional structural studies in order to design small molecules that could block it, like peptidomimetics. Moreover, we will challenge the idea that BCAR3 methylation might be used as a prognostic or predictive biomarker of cancer aggressiveness. Finally, the therapeutic potential of SMYD2 inhibition to fight metastasis will be followed-up in preclinical and translational studies., La méthylation des lysines est une modification post-traductionnelle participant à une régulation dynamique et précise des voies de signalisation cellulaire. Initialement caractérisée au sein des histones et associée à différents mécanismes épigénétiques, la méthylation des lysines est aujourd’hui connue pour affecter l’ensemble du protéome. Au cours des vingt dernières années, les exemples démontrant le rôle essentiel de cette signalisation au cours de processus biologiques fondamentaux se sont multipliés. Par conséquent, la dérégulation des différents acteurs de cette signalisation a été causalement impliquée dans de nombreuses pathologies humaines, telles que les maladies neurodégénératives et les cancers.Au sein de cette signalisation, nous retrouvons les acteurs pouvant influer sur l’abondance de cette marque, c’est-à-dire les lysine-méthyltransférases, apposant le groupe méthyl sur la lysine, et les lysine-déméthylases, assurant son éviction. Le signal porté par le groupe méthyl est généralement transduit en réponse biologique par différentes classes de protéines, pouvant spécifiquement interagir avec cette modification, que l’on appelle les lecteurs.Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à la lysine méthyltransférase SMYD2. Cette enzyme, du fait de sa nature promiscuiste, c’est-à-dire pouvant accommoder un grand nombre de substrats, représentait un défi particulièrement intéressant. Par ailleurs, les différents rapports faisant état de sa dérégulation au cours de la tumorigénèse, en particulier mammaire, laissaient transparaître son fort potentiel thérapeutique. Le leitmotiv qui a rythmé les différentes étapes de ma thèse s’est donc orchestré autour de l’étude du rôle de SMYD2 au cours de la progression du cancer du sein.J’ai pu observer in vivo que SMYD2 n'influençait pas la croissance tumorale primaire, mais était en revanche un facteur essentiel durant la dissémination métastatique du cancer du sein. L’exploration des différents substrats de SMYD2 par protéomique a permis de mettre en évidence la protéine BCAR3, comme acteur principal dans cette fonction pro-métastatique. Mécanistiquement, j’ai montré que la méthylation de BCAR3 servait de point d’ancrage à une famille de remodeleurs du cytosquelette d’actine, les FMNLs. Via des analyses structurales, l’existence d’un nouveau domaine de lecture des lysines méthylées, situé sur le domaine régulateur des FMNLs, a été mis en évidence. Et en effet, cet ancrage à BCAR3 méthylé participait à réguler la localisation des FMNLs, en les concentrant au niveau du lamellipode, une structure essentielle à la migration mésenchymateuse. J’ai pu montrer par la suite que cette signalisation contribuait à promouvoir les capacités invasives des cellules tumorales mammaires et accélérer leur dissémination métastatique in vivo. Enfin, le potentiel thérapeutique de l’inhibition pharmacologique de SMYD2 a été démontré dans le cadre de la prévention des métastases. L’inhibition de SMYD2 dans différents modèles, notamment de xénogreffes dérivées de patientes, permettait en effet de prévenir la colonisation métastatique des cellules tumorales.Au cours de ma thèse, j’ai donc caractérisé une signalisation par méthylation des lysines complète, un axe impliquant les protéines SMYD2-BCAR3-FMNLs, et son rôle central dans la dissémination métastatique mammaire. Le nouveau domaine de lecture de la méthylation sur les formines FMNLs fera l’objet d’analyses structurales plus poussées afin de mettre au point des molécules pouvant bloquer cette fonction, telles que des peptidomimétiques. L’utilisation de la méthylation de BCAR3 comme biomarqueur dans les cancers agressifs sera également à l’étude. Enfin, le potentiel thérapeutique et préventif de l’inhibition de SMYD2 dans la lutte contre les métastases sera poursuivi dans des analyses précliniques et translationnelles.

The process of sperm maturation, spermiogenesis, is unique in many ways and involves major reorganizations of the different cellular compartments. During the elongated and condensed spermatid stages, this process includes a drastic compaction of the paternal genome that will be transmitted to the future offspring. During this process almost all histones are removed and replaced by specific proteins, the protamines, which associate with the paternal genome and compact it in the mature spermatozoa. This reorganization process is essential to avoid DNA damage before and during fertilization and to ensure that a specific paternal epigenome is correctly transmitted to the offspring. The mechanisms of chromatin reorganization first involve a wave of histone hyperacetylation, which then induces their removal. The incorporation of H2A.L.2, a testis-specific histone H2A variant, allows the nucleosome to adopt a more open structure and allows the invasion of the nucleosome by transition proteins that control in turn the recruitment of protamines and their incorporation into the paternal genome. Protamine-2 is synthesized as an immature precursor that requires multiple cleavages to be properly assembled on DNA. However, the functional role of protamine-2 maturation in normal spermatogenesis and its implication in infertility have not been explored. My thesis work aims to characterize this maturation process using a specific antibody against Pre-Prm2. We demonstrated that there was an accumulation of Pre-Prm2 in several mouse models, with defects in the histone-to-protamine transition process and that the maturation process was therefore related to histone removal. We were also able to demonstrate that the transition proteins and the protamines act simultaneously and that the two proteins interact with each other. Furthermore, the use of the antibody specific to human Pre-PRM2 shows that there is retention of Pre-PRM2 in some infertile patients and that this retention correlates with defects in DNA compaction, acrosome formation and sperm motility. Finally, from a certain threshold of aberrant accumulation of Pre-PRM2, the fertilization rate is decreased. In conclusion, this study has shown that poor maturation of PRM2 has consequences on the male genome organization, and that this tool could provide essential information in the human clinic in the future., Le processus de maturation des spermatides, la spermiogénèse, est unique en de nombreux points et implique des réorganisations majeures des différents compartiments cellulaires. Pendant les stades de spermatides allongées et condensées, ce processus inclut notamment une compaction drastique du génome paternel qui sera transmis à la future descendance. Lors de ce processus la quasi-totalité des histones est enlevée et celles-ci sont remplacées par des protéines spécifiques, les protamines, qui s'associent au génome paternel et le compactent dans les spermatozoïdes matures. Ce processus de réorganisation est essentiel afin d’éviter des dommages à l’ADN avant et pendant la fécondation et afin qu’un épigénome paternel spécifique soit correctement transmis à la descendance. Les mécanismes de réorganisation de la chromatine font tout d’abord intervenir une vague d’hyperacétylation des histones qui induit ensuite leur enlèvement. L’incorporation de H2A.L.2, un variant spécifique du testicule, va permettre au nucléosome d’adopter une structure plus ouverte et permettre l’invasion de l’ADN par les protéines de transition qui contrôlent le recrutement des protamines et leur incorporation dans le génome paternel. La protamine-2 est synthétisée sous forme d’un précurseur immature qui nécessite d’être clivée pour être correctement intégrée à l’ADN. Cependant, le rôle fonctionnel de la maturation de la protamine-2 dans la spermatogenèse normale et son implication dans l’infertilité n’ont pas été explorées. Mon travail de thèse vise à caractériser cette maturation à l’aide d’un anticorps spécifique de la Pré-Prm2. Nous avons démontré qu’il y avait une accumulation de Pré-Prm2 dans plusieurs modèles de souris où il y avait un défaut dans le processus de transition des histones vers les protamines et que le processus de maturation était donc lié au processus d’enlèvement des histones. Nous avons également pu démontrer que l’action des protéines de transition et des protamines est complètement simultanée et que les deux protéines interagissent. En outre, l’anticorps spécifique de la Pré-PRM2 humaine montre qu’il y a une rétention de pré-PRM2 chez certains patients infertiles et que cette rétention est corrélé à des défauts de compaction de l’ADN, de formation de l’acrosome et de mobilité spermatique. Enfin, à partir d’un certain seuil d’accumulation aberrante de Pré-PRM2, le taux de fécondation est diminué. En conclusion, cette étude a montré qu’une mauvaise maturation de la PRM2 a des conséquences sur le génome mâle, et que cet outil pourrait apporter des informations essentielles en clinique humaine dans l’avenir.

International audience; Tentons un peu d’oublier l’année 2020, mais pas complètement . . . C’est une année qui nousaura conduits à des envies et des visions différentes. Les rencontres conviviales et bien-veillantes qui ponctuent nos journées chaque année au mois d’octobre depuis 2005 n’ontpu se dérouler comme prévues, mais nous étions tous présents pour les 16esJournées deRecherche Respiratoire (J2R) le 16 octobre 2020, bien que devant nos écrans !Nous y avons cru jusqu’au bout et pensions pouvoir bénéficier de la fin de la fenêtreestivale, le programme était prêt et nos hôtes Brestois (nous ne remercierons jamais assezles équipes des Prs Francis Couturaud et Christophe Leroyer) avaient pensé à toutes lessolutions pour maintenir la distanciation, mais force fut de constater fin septembre qu’iln’était plus réaliste de poursuivre l’aventure en présentiel !!!Qu’à cela ne tienne, le plus important était de permettre aux jeunes, dont les résumésavaient suscité suffisamment d’intérêt et d’appétit pour une communication orale, deprésenter leurs travaux. Les J2R 2020 seraient donc organisées en format virtuel. Noustenons à remercier la SPLF pour son soutien logistique qui a permis cette transformation,ainsi que nos sponsors qui nous permettent de faire vivre les J2R depuis 16 ans.C’est ainsi que nos 19 jeunes étudiants chercheurs ont présenté et discuté leurs travauxsous forme de communications orales lors du Webinaire J2R. Tous les thèmes étaient repré-sentés (asthme, BPCO, cancer bronchique, maladies vasculaires, maladies inflammatoirespulmonaires, infectiologie, épidémiologie et la physiologie. . .) et ces communications,comme à l’accoutumée d’excellente qualité, ont pu être écoutées par quelques 135 per-sonnes connectées. Merci à tous des efforts consentis qui ont permis ce succès.

International audience; Tentons un peu d’oublier l’année 2020, mais pas complètement . . . C’est une année qui nousaura conduits à des envies et des visions différentes. Les rencontres conviviales et bien-veillantes qui ponctuent nos journées chaque année au mois d’octobre depuis 2005 n’ontpu se dérouler comme prévues, mais nous étions tous présents pour les 16esJournées deRecherche Respiratoire (J2R) le 16 octobre 2020, bien que devant nos écrans !Nous y avons cru jusqu’au bout et pensions pouvoir bénéficier de la fin de la fenêtreestivale, le programme était prêt et nos hôtes Brestois (nous ne remercierons jamais assezles équipes des Prs Francis Couturaud et Christophe Leroyer) avaient pensé à toutes lessolutions pour maintenir la distanciation, mais force fut de constater fin septembre qu’iln’était plus réaliste de poursuivre l’aventure en présentiel !!!Qu’à cela ne tienne, le plus important était de permettre aux jeunes, dont les résumésavaient suscité suffisamment d’intérêt et d’appétit pour une communication orale, deprésenter leurs travaux. Les J2R 2020 seraient donc organisées en format virtuel. Noustenons à remercier la SPLF pour son soutien logistique qui a permis cette transformation,ainsi que nos sponsors qui nous permettent de faire vivre les J2R depuis 16 ans.C’est ainsi que nos 19 jeunes étudiants chercheurs ont présenté et discuté leurs travauxsous forme de communications orales lors du Webinaire J2R. Tous les thèmes étaient repré-sentés (asthme, BPCO, cancer bronchique, maladies vasculaires, maladies inflammatoirespulmonaires, infectiologie, épidémiologie et la physiologie. . .) et ces communications,comme à l’accoutumée d’excellente qualité, ont pu être écoutées par quelques 135 per-sonnes connectées. Merci à tous des efforts consentis qui ont permis ce succès.

National audience; Les phénols, les phtalates et les composés perfluorés font partie des substances chimiques les plus produites dans le monde. Outre leur possible rôle sur le système endocrinien, certains de ces composés sont soupçonnés de favoriser l’apparition de symptômes respiratoires chez l’enfant via des effets immunomodulateurs et inflammatoires (notamment, après une exposition prénatale).

Largement utilisés depuis plusieurs décennies, principalement dans le secteur agricole, les pesticides font l’objet de nombreuses études sur les liens entre l’exposition des populations et les effets sur la santé, et ils suscitent toujours autant d’inquiétude, les pathologies suspectées et les populations exposées étant multiples (agriculteurs, consommateurs des produits traités, riverains des parcelles agricoles...).Cette expertise collective Inserm, sollicitée par cinq ministères, a pour objectif d’actualiser les données de l’expertise collective « Pesticides : Effets sur la santé » publiée en 2013. Réuni sous l’égide de l’Inserm, un groupe multidisciplinaire d’experts spécialistes en sociologie, épidémiologie, toxicologie et expologie a analysé la littérature scientifique internationale dans ces domaines afin d’évaluer le lien entre l’exposition aux pesticides et la survenue de certaines pathologies.L’expertise dresse un bilan actualisé des connaissances sur les troubles du développement neuropsychologique et moteur de l’enfant, des pathologies neurologiques de l’adulte, et des pathologies cancéreuses de l’enfant et de l’adulte. La santé respiratoire, les pathologies thyroïdiennes et l’endométriose ont été également abordées et viennent enrichir cette nouvelle version de l’expertise. Elle présente aussi l’analyse des données sur deux substances actives et une famille de pesticides : le glyphosate, le chlordécone et les fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase.

The number of rare diseases is assessed between 5000 and 8000 distinct pathologies. Individually, these diseases are rare, but together they represent a major health problem at the population level. Because of the limited number of patients with certain diseases and the lack of knowledge about them, diagnosis for patients is often delayed.More than 80 % of rare diseases have a genetic origin, the vast majority of which are monogenic. The democratization of high-throughput sequencing technologies since 2005 has allowed the massive acquisition of genomic data from both healthy individuals and patients. However, establishing a diagnosis of a rare disease with current molecular biology technologies remains difficult.The industrial-scale application of exome and genome sequencing analyses associated with the constant increase in medical knowledge represents a concrete hope to bring a diagnosis to the majority of patients concerned by a rare disease suspected to be genetic.This thesis was particularly interested in the implementation of processes for constitutional genome-wide sequencing data analysis following industrial standards and bioinformatics good practices. Then, in the detection of copy number variations from exome sequencing data, but under-explored by many laboratories.Finally, this thesis has allowed the development and the initiation of collaborations still active today. This has been concretized by a study on detection of small somatic variations in an in vitro model of cancer development linked to the cellular microenvironment, the detection of structural variations using the innovative Oxford Nanopore sequencing technology and the comparison of prioritization methodologies for genetic variations using clinical descriptions based on HPO terms., Le nombre de maladies rares est estimé à entre 5000 et 8000 pathologies distinctes. Elles sont individuellement rares puisque par définition elles affectent moins de 1 individu sur 2000 dans la population générale, mais leur nombre les rend collectivement fréquentes. En raison du nombre limité de patients atteints de certaines maladies et du manque de connaissances à leur sujet, le diagnostic pour les patients est souvent retardé.Plus de 80 % des maladies rares auraient une origine génétique, en grande majorité monogénique. La démocratisation des technologies de séquençage à haut débit depuis 2005 a permis l’acquisition massive de données génomiques que ce soit d’individus sains ou de patients. Pourtant, établir un diagnostic de maladie rare avec les technologies de biologie moléculaire actuelle reste difficile.L’application à échelle industrielle des analyses de séquençage d’exome et de génome associée avec l’augmentation constante des connaissances médicales représente un espoir concret pour apporter un diagnostic à la majorité des patients concernés par une maladie rare suspecte d’être génétique.Cette thèse s’est particulièrement intéressée à la mise en place de processus d’analyse de données de séquençage pangénomiques constitutionnelles selon les standards industriels et les bonnes pratiques en vigueur dans le domaine. Puis, à la détection de variations de nombre de copies à partir de données de séquençage d’exomes, analyse souvent inexplorée par de nombreux laboratoires.Enfin, cette thèse aura permis le développement et l’initiation de collaborations encore actives à ce jour. Cela s’est concrétisé par une étude ayant comme objet la détection de variations la détection somatique de petite taille dans un modèle in vitro de développement de cancer lié au microenvironnement cellulaire, la détection de variations structurales à l’aide de la technologie de séquençage novatrice Oxford Nanopore et la comparaison de méthodologies de priorisations de variations génétiques à l’aide de descriptions cliniques basées sur les termes HPO.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes.; La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes., La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

All cells, whether prokaryotic or eukaryotic, have a rich and diversified external glycosylation layer, forming the immediate dominant face in relation to their environment. They result from complex enzymatic processes linking sugars to each other and to proteins or lipids. Variations of the "glycome" can appear in certain pathologies. Cancers are the most frequent pathologies with abnormalities in these glycosylations. These alterations are almost systematic on the surface of cancer cells. Among them, the Thomsen-new antigen (Tn), an N-acetylgalactosamine (GalNAc) on a serine or threonine, is strongly expressed in 90% of mammary carcinomas as well as in cancers of the bladder, cervix, ovary, colon, stomach and prostate. The ubiquitous presence of the Tn antigen in many cancers, combined with its absence in healthy cells, makes it a target of choice for targeted therapy or synthetic anti-tumor vaccines. No antibody targeting the Tn antigen is currently available because of the difficulty in developing an antibody with such specificity. Thus, we were interested in an alternative targeting strategy, based on the use of a molecule capable of recognizing the Tn antigen. C-Type lectins are a family of proteins capable of specifically and reversibly binding to certain carbohydrates in the presence of calcium. Macrophage galactose lectin (MGL) is a C-type lectin with a high affinity for GalNac and its derivatives such as the Tn antigen. This work consisted, initially, in the use of a soluble recombinant form of MGL to validate the potential of this tool for the targeting of cancer cells. The different experiments, in vitro and in vivo, involving MGL, demonstrated the latter's ability to specifically target human tumors via the Tn antigen. The extracellular portion of MGL is therefore a very good vector candidate for the diagnosis and imaging of human tumors and potentially for drug delivery. In a second step, various strategies for the development of a bifunctional tool exploiting this lectin were explored. The goal was to create a peptide platform that could be functionalized on one hand with several lectin domains, in order to control recognition affinity, and on the other hand with functional groups that could be variable according to the application (diagnostic, therapeutic, ...). The different coupling strategies employed allowed us to attach several lectin CRDs to a peptide support, while preserving the three-dimensional and functional state of the proteins. The characterizations carried out show a significant increase in affinity directly related to the number of lectins added to the platform. This work paves the way to new customizable sugar-targeting systems., L’ensemble des cellules, qu’elles soient procaryotes ou eucaryotes, est doté d’une couche de glycosylation externe riche et diversifiée, composant la face dominante immédiate en relation à leur environnement. Elles résultent de processus enzymatiques complexes liant les sucres entre eux et sur des protéines ou lipides. Des variations du « glycome » peuvent apparaître dans certaines pathologies. Les cancers sont les pathologies les plus fréquentes présentant des anomalies de ces glycosylations. Ces altérations sont quasi systématiques à la surface des cellules cancéreuses. Parmi celles-ci, l’antigène Thomsen-nouveau (Tn), un N-acétylgalactosamine (GalNAc) sur une sérine ou une thréonine, est fortement exprimé dans 90% des carcinomes mammaires ainsi que dans les cancers de la vessie, du col de l’utérus, de l’ovaire, du colon, de l’estomac et de la prostate. L’omniprésence de l’antigène Tn dans de nombreux cancers, associés à son absence dans les cellules saines, en fait une cible de choix pour la thérapie ciblée ou des vaccins synthétiques antitumoraux. Aucun anticorps ciblant l’antigène Tn n’est à ce jour disponible du fait de la difficulté à développer un anticorps avec une telle spécificité. Ainsi, nous nous sommes intéressés à une autre stratégie de ciblage, basée sur l’utilisation d’une molécule capable de reconnaître l’antigène Tn. Les lectines de type C sont une famille de protéines capables de se lier spécifiquement et de façon réversible à certains glucides, en présence de calcium. La macrophage galactose lectine (MGL) est une lectine de type C ayant une affinité très importante pour le GalNac et ses dérivés comme l’antigène Tn. Ce travail a consisté, dans un premier temps, à l’utilisation d’une forme recombinante soluble de la MGL pour valider le potentiel de cet outil pour le ciblage des cellules cancéreuses. Les différentes expériences, in vitro et in vivo, impliquant la MGL, ont démontré la capacité de cette dernière à cibler spécifiquement les tumeurs humaines via l’antigène Tn. La partie extracellulaire de la MGL est de ce fait un très bon candidat de vecteur pour le diagnostic et l’imagerie de tumeurs humaines et potentiellement pour l’administration de médicaments. Dans un deuxième temps, diverses stratégies de développement d’un outil bifonctionnel exploitant cette lectine ont été exploré. Le but était de créer une plateforme peptidique fonctionnalisable d’une part avec plusieurs domaines lectines, afin de contrôler l’affinité de reconnaissance, et d’autre part des groupements fonctionnels variable selon l’application recherché (diagnostique, thérapeutique, ...). Les différentes stratégies de couplage employées nous ont permis d’accrocher plusieurs CRD de lectine sur un support peptidique, cela en conservant l’état tridimensionnel et fonctionnel des protéines. Les caractérisations effectuées démontrent une importante augmentation de l’affinité directement fonction du nombre de lectine ajouté sur la plateforme. Ce travail ouvre la voie vers de nouveaux systèmes de ciblage des sucres modulable à façon.

All cells, whether prokaryotic or eukaryotic, have a rich and diversified external glycosylation layer, forming the immediate dominant face in relation to their environment. They result from complex enzymatic processes linking sugars to each other and to proteins or lipids. Variations of the "glycome" can appear in certain pathologies. Cancers are the most frequent pathologies with abnormalities in these glycosylations. These alterations are almost systematic on the surface of cancer cells. Among them, the Thomsen-new antigen (Tn), an N-acetylgalactosamine (GalNAc) on a serine or threonine, is strongly expressed in 90% of mammary carcinomas as well as in cancers of the bladder, cervix, ovary, colon, stomach and prostate. The ubiquitous presence of the Tn antigen in many cancers, combined with its absence in healthy cells, makes it a target of choice for targeted therapy or synthetic anti-tumor vaccines. No antibody targeting the Tn antigen is currently available because of the difficulty in developing an antibody with such specificity. Thus, we were interested in an alternative targeting strategy, based on the use of a molecule capable of recognizing the Tn antigen. C-Type lectins are a family of proteins capable of specifically and reversibly binding to certain carbohydrates in the presence of calcium. Macrophage galactose lectin (MGL) is a C-type lectin with a high affinity for GalNac and its derivatives such as the Tn antigen. This work consisted, initially, in the use of a soluble recombinant form of MGL to validate the potential of this tool for the targeting of cancer cells. The different experiments, in vitro and in vivo, involving MGL, demonstrated the latter's ability to specifically target human tumors via the Tn antigen. The extracellular portion of MGL is therefore a very good vector candidate for the diagnosis and imaging of human tumors and potentially for drug delivery. In a second step, various strategies for the development of a bifunctional tool exploiting this lectin were explored. The goal was to create a peptide platform that could be functionalized on one hand with several lectin domains, in order to control recognition affinity, and on the other hand with functional groups that could be variable according to the application (diagnostic, therapeutic, ...). The different coupling strategies employed allowed us to attach several lectin CRDs to a peptide support, while preserving the three-dimensional and functional state of the proteins. The characterizations carried out show a significant increase in affinity directly related to the number of lectins added to the platform. This work paves the way to new customizable sugar-targeting systems., L’ensemble des cellules, qu’elles soient procaryotes ou eucaryotes, est doté d’une couche de glycosylation externe riche et diversifiée, composant la face dominante immédiate en relation à leur environnement. Elles résultent de processus enzymatiques complexes liant les sucres entre eux et sur des protéines ou lipides. Des variations du « glycome » peuvent apparaître dans certaines pathologies. Les cancers sont les pathologies les plus fréquentes présentant des anomalies de ces glycosylations. Ces altérations sont quasi systématiques à la surface des cellules cancéreuses. Parmi celles-ci, l’antigène Thomsen-nouveau (Tn), un N-acétylgalactosamine (GalNAc) sur une sérine ou une thréonine, est fortement exprimé dans 90% des carcinomes mammaires ainsi que dans les cancers de la vessie, du col de l’utérus, de l’ovaire, du colon, de l’estomac et de la prostate. L’omniprésence de l’antigène Tn dans de nombreux cancers, associés à son absence dans les cellules saines, en fait une cible de choix pour la thérapie ciblée ou des vaccins synthétiques antitumoraux. Aucun anticorps ciblant l’antigène Tn n’est à ce jour disponible du fait de la difficulté à développer un anticorps avec une telle spécificité. Ainsi, nous nous sommes intéressés à une autre stratégie de ciblage, basée sur l’utilisation d’une molécule capable de reconnaître l’antigène Tn. Les lectines de type C sont une famille de protéines capables de se lier spécifiquement et de façon réversible à certains glucides, en présence de calcium. La macrophage galactose lectine (MGL) est une lectine de type C ayant une affinité très importante pour le GalNac et ses dérivés comme l’antigène Tn. Ce travail a consisté, dans un premier temps, à l’utilisation d’une forme recombinante soluble de la MGL pour valider le potentiel de cet outil pour le ciblage des cellules cancéreuses. Les différentes expériences, in vitro et in vivo, impliquant la MGL, ont démontré la capacité de cette dernière à cibler spécifiquement les tumeurs humaines via l’antigène Tn. La partie extracellulaire de la MGL est de ce fait un très bon candidat de vecteur pour le diagnostic et l’imagerie de tumeurs humaines et potentiellement pour l’administration de médicaments. Dans un deuxième temps, diverses stratégies de développement d’un outil bifonctionnel exploitant cette lectine ont été exploré. Le but était de créer une plateforme peptidique fonctionnalisable d’une part avec plusieurs domaines lectines, afin de contrôler l’affinité de reconnaissance, et d’autre part des groupements fonctionnels variable selon l’application recherché (diagnostique, thérapeutique, ...). Les différentes stratégies de couplage employées nous ont permis d’accrocher plusieurs CRD de lectine sur un support peptidique, cela en conservant l’état tridimensionnel et fonctionnel des protéines. Les caractérisations effectuées démontrent une importante augmentation de l’affinité directement fonction du nombre de lectine ajouté sur la plateforme. Ce travail ouvre la voie vers de nouveaux systèmes de ciblage des sucres modulable à façon.

Mesenchymal stem cells (MSC) are widely used in cell therapy and tissue engineering. Their interest is linked to their paracrine activity and their differentiation potential. MSC are rare cells that need to be amplified at large scale for clinical applications. Since MSC are adherent cells, they may be amplified in bioreactors with the help of microcarriers. In order to improve MSC production both qualitatively and quantitatively, it is necessary to adapt the different culture parameters. In collaboration with Carroucell industry, we studied the behavior of MSC from adipose tissue (ASC) along their culture on innovative silica disc microcarriers. In comparison with spherical commercial microcarriers, disc microcarriers increase culture homogeneity, decrease aggregation related cell death and improve cell harvesting step. In spinner flasks, interesting yields have been obtained and harvested cells kept an excellent viability, their specific markers expression as well as their differentiation ability. Therapeutic potential of MSC is linked to their paracrine activity. These last years, extracellular vesicles (EV) produced by MSC were thereby largely studied at preclinical step. As for the MSC themselves, EV production needs to be improved quantitatively for a clinical application. Along this thesis, the interest of a microcarriers based culture on EV production by ASC was assessed. In comparison with 2D culture, produced EV amount was almost twice higher. Samples are mainly composed of exosomes. Nevertheless, an optimization of both culture conditions and EV isolation will be required to ameliorate obtained yields as well as obtained samples.Associated with stem cells, biomaterials showed interesting therapeutic potential for the treatment of numerous pathologies. For bone repair, one of the main treatments failing cause is linked to bacterial infections. In order to limit antibiotic using, new biomaterial possessing both bactericidal and osteogenic properties shall be developed. In collaboration with Elena Ivanova’s team (RMIT, Melbourne, Australia), ASC behavior on nanostructures induced antibacterial titanium biomaterials was investigated. Those materials permit ASC adhesion while modifying cell morphology and focal adhesion formation. Moreover, nanostructured scaffolds permit cell proliferation, are not toxic and ASC keep their multipotency. Finally, in the case of prolonged cultures, these biomaterials showed osteoinducive properties. That is why these nanostructured titanium biomaterials are promising for their future using as implants for bone regeneration., Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont largement utilisées en thérapie cellulaire et en ingénierie tissulaire. Leur intérêt est lié à leur activité paracrine ainsi qu'à leur capacité de différenciation. Les CSM sont des cellules rares qui ont besoin d’être amplifiées à grande échelle pour une utilisation clinique. Comme ce sont des cellules adhérentes, elles peuvent être amplifiées en bioréacteurs via l'utilisation de microporteurs. Afin d’améliorer qualitativement et quantitativement la production de CSM, il est nécessaire d’adapter les différents paramètres de culture. En collaboration avec la société Carroucell, nous avons étudié le comportement de CSM issues de tissu adipeux (ASC) lors de leur culture sur des microporteurs de silice originaux, ayant une forme discoïdale. En comparaison avec des microporteurs sphériques commerciaux, les microporteurs disques permettent une culture plus homogène, limitent la mort cellulaire liée à l’agrégation et favorisent l’étape de décollement. En spinner flasks, des rendements intéressants ont été obtenus et les cellules récupérées ont conservé une très bonne viabilité, l’expression de leur marqueurs spécifiques ainsi que leur capacité de différenciation. Le potentiel thérapeutique des CSM est lié à leur activité paracrine. Ces dernières années, les vésicules extracellulaires (EV) issues de CSM ont donc été largement étudiées au niveau préclinique. À l’image des CSM, la production d’EV nécessite d’être améliorée au niveau quantitatif pour une utilisation clinique. Au cours de cette thèse, l’intérêt d’une culture sur microporteurs dans la production d’EV par les ASC a été étudié. En comparaison avec une culture 2D, la quantité d’EV produite est près de deux fois supérieure. Les préparations sont composées majoritairement d’exosomes. Néanmoins, une optimisation des conditions de culture et d’isolement des EV sera nécessaire à l’amélioration des rendements et de la pureté des échantillons obtenus.Associés au cellules souches, les biomatériaux ont démontré un potentiel thérapeutique intéressant pour le traitement de nombreuses pathologies. Dans le cas de la reconstruction osseuse, les échecs de traitements sont principalement liés aux infections bactériennes. Afin de limiter l’utilisation d’antibiotiques, de nouveaux biomatériaux possédant des propriétés bactéricides et ostéogéniques doivent être développés. En collaboration avec l’équipe d’Elena Ivanova (RMIT, Melbourne, Australie), le comportement d’ASC sur des biomatériaux de titane rendus antibactériens grâce à une topographie nanostructurée a été étudié. Ces matériaux nanostructurés permettent l’adhérence des ASC, tout en modifiant la morphologie des cellules et la formation d’adhérences focales. De plus, les supports nanostructurés permettent la prolifération des cellules, ne sont pas toxiques et les ASC conservent leurs propriétés multipotentes. Enfin, lors de cultures prolongées, ces biomatériaux ont démontré des effets ostéoinducteurs. Ces biomatériaux de titane nanostructurés sont donc prometteurs pour une future application en tant qu'implants pour la régénération osseuse.

International audience; L’étude de la dérégulation des métaux au sein des tissus biologiques intéresse de plus en plus le monde médical car une répartition anormale des métaux est une information importante qui peut contribuer au diagnostic clinique, et orienter le choix du traitement pour de nombreuses pathologies. En tant que méthode d’analyse élémentaire « tout optique », l’imagerie LIBS (laser-induced breakdown spectroscopy) est un candidat idéal pour étudier la composition élémentaire des tissus humains.

Preserving the integrity of genetic material is crucial to ensure cell survival and prevent tumor development. RNA Interference (RNAi) plays an important role in this context. This conserved process is well known to mediate sequence-specific transcriptional gene silencing via the induction of heterochromatin formation in a large variety of species. Through the various protective roles that this chromatin state has on the genome integrity, RNAi contributes to the preservation genomic stability. In parallel, RNAi has been involved also more directly in the cell response to genomic DNA damage in a variety of eukaryotes. In this case, it would participate to DNA damage signalization or repair. However, this function and the molecular mechanisms underlying its involvement remain poorly characterized, eventhough the function appears to be conserved from yeast to human.In this study, we explored the molecular function of RNAi in maintaining genomic stability, using the yeast Schizosacharomyces pombe as a model. In this organism, the key function of RNAi in the formation of heterochromatin has been extensively studied. The mechanism of action relies on the effector RITS complex (RNA Induced-Transcriptional Silencing), which is loaded with Dcr1produced small RNAs. These small RNAs guide RITS to the target regions in order to recruit the factors ensuring the deposition and maintenance of repressive epigenetic marks associated witth the formation of heterochromatin. RNAi has also been involved in the resolution of collisions between the replication and transcription machineries, occurring at hard-to-replicate genomic regions, like at regions containing highly repeated DNA. According to the current model, RNAi favors transcription termination thereby favouring replication fork progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Our study first showed that RITS, and not just Dcr1, are involved in maintaining genomic stability in S. pombe. The combination of biochemical and microscopic approaches revealed physical connections between RITS and the DNA replication and repair processes. We studied in particular the implication of RNAi in the genomic stability of the rDNA region. Our data indicated that RNAi participates in the maintenance of the numerous rDNA units, thereby preventing major chromosomal rearrangements. This function requires RITS and Dcr1, but does not involve other factors essential for the formation of heterochromatin. Moreover, we identified that RNAi contributes to promote replication fork progression within a region close to the origin of replication of the ribosomal unit. The terminally-arrested replication forks constitute fragile structures which can cause genomic instability. In order to further explore this function of RNAi, we used a conditional and inducible fork barrier to block replication at a unique locus in the genome. A genetic assay based on this system, strongly suggest that RITS and Dcr1 manages the homologous recombination-dependent fork restart by acting specifically on the DNA resection step of this process. Altogether, our findings provide a better understanding of the RNAi molecular function in the cellular response to replicative stress. This aspect has been poorly explored by the current studies led in other eukaryotic models., Préserver l’intégrité du matériel génétique est crucial pour assurer la survie cellulaire et prévenir le développement tumoral. L’ARN à interférence (RNAi) joue un rôle important dans ce contexte. Il s’agit d’un processus conservé surtout connu pour sa fonction de silencing transcriptionnel visant à induire la formation d’hétérochromatine chez différentes espèces. Au vu des divers rôles protecteurs dans l’intégrité du génome que revêt cet état chromatinien, le RNAi concourt ainsi, par ce biais, à préserver la stabilité du génome. Le RNAi a également été impliqué plus directement dans la réponse au stress génotoxique chez une variété d’eucaryotes. Dans ce cas, il agirait dans la signalisation ou la réparation des dommages de l’ADN. Cependant, cette fonction et les mécanismes moléculaires, qui sous-tendent son implication, restent très peu caractérisés, bien que la fonction soit clairement conservée de la levure à l’Homme.Dans cette étude, nous avons exploré la fonction moléculaire du RNAi dans le maintien de la stabilité génomique, en utilisant la levure Schizosacharomyces pombe comme modèle d’étude. Dans cet organisme, la fonction clé du RNAi dans la formation d’hétérochromatine a été disséquée. Son mécanisme d’action se base sur le complexe effecteur RITS (RNA Induced-Transcriptional Silencing), qui se charge en petits ARN produits par Dcr1. Ces derniers permettent de guider RITS au niveau des régions cibles afin de recruter les facteurs assurant la déposition et la maintenance des marques épigénétiques répressives associées à la formation d’hétérochromatine. En parallele, le RNAi participerait également à la résolution des collisions entre les machineries de réplication et de transcription se produisant au niveau de régions difficiles à répliquer, comme les régions riches en séquences d’ADN répétées. Selon le modèle proposé, il favoriserait la terminaison de la transcription, ce qui permettrait à la fourche de réplication de poursuivre sa progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Notre étude a d’abord montré que RITS, et pas seulement Dcr1, sont impliqués dans le maintien de la stabilité génomique chez S. pombe. La combinaison d’approches biochimiques et d’analyses microscopiques a révélé des connexions physiques entre RITS et les processus de réplication et de réparation de l’ADN. Nous nous sommes particulièrement intéressés à la fonction du RNAi dans la stabilité des rDNA. Nos données ont indiqué que le RNAi participe au maintien des nombreuses unités de rDNA, prévenant ainsi des réarrangements chromosomiques majeurs. Cette fonction requière RITS et Dcr1, mais n’implique pas d’autres facteurs essentiels à la formation d’hétérochromatine RNAi-dépendante. D’autre part, nous avons mis en évidence que le RNAi contribue à favoriser la progression des fourches de réplication au niveau d’une région proche des origines de réplication de l’unité ribosomale. Les fourches arrêtées constituent des structures fragiles pouvant entraîner une instabilité génomique. Afin d’explorer plus en détail la fonction du RNAi dans leur prise en charge, nous avons utilisé un système permettant de bloquer localement et de façon inductible la progression d’une seule fourche de réplication dans le génome. L’essai génétique basé sur ce système suggère que RITS et Dcr1 favoriseraient le redémarrage via la recombinaison homologue au niveau de la fourche bloquée. Ils agiraient tout particulièrement sur l’étape de la résection initiant ce processus. Dans l’ensemble, ces travaux permettent une meilleure compréhension de la fonction moléculaire du RNAi dans la réponse cellulaire au stress réplicatif. Cet aspect a été assez peu exploré dans les études actuelles chez les autres espèces eucaryotes.

Post-translational modifications are involved in a large number of physiological signaling pathways and are essential for normal cellular functioning. Their deregulation is involved in multiple pathological processes, and particularly in carcinogenesis. The lysine methyltransferases SMYD2 and SMYD3 belong to the family of SET and MYND domain-containing proteins (SMYD) and are both overexpressed in many cancers. They participate in the regulation of multiple canonical oncogenic pathways via the methylation of substrates such as p53 by SMYD2, or VEGFR1 (vascular endothelial growth factor receptor 1), and MAP3K2 (Mitogen -activated protein kinase kinase kinase 2) within the Ras / Raf / Mek / Erk pathway by SMYD3.In this thesis work, using data from proteomic approaches without a priori such as ProtoArray® and SILAC-3xMBT pulldown coupled with mass spectrometry, we identified potential substrates of SMYD2 and SMYD3. The first part of this thesis consisted in the production of the most promising candidate substrates and the validation of their methylation. We confirmed in vitro and in MIA PaCa-2 pancreatic adenocarcinoma cells, the monomethylation by SMYD2 of the protein BCAR3 (Breast cancer anti-estrogen resistance 3) on its lysine K334 -protein involved in aggressiveness and tumor invasiveness-, and RTF1 (RNA polymerase-associated protein) on K587 -protein belonging to the PAF1- complex. Similarly, we demonstrated the trimethylation of RNF113A (Ring Finger Protein 113A) K20 by SMYD3. The second part of this thesis focused on the characterization of phenotypic consequences of RNF113A K20me3 in a small cell lung cancer model. We demonstrated that trimethylation of RNF113A repels its phosphatase PP4, leading to an increase of RNF113A phosphorylation. This induces an increase of its E3-ubiquitin ligase activity involved in DNA dealkylation repair by interacting with the ASCC complex (activating signal cointegrator 1 complex). The trimethylation of RNF113A by SMYD3 therefore participates in the chemoresistance of tumor cells to alkylating agents.This thesis work therefore made it possible to identify new promising signals involving SMYD2 and SMYD3, and to highlight the role of SMYD3 in DNA repair following exposure to alkylating agents through methylation of RNF113A., Les modifications post-traductionnelles des protéines sont impliquées dans un grand nombre de voies de signalisation physiologiques et sont essentielles au fonctionnement normal cellulaire. Leur dérégulation est impliquée dans de multiples processus pathologiques, et notamment dans la carcinogénèse. Les lysine-méthyltransférases SMYD2 et SMYD3 appartiennent à la famille des SET and MYND domain-containing protein (SMYD) et sont toutes deux surexprimées dans de nombreux cancers. Elles participent en effet à la régulation de multiples signalisations oncogéniques canoniques telles que la méthylation de p53 par SMYD2, ou la méthylation de VEGFR1 (vascular endothelial growth factor receptor 1), ou MAP3K2 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2) au sein de la voie Ras/Raf/Mek/Erk par SMYD3.Dans ce travail de thèse, nous avons identifié un certain nombre de substrats potentiels de SMYD2 et SMYD3 à partir de données issues d’approches protéomiques telles que le ProtoArray® et le SILAC-3xMBT pulldown couplé à la spectrométrie de masse. La première partie de cette thèse a consisté à produire et valider la méthylation des différents substrats candidats les plus prometteurs. Nous avons ainsi confirmé in vitro puis en cellules d’adénocarcinome pancréatique MIA PaCa-2, les évènements de monométhylation par SMYD2 de la protéine BCAR3 (Breast cancer anti-estrogen resistance 3) au niveau de sa lysine K334 -protéine impliquée dans l'agressivité et l’invasivité tumorale-, et de RTF1 (RNA polymerase-associated protein) au niveau de K587 -protéine appartenant au complexe PAF1-. De même, nous avons démontré la triméthylation de RNF113A (Ring Finger Protein 113A) K20 par SMYD3. La seconde partie de cette thèse a porté sur la caractérisation des conséquences phénotypiques de la triméthylation de RNF113A K20 dans un modèle de cancer pulmonaire à petites cellules. Nous avons démontré que la triméthylation de RNF113A bloque son interaction avec la phosphatase PP4. Cette perte d’interaction aboutit à une augmentation de son niveau de phosphorylation, entrainant une stimulation de son activité de E3-ubiquitine ligase impliquée dans la réponse aux dommages alkylants. La triméthylation de RNF113A par SMYD3 pourrait donc participer à la chimiorésistance des cellules tumorales aux agents alkylants.Ainsi, ce travail de thèse a permis d’identifier des nouvelles signalisations prometteuses impliquant SMYD2 et SMYD3, et plus particulièrement de mettre en évidence le rôle de SMYD3 dans la réparation de l’ADN suite à l’exposition aux agents alkylants par le biais de la méthylation de RNF113A.

National audience; La crise qui résulte de la montée des résistances bactériennes menace la santé humaine, animale et environnementale. L’impact sanitaire et économique de la crise est massif. Alors que l’alerte est largement donnée et que des mécanismes et des programmes d’aide à l’innovation pour lutter contre l’antibiorésistance ont été mis en place, force est de constater que les nouveaux produits antibiotiques proposés n’arrivent pas à trouver une rentabilité économique leur permettant d’atteindre le marché et d’être au service des patients et de la communauté. Par ailleurs, il est nécessaire de développer des outils/indicateurs pour définir les interventions probantes en matière de lutte contre l’antibiorésistance. Les travaux de réflexion relatés dans cet article sont concentrés sur ces deux aspects de la recherche translationnelle : – la prévention et l’impact en santé de la problématique antibiorésistance, et – les spécificités de la recherche clinique pour innover en matière de lutte contre l’antibiorésistance. Cet article, issu des réflexions d’un groupe d’experts français, propose des solutions directement opérationnelles qui pourraient être mises en place rapidement et transformer radicalement la qualité et la quantité de nos moyens de lutte.

Refers to : Marie-Cécile Ploy, Antoine Andremont, Bruno Valtier, Claire Le Jeunne - Antibiorésistance : outils pour une recherche translationnelle efficace - Therapies, Volume 75, Issue 1, January–February 2020, Pages 1-6; National audience; The rising emergence of bacterial resistances has led to a crisis which threatens human, animal and environmental health. The impact of the emergency is enormous in terms of public health and economics. Although there is a global awareness of the warnings and programmes supporting innovative actions to combat fight against antibiotic resistance, it must be admitted that proposed new antibiotics fail to find the economic profitability necessary for them to reach the market and become available for patients and the community. Moreover, it is necessary to develop tools/indicators to define effective interventions against antibiotic resistance. The work of the think-tank reported in this article concentrated on two aspects of translational research: - prevention and the impact on health of the antibiotic resistance issue, and - the specific requirements of clinical research leading to innovation in the fight against antibiotic resistance. This article, which reflects the thoughts of a group of French experts, proposes directly operational solutions which could be rapidly implemented and radically transform the quality and quantity of our resources available for the combat.

Cells metabolism is strongly disturbed and deregulated in cancers. Several examples reflect this phenomenon, including metabolic reprogramming described in the Warburg effect, functional deregulations of particular metabolic pathways such as the increase of the ROS production in cancer cells, or the identification of oncometabolites linked to acquired mutations such as IDH1/2 mutations, which lead to the production of a metabolite directly linked to the leukemic process in AML. In order to characterize the metabolic reprogramming associated with the leukemic process, we analyzed by an HRMAS approach the metabolites produced by different leukemic cell lines representing different subtypes of AML (different genotype and phenotype). In this model, we have shown that each type of cell line exhibited a particular metabolism in the basal state, witnessing a different metabolic signature depending on the nature of the cell line. In condition of metabolic stress (culture in a serum-free environment), all these cell lines develop mechanisms to adapt their metabolism to nutrient deficiency. Particularly, there is a common signature characterized by the overexpression of metabolites of the phospholipid pathway and of regulation of oxidative stress after 24 hours of culture in a medium without serum. Thanks to these adaptation mechanisms, the leukemic cells find after 48 hours a viability higher than 95% and a metabolic profile almost identical to normal conditions. These results show that leukemic cells develop common survival mechanisms, notably involving deregulations of lipid metabolism, which allow them to continue to proliferate in condition of metabolic stress. Other experimental conditions have been tested, in particular in glucose deficiency conditions in order to explore the path of deregulation of some amino acids such as alanine in these cell lines. Moreover, the quantitative and qualitative study of fatty acids in AMLs through a lipidomic approach reveals a similar adaptation of the lipidomic profiles of the cell lines in the same serum-free conditions previously tested. In parallel, in a study on 54 patients diagnosed with AML, we confirmed by the HRMAS approach that there were differences in metabolic profile in AML patients according to the AML subtype. We also showed that these metabolic signatures were significantly correlated with cytogenetic prognostic subgroups, response to chemotherapy treatment and patient survival. We show in particular that the metabolites overexpressed in patients with poor prognosis are found overexpressed also in patients refractory to treatment. The analysis of these metabolites shows the particular role of several metabolic pathways in the prognosis of AML: i) deregulation of the synthesis of 2-hydroxyglutarate associated with mutations in the IDH1/2 enzyme, ii) deregulation of the metabolism of phospholipids, showing an overexpression of phospholipids in adverse prognosis patients plasmas, and iii) overexpression of the synthesis of some amino acids in chemoresistant patients, suggesting an involvement of the LKB1/AMPK signaling pathway., Le métabolisme des cellules cancéreuses est fortement perturbé et dérégulé dans les cancers. Plusieurs exemples illustrent ce phénomène, notamment la reprogrammation métabolique décrite dans l’effet Warburg, les dérégulations fonctionnelles de certaines voies métaboliques telles que l’augmentation de la production de ROS dans les cellules cancéreuses, ou la mise en évidence d’oncométabolites liés à des mutations acquises telles que les mutations IDH1/2 qui entraînent la production d’un métabolite directement associé au processus leucémique dans les LAM. Afin de caractériser les reprogrammations métaboliques associées au processus leucémique, nous avons analysé par une approche HRMAS les métabolites produits par différentes lignées cellulaires leucémiques représentant différents sous types de LAM (génotype et phénotype différents). Dans ce modèle, nous avons montré que chaque type de lignée présentait un métabolisme particulier à l’état basal, témoin d’une signature métabolique différente selon la nature de la lignée. En situation de stress métabolique (culture en milieu sans sérum), toutes ces lignées développent des mécanismes d’adaptation de leur métabolisme à la carence en nutriments. En particulier, il existe une signature commune caractérisée par la surexpression de métabolites de la voie des phospholipides et de régulation du stress oxydant au bout de 24h de culture en milieu sans sérum. Grâce à ces mécanismes d’adaptation les cellules leucémiques retrouvent au bout de 48h, une viabilité supérieure à 95% et un profil métabolique quasi-identique aux conditions normales. Ces résultats montrent que les cellules leucémiques développent des mécanismes communs de survie, impliquant notamment des dérégulations du métabolisme des lipides, qui leur permettent de continuer à proliférer en situation de stress métabolique. D’autres conditions expérimentales ont été testées, notamment en condition de carence en glucose afin d’explorer la piste de la dérégulation de certains acides aminés comme l’alanine dans ces lignées. De plus, l’étude quantitative et qualitative des acides gras dans les LAM via une approche lipidomique révèle une adaptation similaire des profils lipidomiques des lignées dans les mêmes conditions de privation en sérum précédemment testées. En parallèle, dans une étude sur 54 patients au diagnostic de LAM, nous avons confirmé par l’approche HRMAS qu’il existait chez les patients LAM des différences de profil métabolique en fonction du sous-type de LAM. Nous avons également montré que ces signatures métaboliques étaient significativement corrélées aux sous-groupes pronostiques cytogénétiques, à la réponse au traitement par chimiothérapie et à la survie des patients. Nous montrons notamment que les métabolites surexprimés chez les patients de mauvais pronostic sont retrouvés surexprimés également chez les patients réfractaires au traitement. L’analyse de ces métabolites montrent le rôle particulier de plusieurs voies métaboliques dans le pronostic des LAM : i) la dérégulation de la synthèse de 2-hydroxyglutarate associée aux mutations de l’enzyme IDH1/2, ii) la dérégulation du métabolisme des phospholipides, retrouvant une surexpression de phospholipides dans les plasmas de patients de pronostic défavorable, et iii) la surexpression de la synthèse de certains acides aminés chez les patients chimiorésistants, suggérant une implication de la voie de signalisation LKB1/AMPK.

Both pDCs and γδT cells harbor critical roles in immune responses induction and orientation. Their unique features, high functional plasticity and ability to interact with many immune cell types allow them to bridge innate and adaptive immunity. They actively contribute to protective and pathogenic immune responses, which render them very attractive both as targets and vectors for cancer immunotherapy. Yet, γδT cells have not been extensively explored in melanoma, and despite strategic and closed missions, cross-talks between pDCs and γδT cells have not been deciphered yet, neither in healthy context nor in cancers, especially in melanoma where the long-term control of the tumor still remains a challenge. We provided here a detailed investigation of the phenotypic and functional properties of circulating and tumor-infiltrating γδT cells in melanoma patients, as well as their impact on clinical evolution. We also characterized the bidirectional cross-talks between pDCs and γδT cells both from healthy donor’s blood, patient’s blood and tumor micro-environment. Our study highlighted that melanoma hijacked γδT cells to escape from immune control, and revealed that circulating and tumor-infiltrating γδT cell features are promising potential biomarkers of clinical evolution. We also demonstrated crucial bidirectional interactions between these key potent immune players though type I and II IFN and BTN3A that are dysfunctional in the context of melanoma. Reversion of the dysfunctional bidirectional cross-talks in melanoma context could be achieved by specific cytokine administration and immune checkpoint targeting. We also revealed an increased expression of BTN3A on circulating and tumor-infiltrating pDCs and γδT cells from melanoma patients but stressed out its potential functional impairment.Thus, our study uncovered that melanoma hijacked pDCs/ γδT cells bidirectional interplay to escape from immune control, and pointed out BTN3A dysfunction. Such understanding will help harnessing and synergizing the power of these potent immune cells to design new therapeutic approaches exploiting their antitumor potential while counteracting their skewing by tumors to improve patient outcomes. Our findings pave the way to manipulate these potent and promising cell partners to design novel immunotherapeutic strategies and restore appropriate immune responses in cancers, infections and autoimmune diseases., Les pDCs et Tγδ ont des rôles cruciaux dans l’initiation et l’orientation des réponses immunitaires. Leurs fonctions uniques, leur grande plasticité et leur capacité d’interagir avec de nombreux acteurs immunitaires leur permettent de créer un lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. Elles contribuent donc grandement aux réponses immunitaires protectrices et pathogéniques, et sont de ce fait très prometteuses pour le développement d’immunothérapies anti-tumorales, autant en tant que vecteurs que cibles. Cependant, les lymphocytes Tγδ n’ont pas été étudiés de manière approfondie en contexte de mélanome, et les interactions entre pDCs et Tγδ n’ont été explicitées ni en contexte sain, ni en contexte mélanome, ou le contrôle immunitaire de la tumeur ‡ long terme est encore un défi. Nous avons réalisé une étude détaillée du phénotype et de la fonction des lymphocytes Tγδ circulant et infiltrant le mélanome, et analysé leur impact sur l’évolution clinique. Nous avons aussi caractérisé les interactions bidirectionnelles entre les pDCs et les Tγδ issus de sang de donneurs sains, et de sang ou de tumeur de patients. Nous avons mis en évidence que le mélanome détourne les fonctions effectrices des Tγδ dans le but d’échapper au contrôle immunitaire, et que les caractéristiques des Tγδ issus de sang ou de tumeurs de patients peuvent étre des bio-marqueurs prometteurs d’évolution clinique. Nous avons également montré que les interactions entre pDCs et Tγδ sont médiées par les IFNs de type I et II et par le récepteur BTN3A, essentiel pour l’activation des Td2+, et sont dérégulées en contexte de mélanome. L’administration de cytokines et d’anticorps ciblant les points de contrôle immunitaire peut rétablir des interactions fonctionnelles entre les deux populations cellulaires. De façon intéressante, nous avons observé une augmentation de l’expression de BTN3A sur les pDCs et Tγδ issus de sang de patients ou de tumeurs, tout en soulignant une potentielle dysfonction de cette molécule. Notre étude révèle que le mélanome détourne les interactions entre pDCs et Tgd notamment via la dérégulation de BTN3A. De tels résultats motivent l’exploitation de ces effecteurs immunitaires ainsi que de leur synergie, pour développer de nouvelles approches thérapeutiques exploitant leur potentiel anti-tumoral tout en évitant leur détournement par la tumeur pour améliorer l’évolution clinique des patients. Nos découvertes soutiennent l’exploitation de ces partenaires puissants et prometteurs pour élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques et restaurer des réponses immunes appropriées en contexte de cancer, infections et auto-immunité

The loss of honeybee colonies could be explained by multiple stress factors (biotic or abiotic) that could act alone or in synergy to perturb the physiology of the domestic bees. The impact of these stressors on the bee health is widely discussed. In the miscrosporidiosis, an infection due to Nosema, the impact of this stressor on the systemic immune response (haemolymph being the mirror of this response) and the epithelial response (gut tissue as target) remains unsatisfactory documented. In the context of an infection by Nosema spp, the spore multiplication that is occurring at the level of the midgut stimulate the gut epithelial immune response. While at the same time, the stimulation of the systemic immune response remains an opened question. The aim of this thesis is to decipher the cross-talk existing between the host (A. mellifera) and the pathogen (Nosema spp.). We investigated the epithelial (gut tissues) and circulating bee immune response (haemolymph) using complementary mass spectrometry approaches (molecular mass fingerprints by MALDI BeeTyping®, untargeted proteomics and MALDI imaging) in a context of a controlled or natural infection by Nosema spores. We have demonstrated new molecular markers of bee health from hemolymph and bees early infected with Nosema from digestive tract. In addition, we have developed the MALDI Biotyping method on our microsporidia model to identify the species at a lower cost. These different elements constitute the development of new diagnostic and even prognostic tools to assist the beekeeper or the health services in their apiary monitoring., Le phénomène mondial d’effondrement des colonies d’abeilles domestiques peut être expliqué par l’exposition de celles-ci à différents stresseurs (biotiques et abiotiques) qui peuvent agir seuls ou en synergie. L’impact de ces stresseurs sur la santé des abeilles, surtout lorsqu’ils sont multiples, est largement débattu. Dans le cadre de l’infection par Nosema, une microsporidie présente dans le tube digestif de l’abeille, de nombreuses études semblent indiquer que la multiplication des spores affecte l’épithélium de la paroi intestinale et donc stimule une réponse immunitaire épithéliale. Cependant, montrer que la réponse immunitaire systémique (visible au sein de l’hémolymphe) est bien stimulée, reste un cap à franchir particulièrement délicat. Le but de la thèse est de mieux comprendre les interactions qui se créent entre l’hôte (Apis mellifera) et le pathogène (Nosema spp.). Nous avons étudié pour cela le système immunitaire tissulaire (tube digestif) et circulant (hémolymphe) de l’hôte par des approches complémentaires de spectrométrie de masse (empreintes moléculaires massiques par MALDI BeeTyping®, approches de protéomique fine sur des segments de tube digestif et imagerie moléculaire par MALDI) dans un contexte d’infection contrôlée ou naturelle par des spores de Nosema spp. Nous avons mis en évidence de nouveaux marqueurs moléculaires de la santé de l’abeille à partir de l’hémolymphe d’abeilles infectées de manière précoce par Nosema et à partir du tube digestif de ces mêmes abeilles. De plus nous avons développé la méthode de MALDI Biotyping sur notre modèle de microsporidies pour identifier l’espèce à moindre coût. Ces différents éléments permettront le développement de nouveaux outils de diagnostic voir de pronostic pour assister l’apiculteur ou les services sanitaires dans le suivi de leur rucher.

DNA is organized via histones, the leading players in the compaction of genetic material. Technological evolution has favored the discovery of many protein variants. However, the annotation of the latter was unconventional, complicating their identification by mass spectrometry. Thus, I developed a comprehensive database, called MS_HistoneDB, dedicated to the detection of histone variants by mass spectrometry. MS_HistoneDB allows the use of murine and human samples. Also, the use of immunological tests makes it difficult to discriminate at the protein level of almost similar variants. Thus, I developed a targeted mass spectrometry analysis method to detect and quantify histone variants in a multiplex assay. This methodology has been applied in the investigation of chromatin during spermatogenesis, in mouse models, physiological or pathological mimicking male infertility.Another aspect of my work focused on proteins that bind modified forms of histones. Thus, I studied the "readers" of the BET family (Bromodomain and Extra-terminal domain). These proteins are recruited on chromatin via their bromodomains, a specific module recognizing acetylated histones. Their extra-terminal domain acts as a recruitment platform for transcriptional regulators. These proteins are conserved in the yeast Saccharomyces cerevisiae, and also in fungal pathogens responsible for invasive infections, where the only member is called Bdf1. Thus, I studied the extra-terminal domain of Bdf1 and demonstrated that it is essential for yeast survival. Then, I explored the molecular mechanisms involved. Finally, selective inhibitors are being developed in pathogenic yeast species. All of this work paves the way for the development of a new therapeutic class of antifungals., L’ADN s’organise via les histones, les principaux acteurs dans la compaction du matériel génétique. L’évolution technologique a favorisé la découverte de nombreux variants protéique. Toutefois, l’annotation de ces derniers s’est faite de manière non conventionnelle, compliquant leur identification par spectrométrie de masse. Ainsi, j’ai développé une banque de données exhaustive, intitulée MS_HistoneDB, dédiée à la détection des variants d’histone par spectrométrie de masse. MS_HistoneDB permet l’utilisation d’échantillons murin et humain. En outre, l’utilisation de tests immunologiques permet difficilement de discriminer au niveau protéique des variants quasi-similaire. Ainsi, j’ai développé une méthode d’analyse de spectrométrie de masse ciblée pour détecter et quantifier les variants d’histones en un essai multiplexe. Cette méthodologie a été appliqué dans l’investigation de la chromatine au cours de la spermatogenèse, dans des modèles murins, physiologique ou pathologique mimant l’infertilité masculine.Un autre aspect de mon travail s’est intéressé aux protéines liant les formes modifiées des histones. Ainsi, j’ai étudié les « readers »de la famille BET (Bromodomaine et Extra-terminal domain). Ces protéines sont recrutées sur la chromatine via leurs bromodomaines, module spécifique reconnaissant les histones acétylées. Leur domaine extra terminal joue le rôle de plateforme de recrutement de régulateurs transcriptionnels. Ces protéines sont conservées chez la levure Saccharomyces cerevisiae,et également chez les pathogènes fongiques responsables d’infections invasives, où l’unique membre est appelé Bdf1. Ainsi, j’ai étudié le domaine extra-terminale de Bdf1 et démontré qu’il est essentiel à la survie des levures. Puis, j’ai exploré les mécanismes moléculaires impliqués. Enfin, des inhibiteurs sélectifs sont en cours de développement dans des espèces de levure pathogène. L’ensemble de ces travaux ouvrent la voie au développement d’une nouvelle classe thérapeutique d’antifongiques.

Phytopathogenic fungi are the main cause of crop diseases. Botrytis cinerea is a necrotrophic fungus, responsible for the gray mold, targeting many plants of agronomic interest (tomato, grapevine, strawberry). The extensive control of this disease integrates research for new antifungal solutions derived from natural molecules such as antimicrobial peptides (AMPs). The peptide ETD151 is an exclusively antifungal AMP optimized from heliomicin, an insect defensin from the butterfly Heliothis virescens. This small cationic, cysteine-rich and non-cytotoxic peptide demonstrates a promising in vitro activity on phytopathogenic fungi including B. cinerea. Using multidisciplinary approaches (proteomics, sphingolipidomics, confocal microscopy), this thesis focused on a better understanding of the mechanism of action of ETD151, with the eventual goal of developing a new crop protection strategy. As a first step, bottom-up proteomic studies were conducted on B. cinerea mycelium in the presence or absence of the peptide. Differential analysis of the results allowed us to identify proteins and metabolic pathways, such as the respiratory chain, impacted by ETD151. Thereafter and based on its strong homology with heliomicin, we have demonstrated the prominent role of membrane lipids called glucosylceramides in the activity of ETD151. Two forms Bc-GlcCer-2 and Bc-GlcCer-3 have been characterized by mass spectrometry in B. cinerea and explain the sensitivity of the fungus to the antifungal peptide. These results contributed to the current protein-lipid interaction studies in NMR. Finally, we have been able to define ETD151 as a morphogenic defensin in B. cinerea, as a few insects and plants antifungal defensins. Indeed, the peptide inhibits spore germination and hyphal elongation while at the same time altering the morphology of the fungus. It also disrupts the membrane integrity and leads to the release of intracellular content, non-mechanically and without acting directly on the high-osmolarity glycerol pathway. By combination with BODIPY fluorophore, we have revealed a particular affinity of ETD151 for the cell envelope and its internalization.; Les champignons phytopathogènes sont la principale cause de maladies chez les plantes cultivées. Botrytis cinerea est un champignon nécrotrophe, responsable de la pourriture grise, ciblant de nombreuses cultures d’intérêt agronomique (tomate, vigne, fraise). La lutte contre ce pathogène intègre la recherche de nouvelles solutions antifongiques dérivées de molécules naturelles telles que les peptides antimicrobiens (PAMs). Le peptide ETD151 est un PAM exclusivement antifongique optimisé à partir de l’héliomicine, une défensine d’insecte isolée chez le papillon Heliothis virescens. Ce petit peptide cationique, riche en cystéine et non-cytotoxique démontre une activité in vitro prometteuse sur les champignons phytopathogènes dont B. cinerea. Ces travaux de thèse ont visé par des approches pluridisciplinaires (protéomique, sphingolipidomique, microscopie confocale) à une meilleure compréhension du mécanisme d’action du peptide ETD151, dans le but éventuel de développer une nouvelle stratégie de protection des cultures. Dans un premier temps, des études protéomiques de type « bottom-up » ont été conduites sur du mycélium de B. cinerea en présence ou absence du peptide. L’analyse différentielle des résultats a permis d’identifier des protéines et des voies métaboliques, telle que la chaîne respiratoire, impactées par l’ETD151. Dans un second temps et en s’appuyant sur sa forte homologie avec l’héliomicine, nous avons démontré le rôle prépondérant de certains lipides membranaires appelés glucosylcéramides dans l’activité de l’ETD151. Deux formes de ces lipides, Bc-GlcCer-2 et Bc GlcCer-3, ont été caractérisées par spectrométrie de masse chez B. cinerea et permettent d’expliquer la sensibilité du champignon au peptide antifongique. Ces résultats ont guidé les études d’interaction protéine-lipide par RMN actuellement en cours. Enfin, nous avons pu définir l’ETD151 comme une défensine morphogénique chez B. cinerea, à l’instar de certaines défensines antifongiques d’insectes et de plantes. En effet, le peptide inhibe la germination des spores et l’élongation des hyphes tout en modifiant la morphologie du champignon. Il perturbe également l’intégrité membranaire et aboutit à la libération du contenu intracellulaire, de façon non mécanique et sans agir directement sur la voie contrôlant l’osmorégulation. Par conjugaison avec le fluorophore BODIPY, nous avons révélé une affinité particulière de l’EDT151 pour l’enveloppe cellulaire et son internalisation

Histone variant H2A.Z replaces the canonical histone H2A and is particularly enriched at non-transcribed chromatin regions as pericentromeric, centromeric and telomeric. Histone variant H2A.Z exists in two isoforms H2A.Z-1 and H2A.Z-2 coded by 2 distinct genes, H2afz and H2afv, that differ only by 3 amino acids. H2A.Z seems to be involved in several cellular events as transcription, DNA repair as well as proliferation and cellular differentiation. The function of H2A.Z has been, until now, mostly studied by the in-vitro cell culture. Few data are available concerning the role of H2A.Z in-vivo, regarding different organs, reflecting the lack of animal models to follow the genetic invalidation of H2A.Z. Histone variant H2A.Z is present in wild-type cells and when the 2 genes coding for H2A.Z are deleted, its concentration decreases progressively with succeeding mitosis until it disappeared.We have created a new and unique transgenic mouse model enabling to achieve, in-vivo, a double conditional knock-out of H2afz and H2afv genes, in a specific tissue, the skin epidermis. Constantly proliferating (mitotic tissue) and differentiating (post-mitotic tissue), the epidermis and hair follicles are excellent models to address the role of H2A.Z in cell proliferation and differentiation.In adult 6-8 months mice, the induction of the transgene K14CreERT2 by tamoxifen invalidates H2A.Z genes (H2afz and H2afv) and leads to the progressive loss of H2A.Z in transient amplifying cells (TA) that actively proliferate: in growing hair follicles (anagen) and in epidermal basal layer. The blocking of cells in G2/M phase, affects skin homeostasis calling in return the migration of stem cells from the hair follicle and epidermis, resulting in further epidermis thickening and alopecia of ventral thoracic regions.During skin embryogenesis, the deletion of both H2A.Z genes, activating K14CreERT2 transgene by tamoxifen or by using the constitutively activated K5Cre transgene, leads to a progressive loss of histone variant H2A.Z in all epidermal cells and hair bud cells, which both have a high proliferation index. The loss of H2A.Z results in cell block in G2/M phase, leads to cell differentiation and finally a build-up of dead skin cells in corneum layer.To conclude skin phenotypes obtained H2A.Z knock-out in the adult or during skin embryogenesis, show that H2A.Z plays an essential role in mitosis and appears directly involved in the regulation of epidermis homeostasis.; L’histone variante H2A.Z, histone de la famille H2A est enrichie dans certaines régions non transcrites de la chromatine, telles que la chromatine péricentromérique, centromérique et télomérique. Elle existe sous la forme de deux isoformes, H2A.Z-1 et H2A.Z-2, qui diffèrent par seulement 3 acides aminés et sont codés par deux gènes distincts, H2afz et H2afv. L’histone H2A.Z apparait impliquée dans divers évènements cellulaires tels que la transcription, la réparation de l’ADN ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaire. La fonction de H2A.Z a été, jusqu’ici, analysée surtout grâce à la culture cellulaire in-vitro. Peu d’informations sont disponibles concernant le rôle de H2A.Z in-vivo dans différents organes, reflétant le manque de modèles animaux permettant l’invalidation génique de H2A.Z. Nous avons créé un modèle de souris transgénique permettant de réaliser in-vivo le double knock-out conditionnel (KI/cKO) des gènes H2afz et H2afv de manière tissu-spécifique dans les kératinocytes de la peau. Ce modèle d’étude in-vivo est unique car le seul à ce jour permettant d’éliminer complètement l’expression de H2A.Z. L’histone variante est physiologiquement présente dans toutes les cellules wild-type. Si les deux gènes codant pour H2A.Z sont délétés, la concentration de l’histone diminue au fur et à mesure des mitoses successives et finit par disparaître.L’épiderme en constante prolifération (tissu mitotique) mais aussi en constante différenciation (tissu post-mitotique), ainsi que le follicule pileux où ces deux processus intervenent de manière cyclique lors de la formation du poil, constituent un excellent modèle afin de disséquer le rôle spécifique de H2A.Z dans les processus de prolifération et de différenciation.L’induction par le tamoxifène du transgène K14CreERT2 invalidant les gènes H2A.Z (H2afz et H2afv) dans les kératinocytes, a tout d’abord été réalisée chez la souris adulte âgée de 6-8 mois. Elle entraine progressivement la perte totale de l’histone variante H2A.Z dans les cellules d’amplification transitoire (TA) qui se multiplient activement : au niveau du follicule pileux en phase de croissance (anagène) et au niveau des cellules situées de place en place au niveau de l’assise basale de l’épiderme. Le blocage en phase G2/M de ces cellules, perturbe l’homéostasie de la peau et appelle en retour une migration des cellules souches du follicule pileux vers l’épiderme, entrainant un épaississement de l’épiderme et une alopécie dans la région ventrale thoracique.Lors de la mise en place de la peau embryonnaire la délétion des deux gènes H2afz et H2afv, par l’induction du transgène K14CreERT2 suite à l’injection de tamoxifène ou l’utilisation du transgène K5Cre dont l’activité est constitutive, entraine la perte progressive de l’histone H2A.Z dans toutes les cellules épidermiques et les cellules des bourgeons pileux, qui toutes ont un fort indice de prolifération. La perte de H2A.Z entrainant le blocage des cellules en phase G2/M, ces cellules se différencient et s’accumulent dans la couche cornée.En conclusion, les différents phénotypes développés après le knock-out de H2A.Z dans les kératinocytes chez l’adulte ainsi qu’au cours de l’embryogénèse de la peau, nous ont permis de montrer l’implication de H2A.Z dans la progression de la mitose, et par la même directement son implication dans la régulation de l’homéostasie de l’épiderme.

Histone variant H2A.Z replaces the canonical histone H2A and is particularly enriched at non-transcribed chromatin regions as pericentromeric, centromeric and telomeric. Histone variant H2A.Z exists in two isoforms H2A.Z-1 and H2A.Z-2 coded by 2 distinct genes, H2afz and H2afv, that differ only by 3 amino acids. H2A.Z seems to be involved in several cellular events as transcription, DNA repair as well as proliferation and cellular differentiation. The function of H2A.Z has been, until now, mostly studied by the in-vitro cell culture. Few data are available concerning the role of H2A.Z in-vivo, regarding different organs, reflecting the lack of animal models to follow the genetic invalidation of H2A.Z. Histone variant H2A.Z is present in wild-type cells and when the 2 genes coding for H2A.Z are deleted, its concentration decreases progressively with succeeding mitosis until it disappeared.We have created a new and unique transgenic mouse model enabling to achieve, in-vivo, a double conditional knock-out of H2afz and H2afv genes, in a specific tissue, the skin epidermis. Constantly proliferating (mitotic tissue) and differentiating (post-mitotic tissue), the epidermis and hair follicles are excellent models to address the role of H2A.Z in cell proliferation and differentiation.In adult 6-8 months mice, the induction of the transgene K14CreERT2 by tamoxifen invalidates H2A.Z genes (H2afz and H2afv) and leads to the progressive loss of H2A.Z in transient amplifying cells (TA) that actively proliferate: in growing hair follicles (anagen) and in epidermal basal layer. The blocking of cells in G2/M phase, affects skin homeostasis calling in return the migration of stem cells from the hair follicle and epidermis, resulting in further epidermis thickening and alopecia of ventral thoracic regions.During skin embryogenesis, the deletion of both H2A.Z genes, activating K14CreERT2 transgene by tamoxifen or by using the constitutively activated K5Cre transgene, leads to a progressive loss of histone variant H2A.Z in all epidermal cells and hair bud cells, which both have a high proliferation index. The loss of H2A.Z results in cell block in G2/M phase, leads to cell differentiation and finally a build-up of dead skin cells in corneum layer.To conclude skin phenotypes obtained H2A.Z knock-out in the adult or during skin embryogenesis, show that H2A.Z plays an essential role in mitosis and appears directly involved in the regulation of epidermis homeostasis., L’histone variante H2A.Z, histone de la famille H2A est enrichie dans certaines régions non transcrites de la chromatine, telles que la chromatine péricentromérique, centromérique et télomérique. Elle existe sous la forme de deux isoformes, H2A.Z-1 et H2A.Z-2, qui diffèrent par seulement 3 acides aminés et sont codés par deux gènes distincts, H2afz et H2afv. L’histone H2A.Z apparait impliquée dans divers évènements cellulaires tels que la transcription, la réparation de l’ADN ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaire. La fonction de H2A.Z a été, jusqu’ici, analysée surtout grâce à la culture cellulaire in-vitro. Peu d’informations sont disponibles concernant le rôle de H2A.Z in-vivo dans différents organes, reflétant le manque de modèles animaux permettant l’invalidation génique de H2A.Z. Nous avons créé un modèle de souris transgénique permettant de réaliser in-vivo le double knock-out conditionnel (KI/cKO) des gènes H2afz et H2afv de manière tissu-spécifique dans les kératinocytes de la peau. Ce modèle d’étude in-vivo est unique car le seul à ce jour permettant d’éliminer complètement l’expression de H2A.Z. L’histone variante est physiologiquement présente dans toutes les cellules wild-type. Si les deux gènes codant pour H2A.Z sont délétés, la concentration de l’histone diminue au fur et à mesure des mitoses successives et finit par disparaître.L’épiderme en constante prolifération (tissu mitotique) mais aussi en constante différenciation (tissu post-mitotique), ainsi que le follicule pileux où ces deux processus intervenent de manière cyclique lors de la formation du poil, constituent un excellent modèle afin de disséquer le rôle spécifique de H2A.Z dans les processus de prolifération et de différenciation.L’induction par le tamoxifène du transgène K14CreERT2 invalidant les gènes H2A.Z (H2afz et H2afv) dans les kératinocytes, a tout d’abord été réalisée chez la souris adulte âgée de 6-8 mois. Elle entraine progressivement la perte totale de l’histone variante H2A.Z dans les cellules d’amplification transitoire (TA) qui se multiplient activement : au niveau du follicule pileux en phase de croissance (anagène) et au niveau des cellules situées de place en place au niveau de l’assise basale de l’épiderme. Le blocage en phase G2/M de ces cellules, perturbe l’homéostasie de la peau et appelle en retour une migration des cellules souches du follicule pileux vers l’épiderme, entrainant un épaississement de l’épiderme et une alopécie dans la région ventrale thoracique.Lors de la mise en place de la peau embryonnaire la délétion des deux gènes H2afz et H2afv, par l’induction du transgène K14CreERT2 suite à l’injection de tamoxifène ou l’utilisation du transgène K5Cre dont l’activité est constitutive, entraine la perte progressive de l’histone H2A.Z dans toutes les cellules épidermiques et les cellules des bourgeons pileux, qui toutes ont un fort indice de prolifération. La perte de H2A.Z entrainant le blocage des cellules en phase G2/M, ces cellules se différencient et s’accumulent dans la couche cornée.En conclusion, les différents phénotypes développés après le knock-out de H2A.Z dans les kératinocytes chez l’adulte ainsi qu’au cours de l’embryogénèse de la peau, nous ont permis de montrer l’implication de H2A.Z dans la progression de la mitose, et par la même directement son implication dans la régulation de l’homéostasie de l’épiderme.

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite, and is the causative agent of toxoplasmosis, a benign parasitosis in immunocompetent or non-pregnant subjects. When congenital, toxoplasmosis can manifest as severe neurological malformations. This disease develops in two forms. The first includes the phase caused by the rise of the population of tachyzoites that can cause malformations in the fetus. The second is chronic and asymptomatic, bradyzoite is in the form of cysts. Reactivation of bradyzoites into tachyzoites may be fatal for immunocompromised patients. Tachyzoite-bradyzoite interconversion is therefore at the center of the pathogenesis of this zoonosis. Interconversion is regulated at the transcriptional level, with strict epigenetic control. In vitro, inhibition of histone deacetylase TgHDAC3 by FR235222 has been shown to induce conversion. In this thesis, we have studied a new compound I2, with properties that also act on HDACs. We demonstrate that this compound inhibits growth in all T. gondii strains, but does not induce tachyzoite-bradyzoite differentiation. On the other hand, the compound I2 induces a deformation of the vacuole, which takes the appearance of a bubble, only in certain strains of T. gondii. From the experiments carried out the distortion of the vacuole does not interfere with a cystic wall. Genetic screening has defined a genomic region responsible for the bubble phenotype of the vacuole. In the current state the responsible gene remains to be identified as well as the mechanisms that participate in the distortion of the vacuole. In parallel, another project was initiated on the basis of a study of genes involved in the growth and / or resistance to IFNγ, the main cytokine of defense against the parasite. A gene has been studied. The deletion of this one in the parasite causes a growth defect and, surprisingly, resistance to treatment with IFNγ. This gene and its mode of operation remain to be studied. Together, these works show us an adaptation of T. gondii to its environment and the development of mechanisms of survival that remain to be elucidated.; Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire, et est l’agent responsable de la toxoplasmose, une parasitose habituellement bénigne chez le sujet immunocompétent ou en dehors d'une grossesse. Lorsqu’elle est congénitale, la toxoplasmose peut se manifester par de malformations neurologiques sévères. Cette maladie se développe sous deux formes. La première comprend à la phase aigüe provoquée par l’expansion de la population de tachyzoites qui peuvent provoquer des malformations chez le fœtus. La seconde est dite chronique et asymptomatique, le bradyzoite est y présent sous forme de kystes. Une réactivation des bradyzoites en tachyzoites peut être fatale pour les patients immunodéprimés. L’interconversion tachyzoïte-bradyzoïte est donc au centre de la pathogénèse de cette zoonose. L’interconversion est régulée au niveau transcriptionnel, avec un contrôle épigénétique strict. In vitro, il a été montré que l’inhibition de l’histone déacétylase TgHDAC3 par FR235222 induit la conversion. Dans cette thèse, nous avons étudiés un nouveau composé I2, ayant des propriétés agissant également sur les HDACs. Nous démontrons que ce composé inhibe la croissance chez toutes les souches de T. gondii, sans pour autant induire la différenciation tachyzoïte-bradyzoïte. Par contre, le composé I2 induit une déformation de la vacuole, qui prend l’apparence d’une bulle, uniquement chez certaines souches de T. gondii. D’après les expériences effectuées la distorsion de la vacuole n’interfère ne s’apparente pas à une paroi kystique. Un criblage génétique a permis de définir une région génomique responsable du phénotype « bulle » de la vacuole. En l’état actuel le gène responsable reste à être identifié ainsi que les mécanismes qui participent à la distorsion de la vacuole. Parallèlement, un autre projet a été initié sur la base d’une étude de gènes impliqués dans la croissance et/ou dans la résistance à l’IFNγ, cytokine principale de défense contre le parasite. Un gène a été étudié. La délétion de ce celui-ci chez le parasite provoque un défaut de croissance et de manière surprenante une résistance à un traitement à l’IFNγ. Ce gène et son mode de fonctionnement restent à être étudié. Ensemble, ces travaux nous montrent une adaptation de T. gondii à son environnement et le développement de mécanismes de survie qui restent à être élucidés.

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite, and is the causative agent of toxoplasmosis, a benign parasitosis in immunocompetent or non-pregnant subjects. When congenital, toxoplasmosis can manifest as severe neurological malformations. This disease develops in two forms. The first includes the phase caused by the rise of the population of tachyzoites that can cause malformations in the fetus. The second is chronic and asymptomatic, bradyzoite is in the form of cysts. Reactivation of bradyzoites into tachyzoites may be fatal for immunocompromised patients. Tachyzoite-bradyzoite interconversion is therefore at the center of the pathogenesis of this zoonosis. Interconversion is regulated at the transcriptional level, with strict epigenetic control. In vitro, inhibition of histone deacetylase TgHDAC3 by FR235222 has been shown to induce conversion. In this thesis, we have studied a new compound I2, with properties that also act on HDACs. We demonstrate that this compound inhibits growth in all T. gondii strains, but does not induce tachyzoite-bradyzoite differentiation. On the other hand, the compound I2 induces a deformation of the vacuole, which takes the appearance of a bubble, only in certain strains of T. gondii. From the experiments carried out the distortion of the vacuole does not interfere with a cystic wall. Genetic screening has defined a genomic region responsible for the bubble phenotype of the vacuole. In the current state the responsible gene remains to be identified as well as the mechanisms that participate in the distortion of the vacuole. In parallel, another project was initiated on the basis of a study of genes involved in the growth and / or resistance to IFNγ, the main cytokine of defense against the parasite. A gene has been studied. The deletion of this one in the parasite causes a growth defect and, surprisingly, resistance to treatment with IFNγ. This gene and its mode of operation remain to be studied. Together, these works show us an adaptation of T. gondii to its environment and the development of mechanisms of survival that remain to be elucidated., Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire, et est l’agent responsable de la toxoplasmose, une parasitose habituellement bénigne chez le sujet immunocompétent ou en dehors d'une grossesse. Lorsqu’elle est congénitale, la toxoplasmose peut se manifester par de malformations neurologiques sévères. Cette maladie se développe sous deux formes. La première comprend à la phase aigüe provoquée par l’expansion de la population de tachyzoites qui peuvent provoquer des malformations chez le fœtus. La seconde est dite chronique et asymptomatique, le bradyzoite est y présent sous forme de kystes. Une réactivation des bradyzoites en tachyzoites peut être fatale pour les patients immunodéprimés. L’interconversion tachyzoïte-bradyzoïte est donc au centre de la pathogénèse de cette zoonose. L’interconversion est régulée au niveau transcriptionnel, avec un contrôle épigénétique strict. In vitro, il a été montré que l’inhibition de l’histone déacétylase TgHDAC3 par FR235222 induit la conversion. Dans cette thèse, nous avons étudiés un nouveau composé I2, ayant des propriétés agissant également sur les HDACs. Nous démontrons que ce composé inhibe la croissance chez toutes les souches de T. gondii, sans pour autant induire la différenciation tachyzoïte-bradyzoïte. Par contre, le composé I2 induit une déformation de la vacuole, qui prend l’apparence d’une bulle, uniquement chez certaines souches de T. gondii. D’après les expériences effectuées la distorsion de la vacuole n’interfère ne s’apparente pas à une paroi kystique. Un criblage génétique a permis de définir une région génomique responsable du phénotype « bulle » de la vacuole. En l’état actuel le gène responsable reste à être identifié ainsi que les mécanismes qui participent à la distorsion de la vacuole. Parallèlement, un autre projet a été initié sur la base d’une étude de gènes impliqués dans la croissance et/ou dans la résistance à l’IFNγ, cytokine principale de défense contre le parasite. Un gène a été étudié. La délétion de ce celui-ci chez le parasite provoque un défaut de croissance et de manière surprenante une résistance à un traitement à l’IFNγ. Ce gène et son mode de fonctionnement restent à être étudié. Ensemble, ces travaux nous montrent une adaptation de T. gondii à son environnement et le développement de mécanismes de survie qui restent à être élucidés.

Entre 2010 et 2015, des naissances groupées d'enfants porteurs d'une agénésie transverse des membres supérieurs (ATMS) ont été signalées dans trois départements, l'Ain, la Loire Atlantique et le Morbihan. Afin de répondre aux questionnements des familles et du public, et plus largement à leurs attentes d'une meilleure prise en charge de ces malformations en termes de surveillance, recherche et accompagnement, la mise en place d'une expertise collective a été demandée par les ministres chargés respectivement des solidarités et de la santé, et de la transition écologique et solidaire, et de l'agriculture et de l'alimentation. Elle doit se prononcer sur les causes de ces possibles cas groupés et notamment sur la question des expositions environnementales. Le dispositif a permis de mener les travaux en toute indépendance et transparence et d'impliquer l'ensemble des intéressés. Deux comités ont été constitués : le comité d'experts scientifiques (CES) qui réunit vingt experts de différentes disciplines et le comité d'orientation et de suivi (COS) qui regroupe l'ensemble des parties prenantes concernées par ces cas d'ATMS, incluant des parents d'enfants atteints de cette malformation. Au total, 143 signalements de personnes atteintes de malformations et 43 contributions sur des hypothèses de causes possibles ont été analysés et pris en compte dans les travaux d'expertise. Le premier rapport du comité d'experts scientifiques a été rendu public le 12 juillet 2019. Il sera complété ultérieurement par un rapport final qui intégrera les résultats de l'analyse de la revue de la littérature sur les facteurs de risque.

National audience; Axé sur les phtalates, le projet CNAP se concentre sur le neuro-développement des jeunes enfants : notamment, la question de la fenêtre d’exposition précoce (autour de la grossesse). Le projet vise à : 1/Étudier les effets potentiels de l’exposition prénatale aux phtalates et certains de leurs substituts sur le neuro-développement de jeunes enfants âgés ; 2/Étudier le rôle de voies biologiques particulières, comme la perturbation de la fonction thyroïdienne maternelle et du nouveau-né, dans les effets de cette exposition.

Autoimmune diseases result from a dysfunction of the immune system. The disease etiology is often unknown, complicating the design of appropriate treatments. This thesis project focused on the molecule “a proliferation inducing ligand” (APRIL), a survival factor for antibody-producing plasma cells (PC), in autoimmune hepatitis (AIH) and multiple sclerosis (MS). In AIH, one main histological feature is the presence of a lymphoplasmacytic infiltration forming a damaging interface hepatitis. In this disease, we first noticed a positive correlation between APRIL expression and PC infiltration in portal spaces. In vitro, we further observed an extended survival of liver PC in the presence of APRIL. The corticosteroid therapy commonly applied to AIH patients does not directly target PC. However, we noticed a concomitant reduction in portal PC density and APRIL expression. Hence, this study is extending the survival role of APRIL to liver PC in AIH. Relapses are frequent after treatment withdrawal, telling us that pathogenic cells are spared by the therapy. Our results indicate that APRIL targeting might also be valuable in AIH. Own to its role on PC, APRIL has been successfully targeted in several autoimmune diseases. Besides successes, a clinical trial aiming at APRIL blockade in MS has unfortunately led to an unexpected disease exacerbation. We have been able to show that APRIL targets a new cell type in the central nervous system, the astrocyte. The APRIL binding to astrocyte surface depends on a new binding partner, expressed by the latter, the chondroitin sulfate proteoglycans. This binding induces the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10, leading to the inhibition of, self-reactive T-cell proliferation and pro-inflammatory cytokine secretion. Use of APRIL-deficient mice in the standard model of MS allowed us to confirm the neuroprotective role of APRIL. Finally, after recombinant APRIL injection in this model, a lowered disease severity was observed. Overall, we identified APRIL as a dual role molecule in autoimmune diseases.; Les maladies auto-immunes résultent d’un dysfonctionnement du système immunitaire. L’étiologie de la pathologie reste souvent inconnue, compliquant la conception de traitements adaptés. Ce projet de thèse s’est focalisé sur la molécule « a proliferation inducing ligand » (APRIL), facteur de survie des plasmocytes (PC) produisant les anticorps, dans l’hépatite auto-immune (HAI) et la sclérose en plaques (SEP). Dans l’HAI, une principale caractéristique histologique est la présence d’un infiltrat lymphoplasmocytaire formant une hépatite d’interface dommageable. Dans cette maladie, nous avons d’abord pu mettre en évidence une corrélation positive entre l’expression d’APRIL et l’infiltration des PC dans les espaces portes. In vitro, nous avons observé une survie augmentée des PC du foie en présence d’APRIL. La corticothérapie communément prise par les patients HAI ne cible pas directement les PC. Cependant, nous avons remarqué une réduction simultanée de la densité de PC et de l’expression d’APRIL. Ainsi, cette étude étend le rôle de facteur de survie d’APRIL aux PC du foie dans l’HAI. Les rechutes sont fréquentes après arrêt du traitement, nous indiquant que les cellules pathogènes sont épargnées par la thérapie. Nos résultats montrent que le ciblage d’APRIL pourrait être précieux dans l’HAI. Propre de son rôle sur les PC, APRIL a été ciblée avec succès dans plusieurs maladies auto-immunes. Outre ces succès, un essai clinique visant à bloquer APRIL dans la SEP à malheureusement conduit à une exacerbation inattendue de la maladie. Nous avons été capables de montrer qu’APRIL cible un nouveau type cellulaire dans le système nerveux central, les astrocytes. La fixation d’APRIL à la surface des astrocytes dépend d’un nouveau partenaire de liaison, exprimé par ces derniers, les chondroïtines sulfates protéoglycans. Cette interaction induit la production de la cytokine anti-inflammatoire IL-10, conduisant à l’inhibition de, la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. L’utilisation de souris déficientes pour APRIL dans le modèle standard de la SEP nous a permis de confirmer le rôle neuro-protecteur d’APRIL. Finalement, après injection d’APRIL recombinante dans ce modèle murin, une réduction de la sévérité de la maladie a été observée. Globalement, nous avons identifié APRIL comme une molécule à double rôle dans les maladies auto-immunes.

International audience; The prevalence of asthma has increased rapidly since the early 1970s, and only changes in exposure to environmental factors; which go together with changes in lifestyle, are likely to explain such a rapid increase. Exposure to allergens is a risk factor for allergic sensitization, and allergic sensitization is a risk factor for allergic asthma. However, apart from indoor mold exposure as a risk factor for childhood asthma, there is insufficient evidence to conclude that the associations between allergen exposure and asthma development are causal. A new challenge for research is to analyze the huge amount of data derived from the metagenomic characterization of the environmental and human microbiome, to understand the role of interactions between viruses, bacteria and allergens in the development of asthma. It is recognized that prenatal and postnatal exposure to air pollution and maternal smoking increase the risk of developing asthma in children. In adults, the data are scarce and the results remain controversial as regards these exposures and asthma incidence. Further research is needed to appraise the effect of exposure to phenols, phthalates and perfluorinated compounds, which are widespread in the environment and may be associated with asthma, especially in children. Frequent use of chemicals for home cleaning especially in the form of sprays - which is a common practice at the population level - is a risk factor for the development of adult asthma. The domestic use of cleaning products might also be a risk factor for asthma in children exposed at home. The chemicals involved in these relationships are still to be identified. Occupational asthma is a major phenotype of adult asthma. A significant part of these asthma cases might relate to occupational exposure to cleaning products. While there is evidence of associations between diet during pregnancy or during childhood and the risk of developing asthma in children, the data in adults are insufficient. Beyond genetic factors, body composition is influenced by dietary choices and physical activity. Further research is needed to clarify the complex interplay between these nutritional factors and asthma development. The new challenge for research is to decipher the role of all the environmental factors to which the individual is exposed since conception ("exposome") in the development of asthma, using a holistic approach.

Microtubules (MTs) targeting agents are a powerful weapon in the war against aggressive cancers. Paclitaxel (PTX) has been used successfully for the treatment of solid tumors for decades. Several features, including side-effects and resistance of some cancers make this drug not always effective. With the aim to identify new chemical compounds that sensitize cells to paclitaxel we screened a library of 8,000 compounds, to select those not toxic for cell cultures when applied alone, that become toxic when applied in combination with a non-toxic dose of paclitaxel. This lead to the selection of a carbazole derivative: carba1. In cells, the carba1/PTX combination has a greater cytotoxic effect than the addition of the effects of each drug assayed separately, indicating a synergistic effect. In addition, in-depth phenotypic analyzes indicate that the administration of carba1 amplify the effects of PTX.High doses of carba1 induce a cell blockade in prometaphase, but do not alter the MT network in interphase or mitosis. In contrast, in vitro, carba1 targets the tubulin colchicine binding site, causing a delay and a decrease in MT polymerization. Genetic studies conducted on yeast indicated other potential additional targets including CENP-E, an essential kinesin for chromosome alignment during mitosis.Studies conducted on a preclinical mouse model of aggressive breast cancer (orthotopic grafts) revealed that carba1 alone and carba1/PTX showed no toxicity. In addition, the anti-tumor and anti-metastatic effects of the carba1/PTX combination on these models have been encouraging, but an optimization of the posology is still needed. Carba1 is a new molecule, with previously unknown applications. This is why a declaration of invention, with a view to filing a patent, has been submitted to the CNRS.; Les agents pharmacologiques ciblant la dynamique des microtubules (MTs) sont très utilisés en chimiothérapie des cancers agressifs. Le paclitaxel (PTX) est utilisé depuis des décennies et donne de bons résultats pour le traitement des tumeurs solides. Plusieurs inconvénients, notamment ses effets secondaires et la résistance de certains cancers limitent cependant l'efficacité de ce médicament. Dans le but d'identifier de nouveaux composés pharmacologiques qui sensibilisent les cellules au PTX, nous avons recherché, parmi une collection de 8000 molécules, celles capables de sensibiliser des cellules cancéreuses à une dose non toxique de PTX. Nous avons ainsi sélectionné un composé de la famille des carbazoles : Carba1. Dans les cellules, l’association carba1/PTX a un effet cytotoxique supérieur à la somme des effets de carba1 et de PTX, quand ces molécules sont appliquées séparément, indiquant un effet synergique. De plus, des analyses approfondies de différents phénotypes ont permis de montrer que l'administration de carba1 avait pour conséquence d'amplifier des effets du PTX.À fortes doses, carba1 entraine un blocage des cellules en prométaphase mais n’altère pas le réseau microtubulaire, ni en interphase ni en mitose. En revanche, in vitro, carba1 cible la tubuline en se fixant sur le site colchicine, provoquant un retard et une diminution de la polymérisation des MTs. En plus de la tubuline, des études génétiques réalisées sur la levure suggèrent que carba1 a d'autres cibles dont CENP-E, kinésine essentielle à l’alignement des chromosomes au cours de la mitose.Des études menées sur un modèle de cancer mammaire murin agressif (allogreffes) ont révélé que carba1 seul et carba1/PTX ne présentaient aucune toxicité. De plus, les effets anti-tumoraux et anti-métastatiques de la combinaison carba1/PTX sur ces modèles se sont montrés encourageants, bien que des mises au point, notamment sur la posologie sont encore à prévoir. Carba1 est une molécule nouvelle, avec des applications jusque-là inconnues. C’est pourquoi une déclaration d’invention, en vue d'un dépôt de brevet, a été soumise au CNRS.

DNA is organized via histones, the leading players in the compaction of genetic material. Technological evolution has favored the discovery of many protein variants. However, the annotation of the latter was unconventional, complicating their identification by mass spectrometry. Thus, I developed a comprehensive database, called MS_HistoneDB, dedicated to the detection of histone variants by mass spectrometry. MS_HistoneDB allows the use of murine and human samples. Also, the use of immunological tests makes it difficult to discriminate at the protein level of almost similar variants. Thus, I developed a targeted mass spectrometry analysis method to detect and quantify histone variants in a multiplex assay. This methodology has been applied in the investigation of chromatin during spermatogenesis, in mouse models, physiological or pathological mimicking male infertility.Another aspect of my work focused on proteins that bind modified forms of histones. Thus, I studied the "readers" of the BET family (Bromodomain and Extra-terminal domain). These proteins are recruited on chromatin via their bromodomains, a specific module recognizing acetylated histones. Their extra-terminal domain acts as a recruitment platform for transcriptional regulators. These proteins are conserved in the yeast Saccharomyces cerevisiae, and also in fungal pathogens responsible for invasive infections, where the only member is called Bdf1. Thus, I studied the extra-terminal domain of Bdf1 and demonstrated that it is essential for yeast survival. Then, I explored the molecular mechanisms involved. Finally, selective inhibitors are being developed in pathogenic yeast species. All of this work paves the way for the development of a new therapeutic class of antifungals., L’ADN s’organise via les histones, les principaux acteurs dans la compaction du matériel génétique. L’évolution technologique a favorisé la découverte de nombreux variants protéique. Toutefois, l’annotation de ces derniers s’est faite de manière non conventionnelle, compliquant leur identification par spectrométrie de masse. Ainsi, j’ai développé une banque de données exhaustive, intitulée MS_HistoneDB, dédiée à la détection des variants d’histone par spectrométrie de masse. MS_HistoneDB permet l’utilisation d’échantillons murin et humain. En outre, l’utilisation de tests immunologiques permet difficilement de discriminer au niveau protéique des variants quasi-similaire. Ainsi, j’ai développé une méthode d’analyse de spectrométrie de masse ciblée pour détecter et quantifier les variants d’histones en un essai multiplexe. Cette méthodologie a été appliqué dans l’investigation de la chromatine au cours de la spermatogenèse, dans des modèles murins, physiologique ou pathologique mimant l’infertilité masculine.Un autre aspect de mon travail s’est intéressé aux protéines liant les formes modifiées des histones. Ainsi, j’ai étudié les « readers »de la famille BET (Bromodomaine et Extra-terminal domain). Ces protéines sont recrutées sur la chromatine via leurs bromodomaines, module spécifique reconnaissant les histones acétylées. Leur domaine extra terminal joue le rôle de plateforme de recrutement de régulateurs transcriptionnels. Ces protéines sont conservées chez la levure Saccharomyces cerevisiae,et également chez les pathogènes fongiques responsables d’infections invasives, où l’unique membre est appelé Bdf1. Ainsi, j’ai étudié le domaine extra-terminale de Bdf1 et démontré qu’il est essentiel à la survie des levures. Puis, j’ai exploré les mécanismes moléculaires impliqués. Enfin, des inhibiteurs sélectifs sont en cours de développement dans des espèces de levure pathogène. L’ensemble de ces travaux ouvrent la voie au développement d’une nouvelle classe thérapeutique d’antifongiques.

Gold nanoparticles (Au NPs) have shown promising results in nanomedicine applied to oncology. They are capable of accumulating in tumor areas, inducing a therapeutic effect by delivering drugs or a photo-/radiotherapeutic effect thanks to their energy absorption properties. They also allow diagnosis by different imaging techniques. This dual activity defines them as theranostic agents. Gold nanoclusters (Au NCs) define an interesting sub-family of Au NPs. They are composed of about ten to hundred gold atoms stabilized by organic molecules. Their size smaller than ~8 nm allows them to be eliminated by the kidneys and to exhibit photoluminescence (PL) properties until infrared wavelengths, which are suitable for in vivo optical imaging. They can also induce cell death under irradiation due to the intrinsic properties of gold. Their optical features, pharmaco-kinetic and tumor accumulation are highly sensitive to size and surface chemistry modification. Currently, preclinical results are not sufficient for clinical transfer and it is necessary to improve the characterization of Au NCs and to study their behaviour in vitro and in vivo.In this context, my thesis project focused on the functionalization of Au NCs in order to improve their accumulation in tumors. The first strategy is based on the self-aggregation of Au NCs in the tumor microenvironment. For this purpose, the surface of the Au NCs was either functionalized with i) molecules promoting bioorthogonal click chemistry reactions, or ii) complementary oligonucleotides that can hybridize. The self-aggregation of Au NCs in solution confirmed the increase in PL by inter-particle energy transfer. The self-agregation of Au NCs could potentially improve the therapeutic effect, but the Au NCs still need to be characterized in vivo. The second strategy consisted in increasing the affinity of Au NCs for cells by adding controlled amounts of arginine on their surface. Indeed, arginine is known to promote electrostatic interaction with plasma membranes and cellular internalization. We have determined the maximum arginine threshold per Au NCs, allowing to increase the PL while keeping their small size with high colloidal stability. The best candidates have a high capacity for electrostatic interaction with artificial membranes even in the presence of serum, suggesting that the opsonization of Au NCs is low. Their interaction (< 5min) and internalization (, Les nanoparticules d’or (Au NPs) ont montré des résultats prometteurs en nanomédecine appliquée à la cancérologie. Elles sont capables de s’accumuler dans les zones tumorales, d’induire un effet thérapeutique en délivrant des principes actifs ou un effet photo/radiothérapeutique grâce à leurs propriétés d’absorption d’énergie. Elles permettent aussi le diagnostic par différentes techniques d’imagerie. Cette double activité les définit comme des agents théranostics. Les nanoclusters d’or (Au NCs) forment une sous-famille intéressante de Au NPs. Ils sont composés d’une dizaine à une centaine d’atomes d’or stabilisés par des molécules organiques. Leur taille inférieure à ~8 nm leur permet d’être éliminé par les reins et d’avoir des propriétés de photoluminescence (PL) jusque dans l’infrarouge, une fenêtre spectrale adaptée à l’imagerie optique in vivo. Ils peuvent aussi induire la mort cellulaire sous irradiation en raison des propriétés intrinsèques de l’or. Leurs propriétés optiques, de circulation sanguine et d’accumulation tumorale sont sensibles à de faibles modifications de la taille des Au NCs et de leur chimie de surface. Actuellement, les résultats précliniques sont encore insuffisants pour espérer un transfert en clinique et il est nécessaire d’améliorer la caractérisation des Au NCs et d’étudier leur comportement in vitro et in vivo.Dans ce contexte, mon projet de thèse a consisté à fonctionnaliser ces Au NCs pour améliorer leur accumulation tumorale. La première stratégie repose sur l’auto-agrégation des Au NCs dans le microenvironnement tumoral. Pour cela la surface des Au NCs a été soit i) fonctionnalisée avec des molécules chimiques favorisant des réactions de chimie click bioorthogonale, soit ii) fonctionnalisée avec des monobrins d’oligonucléotides complémentaires pouvant s’hybrider. L’auto-agrégation des Au NCs en solution a confirmée l’augmentation de la PL par transfert d’énergie inter-particules. Cette propriété pourrait éventuellement améliorer l’effet thérapeutique, mais ils doivent encore être caractérisés in vivo. La seconde stratégie a consisté à augmenter l’affinité des Au NCs pour les cellules en ajoutant de l’arginine à la surface des Au NCs de façon contrôlée. En effet, l’arginine est connue pour favoriser l’interaction électrostatique avec les membranes plasmiques et l’internalisation cellulaire. Nous avons déterminé le seuil maximum d’arginine par Au NCs permettant d’augmenter la PL tout en conservant leur petite taille. Les meilleurs candidats ont une forte capacité d’interaction électrostatique avec des membranes artificielles même en présence de sérum, suggérant que l’opsonisation des Au NCs est faible. Leurs capacités d’interaction (< 5min) et d’internalisation (

Phytopathogenic fungi are the main cause of crop diseases. Botrytis cinerea is a necrotrophic fungus, responsible for the gray mold, targeting many plants of agronomic interest (tomato, grapevine, strawberry). The extensive control of this disease integrates research for new antifungal solutions derived from natural molecules such as antimicrobial peptides (AMPs). The peptide ETD151 is an exclusively antifungal AMP optimized from heliomicin, an insect defensin from the butterfly Heliothis virescens. This small cationic, cysteine-rich and non-cytotoxic peptide demonstrates a promising in vitro activity on phytopathogenic fungi including B. cinerea. Using multidisciplinary approaches (proteomics, sphingolipidomics, confocal microscopy), this thesis focused on a better understanding of the mechanism of action of ETD151, with the eventual goal of developing a new crop protection strategy. As a first step, bottom-up proteomic studies were conducted on B. cinerea mycelium in the presence or absence of the peptide. Differential analysis of the results allowed us to identify proteins and metabolic pathways, such as the respiratory chain, impacted by ETD151. Thereafter and based on its strong homology with heliomicin, we have demonstrated the prominent role of membrane lipids called glucosylceramides in the activity of ETD151. Two forms Bc-GlcCer-2 and Bc-GlcCer-3 have been characterized by mass spectrometry in B. cinerea and explain the sensitivity of the fungus to the antifungal peptide. These results contributed to the current protein-lipid interaction studies in NMR. Finally, we have been able to define ETD151 as a morphogenic defensin in B. cinerea, as a few insects and plants antifungal defensins. Indeed, the peptide inhibits spore germination and hyphal elongation while at the same time altering the morphology of the fungus. It also disrupts the membrane integrity and leads to the release of intracellular content, non-mechanically and without acting directly on the high-osmolarity glycerol pathway. By combination with BODIPY fluorophore, we have revealed a particular affinity of ETD151 for the cell envelope and its internalization., Les champignons phytopathogènes sont la principale cause de maladies chez les plantes cultivées. Botrytis cinerea est un champignon nécrotrophe, responsable de la pourriture grise, ciblant de nombreuses cultures d’intérêt agronomique (tomate, vigne, fraise). La lutte contre ce pathogène intègre la recherche de nouvelles solutions antifongiques dérivées de molécules naturelles telles que les peptides antimicrobiens (PAMs). Le peptide ETD151 est un PAM exclusivement antifongique optimisé à partir de l’héliomicine, une défensine d’insecte isolée chez le papillon Heliothis virescens. Ce petit peptide cationique, riche en cystéine et non-cytotoxique démontre une activité in vitro prometteuse sur les champignons phytopathogènes dont B. cinerea. Ces travaux de thèse ont visé par des approches pluridisciplinaires (protéomique, sphingolipidomique, microscopie confocale) à une meilleure compréhension du mécanisme d’action du peptide ETD151, dans le but éventuel de développer une nouvelle stratégie de protection des cultures. Dans un premier temps, des études protéomiques de type « bottom-up » ont été conduites sur du mycélium de B. cinerea en présence ou absence du peptide. L’analyse différentielle des résultats a permis d’identifier des protéines et des voies métaboliques, telle que la chaîne respiratoire, impactées par l’ETD151. Dans un second temps et en s’appuyant sur sa forte homologie avec l’héliomicine, nous avons démontré le rôle prépondérant de certains lipides membranaires appelés glucosylcéramides dans l’activité de l’ETD151. Deux formes de ces lipides, Bc-GlcCer-2 et Bc GlcCer-3, ont été caractérisées par spectrométrie de masse chez B. cinerea et permettent d’expliquer la sensibilité du champignon au peptide antifongique. Ces résultats ont guidé les études d’interaction protéine-lipide par RMN actuellement en cours. Enfin, nous avons pu définir l’ETD151 comme une défensine morphogénique chez B. cinerea, à l’instar de certaines défensines antifongiques d’insectes et de plantes. En effet, le peptide inhibe la germination des spores et l’élongation des hyphes tout en modifiant la morphologie du champignon. Il perturbe également l’intégrité membranaire et aboutit à la libération du contenu intracellulaire, de façon non mécanique et sans agir directement sur la voie contrôlant l’osmorégulation. Par conjugaison avec le fluorophore BODIPY, nous avons révélé une affinité particulière de l’EDT151 pour l’enveloppe cellulaire et son internalisation

The shape of the cell nucleus can vary considerably during developmental and pathological processes as a consequence of the mechanical forces emanating from the microenvironment or generated by the cytoskeleton. However the impact of nuclear morphology on the transcriptional machinery is not known. Using a combination of tools to manipulate the nuclear morphology, we observed that changes in nuclear shape regulate the activity of AP1 and TEAD. We showed that nuclear flattening increases c-Jun phosphorylation and YAP nuclear translocation, leading to transcriptional induction of AP1 and TEAD-target genes. Surprisingly, we found that nuclear compression is necessary and sufficient to mediate c-Jun and YAP activation in response to cell- generated contractility or cell spreading. We additionally observed that nuclear flattening occurs during the cell cycle and promotes proliferation via TEAD and AP1- dependent G1 to S progression.; La forme du noyau peut varier significativement au cours du développement ou lors de processus pathologiques en raison des forces mécaniques émanant du microenvironnement ou générées par le cytosquelette. L’impact de la morphologie nucléaire sur la machinerie transcriptionnelle n’est cependant pas connu. En utilisant plusieurs approches afin de manipuler la morphologie nucléaire, nous avons observé que des changements de forme de l’enveloppe nucléaire régulent l’activité de AP1 et TEAD. Nous avons montré que l’aplatissement du noyau augmente la phosphorylation de c-Jun et la translocation de YAP, conduisant à une augmentation de la transcription des gènes cibles de AP1 et TEAD. Nous avons également observé que l’aplatissement du noyau se produit au cours du cycle cellulaire et favorise la prolifération via l’activation de TEAD et AP1 qui stimulent la progression de la phase G1 à la phase S.

The shape of the cell nucleus can vary considerably during developmental and pathological processes as a consequence of the mechanical forces emanating from the microenvironment or generated by the cytoskeleton. However the impact of nuclear morphology on the transcriptional machinery is not known. Using a combination of tools to manipulate the nuclear morphology, we observed that changes in nuclear shape regulate the activity of AP1 and TEAD. We showed that nuclear flattening increases c-Jun phosphorylation and YAP nuclear translocation, leading to transcriptional induction of AP1 and TEAD-target genes. Surprisingly, we found that nuclear compression is necessary and sufficient to mediate c-Jun and YAP activation in response to cell- generated contractility or cell spreading. We additionally observed that nuclear flattening occurs during the cell cycle and promotes proliferation via TEAD and AP1- dependent G1 to S progression., La forme du noyau peut varier significativement au cours du développement ou lors de processus pathologiques en raison des forces mécaniques émanant du microenvironnement ou générées par le cytosquelette. L’impact de la morphologie nucléaire sur la machinerie transcriptionnelle n’est cependant pas connu. En utilisant plusieurs approches afin de manipuler la morphologie nucléaire, nous avons observé que des changements de forme de l’enveloppe nucléaire régulent l’activité de AP1 et TEAD. Nous avons montré que l’aplatissement du noyau augmente la phosphorylation de c-Jun et la translocation de YAP, conduisant à une augmentation de la transcription des gènes cibles de AP1 et TEAD. Nous avons également observé que l’aplatissement du noyau se produit au cours du cycle cellulaire et favorise la prolifération via l’activation de TEAD et AP1 qui stimulent la progression de la phase G1 à la phase S.

Spermatogenesis, the process of producing male gametes, represents a relevant physiological model for the study of chromatin dynamics. Indeed, a drastic reorganization of the genome is observed at the end of spermatogenesis, during post-meiotic stages of the development of the male germ cells. These reorganizations are intended both to compact the genome to protect it before and during fertilization and to establish a specific male epigenome necessary for early embryonic development. In spermatozoa, during these post-meiotic stages, chromatin is completely reorganized so that the protamines replace the histones. This reorganization is initiated by a wave of genome-wide histone acetylation, followed by massive replacement of histones by small basic proteins, transition proteins and protamines. The molecular mechanisms responsible for this reorganization of the genome remain very poorly known today. My thesis aims to explore these mechanisms by using gene inactivation in mouse of epigenetic actors specifically expressed in post-meiotic germ cells : the nuclear factor Nut (Nuclear protein in Testis) and the histone H2A variant, H2A.L.2. We have demonstrated that the Nut protein interacts and stimulates the p300 acetyltransferase activity and induces the hyperacetylation of histone H4 precisely on the lysine residues at 5 and 8 positions. This acetylation is necessary for the interaction with the first bromodomain of Brdt initiating the process of histone replacement by protamines. Thus, the Nut factor is the main element of the histone acetylation wave. We have also deciphered the crucial role of H2A.L.2 in the “opening ” of nucleosomal structures in post-meiotic germ cells thus allowing its invasion by the transition proteins. These transition proteins will in turn generate a platform for the recruitment and maturation of protamines and induce the formation of transient structures before the final compaction of the mature sperm genome. These studies allowed us to establish for the first time a coherent molecular model for understanding the post-meiotic epigenetic programming of the male genome and its impact on male fertility.; La spermatogénèse, processus de production des gamètes mâles, représente un modèle physiologique pertinent pour l’étude de la dynamique de la chromatine. En effet, une réorganisation drastique du génome est observée en fin de spermatogénèse, lors des étapes post-méiotiques du développement de la lignée germinale mâle. Ces réorganisations visent d’une part à compacter le génome afin de le protéger avant et lors de la fécondation et d’autre part à établir un épigénome mâle spécifique nécessaire pour le développement embryonnaire précoce. La chromatine organisée en nucléosomes est alors totalement remaniée de manière à ce que les protamines remplacent les histones dans les spermatozoïdes. Cette réorganisation est initiée par une vague d’acétylation des histones à l’échelle du génome, suivie par un remplacement massif des histones par de petites protéines basiques, les protéines de transition et les protamines. Les mécanismes moléculaires responsables de cette réorganisation de la chromatine sont très mal connus. Mon travail de thèse vise à explorer ces mécanismes en utilisant une approche d’invalidation de gènes chez la souris correspondant à des acteurs épigénétiques exprimés spécifiquement en post-méiose : le facteur nucléaire Nut (Nuclear protein in Testis) et le variant de l’histone H2A, H2A.L.2. Nous avons démontré que la protéine Nut recrute l’acétyltransferase p300 et induit l’hyperacétylation de l’histone H4 précisément au niveau des résidus lysines en position 5 et 8. Cette acétylation est nécessaire à l’interaction avec le premier bromodomaine de Brdt initiant le processus de remplacement des histones par les protamines. Ainsi, le facteur Nut est l’élément majeur de la vague d’acétylation des histones. Nous avons également mis en évidence le rôle crucial de H2A.L.2 dans “ l’ouverture ” de la structure du nucléosome permettant ainsi son invasion par les protéines de transition. Ces protéines vont à leur tour générer une plateforme pour le recrutement et la maturation des protamines et induire la formation de structures transitoires avant l’étape de compaction finale du génome des spermatozoïdes matures. Ces études nous ont ainsi permis d’établir pour la première fois un modèle moléculaire cohérent permettant de comprendre la programmation épigénétique post-méiotique du génome mâle et son impact sur la fertilité masculine.

In vivo preclinical imaging in oncology is a tool of choice to study the mechanisms thatgovern this pathology as well as for the evaluation of innovative diagnostic and therapeuticsolutions. Each imaging modality has its own strengths and limitations and that’s why thereis a real benefit to combine several modalities to collect complementary information. In thefirst part of this work, the combination of 3-D fluorescence imaging with microCT imaginghas been implemented and has been particularly relevant for the characterization ofdifferent animal models of lung cancer mimicking one or several stages from primary tumordevelopment to metastatic invasion. In a second part, we assessed the potential ofphotoacoustic imaging for non-invasive imaging of vascularization and tissue oxygenation indifferent pathophysiological contexts in mice as well as in humans, thus demonstrating itshigh translational potential. Fluorescent and photoacoustic contrast agents have been usedto increase tumor contrast and monitor changes in the level of expression of biomarkers ofinterest and the benefit provided by the use of a tumor specific marker has beendemonstrated. In parallel with biological studies, technological developments inphotoacoustic imaging have been initiated in order to improve the application potential ofthis imaging modality.; L’imagerie préclinique in vivo en oncologie représente un outil de choix pour étudier lesmécanismes qui régissent cette pathologie mais également pour évaluer des solutionsdiagnostiques et thérapeutiques innovantes. Chaque modalité d’imagerie possède sespropres atouts et limites et c’est pourquoi il existe un réel bénéfice à associer plusieursmodalités pour recueillir des informations complémentaires. Dans la première partie de cetravail, la combinaison de l’imagerie de fluorescence 3-D avec l’imagerie microCT a été miseen oeuvre et s’est montrée particulièrement pertinente pour la caractérisation de différentsmodèles animaux de cancers pulmonaires représentant chacun spécifiquement une ouplusieurs étapes du développement tumoral primaire à l’invasion métastatique. Dans uneseconde partie, nous avons évalué le potentiel de l’imagerie photoacoustique pourl’imagerie non-invasive de la vascularisation et de l’oxygénation tissulaire dans différentscontextes physiopathologiques chez la souris ainsi que chez l’homme, démontrant ainsi sonfort potentiel translationnel. Des agents de contrastes fluorescents et photoacoustiques ontété utilisés pour augmenter le contraste tumoral et suivre les variations de niveaud’expression de biomarqueurs d’intérêt et le bénéfice apporté par l’utilisation d’unmarqueur présentant une spécificité tumorale a été démontré. En parallèle des étudesbiologiques, des développements technologiques en imagerie photoacoustique ont étéinitiés en vue d’améliorer le potentiel applicatif de cette modalité d’imagerie.

International audience; Les microtubules sont des fibres du cytosquelette formées par l’assemblage d’hétérodimères d’α- et de β-tubuline. Ils contribuent à l’établissement de la forme des cellules et de leur polarité, ainsi qu’à leur mobilité. Ils jouent aussi un rôle important dans le transport intracellulaire et dans la division cellulaire. Le réseau microtubulaire s’adapte constamment aux besoins de la cellule. Il peut être constitué de microtubules très dynamiques ou d’autres plus stables. Pour moduler dans l’espace et le temps les différentes fonctions de ces fibres, de nombreuses modifications post-traductionnelles réversibles de la tubuline sont mises en jeu, à l’origine de ce qui est maintenant appelé le « code tubuline ». Dans cette revue, nous nous intéresserons au rôle de deux modifications caractéristiques des microtubules stables : l’acétylation et la détyrosination de l’α-tubuline. Nous discuterons également de l’implication de leur dérégulation dans certaines pathologies.

An early hallmark of Toxoplasma gondii infection is the rapid control of the parasite population by a potent multifaceted innate immune response that engages resident and homing immune cells along with pro- and counter-inflammatory cytokines. In this context, IFN-γ activates a variety of T. gondii–targeting activities in immune and nonimmune cells but can also con- tribute to host immune pathology. T. gondii has evolved mechanisms to timely counteract the host IFN-γ defenses by interfering with the transcription of IFN-γ–stimulated genes. We now have identified TgIST (T. gondii inhibitor of STAT1 transcriptional activity) as a critical molecular switch that is secreted by intracellular parasites and traffics to the host cell nucleus where it inhibits STAT1-dependent proinflammatory gene expression. We show that TgIST not only sequesters STAT1 on dedicated loci but also promotes shaping of a nonpermissive chromatin through its capacity to recruit the nucleosome remodeling deacetylase (NuRD) transcriptional repressor. We found that during mice acute infection, TgIST-deficient parasites are rapidly eliminated by the homing Gr1+ inflammatory monocytes, thus highlighting the protective role of TgIST against IFN-γ–mediated killing. By uncovering TgIST functions, this study brings novel evidence on how T. gondii has devised a molecular weapon of choice to take control over a ubiquitous immune gene expression mechanism in metazoans, as a way to promote long-term parasitism.; Une caractéristique majeure de l’infection par Toxoplasma gondii est le contrôle rapide de la population parasitaire par une réponse immunitaire engageant des cellules résidentes et recrutées ainsi que des cytokines pro- et anti-inflammatoire. Dans ce contexte, l’IFNγ active une multitude d’activité anti- T. gondii des cellules immunes et non-immunes, mais peut aussi contribuer à l’immunopathologie. T. gondii a élaboré des mécanismes pour contrer les défenses de l’hôte en interférant avec la transcription des gènes stimulés par l’IFNγ. Nous avons identifié TgIST (T. gondii inhibitor of STAT1 transcriptional activity) comme un interrupteur moléculaire exporté par les parasites intracellulaires et qui est localisé dans le noyau des cellules hôtes, où il inhibe l’expression des gènes pro-inflammatoires dépendants de STAT1. Nous avons montré que TgIST séquestre STAT1 à des sites spécifiques, et promeut la formation de chromatine non permissive grâce à sa capacité à recruter le remodeleur chromatinien NuRD. Nous avons montré que durant l’infection aiguë en souris, les parasites déficients pour TgIST sont rapidement éliminés par les monocytes pro-inflammatoires GR1+, ce qui montre le rôle protecteur de TgIST contre les défenses médiées par l’IFNγ. En révélant les fonctions de TgIST, cette étude montre de nouvelles évidences sur la façon dont T.gondii a élaboré une arme moléculaire de choix pour prendre le contrôle sur la réponse immune, de façon à promouvoir le parasitisme à long terme

International audience

Identifying what is a driver oncogene and developping small molecules that are able to targetits activity led to drastic changes in NSCLC treatments. EGFR is a transmembrane receptorwith Tyrosine Kinase (TK) activity allowing signal transmission from the environment towardsthe inner of the cell by signaling pathways activation. Among those signaling pathways arefound survival and proliferation pathways. Activating mutations make EGFR a driver onco-gene, which was the first protein to be identified as such. Hence numerous chemical compoundtargeting mutated EGFR (EGFR-TKI, gefitinib) have been developped. Their use in clinicsrepresent a huge improvement for patients care. However resistance mechanisms ultimatelyoccur. Transcriptomic analyses of acquired resistant models to EGFR-TKI have shown thattheir RNA transcripts expression is abnormal. Moreover results from the team have demons-trated that SR proteins (splicing factor) expression is deregulated in NSCLC. Based on thoseresults we hypothesized that SRSF2 mediated alternative splicing of mRNA could be involvedin resistance mechanims acquired by lung carcinoma in response to EGFR-TKIThe lab developped resistant clones by chronic exposure to gefitinib of EGFR mutated lungadenocarcinoma cellular models.We first observed the accumulation of the expression of SRSF2 protein in resistant clonescompared to the sensitive cell line. Secondly, sensitivity to gefitinib induced apoptosis of twoclones was resored when neutralising SRSF2. A RNA-seq analysis led us to identify Atg16L1 aspotentially being involved in the SRSF2-mediated sensitization to gefitinib-induced apoptosis.SRSF2 neutralisation modulates Atg16L1 splicing in response to gefitinib. Neutralisation ofExon 8 containing transcripts of Atg16L1 sensitizes resistant clones to gefitinib induced apop-tosis. This alternative splicing switch modulates autophagic activity of the cells in reponseto gefitinib. We have shown that exon8 containing transcripts favor autophagy inhibition inreponse to gefitinib. This work emphasize the role of Atg16L1 alternative splicing switch ofexon8 in autophagy inhibition and its correlation with a resistant phenotype in response toEGFR-TKI. SRSF2 may participate in the modulation of this alternative splicing switch inreponse to gefitinib., L’identification de la notion de driver oncogene et le développement de molécules capables de cibler leur activité a entrainé d’importants changements dans le traitement des cancers CBNPC.L’EGFR est un récepteur transmembranaire à activité TK (Tyrosine Kinase) permettant latransmission de signaux extracellulaires jusqu’au sein de la cellule grâce à l’activation de voies de signalisations. Parmis ces voies de signalisation on retrouve les voies de prolifération et de survie cellulaire. Des mutations activatrices dans le domaine TK confèrent à ce dernier un rôle de driver oncogene. Dans ce domaine l’EGFR a joué un rôle avant gardiste. Ainsi de nombreuses molécules ciblant l’activité de l’EGFR muté (EGFR-TKI, gefitinib) ont été développées. L’utilisation de ces molécules en clinique a représenté une vraie révolution dans la prise en charge des patients. Cependant ces derniers développent inéluctablement des mécanismes de résistance. L’analyse transcriptomique de modèles ayant acquis une résistance aux EGFR-TKI a mis en évidence une dérégulation de l’expression des transcrits. Par ailleurs des résultats del’équipe ont montré que l’expression des protéines SR (facteurs d’épissage impliqués dans la régulation de nombreux transcrits) était dérégulée dans les CBNPC. Sur la base de ces résultats nous avons émis l’hypothèse que l’épissage alternatif des transcrits médié par les protéines SR pourrait jouer un rôle dans la résistance acquise par les tumeurs pulmonaires en réponse aux EGFR-TKI.Au sein du laboratoire des clones résistants ont été générés après exposition chroniqueau gefitinib de modèles cellulaires d’adénocarcinomes pulmonaires exprimant une mutation activatrice de l’EGFR.Nous avons tout d’abord mis en évidence une accumulation de l’expression de SRSF2 dans les clones résistants comparativement à la lignée sensible. Dans deux clones résistants au gefitinib, issus de la lignée d’adénocarcinome pulmonaire sensible PC9 exprimant un EGFR mutant Del19, nous montrons que la neutralisation de la protéine SRSF2 sensibilise les clones à l’apoptose induite par le gefitinib. Une analyse RNA-seq nous a permis d’identifier Atg16L1 comme un acteur potentiel de la resensibilisation à l’apoptose médiée par SRSF2. La neutralisation de SRSF2 entraine une modulation de l’épissage de l’exon8 de la protéine Atg16L1 en réponse à un traitement au gefitinib. Et la neutralisation de l’expression des transcrits ARN d’ATG16L1 comportant l’exon8 sensibilise les clones résistant à l’apoptose induite par le gefitinib. Ce switch d’épissage entraine une modulation de l’activité autophagique des cellules en réponse au gefitinib. Nous montrons qu’une expression majoritaire des transcrits comportant l’exon 8 favorise une inhibition de l’autophagie en réponse au gefitinib. De plus les modèlesrésistants pour lesquels on observait une resensibilisation à l’apoptose suite à une neutralisation des transcrits contenant l’exon 8, conservent leur phénotype de résistance lorsque dans ces mêmes conditions l’activité autophagique est inhibée. L’ensemble de ces travaux met en avant l’existence d’un switch d’épissage de la protéine Atg16L1 au niveau de son exon 8 contribuant à une inactivation de l’autophagie corrélée avec un phénotype de résistance à l’apoptose en réponse à un traitement par EGFR-TKI. Enfin SRSF2 participerait à la modulation de cet épissage en réponse à un traitement au gefitinib.

Mass cytometry (CMM) has revolutionized the study of cell and phenotypic diversity, significantly increasing the number of markers that can be analyzed simultaneously (41 to date). By making it possible to precisely define the state of the lymphocyte populations, particularly regarding their differentiation, activation and entry into the cell cycle, the CMM has revealed small subsets so far unknown. In this study, the CMM was used to try to better characterize the HIV’s reservoirs. With the introduction in 1996 of Combined Antiretroviral Therapy (ART), HIV infection has shifted from a fatal destiny to a manageable chronic disease with a normal life span through a reduction in active viral replication (the amount of virus is below optimal detection limits). However, if treatment is interrupted, the viral load increases again in the patient due to viable provirus reservoirs located in long-lived cell populations that cannot be eliminated by current treatments. These reservoirs constitute a major obstacle to the eradication of HIV. The best characterized reservoir is that of CD4+ T cells and is mainly hosted in TCM, TTM, TSCM and Tfh. A first study allowed us to evaluate the stages of the cell cycle in association with markers of differentiation, activation and exhaustion, leading to a thorough assessment of the quiescent state of CD4 T cells likely to harbour latent reservoirs of HIV. This broad multiplex analysis demonstrates that some subsets of LTCD4+CD25-HLA-DR- classically considered "at rest" – do actually contain significant amounts of cells in cycling or expressing inhibitory receptors, opening new pathways for redefining CD4 T quiescent cells from peripheral blood. A second study aimed to define CD4+ T Cells populations producing HIV in vivo. We have developed a multiparametric analysis on cells of HIV+ patients under ART and in therapeutic interruption phase (ATI). This study shows that CD3+CD4+CD32high cells express a high level of activation markers and receive important activation signals via cytokines, unlike CD32a- cells. On the other hand, the analysis of HIV-producing LTCD4+ (expressing the p24 capsid protein), allowed us to detect a very small number of p24+ positive cells (less than 0.004% in ATI phase but none before). The phenotype of the producing cells was then highlighted. These are T lymphocytes that do not express CD8, enriched with a factor 4 in TSCM cells, and a factor 2 in TFH. These populations are highly enriched in activated cells co-expressing 3 activation markers (increased by a factor of 20) and are in cycle (Ki67+) and/or over-express immune control molecules (ICPs) with an enrichment of a factor of 500. This allows us to detect producing cells with much higher frequencies in these TCD3+CD8- populations in cycles up to 0.08%, and in G2 phase (2.46%), but also in cells with poly-expression of 4 immune-checkpoints (2.27%). The advent of mass cytometry has exponentially increased the information we could get on a cell. Thanks to this tool, cell cycle identification, in correlation with different phenotypic markers, makes possible the exploration of previously inaccessible information, including the analysis of latent and productive reservoirs of HIV. This work enables us to characterize as precisely as possible these HIV-producing cells, but also the latent cells, and potentially reservoirs of the virus.; La cytométrie de masse CMM) a révolutionné l'étude de la diversité cellulaire et phénotypique, en augmentant de manière significative le nombre de marqueurs pouvant être analysés simultanément (41 à ce jour). En permettant de définir précisément l'état des populations de lymphocytes, notamment en ce qui concerne leur différenciation, activation et leur entrée dans le cycle cellulaire, la CMM a mis au jour de petits sous-ensembles jusqu'ici inconnus. Dans cette étude, la CMM a été utilisée pour tenter de mieux caractériser les réservoirs du VIH. Avec l'introduction de la thérapie antirétrovirale combinée (ART) en 1996, l'infection par le VIH est passée d'un destin fatal à une maladie chronique gérable avec une durée de vie normale grâce à une réduction de la réplication virale active (la quantité de virus est en deçà des limites de détection optimales). Cependant, si le traitement est interrompu, la charge virale chez le patient augmente à nouveau du fait des réservoirs de provirus viables localisés dans des populations de cellules à longue durée de vie et qui ne peuvent pas être éliminées par les traitements actuels. Ces cellules infectées réservoirs constituent un obstacle majeur à l'éradication du VIH. Le réservoir le mieux caractérisé est celui des lymphocytes T CD4+ et est principalement hébergé dans les TCM, les TTM, les TSCM et les Tfh. Une première étude nous a permis d’évaluer les stades du cycle cellulaire en association à des marqueurs de différenciation, d'activation et d'épuisement, pour aboutir à une évaluation poussée de l'état de quiescence des lymphocytes T CD4 susceptibles d’abriter les réservoirs latents de VIH. Cette large analyse multiplexe démontre que certains sous-ensembles des LTCD4+CD25-HLA-DR- classiquement considérés "au repos"- contiennent en fait des quantités notables de cellules en cycle ou exprimant des récepteurs inhibiteurs, ouvrant de nouvelles voies pour une redéfinition des cellules T CD4 quiescentes du sang périphérique. Une deuxième étude avait pour but de définir les populations de LT CD4 produisant du VIH in vivo. Nous avons développé une analyse multiparamétrique sur des cellules de patients VIH+ sous ART et en phase d’interruption thérapeutique (ATI). Cette étude met en évidence que les cellules CD3+CD4+CD32high expriment un fort taux de marqueurs d’activation et reçoivent d’importants signaux d’activation via des cytokines, à l'inverse des cellules CD32a-. D'autre part, l'analyse des LTCD4+ producteurs de VIH (exprimant la protéine de capside p24), nous a permis de détecter un très faible nombre de cellules positives p24+ (inférieur à 0,004% en phase d’ATI mais aucun avant). Le phénotype des cellules productrices a ensuite été mis en évidence. Il s’agit de lymphocytes T n’exprimant pas de CD8, enrichis d’un facteur 4 en cellules TSCM, et d'un facteur 2 en TFH. Ces populations sont très enrichies en cellules activées co-exprimant 3 marqueurs d’activation (augmentés d’un facteur 20) et sont en cycle (Ki67+) et/ou sur-expriment des molécules de contrôle immunitaire (ICP) avec un enrichissement d’un facteur 500. Ceci nous permet de détecter des cellules productrices avec des fréquences beaucoup plus élevées dans ces populations TCD3+CD8- en cycle à hauteur de 0,08%, et en phase G2 (2,46%), mais également dans les cellules présentant une poly-expression des 4 immune-checkpoints (2,27%). L’avènement de la cytométrie de masse a augmenté de façon exponentielle les informations que nous pouvions obtenir sur une cellule. Grâce à cet outil, l’identification du cycle cellulaire, en corrélation avec différents marqueurs phénotypiques, permet d’explorer des informations jusque-là inaccessibles, entre autre l’analyse des réservoirs latents et productif du VIH. Ce travail permet ainsi de caractériser le plus précisément possible ces cellules productrices de VIH, mais aussi les cellules latentes, et potentiellement réservoirs du virus.

Infertility is currently considered by the World Health Organization (WHO) as a major health concern affecting more than 50 million couples worldwide. In western countries, the majority of infertile couples seek assisted reproductive technologies (ART) to achieve a pregnancy. Despite the success of these techniques, almost half of these couples fail to obtain a child. Part of these failures are explained by the alteration of gametogenesis. In humans, spermatogenesis involves hundreds of genes specifically expressed in the testis. The abundance of these genes suggests that spermatogenic defects are associated with a strong genetic component. Recently, technical advances have led to the identification of numerous causative genes, but the vast majority of male infertility cases remain idiopathic. The aim of the present thesis is to identify new genetic causes responsible for male infertility and to elucidate the physiopathological mechanisms associated with these anomalies.During my thesis, I participated with the team GETI (genetics, epigenetics and therapies of infertility) in the genetic exploration of two phenotypes of male infertility related to post-meiotic defects of spermatogenesis: a rare form of non-obstructive azoospermia and the phenotype of multiple morphological abnormalities of the sperm flagella (MMAF). I have also played a key role in creation and analysis of transgenic mice to better characterize the pathogeny of the identified genetic causes in Human.Genetic analyses performed on two infertile brothers born form consanguineous parents and presenting an-idiopathic non-obstructive azoospermia associated with a post-meiotic arrest of spermatogenesis allowed us to identify a homozygous variant in the SPINK2 gene that encodes a serine-protease inhibitor. Phenotypic analysis of Spink2-/- adult male mice showed that they are infertile and perfectly mimic the sperm and testicular phenotypes observed in our patients. We showed that Spink2 protein is expressed from the round spermatid stage and localized in the acrosome, a lysosomal-like vesicle rich in proteases that play a key role during fertilization. When Spink2 is absent, the deregulated proteolytic activity of the targeted proteases such as acrosin leads to the fragmentation of the Golgi apparatus and arrest of spermiogenesis at the round spermatid stage. We also showed that sperm from heterozygous human and mice present a high level of morphological abnormalities and a decrease of progressive motility leading to a variable subfertility. These results showed for the first time that oligo-teratozoospermia and azoospermia could present a pathological continuum due to the same pathogeny.We also performed exome sequencing in a cohort of 78 non related MMAF subjects and identified in 49 cases deleterious bi-allelic mutations in a total of 11 candidate genes including DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 and FSIP2 giving a genetic diagnosis yield of 63%. These results confirm the genetic heterogeneity of MMAF and the efficiency of high throughput sequencing in genetic exploration of this phenotype. We also demonstrated the pathogenic implication of certain candidate genes (n=4) using knock-out mice created by the new technology of genome editing, CRISPR/Cas9.Overall, this work demonstrates the interest and effectiveness of combining exome sequencing and CRISPR/Cas9 system to study spermatogenesis disorders and male infertility., L’infertilité est considérée actuellement par l’organisation mondiale de la santé (OMS) comme une préoccupation majeure de santé affectant plus de 50 millions de couples dans le monde. Dans les pays occidentaux, la majorité des couples infertiles ont recours aux techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP) pour obtenir une grossesse. Malgré le succès de ces techniques, près de la moitié des couples qui ont recours à l’AMP sortent du parcours de soin sans enfant. Une partie de ces échecs est expliquée par l’altération de la gamétogenèse. Chez l’homme, la spermatogenèse fait interagir des centaines de gènes spécifiquement exprimés dans le testicule. L’abondance de ces gènes suggère que les troubles de la spermatogenèse présentent une forte composante génétique. Récemment, les avancées techniques ont favorisé l’identification de gènes responsables de ces anomalies mais la grande majorité des cas d’infertilité masculine reste classée comme idiopathique. L’objectif de la thèse est d’identifier de nouvelles causes génétiques responsables d’infertilité masculine et d’élucider les mécanismes physiopathologiques associés à ces anomalies.Au cours de ma thèse j’ai participé avec l’équipe GETI (génétique, épigénétique et thérapies de l’infertilité) à l’exploration génétique et moléculaire de deux phénotypes distincts d’anomalies spermatiques liés à des défauts post-méiotiques de la spermatogenèse : une forme rare d’azoospermie non obstructive (ANO) et le phénotype d’anomalies morphologiques multiples du flagelle spermatique (AMMF). Enfin j’ai joué un rôle important dans la création et l’analyse de modèles murins pour caractériser la pathogénie de ces anomalies.L’analyse génétique de deux frères infertiles nés de parents consanguins et présentant une ANO idiopathique associée à un arrêt post-méiotique de la spermatogenèse nous a permis d’identifier un variant homozygote délétère dans le gène SPINK2 qui code pour un inhibiteur de sérine-protéases. L’étude des souris KO pour ce gène nous a permis d’observer que les souris mâles adultes sont infertiles et miment parfaitement les phénotypes spermatique et testiculaire observés chez nos patients. Nous avons montré que la protéine codée par ce gène est exprimée dans l’acrosome à partir du stade de spermatide ronde. En l’absence de Spink2, l’activité protéolytique non-neutralisée des protéases cibles qui transitent par le Golgi cause sa fragmentation et bloque la spermiogénèse au stade de spermatide ronde. Nous avons également pu observer que les spermatozoïdes provenant de patients et de souris hétérozygotes présentent un taux élevé d’anomalies morphologiques et une baisse de la mobilité progressive conduisant à une hypofertilité à expressivité variable. Ces résultats montrent pour la première fois que l’oligo-tératozoospermie et l’azoospermie peuvent constituer un continuum pathologique dû à une même pathogénie.Nous avons également réalisé le séquençage exomique complet d’une cohorte de 78 individus AMMF non apparentés et avons identifié chez 49 sujets des mutations bi-alléliques délétères dans 11 gènes candidats dont DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 et FSIP2, soit un rendement diagnostique de 63%. Ces résultats confirment l’hétérogénéité génétique du phénotype MMAF et l’efficacité diagnostique du séquençage haut débit dans son exploration. Nous avons également validé l’implication de certains gènes candidats (n=4) dans ce phénotype chez le modèle murin knock-out créé par la nouvelle technologie d’édition du génome, CRISPR/Cas9.Dans son ensemble, ce travail montre l’intérêt et l’efficacité de la combinaison du séquençage exomique et de la technique de CRISPR/Cas9 pour étudier les troubles de la spermatogenèse et l’infertilité masculine.

Toute perturbation de la mobilité des spermatozoïdes a un fort impact sur la fécondation etpeut conduire à une sous-fertilité ou infertilité. Des efforts importants ont donc été faits pouridentifier des composés pharmacologiques susceptibles de moduler la mobilité desspermatozoïdes. Les composés activateurs sont particulièrement utiles en azoospermie pouraméliorer l'extraction des spermatozoïdes testiculaires et dans le domaine de lacryoconservation car la mobilité des spermatozoïdes congelés-dégelés est réduite. L’étudeprésentée dans ce manuscrit s’attache plus particulièrement à l’identification d’un composéoriginal, à partir d'une bibliothèque de venins, capable d'améliorer la mobilité desspermatozoïdes de mammifères, y compris chez l'homme. Nous avons d'abord identifié dansle venin d'un scorpion S. m. palmatus un peptide de 73 acides aminés et riche en disulfurecapable d'activer puissamment la mobilité des spermatozoïdes. Nous avons ensuite purifié etcaractérisé ce peptide responsable par chromatographie liquide, spectrométrie de masse etsynthèse peptidique. Enfin, la puissance et la toxicité des versions purifiée et synthétique ducomposé identifié sur la motilité des spermatozoïdes ont été évaluées à l'aide de différentstests in vitro chez différentes espèces de mammifères. Nous avons observé que la puissancedu peptide était plus élevée sur les spermatozoïdes éjaculés frais avec une faible motilité,obtenant une augmentation de 100% de la vitesse curviligne dans les spermatozoïdes peuperformants. Nous avons également démontré que le peptide est efficace sur l'épididyme fraisdes bovins et des souris, l'éjaculation congelée des bovins et les spermatozoïdes frais destesticules de primates non humains.Ce manuscrit évoque également brièvement les travaux réalisés durant ce diplôme sur uncomposé inhibant la mobilité dont l’utilisation permettrait d’élargir la fenêtre de fécondationoptimale en insémination artificielle en retardant le phénomène de capacitation duspermatozoïde.

Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by clonal expansion of leukemic(s) cell(s) blocked at an early stage of maturation. Despite therapeutic advances, their prognosis remains poor and therapeutic improvements are needed. In AML, reactive oxygen species (ROS) are considered to contribute to leukemogenesis and, on the opposite, standard chemotherapies exert cytotoxicity via ROS. In addition, the redox balance acts on metabolic dysregulation in AML and depends on many regulators, such as S100A8 protein, associated with worst prognostic in AML and known to stimulate NADPH oxidase.In this context, this work focuses on oxidative disorders, and S100A8 expression in bone marrow microenvironment according to clinical-biological characteristics and evaluate their prognostic impact in AML. In addition, we investigated the impact of exogenous S100A8 on ROS production, mitochondrial respiration, and metabolism in leukemia cell lines.In a cohort of 84 de novo AML at diagnosis, we demonstrate the existence of redox balance disorders on leukemic cells, on normal cells from bone marrow microenvironment, and on antioxidant systems (SOD, GPX, glutathione ...). In addition, ROS production observed in response to mitochondrial modulators indirectly reflects mitochondrial functionality plays a prognostic role independent of the current prognostic factors. The analysis of S100A8 in bone marrow plasmas shows a higher expression in AML than in healthy controls or other hematological neoplasms. This hyperexpression is predominantly of monocytic origin and is associated with molecular abnormalities of good prognosis such as (inv (16), NPM1) or with a subgroup of mutated FLT3-ITD patients with better survival. Finally, the study of S100A8 on leukemia cell lines highlights its heterogeneous effect on cell growth, apoptosis, ROS production and on NOX regulation. Furthermore, we observe a S100A8-phosphocholine change which remains to be explored.In conclusion, this work provides original information on bio-energetic balance in AML and their prognostic impacts, emphasizing that these metabolic alterations impact AML prognosis through complex interactions.; Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) sont caractérisées par une expansion clonale de cellule(s) souche(s) leucémique(s) bloquée à un stade précoce de maturation. Malgré les avancées thérapeutiques, leur pronostic reste sombre et des progrès thérapeutiques doivent encore être réalisés. Dans les LAM, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont considérées comme, d’une part, participant à la leucémogenèse et, d’autre part, comme hautement impliquées dans la sensibilité aux chimiothérapies conventionnelles. Par ailleurs, l’équilibre redox qui participe aux dérégulations métaboliques associées au processus leucémique, dépend de nombreux régulateurs, dont la protéine S100A8, protéine connue pour son action stimulatrice sur la NADPH oxydase et sa valeur pronostique dans les LAM.Ce travail s’est donc intéressé à la caractérisation des désordres oxydatifs dans les LAM afin d’évaluer leur impact clinico-biologique, et d’autre part au rôle de la sécrétion de la S100A8 dans le microenvironnement médullaire. De plus, à partir de lignées leucémiques, nous avons étudié l’impact de la S100A8 exogène sur la production de ROS, la respiration mitochondriale et le métabolome des cellules blastiques.A partir d’une cohorte de 84 patients atteints de LAM de novo au diagnostic, nous avons mis en évidence des désordres de l’équilibre redox à la fois dans les cellules leucémiques, dans les cellules normales de l’environnement médullaire ainsi que sur les systèmes régulateurs antioxydants (SOD, GPX, glutathion…). De plus, nous avons montré que la production des ROS observée en réponse à des modulateurs de la mitochondrie, qui reflète indirectement la fonctionnalité mitochondriale, joue un rôle pronostique indépendant des facteurs pronostiques habituels. L’analyse de la S100A8 dans les plasmas médullaires montre une expression augmentée dans les LAM, d’origine monocytaire majoritairement et est associée à des anomalies moléculaires de bon pronostic (inv(16), NPM1) ou un sous-groupe de patients FLT3-ITD mutés présentant une meilleure survie. Enfin, l’étude de la S100A8 sur les lignées leucémiques a permis de mettre en évidence la diversité de ses effets sur la croissance cellulaire, l’apoptose, la production de ROS ainsi qu’une variation métabolique de la phosphocholine dont les mécanismes restent à explorer.En conclusion, mon travail apporte des éléments originaux sur les particularités de l’équilibre bio-énergétique dans les LAM. Il souligne, que l’impact de ses dérégulations sur le pronostic des patients résulte de la combinaison d’un ensemble de facteurs métaboliques, qui doivent être appréhender dans leur globalité pour une meilleure efficacité thérapeutique.

La détection précoce est un enjeu de taille dans le traitement des cancers. Elle permettrait une prise encharge plus rapide et une thérapie plus efficace.Une des approches pour améliorer la détection précoce est l’imagerie optique et le ciblage derécepteurs tumoraux comme l'intégrine αvβ3 qui est un des récepteurs les plus couramment utilisé pourl’imagerie optique in vivo et le ciblage tumoral. Ce récepteur est largement exprimé en surface descellules endothéliales des néo-vaisseaux tumoraux et de certains types de cellules tumorales y comprisdes VADS.Le «RAFT-c[RGD]4» (Regioselectively Addressable Functionalized Template-arginineglycineasparticacid) est une molécule qui cible l'intégrine αvβ3 sur les néo vaisseaux et les cellulestumorales. Il est un bon outil de ciblage tumoral.Dans la cadre de ce travail de recherche, nous avons étudié l’apport de la présentation multivalente duRAFT-c[RGD]4 sur le ciblage de l’intégrine αvβ3.Dans une approche thérapeutique nous avons également étudié l’efficacité d’une nanoparticuleradiossensibilisante, la nanoparticule AGuIX®. La radiothérapie est l’un des modalités référence dansle traitement du cancer, cependant elle présente des limites ; irradiation des tissus sains, effetssecondaires.