Search

Proteins fulfill numerous functions mandatory to the growth and the survival of living organisms. The study of those proteins is paramount in order to understand biological mechanisms inside the cells. The most widely used technique to characterize proteins is tandem mass spectrometry, whichproduces tens of thousands of experimental mass spectra per analysis. To interpret those spectra -which leads to finding and characterizing the proteins from the analyzed mixture- the most common methodology consists in comparing them to a data-base that can contain hundreds of thousands of "model" spectra. To speed up the analysis, the majority of the approaches reduce the number of comparisons, a limitation supposed to be the cause of identification difficulties. Indeed, the output of a mass spectrometry analysis nowadays still exhibit 50 to 75% of unidentified spectra.In order to solve this problem, we conceived a method to interpret mass spectra without filtering the database. This method relies on a specific datastructure, SpecTrees, which allows a compact representation of the number of shared masses between each pair of spectra, alongside algorithms manipulating efficiently the information contained in this datastructure. Altogether, the datastructure and algorithms compose SpecOMS,a software available to the community. We discuss the use of different parameters for our method and compare it to another efficient algorithm., Les protéines remplissent de nombreuses fonctions indispensables au développement et à la survie des organismes vivants. Leur étude est primordiale pour comprendre les mécanismes biologiques au sein des cellules. La technique la plus utilisée pour caractériser les protéines est la spectrométrie de masse en tandem qui produit des dizaines de milliers de spectres expérimentaux par analyse. Pour interpréter ces spectres –c’est-à-dire retrouver et caractériser les protéines présentes dans le mélange analysé– la méthode la plus courante consiste à les comparer à une banque pouvant contenir des centaines de milliers de spectres "modèles". Pour accélérer l’analyse, la majorité des approches limitent le nombre de comparaisons, limitation suspectée à l’origine de difficultés d’identification. En effet, à l’issue d’une expérience de spectrométrie de masse, 50 à 75% des spectres demeurent aujourd’hui non identifiés. Pour résoudre ces difficultés, nous avons conçu une méthode pour interpréter les spectres de masse sans filtre de la banque. Cette méthode repose sur une structure de données SpecTrees qui permet une représentation compacte dunombre de masses partagées entre chaque paire de spectres, et sur des algorithmes qui manipulent efficacement l’information contenue dans cette structure de donnée. L’ensemble constitue le logiciel SpecOMS diffusé à la communauté. Nous discutons l’usage des différents paramètres de notre méthode et la comparons à un autre algorithme performant.

Proteomics analysis corresponds to the qualitative and quantitative analysis of all proteins expressed in a cell or tissue under given conditions (proteome). Instrumental progresses in mass spectrometry and bioinformatics advances in recent years have allowed its establishment in life sciences. Diverse proteomics strategies thus allow identification and quantification of hundreds/thousands of proteins in complex samples, which classically allows physiopathological states to be characterized. However, proteomics is only emerging in the evolutionary biology field. This field aims at understanding the determinants of the diversity of organisms present on Earth and their “functioning”, including their adaptations to certain environmental constraints.The objective of this thesis was to study, from the organ to the eco-system, the proteomic variations induced by environmental changes, while adapting the different steps of the analysis to each type of sample, each organism, from sample preparation to data analysis. Through the introduction of an original quantitative de novo sequencing strategy, we studied the role of brown adipose tissue against obesity in a non-sequenced species: the vole. Other particular traits were explored, such as the reversible obesity of the grey mouse lemur or the interactions between sociality and longevity in the ant. The considered software solutions did not allow to robustly quantify peptides identified by de novo sequencing from fractionated samples, we thus determined that prefractionation allows for better proteome coverage. On the other hand, without prefractionation, de novo sequencing produces an undeniable gain. Finally, by studying the metaproteome of alpine soil biotic communities, we have highlighted the advantage of combining proteomics and genomics, in order to establish the most appropriate protein database and to “validate” proteomics data., L’analyse protéomique consiste en l’analyse qualitative et quantitative de l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule ou tissu dans des conditions données (protéome). Les progrès instrumentaux en spectrométrie de masse et les avancées bioinformatiques des dernières années ont permis d’imposer ce domaine dans les sciences de la vie. Diverses stratégies protéomiques permettent ainsi, aujourd’hui, d’identifier et quantifier plusieurs centaines/milliers de protéines dans un échantillon complexe, ce qui permet classiquement de caractériser les états physiopathologiques. En revanche, la protéomique est un outil émergent en biologie évolutive. Ce domaine vise à comprendre les déterminants de la diversité des organismes présents sur Terre et de leur « fonctionnement », notamment leurs adaptations à certaines contraintes environnementales.L’objectif de cette thèse était d’étudier, de l’organe à l’écosystème, les variations protéomiques induites par des changements environnementaux, tout en adaptant les différentes étapes de l’analyse à chaque type d’échantillons, à chaque organisme, de la préparation d’échantillons à l’analyse des données. Grâce à la mise en place d’une stratégie de séquençage de novo quantitative originale, ces travaux de thèse ont été l’occasion d’étudier le rôle du tissu adipeux brun dans la protection contre l’obésité chez le campagnol, espèce dont le génome n’est pas séquencé. D’autres traits particuliers ont été explorés, tels que l’obésité réversible du microcèbe, ou encore les interactions entre socialité et longévité chez la fourmi. Les solutions logicielles envisagées ne permettant de quantifier de manière robuste des peptides identifiés par séquençage de novo à partir d’échantillons fractionnés, nous avons ainsi établi que le préfractionnement permet d’obtenir une meilleure couverture de protéome. En revanche, sans préfractionnement, le séquençage de novo produit un gain indéniable. Enfin, en étudiant le métaprotéome de communautés biotiques des sols alpins, nous avons mis en évidence l’intérêt de combiner protéomique et génomique, afin d’établir la banque de données protéiques la plus appropriée, mais aussi pour « valider » les données protéomiques.

The major part of this PhD consists in the creation of a methodology to model biological systems. This methodology considers models based on differential equations, and uses formal methods (interval solver, verification of STL formula), analytical methods (study of stability) and numerical methods (optimization algorithm, statistical analysis). Moreover, many kind of data, like behavioral response to perturbation, or quantitative data (metabolite half-life and concentration) can be incorporated. In collaboration with a biologist team, this methodology is successfully applied to the iron homeostasis network : we study the response of the system to an iron depletion, at the intracellular level, based on specific regulatory proteins (IRP proteins). A major output of this study is insight into the level of iron cells need to proliferate : this concentration is pointed out by the study of the model, and is experimentally validated.The second part of the PhD is the creation of a tool to model genetic regulatory networks, using Thomas' formalism. This tool, developed using ASP (Answer Set Programming) programming language, can integrate many kind of data, like mutation data, or the existence of many steady states. It automatically avoids inconsistency in case of contradiction between different hypotheses. It also infers biological properties such as relationships between kinetic parameters., Les travaux de cette thèse portent principalement sur le développement d'une méthodologie pour la modélisation de systèmes biologiques. Cette méthodologie, basée sur une modélisation en équations différentielles, intègre aussi bien des méthodes formelles (solveur sur intervalles, solveur de formules STL), qu'analytiques (calcul de stabilité d'état stationnaire) ou numériques (algorithme d'optimisation, analyses statistiques). Elle permet l'intégration de différents types de données, telles la réponse comportementale à une perturbation ou des données quantitatives (demie-vie, concentrations). En collaboration avec une équipe de biologistes, cette méthodologie est appliquée, avec succès, au système de l'homéostasie du fer : nous étudions la réponse intracellulaire du système, via des protéines régulatrices spécifiques (protéines IRP), face à une situation de carence en fer. Un résultat majeur de cette étude est l'amélioration des connaissances sur la concentration de fer intracellulaire nécessaire à la prolifération des cellules : cette concentration est mise en avant par l'étude du modèle, puis est confirmée expérimentalement.Le deuxième volet de ces travaux portent sur le développement d'un outil pour la modélisation de réseaux de gènes avec le formalisme des réseaux de Thomas. Cet outil, développé en ASP (Answer Set Programming), permet l'intégration de différents types de données telles des données sur des mutants ou l'existence de différents états stationnaires. Cet outil permet d'éviter automatiquement l'incohérence en cas de contradiction entre différentes hypothèses sur le système. Il permet également l'inférence de propriétés biologiques telles que l'ordre entre paramètres cinétiques.

The eukaryotic lipid kinase phosphatidylinositol 4-kinase III alpha is a ubiquitous enzyme that synthesizes the plasma membrane pool of phosphatidylinositol 4-phosphate. This important phosphoinositide has key roles in different signalization pathways, vesicular traffic and cellular compartment identity. Moreover, PI4KA is an essential factor for hepatitis C virus (HCV) replication. Indeed, PI4KA's interaction with the non-structural HCV protein NS5A at the endoplasmic reticulum membrane leads to formation of a “membranous web” giving to the membrane the signature necessary to the formation of viral replication machineryPI4KA is a large protein (2102 residues, 240 kDa for human PI4KA) with the kinase domain making up the ca 400 C-terminal residues preceded by an Armadillo domain for which no function is known. There is essentially no structural information about the 1500 N-terminal residues and no clue as to the function of most of this region of PI4KA.We use computational methods in order to delineate fragments of human PI4KA amenable to soluble production in Escherichia coli and insect cells. We clone and express these fragments and evaluate the soluble fraction of each construction. Our results further suggest that PI4KA can be described as a two-module protein. The N-terminal module (1100 residues), is composed of two domains which one is an alpha solenoid. Their potential arrangement was defined by small angle X-ray scattering (SAXS).The second module (1000 residues), the C-terminal module, is the core enzyme. Its analysis leads us to identify similarities with the serine/threonine kinases PIKKs, as mTor, homologous to phosphatidylinositol-3-kinases. Three putative domains were delineate at the beginning of this C-terminal module. We name the DI, DII and DIII. Our collaborators have shown their necessity to the kinase activity of PI4KA and the HCV replication. DI domain was characterized and allowed the validation of a new parametrization of the N, N-dimethyl-dodecylamine oxide molecule (LDAO) for simulation of molecular dynamics. Finally, the full-length human PI4KA was expressed in insect cells, purified and a first interaction experiment with membranes have been initiated.; La phosphatidylinositol-4-kinase de type IIIα est une kinase de lipide eukaryote ubiquitaire qui synthétise le phosphatidylinositol-4-phosphate PtdIns(4)P de la membrane plasmique. Ce phosphoinositide est d’autant plus important qu’il tient un rôle majeur dans différentes voies de signalisation cellulaire, le traffic vésiculaire ainsi que dans l’identité des organelles. De plus, la PIK4A humaine est un facteur essentiel pour la réplication du virus de l’hépatite C (VHC). En effet, le recrutement du complexe de réplication du VHC par la protéine virale NS5A à la membrane du reticulum endoplasmique permet la formation d’un réseau membranaire à l’origine de la structuration des complexes de replication viraux.La PI4KA est une kinase imposante (2102 résidus, 240 kDa pour la PI4KA humaine) qui possède un domaine kinase C-terminal d’environ 400 résidus précédé d’un domaine formé de répétitions Armadillo pour lequel aucune fonction n’a été determinée. Le rôle ainsi que le repliement des 1500 résidus N-terminaux de PI4KA ne sont pas connus à ce jour.Afin d’en savoir plus sur la structure tri-dimensionnelle de la PI4KA humaine, nous avons utilisé des outils bio-informatiques afin de délimiter et de modéliser les modules et domaines la composant. Nous avons pu ainsi les exprimer et les produire en bactérie et en cellules d’insecte afin de vérifier nos hypothèses. Nous avons pu conclure que PI4KA est composée de deux modules. Le module N-terminal (1100 résidus), est composé de deux domaines dont un solénoïde α. Les résultats obtenus par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) nous permettent de définir leur agencement potentiel. Le second module (1000 résidus), le module C-terminal, est l’enzyme-core. Son analyse nous a permis d’identifier une similitude remarquable avec les sérine/thréonine kinases PIKKs, comme mTor, apparentées aux phosphatidylinositol-3-kinases. Nous avons défini au début du module C-terminal de PI4KA trois domaines putatifs que nous avons nommés DI, DII et DIII. Nos collaborateurs ont montré qu'ils sont essentiels à l’activité kinase de la protéine ainsi qu’à la replication du VHC. Le domaine DI a été caractérisé et a permis la validation d’une nouvelle paramétrisation de la molécule de N, N-dimethyl-dodecylamine oxide (LDAO) pour des simulations de dynamique moléculaire. Enfin, la PI4KA humaine dans son entier a été exprimée en cellules d’insecte puis purifiée, et un premier test d’interaction avec les membranes a été initié.

Les gènes sont les parties du génome qui codent pour les protéines. Les gènes d’une ou plusieurs espèces peuvent être regroupés en "familles", en fonction de leur similarité de séquence. Cependant, pour connaître les relations fonctionnelles entre ces copies de gènes, la similarité de séquence ne suffit pas. Pour cela, il est important d’étudier l’évolution d’une famille par duplications et pertes afin de pouvoir distinguer entre gènes orthologues, des copies ayant évolué par spéciation et susceptibles d’avoir conservé une fonction commune, et gènes paralogues, des copies ayant évolué par duplication qui ont probablement développé des nouvelles fonctions. Étant donnée une famille de gènes présents dans n espèces différentes, un arbre de gènes (obtenu par une méthode phylogénétique classique), et un arbre phylogénétique pour les n espèces, la "réconciliation" est l’approche la plus courante permettant d’inférer une histoire d’évolution de cette famille par duplications, spéciations et pertes. Le degré de confiance accordé à l’histoire inférée est directement relié au degré de confiance accordé à l’arbre de gènes lui-même. Il est donc important de disposer d’une méthode préliminaire de correction d’arbres de gènes. Ce travail introduit une méthodologie permettant de "corriger" un arbre de gènes : supprimer le minimum de feuilles "mal placées" afin d’obtenir un arbre dont les sommets de duplications (inférés par la réconciliation) sont tous des sommets de "duplications apparentes" et obtenir ainsi un arbre de gènes en "accord" avec la phylogénie des espèces. J’introduis un algorithme exact pour des arbres d’une certaine classe, et une heuristique pour le cas général., Genes are segments of genomes that code for proteins. Genes of one or more species can be grouped into gene families based on their sequence similarity. In order to determine functional relationships among these multiple gene copies of a family, sequence homology is insufficient as no direct information on the evolution of the gene family by duplication, speciation and loss can be inferred directly from a family of homologous genes. And it is precisely this information that allows us to distinguish between orthologous gene copies, that have evolved by speciation and are more likely to preserve the same function and paralogous gene copies that have evolved by duplication and usually acquire new functions. For a given gene family contained within n species, a gene tree (inferred by typical phylogenetic methods) and a phylogenetic tree of the considered species, reconciliation between the gene tree and the species tree is the most commonly used approach to infer a duplication, speciation and loss history for the gene family. The main criticism towards reconciliation methods is that the inferred duplication and loss history for a gene family is strongly dependent on the gene tree considered for this family. Indeed, just a few misplaced leaves in the gene tree can lead to a completely different history, possibly with significantly more duplications and losses. It is therefore important to have a preliminary method for "correcting” the gene tree, i.e. removing potentially misplaced branches. N. El-Mabrouk and C. Chauve introduced "non-apparent duplications" as nodes that are likely to result from the misplacement of one leaf in the gene tree. Simply put, such a node indicates that one or more triplets contradict the phylogeny given by the species tree. In this work, the problem of eliminating non-apparent duplications from a given gene tree by a minimum number of leaf removals is considered. Depending on the disposition of this type of nodes in the gene tree, the algorithm introduced leads to an O(nlogn) performance and an optimal solution in a best case scenario . The general case however is solved using an heuristic method.